RU2056859C1

RU2056859C1 - Рекомбинантный igg-связывающий g-белок стрептококка группы g

Info

Publication number: RU2056859C1
Application number: RU93054302A
Authority: RU
Inventors: Татьяна Витальевна Гупалова; Артем Акопович Тотолян
Original assignee: Татьяна Витальевна Гупалова; Артем Акопович Тотолян
Priority date: 1993-12-14
Filing date: 1993-12-14
Publication date: 1996-03-27

Abstract

Использование: медицина, медицинская биотехнология, для очистки иммуноглобулинов, медицинская диагностика. Сущность изобретения: получают иммуноглобулин G, связывающий G-белок путем клонирования гена G-белка из стрептококка G148 в E.coli, выделения белка из клеток E.coli и очистки белка посредством аффинной хроматографии с последующим отделением гомогенного белка, характеризующегося большим выходом и высокими константами связывания. Преимуществом изобретения является большой выход G белка, гомогенность целевого продукта, его высокая аффиность и в связи с этим перспектива более успешного применения G белка в иммунологии, иммунохимии и медицинской диагностике. 8 ил., 2 табл.

Description

Изобретение относится к медицине и медицинской биотехнологии. Белок G-IgG-Fc рецептор (неиммунносвязывающий рецептор иммуноглобулина G) III типа из человеческого группы G стрептококка. G белок обладает способностью связывать Fc часть иммуноглобулинов большинства видов млекопитающих. В отличие от хорошо изученного IgG-Fc рецептора I типа, стафилококкового белка А белок G связывает все подклассы иммуноглобулинов человека (белок А не связывает третий подкласс человеческого IgG), а также имеет более широкий спектр связывания IgG различных млекопитающих.

Благодаря своей способности связывать Fc фрагмент IgG G белок может быть использован в иммунологических исследования. G белок применяется в ELISA диагностических тест-системах для создания наборов для идентификации инфекционных заболеваний, выявления антигенов возбудителей и антител к ним.

G белок может быть эффективным лигандом для аффинной хроматографии и использоваться для синтеза аффинных сорбентов для HPLC (жидкостной хроматографии под высоким давлением).

G белок может быть выделен из стрептококка энзиматическим расщеплением папаином (нативный белок) либо получен генноинженерным путем (рекомбинантный белок).

Выделение G белка из стрептококка энзиматическим путем характеризуется низким выходом, гетерогенностью получаемого продукта и трудоемкостью технологического процесса, связанного с использованием патогенного микроба. Ввиду этого предпочтительным является получение рекомбинатного белка.

Известен рекомбинатный белок G, получаемый рядом лабораторий путем клонирования гена G белка в непатогенном хозяине. Описанные ранее препараты G белка были либо гетерогенны, либо при получении белка в высокоочищенном состоянии выход его был довольно низкий.

Наиболее близким к предложенному является G белок, описанный Гуссом (1), который сконструировал банк генов стрептококка G148 в фаговом EMBL 3а лямбда векторе. Был изолирован положительный фаговый клон SPG, дающий экспрессию IgG связывающей активности. При дальнейшем клонировании с целью получения ДНК меньшего размера с экспрессией функционального G белка был проклонирован фрагмент G белка в векторе pUC18. Из субклона, продуцирующего IgG связывающий белок, был выделен G белок, очищен аффинной хроматографией и исследован электрофоретически в SDS-PAGE. В SDS-полиакриламидном геле было получения два бенда белка с молекулярным весом 32 и 38 kD. Описанный автором G белок оказался гетерогенным, и выход его был низок.

Причиной гетерогенности полученного Гуссом препарата G белка явилось наличие двух внутренних дополнительных промоторов в структурной части гена G белка. Выход G белка был низкий, так как экспрессия G белка обеспечивалась функцией двух внутренних дополнительных промоторов, которые обычно не функционируют в условиях нормального развития стрептококка.

Константа связывания рекомбинантного G белка с человеческим JgG не приводится и исследования способности препарата G белка связываются с иммуноглобулинами G человека, относящихся к разным подклассам, не представлены, что не позволяет составить полную иммунохимическую характеристику полученного G белка.

Целью изобретения является получение гомогенного продукта IgG связывающего G белка, характеризующегося высокими константами связывания с человеческим IgG.

Цель достигается увеличением выхода целевого продукта. Экспрессия G белка значительно выше, так как продукция обеспечивается функцией мощного промотора из лактозного оперона E.coli. Полученный продукт гомогенен, так как транскрипция идет с промотора E.coli.

