RU2069698C1

RU2069698C1 - Method of detection of tuberculosis mycobacteria

Info

Publication number: RU2069698C1
Application number: RU93044519A
Authority: RU
Inventors: Г.Г. Мордовский; М.А. Кравченко
Original assignee: Свердловское областное объединение "Фтизиопульмонология"
Priority date: 1993-09-07
Filing date: 1993-09-07
Publication date: 1996-11-27

Abstract

FIELD: medicinal and veterinary microbiology. SUBSTANCE: method involves homogenization of analyzed material by its shaking with an equal amount of trisodium phosphate at amplitude 0.5-2.5 mm and frequency 40-60 Hz for 10-20 min, incubation for 18-20 hr, precipitate isolation, its neutralization with carboxylic acid to 6.8 ≅ pH < 7.0 followed by repeated precipitate isolation for sowing on the nutrient medium. Method can be used for tuberculosis diagnosis. EFFECT: improved method of mycobacteria detection. 3 tbl

Description

Изобретение относится к микробиологии, в частности к медицинской и ветеринарной микробиологии, и может быть использовано для лабораторной диагностики туберкулеза. The invention relates to microbiology, in particular to medical and veterinary microbiology, and can be used for laboratory diagnosis of tuberculosis.

Известен способ выявления микобактерий туберкулеза, включающий гомогенизацию исследуемого материала 0,14%-ным раствором хлоргексидина биклюконикума с последующей инкубацией в течение 24 ч, центрифугирование исследуемого материала при 1500 об/мин и посев осадка на жидкую питательную среду (Современные методы лабораторной диагностики туберкулеза, методические рекомендации, М. 1992, c. 8). A known method for the detection of mycobacterium tuberculosis, including homogenization of the test material with a 0.14% solution of chlorhexidine bicluconicum followed by incubation for 24 hours, centrifugation of the test material at 1500 rpm and sowing the sediment on a liquid nutrient medium (Modern methods of laboratory diagnosis of tuberculosis, methodological recommendations, M. 1992, p. 8).

Известный способ характеризуется низкой точностью лабораторной диагностики, так как применяемый для гомогенизации раствор хлоргексидина биклюконикума неудовлетворительно гомогенизирует исследуемый материал. Поэтому дополнительно требуется центрифугирование, которое в свою очередь отрицательно влияет на структуру и жизнеспособность микобактерий. The known method is characterized by low accuracy of laboratory diagnostics, since the solution of chlorhexidine bicluconicum used for homogenization unsatisfactorily homogenizes the test material. Therefore, centrifugation is additionally required, which in turn negatively affects the structure and viability of mycobacteria.

Известен также способ выявления микобактерий туберкулеза, включающий гомогенизацию исследуемого материала 10%-ным раствором трехзамещенного фосфорнокислого натрия с последующей инкубацией исследуемого материала при комнатной температуре в течение 24 ч, нейтрализацию раствором соляной кислоты до достижения pН 7 8 и посев исследуемого материала на питательную среду (Современные методы лабораторной диагностики, методические рекомендации, М. 1992, c. 4). There is also a known method for detecting mycobacterium tuberculosis, including homogenization of the test material with a 10% solution of trisubstituted sodium phosphate followed by incubation of the test material at room temperature for 24 hours, neutralization with hydrochloric acid solution until pH 7 8 is reached and culture of the test material on culture medium (Modern laboratory diagnostic methods, guidelines, M. 1992, p. 4).

Известный способ также обладает низкой точностью лабораторной диагностики, так как инкубация исследуемого материала при комнатной температуре не позволяет с высоким качеством обработать его от посторонней микрофлоры, что в дальнейшем при посеве приводит к увеличению проростов посторонней микрофлоры. А наличие посторонней микрофлоры снижает выявляемость микобактерий туберкулеза, т.е. точность лабораторной диагностики. The known method also has low accuracy in laboratory diagnostics, since incubation of the test material at room temperature does not allow to process it from extraneous microflora with high quality, which subsequently, when sowing, leads to an increase in the growth of extraneous microflora. And the presence of extraneous microflora reduces the detection of mycobacterium tuberculosis, i.e. laboratory diagnostic accuracy.

