RU2061039C1

RU2061039C1 - Method of protein hydrolysate preparing

Info

Publication number: RU2061039C1
Application number: RU94016930A
Authority: RU
Inventors: А.Л. Ковтун; В.М. Сапрыкин; В.К. Фирсов; А.З. Рогожин; Н.А. Черкасов; В.Г. Кузнецов
Original assignee: Научно-исследовательский институт микробиологии Министерства обороны РФ
Priority date: 1994-05-10
Filing date: 1994-05-10
Publication date: 1996-05-27

Abstract

FIELD: microbiology. SUBSTANCE: protein substrate is subjected for hydrolysis with pancreatin at pH = 7.5-7.8, at 48-52 C for 4-5 hr at the ratio substrate: enzyme = 1.0:0.075. Method is used for preparing the basic nutrient media for accumulation and cultivation of bacterial microorganisms. EFFECT: improved method of protein hydrolysate preparing. 9 tbl

Description

Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к способам получения белковых гидролизатов, и может быть использовано при получении основных питательных сред для накопления и культивирования микроорганизмов бактериальной природы. The invention relates to medical microbiology, and in particular to methods for producing protein hydrolysates, and can be used to obtain basic nutrient media for the accumulation and cultivation of microorganisms of a bacterial nature.

Известен способ получения белкового гидролизата (Пригода А.С. и др. Биотехнология. 1990, N 2, с.35-39), состоящий в том, что гидролиз казеина проводят при температуре 40^оС, при pH 8,0 в течение 2-20 ч. При этом соотношение субстрат (казеин) фермент (панкреатин) составляет 10:1. По завершении процесса фермент инактивируют при 75^оС в течение 10 мин и гидролизат осветляют центрифугированием. Для отделения гидролизата от непрореагировавшего белка и остатков фермента супернатант смешивают с активным углем из расчета 30 г сорбента на 1 л гидролизата с экспозицией 30 мин. По окончании сорбции гидролизат последовательно фильтруют через картон марки "КФО", фильтровальную бумагу и стерилизующие мембраны "Millipore" с диаметром пор 0,22 мкм. Полученный таким образом белковый гидролизат представляет собой главным образом смесь аминокислот и пептидов с молекулярной массой от 200 до 5000 Д и используется в качестве заменителя сыворотки в питательных средах для культивирования клеток эукариот.A known method of producing a protein hydrolyzate (Prigoda A.S. et al. Biotechnology. 1990, N 2, p. 35-39), consisting in the fact that hydrolysis of casein is carried out at a temperature of 40 ^about C, at a pH of 8.0 for 2 -20 hours. The ratio of substrate (casein) enzyme (pancreatin) is 10: 1. Upon completion of the process, the enzyme is inactivated at 75 ^about C for 10 minutes and the hydrolyzate is clarified by centrifugation. To separate the hydrolyzate from unreacted protein and enzyme residues, the supernatant is mixed with activated carbon at the rate of 30 g of sorbent per 1 liter of hydrolyzate with an exposure of 30 minutes. At the end of the sorption, the hydrolyzate is successively filtered through KFO brand cardboard, filter paper and Millipore sterilizing membranes with a pore diameter of 0.22 μm. Thus obtained protein hydrolyzate is mainly a mixture of amino acids and peptides with a molecular weight of 200 to 5000 D and is used as a substitute for serum in culture media for the cultivation of eukaryotic cells.

Однако полученный гидролизат используется только при конструировании бессывороточных питательных сред для суспензионного культивирования клеток млекопитающих, а не как основа микробиологических сред (Пригода А.С. и др. Биотехнология, 1990, N 2, с.35-39). However, the resulting hydrolyzate is used only in the design of serum-free culture media for suspension culture of mammalian cells, and not as the basis for microbiological media (Prigoda A.S. et al. Biotechnology, 1990, N 2, p. 35-39).

