RU2054485C1

RU2054485C1 - Method of uroporphyrin preparing

Info

Publication number: RU2054485C1
Application number: RU92009671A
Authority: RU
Inventors: В.Я. Быховский; З.И. Зайцева; В.П. Радина; В.Д. Румянцева; А.Ф. Миронов; М.А. Малков; О.Г. Полатовская; Г.В. Барабанщикова
Original assignee: Институт биохимии им.А.Н.Баха РАН
Priority date: 1992-12-04
Filing date: 1992-12-04
Publication date: 1996-02-20

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: uroporphyrin is prepared by enzymatic transformation of 5-aminolevulinic acid which is carried out by the preparation from biomass of Arthrobacter globiformis BKM-658 obtained by cell treatment with acetone cooled to the temperature below -20 C (acetone powder). EFFECT: improved method of uroporphyrin preparing. 2 dwg, 1 tbl

Description

Изобретение относится к методам получения порфиринов путем микробиологического синтеза. Оно может быть использовано в медицине, где порфирины можно использовать как стандарты при анализе эндогенных порфиринов, в качестве люминесцентной метки при проведении иммуноанализа; в пищевой промышленности как красители; в других отраслях промышленности в качестве катализаторов окислительно-восстановительных реакций, каталитической реакции передачи цепи при радикальной полимеризации и аналитических реагентов при обнаружении ионов тяжелых металлов. The invention relates to methods for producing porphyrins by microbiological synthesis. It can be used in medicine, where porphyrins can be used as standards in the analysis of endogenous porphyrins, as a luminescent label for immunoassay; in the food industry as dyes; in other industries as catalysts for redox reactions, a catalytic chain transfer reaction in radical polymerization, and analytical reagents in the detection of heavy metal ions.

Известны способы получения смеси порфиринов, содержащей уропорфирин и копропорфирин, путем культивирования бактерий рода Arthrobacter hyalinus Arthrobacter pascens. Дальнейшее разделение порфиринов проводится высаживанием их из культуральной жидкости при различных значениях рН. Копропорфирин III выпадает в осадок в интервале рН 4-6, а уропорфирин III высаживают при рН 1-4. Эти методы не дают высокой степени очистки обоих порфиринов. Known methods for producing a mixture of porphyrins containing uroporphyrin and coproporphyrin by culturing bacteria of the genus Arthrobacter hyalinus Arthrobacter pascens. Further separation of the porphyrins is carried out by planting them from the culture fluid at various pH values. Coproporphyrin III precipitates in the range of pH 4-6, and uroporphyrin III is precipitated at pH 1-4. These methods do not give a high degree of purification of both porphyrins.

Согласно другому способу те же культуры в присутствии L-цистеина продуцируют уропорфирин III, время инкубации составляет от 2 до 30 дней. Недостатками этих способов являются длительный срок инкубирования, сопряженный с возможностью заражения культуры посторонней микрофлорой, а также образование смеси порфиринов, содержащей от 4 до 8 свободных карбоксильных групп, разделение которой потребовало создания специального полимерного носителя. According to another method, the same cultures in the presence of L-cysteine produce uroporphyrin III, the incubation time is from 2 to 30 days. The disadvantages of these methods are the long incubation period associated with the possibility of infection of the culture with extraneous microflora, as well as the formation of a mixture of porphyrins containing from 4 to 8 free carboxyl groups, the separation of which required the creation of a special polymer carrier.

Наиболее близким решением, выбранным за прототип, является способ получения уропорфирина, основанный на энзиматической трансформации 5-аминолевулиновой кислоты, осуществляемой препаратом, полученным путем обработки биомассы трехсуточной культуры Propionibacterium shermanii M-82 ацетоном, охлажденным до -20^оС. Содержание уропорфирина составило 20 мг/л в расчете на 5-АЛК. Соотношение изомеров уропорфирина I и III, определенное с помощью ВЭЖХ, составило 4:1.The closest solution chosen as the prototype, a method for producing uroporphyrin based on the enzymatic transformation of the 5-aminolevulinic acid carried preparation obtained by treating the biomass three-day culture of Propionibacterium shermanii M-82 with acetone, cooled to -20 ° ^C. The content was 20 mg uroporphyrin / l per 5-ALA. The ratio of isomers of uroporphyrin I and III, determined using HPLC, was 4: 1.

