【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、解毒や抗酸化作用で有用なグルタチオンの類縁物質であるホモグルタチオンの酵素法による製造方法に関する。ホモグルタチオンは主に豆科植物に存在し、生化学用の試薬として有用であるのみならず、生体内でグルタチオンと同様に解毒作用や抗酸化作用を有する化合物である。
【０００２】
【従来の技術】
ホモグルタチオンの製造に関しては、豆科植物のササゲ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓａｕｒｅｕｓ）からの抽出、精製、あるいは保護基を付けた原料アミノ酸からの化学合成が報告されている（Ｃａｍｂｌｅ，Ｒら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（Ｃ）１９６８年１２１９−１２２４頁）。
しかしながら、豆科植物からの抽出は、ホモグルタチオンの含有量が少ないことより、操作が煩雑で、収率が低く、また大量の廃棄物が発生する。一方、化学合成による方法は各構成アミノ酸に保護基を付けて順次合成していく方法であるが、収率が低いうえに、触媒として鉛や水銀を含む有害な化合物を使用するので好ましくない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、かかる従来の方法の欠点を有しない、安全でかつ簡便で安価に、ホモグルタチオンを酵素的に製造する方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる課題を解決するために、鋭意研究の結果、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−システインおよびβ―アラニンに、グルタミルシステインシンセターゼおよびグルタチオンシンセターゼ活性を有する大腸菌又はその処理物を反応させたところ、ホモグルタチオンが生成することを見出し、本発明を完成するにいたった。
すなわち本発明は、
（１）Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−システイン及びβ―アラニンを、γ―グルタミルシステインシンセターゼ及びグルタチオンシンセターゼ活性を有するエッシェリヒア属のバクテリア又はその処理物を用い反応させることを特徴とする、ホモグルタチオンの製造方法、
（２）反応系に、アデノシン−５’−三リン酸を存在させることを特徴とする、上記（１）記載のホモグルタチオンの製造方法、
（３）反応系に、アデノシン−５’−三リン酸の再生系を共役させることを特徴とする、上記（２）記載のホモグルタチオンの製造方法、
（４）アデノシン−５’−三リン酸の再生系が、アセテートキナーゼ反応系、カルバメートキナーゼ反応系あるいはバクテリア、酵母の解糖反応系であることを特徴とする、上記（３）記載のホモグルタチオンの製造方法、
（５）エッシェリヒア属のバクテリアが、遺伝子組換え技術によりグルタチオンシンセターゼ活性を増大させた大腸菌であることを特徴とする、上記（１）記載のホモグルタチオンの製造方法、
（６）エッシェリヒア属のバクテリアの処理物が、エッシェリヒア属のバクテリアの無細胞抽出液、有機溶媒あるいは界面活性剤処理した細胞の懸濁液、固定化された菌体又は酵素のいずれかであることを特徴とする、上記（１）記載のホモグルタチオンの製造方法、
を提供するものである。
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で用いられるバクテリアは、γ―グルタミルシステインシンセターゼ及びグルタチオンシンセターゼ活性を有するエッシュリヒア属のバクテリアであればいずれでもよいが、特に、遺伝子組換え手法でグルタチオンシンセターゼ活性を増強した大腸菌が好ましい。かかる大腸菌としては、特公平１−５８９５１号公報に記載のエシェリヒア・コリ微工研菌寄第７４７１が、また、グルタチオンシンセターゼ並びにγ−グルタミルシステインシンセターゼを共に増強した大腸菌としては、特公平１−５８９５１号公報に記載のエシェリヒア・コリ微工研菌寄第７４２０、エシェリヒア・コリ微工研菌寄第７４２１を挙げることができる。
これらバクテリアの培養は、特定の方法を用いることは必要とせず、通常の方法で培養すればよい。
【０００６】
反応は、培養により得られた菌体、あるいはその処理物が用いられる。処理物としては、菌体の有機溶媒あるいは界面活性剤処理物、無細胞抽出液、あるいは固定化された菌体又は酵素等を例示することができる。これらの中では、基質、特にアデノシン−５’−三リン酸の透過性をよくするためにトルエンのような有機溶媒あるいは界面活性剤による処理物、あるいは固定化された菌体又は酵素が好ましい。