Использование гидролизата для приготовления бактериологических питательных сред не повышает их ростовых свойств, так как содержит мало низкомолекулярных пептидов. Повышение ростовых свойств питательных сред данным способом путем изменения только температуры гидролизата, или модуля загрузки, или pH реакционной смеси не происходит. The use of a hydrolyzate for the preparation of bacteriological nutrient media does not increase their growth properties, since it contains few low molecular weight peptides. The increase in growth properties of nutrient media in this way by changing only the temperature of the hydrolyzate, or loading module, or the pH of the reaction mixture does not occur.

Известен способ получения гидролизата путем кислотного гидролиза казеина с последующей деминерализацией его (авт. св. СССР N 738583). A known method of producing a hydrolyzate by acid hydrolysis of casein, followed by demineralization of it (ed. St. USSR N 738583).

Гидролиз проводят в две стадии, на первой из них процесс ведут соляной или серной кислотой в течение 25-35 мин при 100-102^оС, а также протеолитическим ферментом-пепсидном при pH 1,0-2,0 до перевода в растворимое состояние гликопептидов с последующим удалением надосадочной жидкости, а на второй стадии гидролиз проводят с соляной или серной кислотой до глубины расщепления белка 45-50% Затем осуществляют деминерализацию смеси электродиализом.The hydrolysis is carried out in two stages, the first of which process is carried out with hydrochloric or sulfuric acid for 25-35 minutes at 100-102 ^C, and the proteolytic enzyme-pepsidnom at pH 1,0-2,0 before transfer to soluble state glycopeptides followed by removal of the supernatant, and in the second stage the hydrolysis is carried out with hydrochloric or sulfuric acid to a depth of protein breakdown of 45-50%. Then, the mixture is demineralized by electrodialysis.

К недостаткам этого способа следует отнести продолжительность и двухстадийность процесса гидролиза, обязательную деминерализацию смеси белкового гидролизата, что увеличивает себестоимость питательной основы. The disadvantages of this method include the duration and two-stage process of hydrolysis, the mandatory demineralization of a mixture of protein hydrolyzate, which increases the cost of the nutrient base.

Невозможность получения требуемого технического результата обусловлена тем, что в известном способе используются три гидролизующих агента, замена или исключение одного из них приводит к снижению себестоимости, но не повышает ростовых свойств питательных сред. The impossibility of obtaining the desired technical result is due to the fact that in the known method three hydrolyzing agents are used, replacement or exclusion of one of them leads to a reduction in cost, but does not increase the growth properties of nutrient media.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения белкового гидролизата по Хоттингеру (Козлов Ю.А. Питательные среды в медицинской микробиологии, М. 1950, с.290-292; Заплатина С.И. и др. Труды Ростовского противочумного института. Ростов-на-Дону, 1959), состоящий в том, что 18 г казеина замачивают в водопроводной воде. Через сутки его отжимают и растворяют в 1 л горячей воды. Раствор подщелачивают 20%-ным раствором NaOH до pH 7,0-7,2 и кипятят в течение 15-20 мин до полного растворения казеина. К охлажденному до 40^оС раствору казеина добавляют молотую поджелудочную железу из расчета 50 г на 1 л раствора и 10 мл хлороформа. Готовый раствор помещают в термостат, где поддерживают температуру 37^оС. Первые сутки перевар взбалтывают через каждые 15-20 мин, а в последующие дни 2-3 раза в сутки. Гидролиз проводят в течение 4-5 сут до полного прекращения нарастания аминного азота.Closest to the proposed is a method of producing a protein hydrolyzate according to Hottinger (Kozlov Yu.A. Nutrient media in medical microbiology, M. 1950, p. 290-292; Zaplatina S.I. et al. Proceedings of the Rostov Anti-Plague Institute. Rostov-on Don, 1959), consisting in the fact that 18 g of casein is soaked in tap water. After a day, it is squeezed and dissolved in 1 liter of hot water. The solution was alkalinized with a 20% NaOH solution to pH 7.0-7.2 and boiled for 15-20 minutes until casein was completely dissolved. Cooled to 40 ^C. was added a solution of casein milled pancreas rate of 50 g per 1 liter of solution and 10 ml of chloroform. The final solution was placed in an oven where temperature is maintained at 37 ° ^C. The first day digest shaken every 15-20 minutes, and in subsequent days 2-3 times per day. Hydrolysis is carried out for 4-5 days until the complete cessation of the growth of amine nitrogen.