Последующая обработка исследуемого материала соляной кислотой приводит к снижению жизнеспособности микобактерий туберкулеза, что также снижает точность лабораторной диагностики туберкулеза. Subsequent treatment of the test material with hydrochloric acid leads to a decrease in the viability of tuberculosis mycobacteria, which also reduces the accuracy of laboratory diagnosis of tuberculosis.

Наиболее близким к данному способу по технической сущности и достигаемому результату является способ выявления микобактерий туберкулеза, включающий гомогенизацию исследуемого материала путем встряхивания его со стеклянными бусами или битым стеклом, вторичную гомогенизацию путем встряхивания его с равным количеством десятипроцентного раствора трехзамещенного фосфорнокислого натрия и последующую инкубацию при комнатной температуре в течение 20 24 ч, после чего исследуемый материал центрифугируют, а выделенный осадок нейтрализуют пятипроцентным раствором соляной кислоты для последующего посева на питательную среду (Современные методы микробиологической диагностики туберкулеза, методические рекомендации, М. 1975, с. 15). The closest to this method in terms of technical nature and the achieved result is a method for detecting mycobacterium tuberculosis, including homogenizing the test material by shaking it with glass beads or broken glass, secondary homogenizing by shaking it with an equal amount of a ten percent solution of trisubstituted sodium phosphate and subsequent incubation at room temperature for 20 to 24 hours, after which the test material is centrifuged, and the precipitate is neutralized typrocent solution of hydrochloric acid for subsequent plating on a nutrient medium (Modern methods of microbiological diagnosis of tuberculosis, guidelines, M. 1975, p. 15).

Недостатком указанного способа является то, что при его осуществлении не обеспечивается необходимая точность лабораторной диагностики за счет количественных потерь исследуемого материала, нарушения структуры и жизнеспособности микобактерий в нем. The disadvantage of this method is that its implementation does not provide the necessary accuracy of laboratory diagnostics due to quantitative losses of the test material, violation of the structure and viability of mycobacteria in it.

Гомогенизация с помощью стеклянных бус или битого стекла ведет к адсорбции микобактерий на их поверхности, что и обуславливает количественные потери микобактерий в исследуемом материале. Кроме того, за счет механического воздействия бус или битого стекла на исследуемый материал возникает электростатическое поле, приводящее к распределению микобактерий по полюсам, то есть образуются новые конгломераты, вследствие чего и требуется повторная гомогенизация трехзамещенным фосфорнокислым натрием. Homogenization using glass beads or broken glass leads to the adsorption of mycobacteria on their surface, which leads to quantitative losses of mycobacteria in the studied material. In addition, due to the mechanical effect of beads or broken glass on the material under study, an electrostatic field arises, leading to the distribution of mycobacteria at the poles, that is, new conglomerates are formed, which requires repeated homogenization with trisubstituted sodium phosphate.

Выделение осадка центрифугированием приводит к нарушению структуры микобактерий, снижению их жизнеспособности, а последующая нейтрализация раствором сильной соляной кислоты вследствие экзотермической реакции на уровне оболочки клетки микобактерии приводит к дальнейшему снижению их жизнеспособности. Separation of the precipitate by centrifugation leads to disruption of the structure of mycobacteria, a decrease in their viability, and subsequent neutralization with a solution of strong hydrochloric acid due to an exothermic reaction at the cell wall level of mycobacteria leads to a further decrease in their viability.

Следовательно, указанный способ не обеспечивает достаточную лабораторную точность диагностики и тем самым снижает достоверность последующего анализа результатов исследования. Therefore, this method does not provide sufficient laboratory diagnostic accuracy and thereby reduces the reliability of the subsequent analysis of the research results.

В основу изобретения положена задача повышения точности лабораторной диагностики путем снижения количественных потерь, снижения нарушений структуры и жизнеспособности микобактерий в исследуемом материале при сокращении времени лабораторных исследований. The basis of the invention is the task of improving the accuracy of laboratory diagnostics by reducing quantitative losses, reducing structural disorders and the viability of mycobacteria in the test material while reducing the time of laboratory tests.