固定化された菌体又は酵素は、例えばポリアクリルアミドゲル、アルギン酸カルシウム、カラギーナン等の高分子の担体に包括固定化し、ヘキサメチレンジアミンとグルタルアルデヒドによって架橋処理を行うことによって得られる。菌体の場合は、トルエンのような有機溶媒で更に処理すると高活性で耐久性に富む固定化菌体が得られる。この固定化菌体はカラムに充填し、固定化菌体カラムとして、ホモグルタチオンの連続生産に好適に用いられる。
【０００７】
ホモグルタチオンの酵素合成は、Ｌ−グルタミン酸とＬ−システインのγ―グルタミルシステインシンセターゼによるγ―グルタミルシステインの生成と、生成したγ―グルタミルシステインとβ―アラニンのグルタチオンシンセターゼによるホモグルタチオンの生成の２段階からなり、それぞれアデノシン−５’−三リン酸を必要とする。従って、反応系にアデノシンー５‘−三リン酸を添加することが望ましい。
アデノシン−５’−三リン酸は、それ自体を添加することもできるが、安価にホモグルタチオンを生産するために、アデノシン−５’−三リン酸の再生系を組み合わせることができる。組み合わせる再生系としては、アセトキナーゼ反応系、カルバメートキナーゼ反応系あるいはバクテリア、酵母の解糖反応系等を例示することができ、中でも大腸菌自体で活性の強いアセテートキナーゼ系が好ましい。
アデノシン−５’−三リン酸再生系を共役させる場合、例えば、アセトキナーゼ反応系を利用する場合、反応に必要なアデノシン−５’−三リン酸の添加量は必要モル数の１／１０〜１／１００とし、そのかわりに安価なアセチルリン酸を必要モル数添加することで反応を好適に進行させることができる。
【０００８】
ホモグルタチオン生成反応は、菌体あるいは菌体処理物を、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−システイン、β―アラニン、マグネシウムイオン、アデノシン−５’−三リン酸（及びアセチルリン酸）を含むｐＨ６〜９の反応液で、２０〜４０℃、数時間接触させることによって行うことができる。反応液の好ましい実施様態の例は、Ｌ−グルタミン酸５〜２００ｍＭ、Ｌ−システイン５〜５０ｍＭ、β―アラニン５〜２００ｍＭ、マグネシウムイオン１〜３０ｍＭ、アデノシン−５’−三リン酸０．５〜１０ｍＭ、アセチルリン酸５〜８０ｍＭ、リン酸カリウム緩衝液でｐＨは中性付近、反応温度は３７℃付近である。
また、固定化菌を充填したカラムで連続的にホモグルタチオンを生産する場合は、カラムを２０〜４０℃（好適には３７℃）に保温し、上記原料液を空間速度（Ｓ．Ｖ）０．１〜２．０（好適には０．５）で通塔することによって目的が達せられる。
【０００９】
生成したホモグルタチオンの単離、精製は、必要に応じて菌体等を除去後、反応液を吸着樹脂やイオン交換樹脂を用いる等の常法により行うことができる。
【００１０】
本発明の特徴は、γ−グルタミルシステインシンセターゼ及びグルタチオンシンセターゼの二酵素によりアミノ酸から酵素的にホモグルタチオンを製造する点にある。ホモグルタチオンは豆科植物の生体内では、γ―グルタミルシステインシとβ―アラニンから、グルタチオンシンセターゼとは別のホモグルタチオンシンセターゼで生合成されており、グルタチオンシンセターゼでホモグルタチオンが生合成されるという報告はない。本発明者等は、遺伝子組換え手法でグルタチオンシンセターゼ活性を増強した大腸菌の処理物を用い種々の反応を検討していたところ、驚くべきことに、グルタチオンの生合成の時の約６割の程度でホモグルタチオンが生成することを見いだしたものである。
【００１１】
【実施例】
以下実施例をもって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１
１． 微生物の培養
グルコース２％、ペプトン１％、酵母エキス１．５％、硫酸マグネシウム０．２％、ならびにリン酸一カリウム０．５％を含みｐＨ７．０に調整した培地１５Ｌを３０Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、加熱滅菌した。これに予めブイヨン培地にて前培養したエシェリヒア・コリＨＢ１０１を接種し、３７℃で２４時間好気条件下で培養した。この様にして得られた培養液を６０００ｒｐｍで遠心分離し、湿重量５００ｇの菌体を得た。
２． トルエン処理菌体の調製
得られた湿菌体２４０ｇを生理食塩水で洗浄後、ｐＨ７．０の５ｍＭトリス塩酸溶液に０．５ｍＭとなる様にシステインを加えた緩衝液６００ｍｌに懸濁した。この懸濁液にトルエンを７８ｍｌ添加し、３０℃で激しく撹拌した。２時間撹拌後、遠心分離によりトルエン処理菌体２００ｇを得た。
３． ホモグルタチオン生成反応
表１に示す組成の反応液１００ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、３７℃に保ちつつマグネチックスターラーで１００ｒｐｍにて撹拌し、７時間反応を行った。反応液を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、０．５ｍＭ（０．１６ｍｇ／ｍｌ）のホモグルタチオンが生成していた。なお、反応液にアセチルリン酸を添加しなかった場合、ホモグルタチオンの生成量は０．１ｍＭであった。