Недостатком этого метода является низкое содержание уропорфирина в культуральной жидкости, что затрудняет его выделение прямым осаждением и требует применения ионообменных смол, талька и других материалов. The disadvantage of this method is the low content of uroporphyrin in the culture fluid, which makes it difficult to isolate it by direct deposition and requires the use of ion-exchange resins, talc and other materials.

Целью изобретения является повышение содержания уропорфирина в культуральной жидкости, создание устойчивого ферментного препарата, подлежащего длительному хранению (до 3 месяцев) для использования его по мере надобности. The aim of the invention is to increase the content of uroporphyrin in the culture fluid, the creation of a stable enzyme preparation, subject to long-term storage (up to 3 months) for use as needed.

Предлагаемый способ заключается в том, что ферментативную трансформацию 5-аминолевулиновой кислоты (5-АЛК) осуществляют сухим препаратом биомассы культуры Arthrobacter globiformis BKM-658 (известный коллекционный штамм, применяется как продуцент копропорфирина, авт. св. СССР N 1482946), приготовленным путем обработки клеток этой культуры ацетоном, охлажденным до -20^оС и ниже. Саму культуру выращивают в течение 6 сут при 28^оС на среде, содержащей кукурузный экстракт или пептон. По окончании выращивания культуры клетки отделяют, промывают, центрифугируют. Отмытые клетки обрабатывают ацетоном, охлажденным до (-20)- (-25)^оС и ниже. Осадок ("ацетоновый порошок") отфильтровывают, сушат, хранят при -5^оС. Ферментный препарат с 5-АЛК инкубирую в фосфатном буфере в течение 48 ч. При этом происходит трансформация 5-АЛК (I) в уропорфирин (II),

_III
содержание которого в культуральной жидкости составляет 200-220 мг/л. Способ позволяет получать уропорфирин, свободный от других карбоксилсодержащих порфиринов с достаточно высоким выходом, сокращает время инкубирования и расход сырья. Синтезируемый продукт состоит из смеси изомеров стадии I и III. С помощью метода ВЭЖХ установлено, что соотношение изомеров I и III уропорфирина составляет 4: 1. Наличие в смеси только уропорфирина и отсутствие копропорфирина показано с помощью физико-химических методов.The proposed method consists in the fact that the enzymatic transformation of 5-aminolevulinic acid (5-ALA) is carried out with a dry biomass preparation of Arthrobacter globiformis BKM-658 culture (a known collection strain used as coproporphyrin producer, ed. St. USSR N 1482946), prepared by processing cells of the culture with acetone, cooled to ^-20 ° C and below. Culture itself is grown for 6 days at ²⁸ ° C on a medium containing corn steep liquor or peptone. At the end of the culture, the cells are separated, washed, centrifuged. The washed cells were treated with acetone, cooled to (-20) - (-25) ^{° C} or lower. The precipitate ( "acetone powder") was filtered, dried and stored at -5 ° ^C. The enzyme preparation of 5-ALA are incubated in phosphate buffer for 48 hours. Thus there is a transformation of 5-ALA (I) in uroporphyrin (II),

_III
the content of which in the culture fluid is 200-220 mg / l. The method allows to obtain uroporphyrin, free of other carboxyl-containing porphyrins with a sufficiently high yield, reduces the incubation time and consumption of raw materials. The synthesized product consists of a mixture of isomers of stage I and III. Using the HPLC method, it was found that the ratio of the isomers I and III of uroporphyrin is 4: 1. The presence of only uroporphyrin in the mixture and the absence of coproporphyrin were shown using physicochemical methods.

