SU1707077A1

SU1707077A1 - Method of restictase bsp di preparation

Info

Publication number: SU1707077A1
Application number: SU904828104A
Authority: SU
Inventors: Николай Николаевич Соколов; Нина Васильевна Аникейчева; Андрей Борисович Фицнер; Ольга Тихоновна Самко; Алексей Александрович Калугин; Элла Борисовна Хорошутина; Галина Исаковна Либрик
Original assignee: Институт Биологической И Медицинской Химии Амн Ссср
Priority date: 1990-05-24
Filing date: 1990-05-24
Publication date: 1992-01-23

Abstract

Изобретение относитс к биотехнологии и может быть использовано в молеку- л рно-генетических работах. Целью изобретени вл етс повышение выхода целевого продукта. Изобретение заключаетс в том, что в качестве продуцента рестриктазы используют B.Sphaericus ВКМ В- 752, который выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в услови х аэрации , целевой продукт выдел ют из полученной биомассы известными методами. Биомасса B.sphaerlcus ВКМ В-752 (DI) содержит новую эндонуклеазу рестрикции BspDI, узнающую и расшепл ющую последовательность ДНК 5 ... GATC ... З в количествах , достаточных дл получени рестркактазы в препаративных масштабах. Дл изошизомера BspDI-рестриктазы Sau 3AI выход очищенного фермента 500 ед на 1 г сырого веса биомассы. Выход очищенного препарата рестриктазы Bsp D составл ет 1600 - 2000 ед. активности на 1 г сырой биомассы, что в 3 - 4 раза превышает указанные цифры дл рестриктазы Sau 3AI. (ЛThe invention relates to biotechnology and can be used in molecular genetic work. The aim of the invention is to increase the yield of the target product. The invention consists in the fact that B.Sphaericus VKM B-752, which is grown on a nutrient medium containing sources of carbon, nitrogen and mineral salts, under conditions of aeration, is used as a producer of restricts, the target product is isolated from the resulting biomass by known methods. The biomass of B.sphaerlcus VKM B-752 (DI) contains a new restriction endonuclease BspDI, which recognizes and splits the 5 ... GATC ... 3 DNA sequence in quantities sufficient to produce a restractase on preparative scales. For the isosuizomer of BspDI restrictase Sau 3AI, the yield of the purified enzyme is 500 units per gram of wet weight of biomass. The yield of the purified preparation of Bsp D restrictase is 1600 - 2000 units. activity per 1 g of raw biomass, which is 3-4 times higher than the indicated figures for restriction enzyme Sau 3AI. (L

Description

Изобретение относитс к биотехнологии и может быть использовано в научно-исследовательской работе в генетической инженерии и молекул рной биологии.This invention relates to biotechnology and may be used in research work in genetic engineering and molecular biology.

Рестриктазы II класса (сайт-специфические эндонуклеазы) широко примен ютс при изучении первичной структуры ДНК, в молекул рном клонировании, изучении структурно-функциональной организации генома, вы снении механизмов экспрессии генов, в частности роли метилировани в этом процессе.Class II restriction enzymes (site-specific endonucleases) are widely used in studying the primary structure of DNA, in molecular cloning, in studying the structural and functional organization of the genome, in determining the mechanisms of gene expression, in particular the role of methylation in this process.

В литературе описано более 1100 эндо- нуклеаз рестрикции, одна из которых выделена из Streptococcus aureus ЗА.The literature describes more than 1,100 restriction endonucleases, one of which is isolated from Streptococcus aureus.

Этот фермент имеет 116 участков узнавани на ДНК бактериофага Я, 87 - на ДНК аденовируса Ad2, 8 - на ДНК обезь ннегоThis enzyme has 116 recognition sites for bacteriophage I DNA, 87 for adenovirus Ad2, 8 for monkey DNA.

вируса SV40, 22 - на плазмиде pBR322 и ни одного на ДНК .SV40 virus, 22 - on the plasmid pBR322 and none on DNA.

Содержание рестриктазы Sau3AI в биомассе S.aureus ЗА не указано, выход очищенного препарата фермента составл л 500 ед/г биомассы.The content of Sau3AI restrictase in biomass of S.aureus 3A is not indicated; the yield of the purified enzyme preparation was 500 u / g of biomass.

Целью изобретени вл етс повышение выхода целевого продукта.The aim of the invention is to increase the yield of the target product.

Поиск штамма-продуцента осуществл ли с помощью разработанного экспресс-метода определени рестриктазной активности в толуольных лиза тах из клеток микроорганизмов с последующим электро- форетическим разделением в агарозном геле продуктов расщеплени ДНК.The search for the producer strain was carried out using the developed express method for the determination of restriction enzyme activity in toluene lysates from microorganism cells, followed by electrophoretic separation of the DNA cleavage products in an agarose gel.