【００１２】
【表１】
【００１３】
実施例２
実施例１と同じ組成の培地に加熱滅菌後２０μｇ／ｍｌとなる様にクロラムフェニコールを添加した培地でエシェリヒア・コリ微工研菌寄第７４２１を実施例１と同様に培養して、湿重量４２０ｇの菌体を得た。得られた菌体を実施例１と同様に処理してトルエン処理菌体２００ｇを得た。
得られたトルエン処理菌体を用いて実施例１と同様に表１に示した反応組成の反応液１Ｌで７時間反応を行った結果、高速液体クロマトグラフィーで、１０ｍＭ（３．２ｍｇ／ｍｌ）のホモグルタチオンが生成した。
得られた反応液１Ｌを分画分子量６０００の限外濾過膜で濾過した後、硫酸でｐＨ２．０に調整して、吸着樹脂セパビーズＳＰ２０７（三菱化学工業製）１Ｌを充填したカラムに通塔しホモグルタチオンを吸着させた。そのカラムを水洗後、１０％メタノールで溶出し、溶出したホモグルタチオン画分をイオン交換樹脂ダイヤイオンＷＡ３０Ｓ（三菱化学工業製）６０ｍｌを充填したカラムに通塔しホモグルタチオンを吸着させた。そのカラムを水洗後、２％の酢酸で溶出し、ホモグルタチオン画分を集めた。
ホモグルタチオン画分を減圧濃縮して生成した白色の結晶状のものを濾取して減圧乾燥を行ったところ、１．２ｇのホモグルタチオンを得た。
得られたホモグルタチオンの高速液体クロマトグラフィー分析での純度は９５％であった。
また、得られたホモグルタチオンを加水分解して、ほぼ等モルのＬ−グルタミン酸、Ｌ−システインおよびβ―アラニンが生ずることをアミノ酸アナライザーにて確認した。
【００１４】
実験例
表２に記載の各種微生物を、実施例１と同じ培地組成の培地１Ｌを５Ｌ三角フラスコに入れて、３０℃で２４時間振トウ培養した。培養終了後、各々の培養液より遠心分離で菌体を集めた。各湿菌体１ｇにつきトルエン処理、ならびに超音波破砕を行った。トルエン処理は実施例１と同様にして、超音波破砕は湿菌体１ｇを４ｍｌのｐＨ７．０の５ｍＭトリス塩酸溶液に０．５ｍＭとなる様にシステインを加えた緩衝液に懸濁して、冷却しながら４分間行い、遠心分離して酵素液を得た。
それぞれの菌体処理液を用いて、実施例１と同様に表１に示した反応液５０ｍｌで７時間反応を行い、生成しているホモグルタチオン量を高速液体クロマトグラフィーで測定した。結果を表２に示す。なお、超音波破砕で得た酵素液の添加量は各々２ｍｌとした。
【００１５】
【表２】
【００１６】
実施例３
実施例２で得たエシェリヒア・コリ微工研菌寄第７４２１の湿菌体２０ｇを生理食塩水で洗浄後、生理食塩水２０ｍｌに懸濁し、４０℃に保った。１．２４ｇのκ―カラギーナンを６０ｍｌの生理食塩水に溶解し、４０℃に昇温し、上記菌体懸濁液を添加混合した。この混合液を０．３Ｍ塩化カリウム水溶液中に滴下して球状の固定化菌体を得た。この固定化菌体を２％の塩化カリウム、０．０８Ｍのヘキサメチレンジアミン及び１％のグルタルアルデヒドを含む０．３３Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）４００ｍｌに移し、５℃で１時間緩やかに撹拌して硬化処理を行い、生理食塩水で洗浄後、トルエン１０％、Ｌ−システイン０．５ｍＭを含む５ｍＭトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）２００ｍｌに入れて、２５℃で１時間撹拌した。
このようにして得たトルエン処理した固定化菌体８０ｇを生理食塩水で洗浄後、ジャケット付きのカラム（φ２．７ｃｍ×１４ｃｍ）に充填し、ジャケットに温水を通して３７℃に保ち、表１に示した組成の原料液（但し、表１中のトルエン処理菌体を除く）を毎時４０ｍｌの流速で通塔させた。
この操作を５日間連続して行い、通過液中に生成しているホモグルタチオンを実施例２と同様の方法で単離した。その結果、５日間の連続生産で合計１．１ｇのホモグルタチオンを得た。
得られたホモグルタチオンの純度は高速液体クロマトグラフィー分析で９６％であった。又、取得したホモグルタチオンは実施例２と同様の方法で同定した。
【００１７】
【発明の効果】
本発明は、従来知られていない、微生物あるいは酵素法によるホモグルタチオンの製造方法であり、安価に工業的に大量生産が可能な微生物を使用する製造方法を提供するものである。
本発明においてＬ−グルタミン酸、Ｌ−システインおよびβ―アラニンにγ―グルタミルシステインシンセターゼとグルタチオンシンセターゼの二酵素を同時に作用させ、γ―グルタミルシステインシンセターゼはＬ−グルタミン酸とＬ−システインを結合させ、グルタチオンシンセターゼはその結合物にβ―アラニンを結合させてホモグルタチオンを生成させる。これらの反応は同一系内で併行して行われ、お互いに反応を阻害せずかえって全体としての反応の進行が促進される。工程が少ない分、高収率が達成される。遺伝子組換え技術で両酵素の活性を増大させた菌を使用すると実生産で回収が可能なホモグルタチオンの生成が認められる。