Последовательность операций осуществления данного способа изложена в примере. The sequence of operations for the implementation of this method is described in the example.

П р и м е р 1. Культуру Arthrobacter globiformis BKM-658 выращивают в течение 6 сут при 28^оС на среде следующего состава, глюкоза 1% кукурузный экстракт 6% аммоний сернокислый 0,1% Выращивание проводят в колбах Эрленмейера на 750 мл, заполненных 100 мл опытной среды, на качалках со скоростью встряхивания 180 об/мин. рН среды 7,2-7,4. Всего в опыте было 10 колб с общим объемом среды 1,0 л. Через 3 сут. выращивания проводят корректировку рН среды до 7,2-7,4 с помощью 10%-ного раствора бикарбоната натрия. Одновременно вносят 1,0% глюкозы. Эта процедура повторяется ежедневно до окончания культивирования.EXAMPLE EXAMPLE 1 The culture Arthrobacter globiformis BKM-658 were grown for 6 days at ²⁸ ° C on a medium of the following composition 1% glucose 6% corn steep liquor, ammonium sulfate 0.1% Cultivation is performed in Erlenmeyer flasks of 750 ml, filled with 100 ml of experimental medium on a rocking chair with a shaking speed of 180 rpm The pH of the medium is 7.2-7.4. In total, in the experiment there were 10 flasks with a total volume of medium of 1.0 l. After 3 days. cultivation adjust the pH of the medium to 7.2-7.4 using a 10% solution of sodium bicarbonate. At the same time contribute 1.0% glucose. This procedure is repeated daily until cultivation is complete.

По окончании выращивания культура из 10 колб объединяется в одной емкости и клетки отделяют на центрифуге с охлаждением (4^оС) при 5000 об/мин в течение 15 мин. Отделенные клетки промывают 3-4 раза по 500 мл 0,05 М калий-натрий-фосфатным буфером (рН 7,2-7,4), содержащим хлорамфеникол в количестве 20 мг/100 мл буфера. Отмывание проводят до полного отсутствия флуоресценции в ультрафиолетовом свете порфиринов, представленных в основном копропорфирином III, в промывных водах. Центрифугирование во всех случаях проводят на центрифуге с охлаждением (4^оС).At the end of the growing culture of 10 flasks were combined in one vessel and the cells were separated by centrifugation with cooling (4 ° ^C) at 5000 rev / min for 15 min. The separated cells are washed 3-4 times with 500 ml of 0.05 M potassium sodium phosphate buffer (pH 7.2-7.4) containing chloramphenicol in an amount of 20 mg / 100 ml of buffer. Washing is carried out to the complete absence of fluorescence in ultraviolet light of porphyrins, represented mainly by coproporphyrin III, in the washings. Centrifugation in all cases is carried out in a centrifuge with cooling (4 ^° C).

Отмытые клетки суспендируют в 150 мл вышеупомянутого фосфатного буфера (консистенция густой сметаны) и при помешивании вливают в стакан с 2,0 л ацетона, предварительно охлажденного в камере с сухим льдом до -25^оС. Полученный осадок после 30-минутного выдерживания при -25^оС и помешивании отделяют на воронке Бюхнера и тщательно отмывают охлажденным до -25^оС ацетоном до отсутствия флуоресценции порфиринов в фильтрате.The washed cells were suspended in 150 ml of the above phosphate buffer (consistency of thick cream) and poured while stirring into a beaker with 2.0 liters of acetone, pre-cooled in a chamber with dry ice to -25 ^C. The precipitate obtained after 30 minutes incubation at -25 ^о С and stirring are separated on a Buchner funnel and thoroughly washed with acetone cooled to -25 ^о С until there is no fluorescence of porphyrins in the filtrate.

Препарат переносят с воронки Бюхнера на чашку Петри и высушивают в эксикаторе, заполненном безводным хлористым кальцием и парафином, при 4^оС.The drug is transferred from a Buchner funnel to a Petri dish and dried in a desiccator filled with anhydrous calcium chloride and paraffin, at 4 ^about C.