Поставленная задача решается тем, что в способе выявления микобактерий туберкулеза, включающем гомогенизацию исследуемого материала путем встряхивания его с равным количеством 10%-ного раствора трехзамещенного фосфорнокислого натрия, инкубацию исследуемого материала, выделение осадка, нейтрализацию его кислотой и посев осадка на питательную среду, гомогенизацию проводят, подвергая исследуемый материал колебаниям с амплитудой 0,5 2,5 мм, частотой 40 60 Гц в течение 10 20 мин, инкубацию осуществляют в течение 18 20 ч, а нейтрализацию осадка ведут карбоновой кислотой до достижения 6,8≅pH≅7,0 c последующим повторным выделением осадка и посева на питательную среду. The problem is solved in that in a method for detecting mycobacterium tuberculosis, including homogenizing the test material by shaking it with an equal amount of a 10% solution of trisubstituted sodium phosphate, incubating the test material, isolating the sediment, neutralizing it with acid and sowing the sediment on a nutrient medium, homogenization is carried out Subjecting the test material to vibrations with an amplitude of 0.5–2.5 mm, a frequency of 40–60 Hz for 10–20 min, incubation is carried out for 18–20 h, and the sediment is neutralized carboxylic acid to reach 6.8≅pH≅7.0 with subsequent re-precipitation and plating on a nutrient medium.

Гомогенизация исследуемого материала в присутствии трехзамещенного фосфорнокислого натрия посредством вынужденных колебаний с амплитудой 0,5 - 2,5 мм, частотой 40 60 Гц в течение 10 20 мин позволяет осуществить его полную гомогенизацию без количественных потерь на адсорбцию. Homogenization of the test material in the presence of trisubstituted sodium phosphate through forced oscillations with an amplitude of 0.5 - 2.5 mm, a frequency of 40 60 Hz for 10 20 minutes allows its complete homogenization without quantitative adsorption losses.

При меньшей амплитуде, частоте и времени не происходит полного освобождения от посторонней флоры (сгустков, комков, слизи). With a smaller amplitude, frequency and time, complete liberation from extraneous flora (clots, lumps, mucus) does not occur.

Увеличение амплитуды, частоты и времени гомогенизации способствует нарушению структуры микобактерий и снижению тем самым числа жизнеспособных микобактерий. An increase in the amplitude, frequency and time of homogenization contributes to the disruption of the structure of mycobacteria and thereby reduce the number of viable mycobacteria.

Полностью гомогенизированный и жизнеспособный исследуемый материал позволяет осуществить инкубацию в течение 18 20 ч при температуре 37^oC, что сокращает ее время и приводит к сокращению сроков лабораторного исследования при обеспечении более полного выявления микобактерий, что повышает точность лабораторной диагностики.A fully homogenized and viable test material allows incubation for 18 to 20 hours at a temperature of 37 ^o C, which reduces its time and leads to a reduction in the time of laboratory testing while ensuring more complete detection of mycobacteria, which increases the accuracy of laboratory diagnostics.

Нейтрализация осадка карбоновой кислотой создает щадящий для микобактерий режим, не связанный с экзотермическим воздействием на них и тем самым не нарушающий их жизнеспособность. Neutralization of the precipitate with carboxylic acid creates a sparing regime for mycobacteria that is not associated with exothermic effects on them and thereby not violating their viability.

С помощью нейтрализации карбоновой кислотой достигается нейтральная среда (6,8≅pH≅7,0), создающая оптимальные условия для микобактерий, являясь для них дополнительным питательным субстратом, что и способствует их сохранению. Using neutralization with carboxylic acid, a neutral medium is achieved (6.8≅pH≅7.0), which creates optimal conditions for mycobacteria, being an additional nutrient substrate for them, which contributes to their conservation.

В процессе нейтрализации карбоновой кислотой возникают за счет разности удельных масс микобактерий и надосадочной жидкости условия для осаждения последних близким к естественному путем и, следовательно, возможность повторного выделения осадка, тем самым увеличивая концентрацию микобактерий в исследуемом материале, что также повышает точность лабораторной диагностики туберкулеза. In the process of neutralization with carboxylic acid, due to the difference in the specific gravities of mycobacteria and supernatant, conditions arise for the precipitation of the latter close to the natural way and, therefore, the possibility of re-precipitation, thereby increasing the concentration of mycobacteria in the test material, which also increases the accuracy of laboratory diagnosis of tuberculosis.