また、大腸菌で元々活性の高いアセテートキナーゼによるアデノシン−５’−三リン酸再生系等を利用することによって、安価なアセチルリン酸を供給するだけで、アデノシン−５’−三リン酸が反応に消費された時に生じるアデノシン−５’−二リン酸がアデノシン−５’−三リン酸に再生され、高価なアデノシンー５‘−三リン酸をエネルギー源として大量に添加し消費することなくホモグルタチオンが酵素的に合成される。
さらに、菌体固定化物等を充填したカラムを利用した場合、ホモグルタチオンの連続生産が可能であり、菌体の取扱い回数が少なくて済み、工業的に有利である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing homoglutathione, which is a related substance of glutathione useful for detoxification and antioxidant action, by an enzymatic method. Homoglutathione is a compound that exists mainly in legumes and is not only useful as a biochemical reagent, but also has a detoxifying action and an antioxidative action in the same manner as glutathione in vivo.
[0002]
[Prior art]
Regarding the production of homoglutathione, extraction, purification from leguminous cowpea (Phaseolusaureus), or chemical synthesis from a raw material amino acid with a protecting group has been reported (Camble, R et al., J. Chem. Soc. (C) 1968, pages 1219-1224).
However, extraction from legumes is complicated in operation due to the low content of homoglutathione, yield is low, and a large amount of waste is generated. On the other hand, the chemical synthesis method is a method of sequentially synthesizing each constituent amino acid with a protecting group, but it is not preferable because the yield is low and a harmful compound containing lead or mercury is used as a catalyst.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
The object of the present invention is to provide a method for enzymatically producing homoglutathione that is safe, simple and inexpensive, without the disadvantages of such conventional methods.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve such problems, the present inventors have made extensive studies and have reacted L-glutamic acid, L-cysteine and β-alanine with Escherichia coli having glutamylcysteine synthetase and glutathione synthetase activity or a processed product thereof. As a result, it was found that homoglutathione was produced, and the present invention was completed.