Белковый гидролизат используют для приготовления питательных сред при культивировании микроорганизмов бактериальной природы. Protein hydrolyzate is used for the preparation of culture media in the cultivation of microorganisms of a bacterial nature.

К недостаткам этого способа следует отнести длительность процесса гидролиза (4-5 сут), значительную себестоимость питательной основы и невысокие ростовые свойства питательных сред, приготовленных из нее. Сокращение времени гидролиза приводит к снижению себестоимости питательной основы, но при этом снижаются ее ростовые свойства. Изменение только pH реакционной смеси или модуля загрузки по ферменту не приводит к достижению требуемого технического результата. The disadvantages of this method include the duration of the hydrolysis process (4-5 days), the significant cost of the nutrient base and the low growth properties of the nutrient media prepared from it. Reducing the time of hydrolysis leads to a decrease in the cost of the nutrient base, but at the same time its growth properties are reduced. Changing only the pH of the reaction mixture or the loading module for the enzyme does not lead to the achievement of the required technical result.

Задачей изобретения является сокращение процесса получения гидролизата, снижение его себестоимости и повышение ростовых свойств полученных на его основе питательных сред, используемых для выращивания микроорганизмов бактериальной природы. The objective of the invention is to reduce the process of producing a hydrolyzate, reduce its cost and increase the growth properties of the nutrient media obtained on its basis, used to grow microorganisms of a bacterial nature.

Задача решается тем, что в способе получения белкового гидролизата, включающем ферментативное расщепление белкового субстрата, гидролиз проводят в течение 4-5 ч при температуре 50 ± 2^оС и pH 7,5-7,8 панкреатином в соотношении субстрат-фермент, равном 1,0:0,075.The problem is solved by the method for producing a protein hydrolyzate comprising enzymatic degradation of the protein substrate, the hydrolysis is carried out for 4-5 hours at a temperature of 50 ± 2 ^{° C} and pH 7,5-7,8 pancreatin in a ratio of substrate-enzyme ratio of 1 0: 0.075.

Сущность предложенного способа заключается в следующем. В реактор загружают 120 л водопроводной воды и 12 кг казеина. Смесь нагревают "глухим" паром до температуры 50± 2^оС, включают мешалку и добавляют к смеси 40%-ный раствор NaOH, устанавливая pH 7,5-7,8. В смесь вводят 900 г панкреатина (активностью 25 ед/г, если активность иная, то делают перерасчет навески, вводимой в реактор) и ведут процесс в течение 4-5 ч при 50± 2^оС. В течение первого часа процесса гидролиза смесь постоянно перемешивают. В последующие часы перемешивание проводят по 5-10 мин через каждые 30 мин гидролиза. Через каждый час гидролиза отбирают пробу, в которой определяют концентрацию аминного азота и pH. Критерием окончания процесса является отсутствие прироста аминного азота в смеси.The essence of the proposed method is as follows. 120 l of tap water and 12 kg of casein are charged into the reactor. The mixture was heated "hollow" steam to a temperature of 50 ± 2 ^{° C,} and the stirrer was added to a mixture of 40% NaOH solution, setting a pH 7,5-7,8. 900 g of pancreatin (25 units / g activity, if the activity is different, is added to the mixture, then the sample is added to the reactor) and the process is carried out for 4-5 hours at 50 ± 2 ^о С. During the first hour of the hydrolysis process, the mixture is constantly mix. In the following hours, stirring is carried out for 5-10 minutes every 30 minutes of hydrolysis. After every hour of hydrolysis, a sample is taken in which the concentration of amine nitrogen and pH are determined. The criterion for the end of the process is the absence of an increase in amino nitrogen in the mixture.

