RU1630314C

RU1630314C - Culture medium for cultivating bacteria which produce protein a

Info

Publication number: RU1630314C
Authority: RU
Inventors: П.И. Горошкин; В.М. Семенов; В.В. Зайцев; К.С. Азаренок; С.В. Жаворонок; В.А. Ходос; В.М. Жавненко; В.И. Кис
Original assignee: Витебский центр научно-технического творчества молодежи
Priority date: 1989-01-24
Filing date: 1989-01-24
Publication date: 1995-10-10

Abstract

FIELD: microbiology. SUBSTANCE: fermentative acid hydrolyzate of blood of cattle and fermentative acid hydrolyzate of serum blood of cattle are used to prepare culture medium, quantities of said hydrolyzates are 69-72 and 23-24 vol respectively, content of amine nitrogen in said hydrolyzates being 500-600 and 220-280 mg respectively. After sterilization ethanol and 40 solution of glucose are added into mixture of said hydrolyzates, their quantities being 4.0-7.0 and 0.3-0.7 vol respectively. During cultivation of staphylococcus strains being producers of protein A with the help of proposed medium amount of bacterial mass increases 10-15 times. EFFECT: increases yield of desired product.

Description

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при получении микробного белка. The invention relates to microbiology and can be used to obtain microbial protein.

Цель изобретения повышение выхода целевого продукта. The purpose of the invention is to increase the yield of the target product.

Приготовление и использование среды иллюстрируется следующими примерами. The preparation and use of the medium is illustrated by the following examples.

П р и м е р 1. Приготовление компонента А* ферментативно-кислотного гидролизата форменных элементов крови крупного рогатого скота (КРС). PRI me R 1. Preparation of component A * enzymatic-acid hydrolyzate of blood cells of cattle (cattle).

(*Здесь и далее в примерах гидролизаты будут обозначены как компоненты А и Б). (* Hereinafter in the examples, hydrolysates will be designated as components A and B).

В ферментере готовят ферментационную смесь, для чего закачивают определенный объем (но не более половины объема ферментера) водопроводной воды, добавляют гидрокарбонат натрия 40-44 г/л, панкреатин 30-40 г/л или поджелудочную железу 300-400 г/л, хлороформ 15-20 мл/л и перемешивают в течение 1-2 ч. Затем закачивают в ферментер форменные элементы крови КРС в соотношении 1: 1 к объему феpментационной смеси, перемешивают в течение 1-2 ч, нагревают до 38-42^оС. Ферментацию ведут 24-48 ч при 38-42^оС и периодическом перемешивании до определенного содержания аминного азота в переваре. Затем подкисляют перевар до рН 3,0-3,5 центрированной соляной кислотой, прогревают 30-40 мин при 80-90^оС, осветляют сепарированием, нейтрализуют 20%-ным раствором NaOH до рН 7,8-8,3, добавляют 3,0 г/л Na₂HPO₄ и 2,33 г/л KH₂PO₄.A fermentation mixture is prepared in the fermenter, for which a certain volume (but not more than half of the fermenter volume) of tap water is pumped, sodium bicarbonate 40-44 g / l, pancreatin 30-40 g / l or pancreas 300-400 g / l, chloroform are added 15-20 ml / l and stirred for 1-2 hours then pumped into the fermenter RNC blood corpuscles in the ratio 1: 1. fepmentatsionnoy to the volume of the mixture was stirred for 1-2 h, heated to 38-42 ° ^C. The fermentation lead 24-48 hours at 38-42 ^about With and periodic stirring to a certain content of amine azo that in digest. The digest was then acidified to pH 3.0-3.5 centered hydrochloric acid is heated 30-40 minutes at 80-90 ^{° C,} clarified by separation, neutralized with 20% NaOH solution to a pH of 7,8-8,3, add 3 , 0 g / l Na ₂ HPO ₄ and 2.33 g / l KH ₂ PO ₄ .

Приготовление компонента Б ферментативно-кислотного гидролизата сыворотки крови КРС. Preparation of Component B of Enzymatic Acid Hydrolyzed Serum of Cattle.

В ферментере готовят ферментационную смесь, для чего в ферментер закачивают воду (не более половины его объема), добавляют гидрокарбонат натрия 40-44 г/л, панкреатин 60-80 г/л, или гомогенизированную поджелудочную железу 600-800 г/л, хлороформ 15-20 г/л и перемешивают в течение 1-2 ч. Затем закачивают в ферментер сыворотку или плазму крови КРС, осветленную сепарированием, в соотношении 1:1 к объему ферментационной смеси и нагревают до 42-45^оС. Ферментацию ведут при 42-45^оС и периодическом перемешивании в течение 2-6 суток до определенного содержания аминного азота в переваре. Подкисляют перевар до рН 3,0-3,5 концентрированной соляной кислотой, прогревают 30-40 мин при 80-90^оС, осветляют сепарированием, нейтрализуют 20%-ным раствором NaOH до рН 7,8-8,3, добавляют 3,0 г/л Na₂HPO₄ и 2,33 г/л KH₂PO₄.A fermentation mixture is prepared in the fermenter, for which water is pumped into the fermenter (not more than half of its volume), sodium bicarbonate 40-44 g / l, pancreatin 60-80 g / l, or homogenized pancreas 600-800 g / l, chloroform are added . 15-20 g / l and was stirred for 1-2 hours then pumped into the fermenter serum or plasma of cattle blood clarified by separation, a 1: 1 ratio to the volume of the fermentation mixture and heated to 42-45 ° ^C. The fermentation was carried out at 42 ^-45 ° C and stirring periodically for 2-6 days to certain content aminnog nitrogen digest. The digest was acidified to pH 3.0-3.5 with concentrated hydrochloric acid, heated 30-40 minutes at 80-90 ^{° C,} clarified by separation, neutralized with 20% NaOH solution to a pH of 7,8-8,3, was added 3, 0 g / l Na ₂ HPO ₄ and 2.33 g / l KH ₂ PO ₄ .