That is, the present invention
(1) A homoglutathione characterized by reacting L-glutamic acid, L-cysteine and β-alanine with a bacterium belonging to the genus Escherichia having γ-glutamylcysteine synthetase and glutathione synthetase activity or a treated product thereof. Production method,
(2) A method for producing homoglutathione according to (1) above, wherein adenosine-5′-triphosphate is present in the reaction system,
(3) The method for producing homoglutathione according to (2) above, wherein the reaction system is conjugated with an adenosine-5′-triphosphate regeneration system,
(4) The homoglutathione according to (3) above, wherein the regeneration system for adenosine-5′-triphosphate is an acetate kinase reaction system, a carbamate kinase reaction system or a glycolysis reaction system of bacteria or yeast. Manufacturing method,
(5) The method for producing homoglutathione according to (1) above, wherein the bacterium belonging to the genus Escherichia is Escherichia coli having increased glutathione synthetase activity by a gene recombination technique,
(6) The processed product of Escherichia bacterium is a cell-free extract of Escherichia bacterium, a suspension of cells treated with an organic solvent or a surfactant, an immobilized cell or enzyme. A method for producing homoglutathione according to (1) above,
Is to provide.
[0005]
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The bacterium used in the present invention may be any bacterium belonging to the genus Escherichia having γ-glutamylcysteine synthetase and glutathione synthetase activity, and Escherichia coli having enhanced glutathione synthetase activity by a genetic recombination technique is particularly preferable. . Examples of such Escherichia coli include Escherichia coli Microbacterium No. 7471 described in JP-B-1-58951, and Escherichia coli in which both glutathione synthetase and γ-glutamylcysteine synthetase are enhanced. No. -58951, mention may be made of Escherichia coli microfabricated bacteria 7420 and Escherichia coli microfabricated 7421.
The culture of these bacteria does not require the use of a specific method, and may be performed by a normal method.
[0006]
For the reaction, microbial cells obtained by culturing or treated products thereof are used. Examples of the treated product include an organic solvent or a surfactant-treated product of a microbial cell, a cell-free extract, or an immobilized microbial cell or enzyme. Among these, in order to improve the permeability of the substrate, particularly adenosine-5′-triphosphate, a treated product with an organic solvent such as toluene or a surfactant, or an immobilized cell or enzyme is preferable.
The immobilized cells or enzyme can be obtained, for example, by comprehensively immobilizing on a polymer carrier such as polyacrylamide gel, calcium alginate, and carrageenan, and performing a crosslinking treatment with hexamethylenediamine and glutaraldehyde. In the case of bacterial cells, further treatment with an organic solvent such as toluene yields highly active and durable immobilized bacterial cells. This immobilized microbial cell is packed in a column, and is suitably used for continuous production of homoglutathione as an immobilized microbial cell column.
[0007]
Enzymatic synthesis of homoglutathione includes the production of γ-glutamylcysteine by γ-glutamylcysteine synthetase of L-glutamic acid and L-cysteine, and the production of homoglutathione by the produced γ-glutamylcysteine and β-alanine glutathione synthetase. It consists of two steps, each requiring adenosine-5'-triphosphate. Therefore, it is desirable to add adenosine-5′-triphosphate to the reaction system.
Adenosine-5'-triphosphate can be added by itself, but in order to produce homoglutathione at low cost, adenosine-5'-triphosphate regeneration system can be combined. Examples of the regeneration system to be combined include an acetokinase reaction system, a carbamate kinase reaction system, or a glycolysis reaction system of bacteria or yeast. Among them, an acetate kinase system that is highly active in Escherichia coli itself is preferable.
When conjugating an adenosine-5′-triphosphate regeneration system, for example, when using an acetokinase reaction system, the amount of adenosine-5′-triphosphate required for the reaction is 1/10 to 10/10 of the required mole number. The reaction can be suitably advanced by adding 1/100, and adding the required mole number of inexpensive acetyl phosphate instead.
[0008]
The homoglutathione formation reaction is performed at a pH of 6 to 9 containing L-glutamic acid, L-cysteine, β-alanine, magnesium ion, adenosine-5′-triphosphate (and acetylphosphate). It can carry out by making it contact for 20 to 40 degreeC with a reaction liquid for several hours. Examples of preferred embodiments of the reaction solution include L-glutamic acid 5 to 200 mM, L-cysteine 5 to 50 mM, β-alanine 5 to 200 mM, magnesium ion 1 to 30 mM, adenosine-5′-triphosphate 0.5 to 10 mM. Acetyl phosphate 5-80 mM, potassium phosphate buffer, pH is near neutral, reaction temperature is around 37 ° C.