Поставленна задача достигаетс тем, что в качестве продуцента рестриктазы используют Bacillus sphaericus ВКМ В-752 (DThe task is achieved by the use of Bacillus sphaericus VKM B-752 (D

о VI about VI

о VI VIabout VI VI

I), который выращивают на питательной среде , содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в услови х аэрации, целевой продукт выдел ют из полученной биомассы известными методами.I), which is grown on a nutrient medium containing carbon, nitrogen and mineral salt sources, under aeration conditions, the target product is isolated from the obtained biomass by known methods.

Рестриктаза Bsp DI - изошизомер SauSAI узнает участок нуклеотидной последовательности ДНК 5...САТС....З и расшеп- л ет ДНК фага А по 116 участкам. ДНК вируса SV40 - по 8, ДНК плазмиды pBR 322The Bsp DI restriction enzyme, the SauSAI isoshizomer, recognizes a portion of the nucleotide sequence of DNA 5 ... SATS ... 3 and splits the DNA of phage A into 116 regions. SV40 virus DNA - 8 each, plasmid pBR 322 DNA

- по 22 и не гидролизует.ДНК рк174.- 22 and does not hydrolyze. DNA pk174.

Штамм Bacillus sphaerlcus BKM В-752 был получен из Всесоюзной Коллекции Мик- ррорганизмов АН СССР, где хранитс по номером ВКМ В-752 ССМ 1087-Ви 386- АТСС 10208 N.R.Smith 966 (Каталог культур Всесоюзной коллекции непатогенных микроорганизмов ).The strain Bacillus sphaerlcus BKM B-752 was obtained from the All-Union Collection of Microorganisms of the Academy of Sciences of the USSR, where it is stored by the number VKM B-752 CCM 1087-We 386-ATCC 10208 N.R.Smith 966 (Catalog of cultures of the All-Union collection of non-pathogenic microorganisms).

Характеристика штамма.Characteristics of the strain.

Морфологические особенности.Morphological features.

Палочки подвижны, грамотрицательны.The sticks are mobile, gram-negative.

Культурэльно-биохимические свойства.Cultural and biochemical properties.

На скошенном агаре рост по штриху обильный. На чашках с м сопептонным агаром колонии крупные, матовые. На м со- пептонном бульоне Хоттингера заметное равномерное помутнение, осадок.On sloped agar, growth along the stroke is abundant. On the cups with m sopptonnogo agar colonies large, dull. On m of peptone broth of Hottinger there is a noticeable uniform turbidity, sediment.

Отношение к кислороду - аэроб.Attitude to oxygen - aerobic.

Лакмусовое молоко - свертывание, пен- тонизаци . Индол - не образует. На глюкозеLitmus milk - coagulation, pentonation. Indole - does not form. On glucose

- кислота+, газ-, маннит-. Желатина уколом- acid +, gas-, mannitol-. Gelatin prick

- разжижение.- liquefaction.

Оптимальные услови выращивани и хранени культуры.Optimum growing and storage conditions.

Культура B.sphaericus BKM В-752 хорошо растет на твердых и жидких полноценных питательных средах: масопептонном агаре, бульоне Хоттингера, среде LB. Оптимум роста культуры при рН среды 7,2 - 7,4. При рН 10 культура не растет.Culture of B. spphaericus BKM B-752 grows well on solid and liquid nutrient media: masopeptonic agar, Hottinger broth, LB medium. The optimum growth of culture at pH 7.2 - 7.4. At pH 10 culture does not grow.

Наибольший выход биомассы, содержащей рестриктазу BspDI, достигаетс в том случае, когда штамм-продуцент выращивают на питательной среде Хоттингера, котора содержит в 1 л 25Q мл основного перевара Хоттингера, 5 г NaCI, 1 г К2НР04 и до 1 л Н20.The highest yield of biomass containing BspDI restrictase is achieved when the producer strain is grown on Hottinger's nutrient medium, which contains 1 g of 25Q ml of the main Hottinger food, 5 g of NaCI, 1 g of K2HP04 and up to 1 l of H20.

Ферментацию культуры провод т после добавлени в ферментер инокул та в соотношении 1:10 к объему среды.Fermentation of the culture is carried out after the inoculum is added to the fermenter in a ratio of 1:10 to the volume of the medium.