По окончании гидролиза смесь нагревают до кипения, после чего ее охлаждают холодной водой через рубашку реактора до 35-40^оС. Полученный гидролизат фильтруют через картон марки "Т" на фильтр-прессе.Upon completion of hydrolysis, the mixture is heated to reflux, after which it was cooled with cold water through the jacket of the reactor to 35-40 ° ^C. The hydrolyzate is filtered through cardboard mark "T" in a filter press.

Сравнительная характеристика гидролизатов по физико-химическим показателям и аминокислотному составу приведена в табл.1 и 2. Comparative characteristics of hydrolysates in physicochemical parameters and amino acid composition are given in tables 1 and 2.

Причинно-следственная связь между совокупностью существенных признаков предлагаемого изобретения и достигаемым техническим результатом показана в табл.3. A causal relationship between the totality of the essential features of the invention and the achieved technical result is shown in table 3.

Изобретение позволяет сократить длительность гидролиза в 20-25 раз, снизить себестоимость питательной основы за счет сокращения продолжительности гидролиза и снижения модуля загрузки (фермент-субстрат, по ферменту) в 2 раза. Совокупность оптимальных значений температуры, pH, использование панкреатина в соотношении 1,0:0,075 (субстрат-фермент) интенсифицирует процесс и повышает качество гидролизата, так как увеличивает концентрацию пептидов в смеси в 12 раз. The invention allows to reduce the duration of hydrolysis by 20-25 times, reduce the cost of the nutrient base by reducing the duration of hydrolysis and lowering the loading module (enzyme-substrate, by enzyme) by 2 times. The set of optimal temperatures, pH, the use of pancreatin in a ratio of 1.0: 0.075 (substrate-enzyme) intensifies the process and improves the quality of the hydrolyzate, as it increases the concentration of peptides in the mixture by 12 times.

Изобретение позволяет получать белковый гидролизат, содержащий смесь аминокислот и пептидов с молекулярной массой от 200 до 2000 Д, используемый для конструирования бактериологических питательных сред, вместо перевара говяжьей вырезки крупного рогатого скота и казеина по Хоттингеру. The invention allows to obtain a protein hydrolyzate containing a mixture of amino acids and peptides with a molecular weight of from 200 to 2000 D, used to construct bacteriological culture media, instead of digesting beef tenderloin in cattle and casein according to Hottinger.

П р и м е р 1. В реактор вместимостью 0,15 м³ загружают 120 л водопроводной воды и 12 кг казеина. Смесь нагревают "глухим" паром до температуры 50^оС, включают мешалку и добавляют 40%-ный раствор NaOH до pH 7,5. В реактор вводят 900 г панкреатина с активностью 25 ед/г. Гидролиз проводят при температуре 50^оС. В течение первого часа процесса смесь постоянно перемешивают. В последующие часы перемешивают по 10 мин через каждые 30 мин. Через 5 ч гидролиза смесь нагревают до кипения, охлаждают холодной водой через рубашку реактора до температуры 40^оС, фильтруют через картон марки "Т" на фильтр-прессе.PRI me R 1. In a reactor with a capacity of 0.15 m ³ load 120 l of tap water and 12 kg of casein. The mixture was heated "hollow" steam to a temperature of 50 ^{° C,} and the stirrer was added 40% NaOH solution until pH 7,5. 900 g of pancreatin with an activity of 25 u / g are introduced into the reactor. Hydrolysis is carried out at a temperature of 50 ^about C. During the first hour of the process, the mixture is constantly stirred. In the following hours, mix for 10 minutes every 30 minutes. After 5 hours the hydrolysis, the mixture is heated to boiling, cooled with cold water through the reactor jacket temperature to 40 ^C., filtered through cardboard mark "T" in a filter press.

Физико-химическая характеристика гидролизата и его аминокислотный состав представлены в табл.4 и 5. Physico-chemical characteristics of the hydrolyzate and its amino acid composition are presented in tables 4 and 5.