Сущностью изобретения является получение IgG связывающего G белка путем клонирования гена G белка и, стрептококка 6148 в E.coli, выделением белка из клеток E.coli путем их разрушения в ультразвуковом дезинтеграторе и очисткой G белка посредством аффинной хроматографии.

П р и м е р 1. Клонирование G белка.

Был сконструирован банк генов стрептококка G148 в фаговом EMBL 3а лямбде векторе. Из 50000 рекомбинатных фаговых клонов был отобран клон, дающий наибольшую экспрессию IgG связывающей активности G белка. Для нахождения минимального фрагмента ДНК, содержащего ген G белка, проводили субклонирование в E.coli JM109. 1,5 kb EcoRI/HindIII фрагмент был клонирован в pUC8.

Из клона, дающего наибольшую экспрессию, была выделена рекомбинантная плазмида р3G. Многие стрептококковые штаммы, экспрессирующие G белок, также связывают и человеческий сыворотный альбумин. Полученный клон, экспрессирующий G белок, обладал как IgG-, так и альбуминсвязывающей активностью. Для получения только IgG связывающего G белка необходимо было проклонировать фрагмент гена G белка, кодирующего синтез конкретного рецепторного участка. В подходе, использованном Гуссом, рамка считывания лактозного оперона, в котором не осуществлялось клонирование гена G белка, была нарушена. Для сохранения данной рамки считывания клонирование осуществлялось в векторе pUC8 в область сайта рестриктазы HindIII, после чего ДНК обрабатывалась ферментом Кленова. Фрагмент гена G белка рестрицировали рестриктазами Sau3A и HindIII, после чего он также обрабатывался ферментом Кленова. Легирование происходило в данном случае по тупым концам. При этом сохранилась нормальная рамка считывания лактозного оперона и структурная часть гена G белка транскрибировалась без нарушения рамки считывания; образовывался рекомбинатный продукт, обладающий IgG связывающими свойствами G белка с высоким уровнем экспрессии. Альбуминсвязывающей активности обнаружено при этом не было. Отобранный в данном случае рекомбинантный клон содержал плазмиду p7G.

Таким образом по существу был получен активный штамм-продуцент, который может быть назван E.coli JM109.7G.

П р и м е р 2. Выделение G белка.

Культура E. coli JM109.7G выращивалась ночь в LB среде с ампициллином (100 мкг/мл) при сильном шуттелировании, затем клетки осаждали центрифугированием при 5000 g, отмывали, суспендировали в PBS буфере с добавлением 0,003 М фенилметил (сульфонил флюорида и разрушали ультразвуком. После центрифугирования при 20000 g в течение одного часа надосадок, содержащий препарат G белка, пропускали через 0,45 мм фильтр.

П р и м е р 3. Аффинная хроматография.

Фильтрат наносили на колонку, заполненную цианбромированной IgG сефарозой 4В, предварительно уравновешенную PBS буфером, рН 7,0 с 0,02% азидом натрия. Несвязавшийся белок удаляли промыванием колонки тем же буфером. IgG связывающий белок элюировали 0,1 М глициновым буфером, рН 2,0 в виде одного пика. Значение рН в элюате немедленно доводили до 7,0 0,5 М раствором трис-HCl, рН 8,8. Белок G диализовали и лиофилизировали. Выход целевого продукта IgG связывающего G белка до 40 мг с одного литра культуры.

П р и м е р 4. Иммунохимические характеристики препарата рекомбинатного IgG связывающего G белка.

Препарат G белка был исследован на способность связываться с иммуноглобулинами G человека, относящимися к разным подклассам, и с альбумином человека. Для проверки способности препаратов белка G связываться с IgG человека использовали два варианта твердофазного иммуноферментного анализа прямой и двуслойный (сэндвич) методы. В первом из них испытуемые препараты были иммобилизованы на твердой фазе. При этом оценивали количество связавшихся с ними меченых пароксидазой иммуноглобулинов. Во втором методе на твердой фазе адсорбировали препараты немеченых иммуноглобулинов, к ним из раствора присоединялись молекулы белка А или белка G, которые в свою очередь связывали из раствора меченые пероксидазой иммуноглобулины. Во всех экспериментах использовали не менее четырех параллельных рядов титрирования. Результаты представлены в виде усредненных кривых титрования на графиках.

На фиг.1-6 приведены графики результатов исследования способности препарата IgG связывающего G белка связывать различные подклассы IgG человека. В качестве контроля эффективности связывания использовали стафилококковый белок А, так как данных по способности связываться с человеческими иммуноглобулинами белка G, описываемого Гуссом (1), не представлено.