Пример. В качестве исследуемого материала использовали мокроту, промывные воды бронхов, секрет бронхов и т.п. Исследуемый материал помещали в мерный флакон емкостью 100 мл. К исследуемому материалу в объеме 10 л добавляли 10 мл десятипроцентного раствора трехзамещенного фосфорнокислого натрия и производили встряхивание в режимах, приведенных в таблице 1. Исследовали 147 проб. Example. Sputum, bronchial washings, bronchial secretions, etc. were used as the test material. The test material was placed in a 100 ml volumetric vial. To the test material in a volume of 10 l was added 10 ml of a ten percent solution of trisubstituted sodium phosphate and shaking was performed in the modes shown in table 1. 147 samples were examined.

Из представленных данных таблицы 1 видно, что при последующем посеве наиболее оптимальными техническими условиями гомогенизации встряхиванием исследуемого материала является встряхивание с амплитудой колебаний 0,5 2,5 мм при частоте 40 60 Гц и продолжительности 10 20 мин, что способствует более высокой выявляемости (на 3±1%), а следовательно, повышению точности лабораторной диагностики. From the data presented in table 1 it is seen that during subsequent sowing, the most optimal technical conditions for homogenization by shaking the test material is shaking with an amplitude of 0.5 to 2.5 mm at a frequency of 40 to 60 Hz and a duration of 10 to 20 minutes, which contributes to higher detectability (by 3 ± 1%), and therefore, increase the accuracy of laboratory diagnostics.

Далее гомогенизированный исследуемый материал подвергали инкубации в термостате в режимах, указанных в таблице 2. Next, the homogenized test material was incubated in a thermostat in the modes indicated in table 2.

Из представленных данных таблицы 2 видно, что повторное выделение осадка способствует большей выявляемости МБТ из исследуемого материала в среднем на 3% и сокращает сроки исследования в среднем на 8 сут. From the data presented in table 2 it can be seen that re-precipitation contributes to a greater detection of MBT from the studied material by an average of 3% and reduces the study time by an average of 8 days.

После инкубации надосадочную жидкость сливают, а осадок нейтрализуют лимонной кислотой до достижения pН 6,8. After incubation, the supernatant is drained and the precipitate is neutralized with citric acid until a pH of 6.8 is reached.

Сравнительные данные использования карбоновых кислот для нейтрализации осадка приведены в таблице 3 (pН 6,8 7,0). Comparative data on the use of carboxylic acids to neutralize sludge are given in table 3 (pH 6.8 7.0).

Из представленных данных таблицы 3 следует отметить преимущество использования карбоновых кислот для нейтрализации осадка, которое проявилось в большей высеваемости МБТ (на 6±2%), сокращению сроков исследования (на 6±1 сут) и проростов посторонней микрофлоры в 2 раза. From the data presented in Table 3, it should be noted the advantage of using carboxylic acids to neutralize the sediment, which was manifested in a higher MBT sowing rate (by 6 ± 2%), a reduction in the study time (by 6 ± 1 day), and 2-fold growth of foreign microflora.

После нейтрализации лимонной кислотой повторно отделяют осадок для посева на питательную среду Левенштейна-Йенсена. After neutralization with citric acid, the precipitate is re-separated for plating on Levenshtein-Jensen culture medium.

Таким образом, при выявлении микобактерий туберкулеза заявляемым способом точность лабораторной диагностики по сравнению с известным способом повышается в 1,5 2,0 раза при одновременном сокращении времени лабораторных исследований. Thus, when detecting mycobacterium tuberculosis by the claimed method, the accuracy of laboratory diagnostics in comparison with the known method increases by 1.5 2.0 times while reducing the time of laboratory tests.

Claims

A method for detecting mycobacterium tuberculosis, including homogenizing the test material by shaking it with an equal amount of a ten percent solution of trisubstituted sodium phosphate, incubating the test material, isolating the precipitate, neutralizing it with acid and sowing the precipitate on a nutrient medium, characterized in that the homogenization is carried out by subjecting the test material to vibrations the amplitude of 0.5 to 2.5 mm, a frequency of 40 to 60 Hz for 10 to 20 minutes, the incubation is carried out for 18 to 20 hours, and the sediment is neutralized by carbon acid until a howl 6,8 ≅ pH ≅ 7,0 followed by re-isolation of the precipitate for plating on nutrient medium.