Компоненты А и Б осветляют сепарированием, центрифугированием или фильтрацией, разводят водопроводной водой до определенного содержания аминного азота, смешивают их в соответствующем соотношении, затем стерилизуют при 120-118^оС 45 мин, добавляют 3-7 об. этанола, 0,3-0,7 об. 40%-ного стерильного раствора глюкозы и используют для культивирования микроорганизмов.Components A and B are clarified by separation, centrifugation or filtration, diluted with tap water to a certain content of amine nitrogen, mixed in the appropriate ratio, then sterilized at 120-118 ^about C for 45 minutes, add 3-7 about. ethanol, 0.3-0.7 vol. 40% sterile glucose solution and is used for the cultivation of microorganisms.

П р и м е р 2. Приготовленные в соответствии с примером 1 компоненты А и Б после осветления и разведения смешивают в объемных соотношениях, об. 3:1, т.е. 69,0 об. компонента А и 23,0 об. компонента Б и закачивают в ферментер. Смесь охлаждают до 38-40^оС и добавляют 4,0 об. этанола и 0,3 об. 40%-ного раствора глюкозы. В ферментере с питательной средой закачивают посевной материал 10 об. суточной бульонной культуры белок А продуцирующего золотистого стафилококка, шт. Cowan-1 при концентрации микробных клеток 1 млрд/см³. Культивирование ведут при 38-40^оС, рН 6,8-8,2 в условиях аэрации и постоянного перемешивания.PRI me R 2. Prepared in accordance with example 1, components a and B after clarification and dilution are mixed in volume ratios, vol. 3: 1, i.e. 69.0 about component a and 23.0 vol. component B and pumped into the fermenter. The mixture is cooled to 38-40 ^about C and add 4.0 about. ethanol and 0.3 vol. 40% glucose solution. In a fermenter with a nutrient medium pumped seed 10 vol. daily broth culture protein A producing Staphylococcus aureus, pcs. Cowan-1 at a concentration of microbial cells of 1 billion / cm ³ . Culturing is conducted at 38-40 ^{° C,} pH 6.8-8.2 with aeration and continuous mixing.

Титр белка А, продуцированного в питательную среду, достигает не ниже 1: 512 в реакции встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ) со свиными иммуноглобулинами. The titer of protein A produced in a nutrient medium reaches at least 1: 512 in the reaction of counter immunoelectrophoresis (WIEF) with porcine immunoglobulins.

П р и м е р 3. Готовят среду в соответствии с примером 2, но компоненты берут в следующем объемном соотношении, об. Компонент А 70,5
(3:1) Компонент Б 23,5 Этанол 4,0 40%-ный раствор глюкозы 0,3
Посев материала и культивирование бактериальных клеток осуществляют, как в примере 2.PRI me R 3. Prepare the medium in accordance with example 2, but the components are taken in the following volume ratio, vol. Component A 70.5
(3: 1) Component B 23.5 Ethanol 4.0 40% glucose 0.3
Sowing material and culturing bacterial cells is carried out as in example 2.

Титр белка А достигает в реакции ВИЭФ 1:512. The titer of protein A reaches 1: 512 in the WIEF reaction.

П р и м е р 4. Приготовление питательной среды, посев бактериальных клеток и культивирование их осуществляют, как в примерах 2 и 3, только в качестве продуцента белка А используют золотистый стафилококк штамм ГИСК N А676. PRI me R 4. The preparation of a nutrient medium, the sowing of bacterial cells and their cultivation is carried out, as in examples 2 and 3, only as a producer of protein A use Staphylococcus aureus strain GISK N A676.

Накопление белка А в среде достигает в титре 1:512. The accumulation of protein A in the medium reaches a titer of 1: 512.

П р и м е р 5. Готовят среду в соответствии с примером 2, но компоненты берут в следующем объемном соотношении, об. Компонент А 72,0
(3:1) Компонент Б 24,0 Этанол 4,0 40%-ный раствор глюкозы 0,3
Посев материала и культивирование бактериальных клеток осуществляют, как в примере 2.PRI me R 5. Prepare the medium in accordance with example 2, but the components are taken in the following volume ratio, vol. Component A 72.0
(3: 1) Component B 24.0 Ethanol 4.0 40% glucose 0.3
Sowing material and culturing bacterial cells is carried out as in example 2.