П р и м е р 2. Исходные данные: температура гидролиза 48^оС, pH смеси 7,8, время гидролиза 4 ч. Физико-химическая характеристика гидролизата и его аминокислотный состав представлены в табл.4 и 5.PRI me R 2. Initial data: the hydrolysis temperature of 48 ^about With the pH of the mixture of 7.8, the hydrolysis time of 4 hours. The physico-chemical characteristics of the hydrolyzate and its amino acid composition are presented in tables 4 and 5.

П р и м е р 3. Исходные данные: температура гидролиза 52^оС, pH смеси 7,8, время гидролиза 5 ч. Физико-химическая характеристика гидролизата и его аминокислотный состав представлены в табл.4 и 5.PRI me R 3. The initial data: the temperature of the hydrolysis of 52 ^about With, the pH of the mixture is 7.8, the hydrolysis time of 5 hours. The physicochemical characteristics of the hydrolyzate and its amino acid composition are presented in tables 4 and 5.

Использование белкового гидролизата в качестве питательной основы бактериологических сред для культивирования различных микроорганизмов иллюстрируется следующими примерами. The use of protein hydrolyzate as a nutrient base for bacteriological media for the cultivation of various microorganisms is illustrated by the following examples.

П р и м е р 4. Берут гидролизат, приготовленный по примеру 1, 2 или 3, разбавляют дистиллированной водой до концентрации 120 мг% по аминному азоту. К 1 л смеси добавляют 3,0 г хлористого натрия и 1,0 г Na₂HPO₄, кипятят 20 мин, устанавливают pH 7,2, разливают в стерильные флаконы по 100,0 мл, стерилизуют автоклавированием при 110^оС 30 мин. Питательную среду во флаконах засевают 24-часовой суспензией вакцинного штамма ЕВ чумного микроба в концентрации 1,0·10⁹ м·кл (1 мл 1·10⁷ м·кл), выращивают в течение 48 ч при 28^оС.PRI me R 4. Take the hydrolyzate prepared according to example 1, 2 or 3, diluted with distilled water to a concentration of 120 mg% in amine nitrogen. To the mixture was added 1 liter of 3.0 g of sodium chloride and 1.0 g of Na ₂ HPO _4, refluxed for 20 minutes, adjusted pH 7,2, dispensed into sterile vials 100.0 ml, sterilized by autoclaving at ¹¹⁰ ° C for 30 minutes. The nutrient medium in the bottles is inoculated with a 24-hour suspension of the vaccine strain EB of the plague microbe at a concentration of 1.0 · 10 ⁹ m · cells (1 ml 1 · 10 ⁷ m · cells), grown for 48 hours at 28 ^about C.

Данные ростовых и морфологических свойств Y.pestis штамма ЕВ приведены в табл.6 в сравнении с результатами, полученными на средах из перевара казеина и мяса по Хоттингеру. The growth and morphological properties of Y. pestis EB strain are given in Table 6 in comparison with the results obtained on media from casein and meat digest according to Hottinger.

Из табл.6 видно, что выход биомассы на среде из заявляемого объекта превышает выход биомассы на средах из перевара казеина и мяса по Хоттингеру. From table 6 it is seen that the yield of biomass on the medium from the claimed facility exceeds the yield of biomass on the media from a casein and meat digest according to Hottinger.