В результате из 1,0 л растущей культуры Arthrоbacter globiformis было получено 60 г сырой биомассы, а из последней 7,0 г конечного сухого препарата ("ацетонового" порошка). As a result, from 1.0 l of the growing Arthrobacter globiformis culture, 60 g of crude biomass were obtained, and from the last 7.0 g of the final dry preparation (“acetone” powder).

1,0 г ацетонового порошка растирают в фарфоровой ступке в 250 мл КNa-фосфатного буфера (рН 7,4), содержащего 20 мг/100 мл хлорамфеникола и 60 мг/100 мл восстановленного глутатиона. 1.0 g of acetone powder is ground in a porcelain mortar in 250 ml of KNa-phosphate buffer (pH 7.4) containing 20 mg / 100 ml of chloramphenicol and 60 mg / 100 ml of reduced glutathione.

После 30 мин прединкубации вышеупомянутой смеси при 37^оС в нее вносят 5-АЛК в количестве 30 мг/100 мл и продолжают инкубацию в течение 48 ч при 37^оС.After 30 min preincubation the above mixture at ³⁷ ° C in it is made of 5-ALA in an amount of 30 mg / 100 ml and the incubation was continued for 48 hours at 37 ° ^C.

По окончании инкубации добавляют к смеси раствор трихлоруксусной кислоты до конечной концентрации 5% Смесь выдерживают на холоду (4^оС) в течение 1 ч и центрифугируют при 5000 об/мин в течение 15 мин. Осадок отделяют и в супернатанте определяют содержание порфиринов. В данном примере 50 мг в 250 мл супернатанта. Последний разбавляют в 3 раза дистиллированной водой.After incubation the mixture was added to a solution of trichloroacetic acid to a final concentration of 5% mixture is kept in the cold (4 ° ^C) for 1 hour and centrifuged at 5000 rev / min for 15 min. The precipitate was separated and the content of porphyrins was determined in the supernatant. In this example, 50 mg in 250 ml of supernatant. The latter is diluted 3 times with distilled water.

К 750 мл водного раствора порфирина добавляют 40%-ный раствор едкого натра до рН 3,0. Оставляют на сутки при (4^оС), выпавший осадок отфильтровывают, промывают водой с рН 3,0 и сушат в эксикаторе над серной кислотой. Полноту высаживания уропорфирина из культуральной жидкости проверяют спектрофотометрически по полосе Соре. Высушенный уропорфирин этерифицируют смесью метанол серная кислота (95:5, v/v) в течение 1 сут. Реакционную массу разбавляют водой, октаметиловый эфир уропорфирина экстрагируют хлороформом и очищают хроматографией на окиси алюминия III степени активности (проявитель хлороформ). После упаривания растворителя вещество перекристаллизовывают из смеси хлороформ метанол (1:5, v/v). Вес 39 мг (что соответствует содержанию в исходном растворе 280 мг/л): т.пл. 300-302^оС. Т.пл. ОМЭ уропорфирина III 265^oC, т. пл. ОМЭ уропорфирина I 302^oC. Электронный спектр, λ_макс. (ε х 10^-3), нм: 404 (217), 500 (15,74), 534 (9,45), 570 (6,87), 625 (4,17). Масс-спектр, м.в._рассч. 943,0; м.в._найд. 942,2. Найдено, C 61,00; H 5,78; N 5,87. C₄₈H₅₄N₄O₁₆. Вычислено, C 61,14; H 5,77; N 5,94.To 750 ml of an aqueous solution of porphyrin add 40% sodium hydroxide solution to a pH of 3.0. Allow to stand for overnight at (4 ° ^C), the precipitate was filtered off, washed with water to pH 3.0 and dried in a desiccator over sulfuric acid. The completeness of planting of uroporphyrin from the culture fluid is checked spectrophotometrically in the Soret band. Dried uroporphyrin is esterified with methanol sulfuric acid (95: 5, v / v) for 1 day. The reaction mass is diluted with water, uroporphyrin octamethyl ether is extracted with chloroform and purified by chromatography on alumina of the III degree of activity (developer chloroform). After evaporation of the solvent, the substance is recrystallized from a mixture of chloroform methanol (1: 5, v / v). Weight 39 mg (which corresponds to the content in the initial solution of 280 mg / l): so pl. 300-302 ^about S.T. OME uroporphyrin III 265 ^o C, so pl. OME of uroporphyrin I 302 ^o C. Electronic spectrum, λ _max. (ε x 10 ^-3 ), nm: 404 (217), 500 (15.74), 534 (9.45), 570 (6.87), 625 (4.17). Mass spectrum, m.v. _calculation 943.0; m.v. _found 942.2. Found C 61.00; H 5.78; N, 5.87. C ₄₈ H ₅₄ N ₄ O ₁₆ . Calculated, C 61.14; H 5.77; N, 5.94.