When homoglutathione is continuously produced in a column packed with immobilized bacteria, the column is kept at 20 to 40 ° C. (preferably 37 ° C.), and the above raw material liquid is kept at a space velocity (SV) of 0. The purpose can be achieved by passing through the column at 1 to 2.0 (preferably 0.5).
[0009]
Isolation and purification of the produced homoglutathione can be carried out by a conventional method such as using an adsorption resin or an ion exchange resin after removing the cells and the like as necessary.
[0010]
A feature of the present invention is that homoglutathione is enzymatically produced from an amino acid by two enzymes, γ-glutamylcysteine synthetase and glutathione synthetase. Homoglutathione is biosynthesized from γ-glutamylcysteine and β-alanine with a homoglutathione synthetase other than glutathione synthetase in the legumes, and homoglutathione is biosynthesized with glutathione synthetase. There is no report that The present inventors have examined various reactions using a processed product of Escherichia coli whose glutathione synthetase activity is enhanced by a genetic recombination technique. Surprisingly, about 60% of the biosynthesis of glutathione was surprisingly performed. It was found that homoglutathione was produced to a certain extent.
[0011]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
Example 1
1. Microbial culture 2%, peptone 1%, yeast extract 1.5%, magnesium sulfate 0.2% and monopotassium phosphate 0.5%, adjusted to pH 7.0 15L medium 30L jar fur Placed in mentor and heat sterilized. This was inoculated with Escherichia coli HB101 pre-cultured in bouillon medium and cultured at 37 ° C. for 24 hours under aerobic conditions. The culture solution thus obtained was centrifuged at 6000 rpm to obtain a microbial cell having a wet weight of 500 g.
2. Preparation of Toluene-treated Bacteria 240 g of the obtained wet cells were washed with physiological saline, and suspended in 600 ml of a buffer solution in which cysteine was added to a pH of 7.0 5 mM Tris-HCl solution to 0.5 mM. To this suspension, 78 ml of toluene was added and stirred vigorously at 30 ° C. After stirring for 2 hours, 200 g of toluene-treated cells were obtained by centrifugation.
3. Homoglutathione production reaction 100 ml of a reaction solution having the composition shown in Table 1 was placed in a 200 ml beaker, stirred at 100 rpm with a magnetic stirrer while maintaining at 37 ° C., and reacted for 7 hours. When the reaction solution was measured by high performance liquid chromatography, 0.5 mM (0.16 mg / ml) homoglutathione was produced. When acetyl phosphate was not added to the reaction solution, the amount of homoglutathione produced was 0.1 mM.
[0012]
[Table 1]
Example 2
Escherichia coli Kogyo Kenkyusho 7421 was cultured in the same manner as in Example 1 in a medium in which chloramphenicol was added to 20 μg / ml after heat sterilization. A bacterial cell weighing 420 g was obtained. The obtained microbial cells were treated in the same manner as in Example 1 to obtain 200 g of toluene-treated microbial cells.
Using the obtained toluene-treated cells, the reaction was carried out for 7 hours with 1 L of the reaction solution having the reaction composition shown in Table 1 in the same manner as in Example 1. As a result, 10 mM (3.2 mg / ml) was obtained by high performance liquid chromatography. Of homoglutathione was produced.
1 L of the obtained reaction solution was filtered through an ultrafiltration membrane with a molecular weight cut off of 6000, adjusted to pH 2.0 with sulfuric acid, and passed through a column packed with 1 L of adsorption resin Sepa beads SP207 (manufactured by Mitsubishi Chemical). Homoglutathione was adsorbed. The column was washed with water and eluted with 10% methanol, and the eluted homoglutathione fraction was passed through a column packed with 60 ml of ion exchange resin Diaion WA30S (manufactured by Mitsubishi Chemical) to adsorb homoglutathione. The column was washed with water and eluted with 2% acetic acid, and the homoglutathione fraction was collected.
A white crystalline product produced by concentrating the homoglutathione fraction under reduced pressure was collected by filtration and dried under reduced pressure to obtain 1.2 g of homoglutathione.
The purity of the obtained homoglutathione by high performance liquid chromatography analysis was 95%.