П р и м е р 5. В жидкую среду, имеющую состав по примеру 4, дополнительно вводят агар-агар из расчета 20 г/л. Устанавливают pH 7,1, разливают в матрацы по 0,5 л, стерилизуют автоклавированием при 110^оС 30 мин, добавляют стерильный раствор сульфита натрия из расчета 0,25 мг/л. Среду разливают в чашки Петри, засевают 24-часовой суспензией вакцинного штамма ЕВ Y.pestis в концентрации 1·10² м·кл на чашку для определения показателя прорастания и морфологии колоний. Культуру выращивают в течение 48 ч при 27^оС. Данные приведены в табл.7.PRI me R 5. In a liquid medium having the composition according to example 4, additionally enter agar-agar at a rate of 20 g / L. Set the pH to 7.1, poured into mattresses of 0.5 l, sterilized by autoclaving at 110 ^about 30 minutes, add a sterile solution of sodium sulfite at a rate of 0.25 mg / L. The medium is poured into Petri dishes, inoculated with a 24-hour suspension of the vaccine strain EB Y. pestis at a concentration of 1 · 10 ² m · cells per cup to determine the rate of germination and morphology of the colonies. The culture was grown for 48 h at 27 ^about C. The data are shown in table.7.

Из табл.7 видно, что на плотной среде из белкового гидролизата выростало 68± 2 типичных колоний чумного микроба, а на средах из перевара казеина и мяса по Хоттингеру 59± 3 и 57± 2 колоний соответственно. It can be seen from Table 7 that 68 ± 2 typical plague microbial colonies grew from a protein hydrolyzate on a dense medium, and 59 ± 3 and 57 ± 2 colonies, respectively, on a Hottinger medium from a casein and meat digest.

П р и м е р 6. Готовят среду по примеру 4, но хлористый натрий добавляют из расчета 0,5 г/л. Устанавливают pH 7,4, разливают в стерильные флаконы по 100 мл, стерилизуют автоклавированием при 110^оС 30 мин. Питательную среду засевают 24-часовой суспензией кишечной палочки штамм М17 в концентрации 1·10⁹ м·кл (в 1 мл 1·10⁷ м·кл). Выращивают в течение 24 ч при 37^оС. Данные ростовых и морфологических свойств Е.сoli приведены в табл.8.PRI me R 6. Prepare the medium according to example 4, but sodium chloride is added at the rate of 0.5 g / l. Adjusted pH 7,4, dispensed into sterile vials of 100 ml, sterilized by autoclaving at ¹¹⁰ ° C for 30 minutes. The nutrient medium is inoculated with a 24-hour suspension of Escherichia coli strain M17 at a concentration of 1 · 10 ⁹ m · cells (in 1 ml of 1 · 10 ⁷ m · cells). Grown for 24 hours at 37 ^about C. Data growth and morphological properties of E. coli are given in table 8.

Из данных табл.8 видно, что выход биомассы на среде из заявляемого объекта превышает выход биомассы на среде из перевара казеина и мяса по Хоттингеру. From the data of table 8 it is seen that the yield of biomass on the medium from the claimed object exceeds the yield of biomass on the medium from a digest of casein and meat according to Hottinger.

П р и м е р 7. Готовят среду по примеру 4, дополнительно вводят агар-агар из расчета 20 г/л, устанавливают pH 7,0± 0,1, разливают в матрацы по 0,5 л, стерилизуют автоклавированием при 110^оС 30 мин. Разливают в чашки Петри, засевают 24-часовой суспензией Staphylococcus aureus в концентрации 1·10² м·кл на чашку для определения показателя прорастания и морфологии колоний. Данные приведены в табл.9.PRI me R 7. Prepare the medium according to example 4, additionally introduce agar-agar at a rate of 20 g / l, set pH 7.0 ± 0.1, poured into mattresses 0.5 l, sterilized by autoclaving at 110 ^about From 30 minutes Poured into Petri dishes, seeded with a 24-hour suspension of Staphylococcus aureus at a concentration of 1 · 10 ² m · cells per Cup to determine the rate of germination and morphology of the colonies. The data are given in table.9.

Из данных табл.9 видно, что на всех средах вырастает одинаковое количество типичных колоний. From the data of Table 9 it can be seen that the same number of typical colonies grows on all media.

Claims

A method of producing a protein hydrolyzate, including enzymatic hydrolysis of a protein substrate, characterized in that the hydrolysis is carried out by pancreatin for 4 to 5 hours in a ratio of substrate pancreatin 1.0 to 0.075.