Рабочие культуры пересевуют на среду Хоттингера один раз в 8 - 10 дней. Хран т культуру в полужидком агаре под вазелиновым маслом или в лиофилизировзнном виде в-ампулах.Workers cultures are re-sown on Hottinger’s medium once every 8–10 days. Culture is stored in semi-liquid agar under liquid paraffin or in lyophilized form in ampoules.

Выделение рестриктазы BspDI производ т фракционированием полиэтиленими- ном и хроматографией на колонках с аффинным сорбентом и ионообменниками.Isolation of BspDI restrictase was performed by fractionation with polyethyleneimine and affinity sorbent columns and ion exchangers.

Инкубационна смесь, дл определени активности рестриктэзы BspDI объемом 50 мкг, содержит 0,01 М трис-НС буфер(рН 7,4) 0,01 М iv1gd2, 0.001 М дитиотреитола (илиThe incubation mixture, for determining the activity of a 50 µg BspDI restriction enzyme, contains 0.01 M Tris-HC buffer (pH 7.4), 0.01 M iv1gd2, 0.001 M dithiothreitol (or

Г,007 М 2-меркаптоэтанола) и 2 мкг ДНК фага А . Инкубацию провод т при 37°С л течение 60 мин. Продукты расщеплени ДНК фага А рестриктазой BspDI анализируют в 1,4%-ном агарозном геле с последующим прокрашиванием гел бромидом этиди . 3,1 единицу активности фермента принимают то минимальное количество (в мкл), которое необходимо дл полного расщеплени 1 мкг ДНК фага Я при 37°С за G, 007 M 2-mercaptoethanol) and 2 μg of phage A DNA. Incubation is carried out at 37 ° C for 60 minutes. The phage A DNA digestion products with the BspDI restriction enzyme are analyzed on a 1.4% agarose gel, followed by staining of the gel with ethidium bromide. 3.1 units of enzyme activity take the minimum amount (in μl) that is necessary for the complete cleavage of 1 μg of phage H DNA at 37 ° C for

ч инкубации в стандартных услови х инкубационной смеси.Incubation under standard incubation conditions.

Пример 1. Культуру В, sphaericus ВКМ В-752 предварительно адаптируют в течение ночи при 37°С в услови х аэрацииExample 1. Culture B, sphaericus VKM B-752 is pre-adapted overnight at 37 ° C under aeration conditions

на основной питательной среде, содержащей в 1 л 250 мл основного перевара Хоттингера , 5 г NaCI, 1 г К2НРО 1 и до 1 л воды. Инокул т дл ферментера готов т, пересева адаптированную культуру на 1 л свежейon the main nutrient medium containing in 1 l of 250 ml of the main Hottinger ferment, 5 g of NaCI, 1 g of K2HRO 1 and up to 1 l of water. Inoculum for the fermenter is prepared by transferring the adapted culture to 1 l of fresh

среды из расчета 1:10 и размножают в услови х аэрации.medium at the rate of 1:10 and propagated under conditions of aeration.

Ферментацию культуры провод т после добавлени в среду инокул та в соотношении 1:10 к объему среды при 37°С г услови хThe culture is fermented after inoculum is added to the medium in a ratio of 1:10 to the volume of the medium at 37 ° C.

аэрации (рН среды 7,2 - 7,4).aeration (pH of 7.2 - 7.4).

Зо врем выращивани рН культураль- HOI жидкости поддерживают в пределах 7.1 - 7,5. Выращивание продолжают до достижени конца логарифмической фазы роста.For the time of cultivation, the pH of the culture HOI fluid is maintained within the range of 7.1–7.5. Growing is continued until the end of the logarithmic growth phase is reached.

Выход сырой биомассы составл ет 3 - 4 г/п культуральной жидкости. Содержание рестриктазы BspDI в биомассе составл ет 7000-9000 ед/г.The yield of raw biomass is 3–4 g / p culture liquid. The content of BspDI restrictase in biomass is 7000-9000 U / g.

Выделение рестриктазы BspDI.The allocation of restrictase BspDI.

5 г биомассы Bacillus sphaericus BKM В-752 суспендируют в буферном растворе ч клетки разрушают ультразвуком при 2 - 4°С. После удалени остатков клеточных оболочек и неразрушенных клеток с помощью ультрацентрифугировани к бесклеточному экстракту добавл ют полиэтиленимин до конечной концентрации 1%. раствор осветл ют центрифугированием и ведут последовательно хроматографию на5 g of Bacillus sphaericus BKM B-752 biomass is suspended in a buffer solution and the cells are destroyed by ultrasound at 2-4 ° C. After removal of cell debris and intact cells using ultracentrifugation, polyethyleneimine is added to the cell-free extract to a final concentration of 1%. the solution is clarified by centrifugation and chromatographed sequentially.