Фиг. 1 и 2 демонстрируют способность G белка и белка А, иммобилизованных на твердой фазе, связывать различные концентрации IgGI. Сравнение кривых титрования позволяет заключить, что IgG связывающий G белок связывает IgGI более эффективно, чем А белок. Фиг.3 и 4 иллюстрируют способность белка G связывать миеломные IgG2 и IgG4. Сопоставление кривых титрования показывает, что эффективность связывания иммуноглобулинов IgG2 и IGG4 белком G выше, чем белком А.

Фиг.5 и 6 отражают связывающую способность белка А и белка G в отношении IgG3. Белок G эффективно связывает IgG3, вт о время как белок А с ним не взаимодействует.

Фиг. 7 показывает связывающую способность белка G, находящегося в свободном (не иммобилизованном) состоянии, с пулом всех подклассов IgG человека.

На фиг.8 приведен график результатов сравнения связывания белка G и белка А с сывороточным альбумином человека. Ни белок G, ни белок А с альбумином не реагируют.

Определение равновесных констант связывания G белка с человеческими иммуноглобулинами проводилось методом насыщения. Константы равновесия реакций приведены в табл.1.

Так как для рекомбинантного IgG связывающего G белка ранее не рассчитано констант связывания другими авторами, в частности Гуссом, то их можно сравнить с константами связывания с IgG человека, полученными для нативного G белка, выделенного из стрептококка энзиматическим путем. Они практически не отличаются от полученных. Константы связывания белка А оказались в 5-8 раз ниже.

В табл.2 представлены данные определения взаимодействия препаратов белка А и белка G с моноклональными легкими цепями, IgA и IgM человека. Пpи высоких концентрациях иммуноглобулинов или легких цепей наблюдали слабое взаимодействие с исследуемым препаратом, что может быть объяснено присутствием примесей альбумина или IgG. В целом полученные данные свидетельствуют об отсутствии взаимодействия G белка, а также белка А со свободными легкими цепями и иммуноглобулинами классов А и М.

П р и м е р 5. Определение молекулярного веса IgG связывающего G белка методом SDS-PAGE.

Препарат G белка анализировали в SDS-PAGE по методу Laemmli. Молекулярный вес полученного IgG связывающего G белка Мв=38 kD. В качестве стандартов молекулярного веса использовали: фосфорилазу b, Мв=94000; бычий сывороточный альбумин, Мв 67000; овальбумин, Мв 30000; трипсиновый ингибитор, Мв 20000 и яичный лизоцим, Мв 14400.

П р и м е р 6. Стабильность препарата G белка.

Белок G хорошо растворим в воде и водных растворах, может быть легко лиофилизирован, несколько раз заморожен, обладает стабильностью при хранении в растворах при 10^оС. Препарат IgG связывающего G белка может быть легко помечен пароксидазой, щелочной фосфатазой и радиоактивным йодом, что позволяет использовать его в иммунологических тест-системах.

П р и м е р 7. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности.

Определена нуклеотидная последовательность структурной части гена G белка по методу Sanger et al (см. табл. 3) и выделена из нее аминокислотная последовательность (см. табл. 4).

Обозначение аминокислот Phe: F Leu: L Ile: I Met: M Val: V Ser: S Pro: P Thr: T Ala: A Tyr: Y His: H Gln: Q Asn: N Lys: K Asp: D Glu: E Cys: C Trp: W Arg: R Gly: G
П р и м е р 8. Аминокислотный состав. Неполярные Количество Процент А 34 14,592 V 18 7,725 L 11 4,721 Р 14 6,009 М 2 0,858 F 6 2,575 W 2 0,858 Полярные Количество Процент G 13 5,579 S 5 2,146 T 35 15,021 C 0 0,000 Y 6 2,575 N 7 3,004 Q 2 0,858 Кислые Количество Процент D 20 8,584 Е 22 9,442 Основные Количество Процент K 28 12,017 R 1 0,429 H 0 0,000
Общее количество аминокислот 232.

П р и м е р 9. Определение изоэлектрической точки (рI).

Изоэлектрическая точка определена методом изоэлектрофокусирования. Белок G фокусировался на Phast gel JEF со следующими стандартами: оксидаза глюкозы, рI 4,15, трипсиновый ингибитор pI 4,55, бета-лактоглобулин pI 5,2, бычья карбоник ангидраза В, pI 5,85, человеческая карбоник ангидраза, рI 6,55. pI IgG связывающего G белка 5,4.