In addition, it was confirmed with an amino acid analyzer that the resulting homoglutathione was hydrolyzed to produce approximately equimolar amounts of L-glutamic acid, L-cysteine and β-alanine.
[0014]
Experimental Examples Various microorganisms described in Table 2 were placed in a 5 L Erlenmeyer flask with 1 L of the medium having the same medium composition as Example 1, and cultured at 30 ° C. for 24 hours with shaking. After completion of the culture, the cells were collected from each culture solution by centrifugation. Toluene treatment and ultrasonic crushing were performed per 1 g of each wet cell. Toluene treatment was performed in the same manner as in Example 1, and ultrasonic disruption was performed by suspending 1 g of wet cells in a buffer solution containing cysteine added to 4 ml of 5 mM Tris-HCl solution having a pH of 7.0 so that the concentration was 0.5 mM. The mixture was centrifuged for 4 minutes and centrifuged to obtain an enzyme solution.
Using each cell treatment solution, the reaction was carried out for 7 hours with 50 ml of the reaction solution shown in Table 1 in the same manner as in Example 1, and the amount of homoglutathione produced was measured by high performance liquid chromatography. The results are shown in Table 2. The addition amount of the enzyme solution obtained by ultrasonic crushing was 2 ml each.
[0015]
[Table 2]
Example 3
20 g of the wet cells of Escherichia coli Microbiken No. 7421 obtained in Example 2 was washed with physiological saline, suspended in 20 ml of physiological saline, and kept at 40 ° C. 1.24 g of κ-carrageenan was dissolved in 60 ml of physiological saline, heated to 40 ° C., and the cell suspension was added and mixed. This mixed solution was dropped into a 0.3M aqueous potassium chloride solution to obtain spherical immobilized cells. The immobilized cells were transferred to 400 ml of 0.33M potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 2% potassium chloride, 0.08M hexamethylenediamine and 1% glutaraldehyde, and the mixture was kept at 5 ° C. for 1 hour. Curing treatment is carried out with gentle stirring, washed with physiological saline, put in 200 ml of 5 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0) containing 10% toluene and 0.5 mM L-cysteine, and stirred at 25 ° C. for 1 hour. did.
80 g of the immobilized bacterial cells treated with toluene thus obtained were washed with physiological saline and then packed in a jacketed column (φ2.7 cm × 14 cm), and warm water was passed through the jacket at 37 ° C., as shown in Table 1. A raw material solution having the composition described above (excluding the toluene-treated cells in Table 1) was passed through the tower at a flow rate of 40 ml per hour.
This operation was performed continuously for 5 days, and the homoglutathione produced in the passing solution was isolated in the same manner as in Example 2. As a result, 1.1 g of homoglutathione was obtained in total for 5 days of continuous production.
The purity of the obtained homoglutathione was 96% by high performance liquid chromatography analysis. The obtained homoglutathione was identified by the same method as in Example 2.
[0017]
【The invention's effect】
The present invention is a conventionally known method for producing homoglutathione by microorganisms or enzymatic methods, and provides a method for producing microorganisms that can be industrially mass-produced at low cost.
In the present invention, two enzymes, γ-glutamylcysteine synthetase and glutathione synthetase, are simultaneously acted on L-glutamic acid, L-cysteine and β-alanine, and γ-glutamylcysteine synthetase binds L-glutamic acid and L-cysteine. Glutathione synthetase binds β-alanine to its conjugate to produce homoglutathione. These reactions are performed in parallel in the same system, and the progress of the reaction as a whole is promoted without interfering with each other. High yields are achieved with fewer steps. Using bacteria that have increased the activity of both enzymes by gene recombination technology, homoglutathione that can be recovered in actual production is observed.
In addition, by using an adenosine-5′-triphosphate regeneration system using acetate kinase which is originally highly active in Escherichia coli, adenosine-5′-triphosphate can be reacted by simply supplying inexpensive acetylphosphate. Adenosine-5′-diphosphate generated when consumed is regenerated to adenosine-5′-triphosphate, and homoglutathione can be produced without adding and consuming a large amount of expensive adenosine-5′-triphosphate as an energy source. It is synthesized enzymatically.
Furthermore, when a column packed with a cell-immobilized product or the like is used, homoglutathione can be continuously produced, and the number of times the cell is handled is small, which is industrially advantageous.