Титр белка А в реакции ВИЭФ 1:512. Protein A titer in the WIEF reaction 1: 512.

Кроме выращивания белок А продуцирующих золотистых стафилококков, предлагаемая питательная среда пригодна и для культивирования ряда других бактериальных клеток, что иллюстрируется следующими примерами. In addition to growing protein A producing Staphylococcus aureus, the proposed nutrient medium is also suitable for the cultivation of a number of other bacterial cells, as illustrated by the following examples.

Среда может быть использована также для культивирования микроорганизмов. The medium can also be used for the cultivation of microorganisms.

П р и м е р 6. Для культивирования сальмонелл среду готовят в соответствии с примером 2, но компоненты берут в следующем объемном соотношении, об. Компонент А 70,5
(3:1) Компонент Б 23,5 Этанол 4,0 40%-ный раствор глюкозы 0,3
Во флакон вместимостью 500 см³, содержащий 200 см³ среды, вносят 20 см³ суточной бульонной культуры сальмонелл с концентрацией микробных клеток 1 млрд/см³. Культивируют при 37±1,0^оС, рН 6,8-8,0 в стационарных условиях.PRI me R 6. For the cultivation of salmonella medium is prepared in accordance with example 2, but the components are taken in the following volume ratio, vol. Component A 70.5
(3: 1) Component B 23.5 Ethanol 4.0 40% glucose 0.3
In a bottle with a capacity of 500 cm ³ containing 200 cm ^{3 of} medium, 20 cm ^{3 of the} daily broth culture of Salmonella with a concentration of microbial cells of 1 billion / cm ^{3 is} added. Cultivate at 37 ± 1.0 ^about With a pH of 6.8-8.0 in stationary conditions.

Через сутки культивирования концентрация микробных клеток составила 2,7 млрд/см³.After one day of cultivation, the concentration of microbial cells was 2.7 billion / cm ³ .

П р и м е р 7. Для культивирования кампилобактерий среду готовят в соответствии с примером 2, но компоненты берут в следующем объемном соотношении, об. Компонент А 70,5
(3:1) Компонент Б 23,5 Этанол 4,0 40%-ный раствор глюкозы 0,3
Посев материала и культивирование бактериальных клеток осуществляют, как в примере 6.PRI me R 7. For the cultivation of campylobacter, the medium is prepared in accordance with example 2, but the components are taken in the following volume ratio, vol. Component A 70.5
(3: 1) Component B 23.5 Ethanol 4.0 40% glucose 0.3
Sowing material and culturing bacterial cells is carried out as in example 6.

Через сутки культивирования концентрация микробных клеток составляет 0,8 млрд/см³.After a day of cultivation, the concentration of microbial cells is 0.8 billion / cm ³ .

Приведенные примеры показывают, что предлагаемая питательная среда при определенных соотношениях компонентов А и Б пригодна для культивирования бактериальных клеток. В качестве контрольной среды для сравнительных испытаний, проводившихся одновременно, используют питательную среду на основе перевара Хоттингера. The above examples show that the proposed nutrient medium at certain ratios of components A and B is suitable for the cultivation of bacterial cells. As a control medium for comparative tests conducted simultaneously, a nutrient medium based on the Hottinger reagent is used.

Установлено, что накопление бакмассы стафилококка на предлагаемой питательной среде выше в 10-15 раз по сравнению с контрольной. Титр белка А в контрольной среде определяется не выше 1:16, на известной среде 1:32, а на предлагаемой 1:512. It has been established that staphylococcus bacterial accumulation on the proposed nutrient medium is 10–15 times higher than the control. The titer of protein A in the control medium is determined not higher than 1:16, on the known medium 1:32, and on the proposed 1: 512.

Накопление биомассы сальмонелл на предлагаемой среде в 1,5-2 раза выше, кампилобактерии накапливаются в 10-20 раз выше, чем на известной среде. The accumulation of Salmonella biomass on the proposed medium is 1.5-2 times higher, campylobacter accumulate 10-20 times higher than on the known medium.

Claims

NUTRIENT ENVIRONMENT FOR GROWING PROTEINS AND PRODUCING BACTERIA, containing a nutrient base, glucose and a growth stimulator, characterized in that, in order to increase the yield of the target product, it contains an enzymatic acid hydrolyzate of blood cells of cattle containing amine nitrogen as a nutrient base 500 600 mg% and enzymatic acid hydrolyzate of cattle blood serum with the content of amine nitrogen 220 280 mg% as a growth promoter it contains ethanol and glucose in the form of 40 % solution in the following quantitative ratio of components, vol. enzymatic acid hydrolyzate of blood cells of cattle with an amine nitrogen content of 500 600 mg% 69.0 72.0; enzymatic acid hydrolyzate of cattle blood serum with amine nitrogen content 220 280 mg% 23.0 24.0; 40% glucose solution 0.3 0.7; ethanol 4.0 7.0.