ДЭАЭ-целлюлозе, голубой сефарозе и фос- фоцеллюлозе.DEAE-cellulose, blue sepharose and phosphocellulose.

Получают 10000 ед активности фермента в 10 мл глицеринового буфера Выход счищенного препарата рестриктазы 2000 едGet 10,000 units of enzyme activity in 10 ml of glycerol buffer The output of the purified drug restrictase 2000 units

на 1 г сырого веса биомассы. Препарат рестриктазы BspDI стабильно сохран ет активность в течение не менее 3-5 мес при хранении при -20°С. Фермент не содержит примесей фосфатаз. эк зону к лез и неспециических эндонукле з, пригоден дл картиовани ДНК и всех видов генно-инжечер- ных работ,per 1 g wet weight of biomass. The drug restrictase BspDI stably retains activity for at least 3-5 months when stored at -20 ° C. The enzyme does not contain impurities phosphatase. The eczone of creep and non-endonucleases is suitable for mapping DNA and all types of gene-inducing work,

Пример 2. Культивирование штамма Bacillus sphaericus ВКМ В-752 провод т аналогично примеру 1, но в качествае питательной среды используют среду LB, содержащую в 1 л 10 г триптона, 5,0 г дрожжевого экстракта, 10,0 г NaCI и до 1 л воды.Example 2. The cultivation of the strain Bacillus sphaericus VKM B-752 is carried out analogously to example 1, but as a nutrient medium, LB medium containing 10 g of tryptone, 5.0 g of yeast extract, 10.0 g of NaCI and up to 1 l is used in 1 liter water.

Выход биомассы 2,5 - 3,5 г/л культу- ральн ой жидкости. После проведени очистки фермента по примеру 1 выход рестриктэзы BspDI составл ет 1600ед/гби- омассы.Biomass yield 2.5 - 3.5 g / l culture liquid. After purification of the enzyme according to Example 1, the yield of BspDI restriction enzyme is 1600 units / GByomass.

Таким образом, по предлагаемому способу получают новую рестрмктэзу BspDl.Thus, according to the proposed method, a new restrktazu BspDl.

Биомасса штамма Bacillus sphaericus ВКМ В-752 содержит новую эндонуклеазу рестрикции BspDI. узнающую и расщепл ющую нуклеотидную последовательность ДНК 5... GATC ... У количествах, доста- тоиных дл получени рестриктазы в пре- парати зных масштабах: содержание рестриктазы BspDI в биомассе 7000 - 9000 ед на 1 г.The biomass of the strain Bacillus sphaericus VKM B-752 contains a new restriction endonuclease BspDI. 5 ... GATC ... DNA recognition and cleaving nucleotide sequence. The quantities sufficient to produce a restriction enzyme on a preparative scale: the BspDI restrictase content in biomass is 7000-9000 units per 1 g.

Выход очищенной рестриктазы Sau3Al, изошизомера , 500 ед на 1 г биомассы.The output of the purified restrictase Sau3Al, isoschizomer, 500 units per 1 g of biomass.

Дл рестриктг :зы BspDI выход очищенного фермента составл ет 1600 - 2000 ед. активности на 1 г сырой биомассы, ито е 3 - 4 раза превышает известные цифры дг For restriction: BspDI, the yield of the purified enzyme is 1600 to 2000 units. activity per 1 g of raw biomass, ito e 3 - 4 times the known figures dg

ЗаиЗА (500 ед).Zayaza (500 units).

Рестрикт.чза BspDI из B.sphaerlcus ВКМ В-752 представл ет интерес, дл молекул р- но-генетических исследований в плане ее использовани дл изучени процессов вA BspDI restriction enzyme from B. sphaerlcus VKM B-752 is of interest for p-genetic research molecules in terms of its use for studying processes in

метилировани ДНК. Эот св зано с особенност ми расщеплени сайта узнавани 5.., GATC ,.. ЗЪтим ферментом и его изошизоме- рзми.МЬо и Dpnll в зависимости от метилированного основани (аденин или цитозин)DNA methylation. This is associated with the features of cleavage of the recognition site 5 .., GATC, .. by the enzyme and its isoschisomerism. MO and Dpnll depending on the methylated base (adenine or cytosine)

в участке узнавани .in the area of recognition.

Claims

Claim Method A method for producing BspDI restriction enzyme, which involves cultivating a producing microorganism on a nutrient medium containing carbon sources, nitrogen and mineral salts under conditions of aeration, dehydrating the cells and isolating the enzyme from the cell-free extract and chromatographically purifying it, and in order increasing the yield of the target product; Bedims sphsericus VKM B-752 is used as a producing microorganism.