Предлагаемый IgG связывающий G белок имеет целый ряд существенных преимуществ: большой выход G белка (до 40 мг с 1 л культуры). Для описанных в литературе препаратов G белка такого высокого выхода ранее не приводилось. Это позволяет значительно снизить стоимость целевого продукта, обеспечить его доступность на внутреннем рынке, а также сохранить высокую конкурентоспособность на мировом рынке.

Гомогенность полученного G белка обеспечивает его высокую специфичность и позволит применять в медицинской диагностике инфекционных заболеваний.

Высокая аффинность G белка позволяет связывать его с сорбентами, используемыми в аффинной хроматографии для очистки иммуноглобулинов человека и многих других млекопитающих.

Получаемый G белок по существу является представителем нового поколения бактериальных Fc рецепторов для иммуноглобулинов, который позволит устранить ограничения при применении А белка.

В связи с изложенным G белок имеет перспективу более широкого применения в прикладной иммунологии, иммунохимии, иммуногистологии, в медицинской диагностике, а также в производственных целях.

Claims

1. РЕКОМБИНАНТНЫЙ IGG-СВЯЗЫВАЮЩИЙ G-БЕЛОК СТРЕПТОКОККА ГРУППЫ G, полученный клонированием гена G-белка из стрептококка G148 в непатогенном штамме E.coli JM109, трансформированном рекомбинантной плазмидой p7G, имеющей следующую нуклеотидную последовательность структурной части гена G-белка:
1 GATCGATGCG-TCTGAATTAA CACCAGCCGT GACAACTTAC AAACTTGTTA
51 TTAATGGTAA AACATTGAAA GGCGAAACAA CTACTGAAGC TGTTGATGCT
101 GCTACTGCAG AAAAAGTCTT CAAACAATAC GCTAACGACA ACGGTGTTGA
151 CGGTGAATGG ACTTACGACG ATGCGACTAA GACCTTTACA GTTACTGAAA
201 AACCAGAAGT GATCGATGCG TCTGAATTAA CACCAGCCGT GACAACTTAC
251 AAACTTGTTA TTAATGGTAA AACATTGAAA GGCGAAACAA CTACTAAAGC
301 AGTAGACGCA GAAACTGCFG AAAAAGCCTT CAAACAATAC GCTAACGACA
351 ACGGTGTTGA TGGTGTTTGG ACTTATGATG ATGCGACTAA GACCTTTACG
401 GTAACTGAAA TGGTTACAGA GGTTCCTGGT GATGCACCAA CTGAACCAGA
451 AAAACCAGAA GCAAGTATCC CTCTTGTTCC GTTAACTCCT GCAACTCCAA
501 TTGCTAAAGA TGACGCTAAG AAAGACGATA CTAAGAAAGA AGATGCTAAA
551 AAACCAGAAG CTAAGAAAGA AGACGCTAAG AAAGCTGAAA CTCTTCCTAC
601 AACTGGTGAA GGAAGCAACC CATTCTTCAC AGCAGCTGCG CTTGCAGTAA
651 TGGCTGGTGC GGGTGCTTTG GCGGTCGCTT CAAAACGTAA AGAAGACTAA
при этом белок характеризуется следующей аминокислотной последовательностью:
1 IDASELTRAV TTYKLVINGK TLKGETTTEA VVAATAEKVF KQYAMDNGVD
51 GEWTYDDATK TFTVTEKPEV IDASELTPAV TTYKLVINGK TLKGETTTKA
101 VDAETAEKAF KQYANDNJVD GVWTYDDATK TFTVTEMVTE VPGDAPTEPE
151 KPEASIPLVP LTPATPIAKD DAKKDDTKKE DAKKPEAKKE DAKKAETLPT
201 TGEGSNPFFT AAALAVMAGA GALAVASKRK ED
и мол.м. 38 kD, определенной в SDS-PAGE.

2. IgG-связывающий G-белок по п.1, характеризующийся константами связывания с пулом IgG человека - 44,4 • 10⁹ м^- ¹, с IgG 1 - 33,4 • 10⁹ м^- ¹, с IgG 3 - 56,7 • 10⁹ м^- ¹.

2. IgG-связывающий G-белок по пп.1 и 2, характеризующийся тем, что 1 мг G-белка связывает 5 мг человеческого IgG в растворе.

4. IgG-связывающий G-белок по пп.1 - 3, характеризующийся изоэлектрической точкой pI 5,4.