ТСХ на пластинках "Алуфол" в системе хлороформ гексан (4:1) R_f 0,65. На пластинках "Силуфол" в системе хлороформ метанол (9,5:0,5) R_f 0,4.TLC on Alufol plates in a chloroform hexane (4: 1) system R _f 0.65. On Silufol plates in the chloroform methanol system (9.5: 0.5) R _f 0.4.

Для установления изомерного состава ОМЭ уропорфирина его омыляют 25%-ной соляной кислотой. Идентификацию проводят с кислотами уропорфирина I и уропорфирина III фирмы Sigma и образцом, полученным из пера турако на пластинках "HPTLC Kieselgel 60F 254" в системе хлороформ метанол вода (65:25:4) и на пластинках с целлюлозой в системе 2,6-лутидин вода (5:3,5), насыщ. парами NH₃. Оказалось, что уропорфирин, полученный микробиологическим путем, является смесью изомеров уропорфирина. Окончательная идентификация изомерного состава уропорфирина подтверждена с помощью ВЭЖХ на микроколоночном хроматографе НР 1090М (Hewlett Packard) в условиях разделения. Колонка ODS Hypersil, 5 мкм, 2,1 х 100 мм. Скорость потока 0,25 мл/мин. Элюент: A 1 M ацетат аммония, рН 5,18; Б метанол.To establish the isomeric composition of the OME of uroporphyrin, it is saponified with 25% hydrochloric acid. The identification is carried out with the acids of urophorphyrin I and urophorphyrin III from Sigma and a sample obtained from turraco peroxide on HPTLC Kieselgel 60F 254 plates in a chloroform methanol-water system (65: 25: 4) and on plates with cellulose in a 2,6-lutidine system water (5: 3.5), sat. in pairs of NH ₃ . It turned out that urophorphyrin obtained by the microbiological method is a mixture of isomers of urophorphyrin. The final identification of the isomeric composition of uroporphyrin was confirmed by HPLC on an HP 1090M microcolumn chromatograph (Hewlett Packard) under separation conditions. ODS Hypersil Column, 5 μm, 2.1 x 100 mm. Flow rate 0.25 ml / min. Eluent: A 1 M ammonium acetate, pH 5.18; B methanol.

На фиг.1 и 2 приведены хроматограммы смеси стандартов порфиринов уропорфиринов I, III; копропорфиринов I, III; протопорфирина IX (фиг.1) и изомеров уропорфирина I, III (фиг.2) (таблица). Figures 1 and 2 show chromatograms of a mixture of standards of porphyrins of uroporphyrins I, III; coproporphyrins I, III; protoporphyrin IX (figure 1) and isomers of uroporphyrin I, III (figure 2) (table).

Claims

METHOD FOR PRODUCING UROPORPHYRIN, which involves the enzymatic transformation of 5-aminolevulinic acid with a dry microorganism cell biomass preparation obtained by treating cells with acetone cooled to a temperature below minus 20 ^o С, characterized in that Arthrobacter globiformis VKM-658 culture is used as a microorganism.