RU2043771C1

RU2043771C1 - Vaccine against escherichiosis in animals

Info

Publication number: RU2043771C1
Application number: RU93009804A
Authority: RU
Inventors: Михаил Константинович Пирожков; Олег Алексеевич Тугаринов; Юрий Алексеевич Малахов; Евгений Владимирович Сусский
Original assignee: Михаил Константинович Пирожков; Олег Алексеевич Тугаринов; Юрий Алексеевич Малахов; Евгений Владимирович Сусский
Priority date: 1993-02-25
Filing date: 1993-02-25
Publication date: 1995-09-20

Abstract

FIELD: veterinary microbiology, biotechnology. SUBSTANCE: vaccine has antigens of escherichia: somatic 078, 0141, protein adhesive antigens K88, K99, 987P, F41, capsule polysaccharide K80, K87, TL, TC anatoxins providing the synthesis of specific antibodies in blood of immunized animals that inhibit the main processes of coli-infection development colony-forming of pathogen in intestine of animals and neutralization of endo- and enterotoxins. For prophylaxis of escherichiosis in newborns vaccine is administrated to pregnant animals twice at interval 12-14 days 1.5-2 months before confinement, and also to piglet and lambs before weanling. EFFECT: enhanced effectiveness of vaccine. 4 tbl

Description

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и представляет собой вакцину, содержащую адгезивные антигены К88, К99, 987Р, F41, ТЛ и ТС анатоксины, предназначенную для профилактики эшерихиоза телят, поросят, ягнят и жеребят. The invention relates to the field of veterinary microbiology and is a vaccine containing adhesive antigens K88, K99, 987P, F41, TL and TS toxoids, designed to prevent escherichiosis of calves, piglets, lambs and foals.

Эшерихиоз (колибактриоз, колидиарея, колиинфекция) широко распространен во всех странах мира и наносит значительной экономический ущерб из-за высокой заболеваемости и летальности. Основным средством борьбы с эшерихиозом является вакцинация беременных животных за 1-2 месяца до родов, а для профилактики отечной болезни поросят вакцинация их перед отъемом. Escherichiosis (colibactriosis, colidiarrhea, coli infection) is widespread in all countries of the world and causes significant economic damage due to high morbidity and mortality. The main means of combating Escherichiosis is vaccination of pregnant animals 1-2 months before birth, and for the prevention of edematous disease, they should be vaccinated before weaning.

Известна поливалентная гидроокисьалюминиевая формолвакцина против колибактериоза (эшерихиоза) поросят, телят и ягнят. Вакцину изготавливают в двух вариантах из эшерихий следующих серологических групп и сероваров:
Вакцина против колибактериоза поросят: 08:K43; 09:K30; 078:K80; 0138: K81; 0139:K82; 0141:K87:K88, 0147:K89:K88, 0149:K91:K88.Polyvalent aluminum hydroxide formol vaccine against colibacteriosis (Escherichiosis) of piglets, calves and lambs is known. The vaccine is made in two versions from the Escherichia of the following serological groups and serovars:
Piglet colibacteriosis vaccine: 08: K43; 09: K30; 078: K80; 0138: K81; 0139: K82; 0141: K87: K88, 0147: K89: K88, 0149: K91: K88.

Вакцина против калибактериоза телят и ягнят: 08:K43, 09:K30, 015:K14: H30, 020, 026:K60, 041, 055, 078:K80, 086:K61:H32, 0115, 0117:К62:H4, 0119: K69:H4, 0101:K99. Calibacteriosis vaccine for calves and lambs: 08: K43, 09: K30, 015: K14: H30, 020, 026: K60, 041, 055, 078: K80, 086: K61: H32, 0115, 0117: K62: H4, 0119 : K69: H4, 0101: K99.

Вакцину вводят внутримышечно двукратно с интервалом 10-15 дней крупному рогатому скоту в дозах10-15 и 10-15, свиньям 4-5 и 5-6, поросятам перед отъемом 1-1,5 и 1,5-2, овцам 3-4 и 4-5, ягнятам перед отъемом 1-1,5 и 1,5-2 см³.The vaccine is administered intramuscularly twice with an interval of 10-15 days to cattle in doses of 10-15 and 10-15, pigs 4-5 and 5-6, piglets before weaning 1-1.5 and 1.5-2, sheep 3-4 and 4-5, the lambs before weaning 1-1.5 and 1.5-2 cm ³ .

Основными недостатками вакцины являются невысокая иммуногенность по отношению к эпизоотическим штаммам эшерихий, содержащим адгезивные антигены К88 и К99 и отсутствие иммунитета против штаммов с адгезивными антигенами F41 и 987Р, а также наличие большого числа штаммов различных серогрупп, предназначенных для создания иммунитета к О-антигенам, играющим, как оказалось второстепенную роль в развитии инфекционного процесса и в иммуногенезе. The main disadvantages of the vaccine are the low immunogenicity with respect to epizootic Escherichia strains containing adhesive antigens K88 and K99 and the absence of immunity against strains with adhesive antigens F41 and 987P, as well as the presence of a large number of strains of various serogroups designed to create immunity to O-antigens playing , as it turned out, a secondary role in the development of the infectious process and in immunogenesis.

Целью изобретения является повышение антигенной и иммуногенной активности, расширение спектра действия и защитного эффекта вакцины путем создания препарата нового класса, изготовленного на основе полисахаридных капсульных, соматических, адгезивных антигенов, термолабильного (ТЛ) и термостабильного (ТС) анатоксинов. The aim of the invention is to increase the antigenic and immunogenic activity, expanding the spectrum of action and the protective effect of the vaccine by creating a new class of drug made on the basis of polysaccharide capsule, somatic, adhesive antigens, thermolabile (TL) and thermostable (TS) toxoids.

Поставленная цель достигнута созданием вакцины против эшерихиоза животных, содержащей полисахаридные капсульные антигены К80, К87, соматические антигены 078, 0141; антигены адгезии К88, К99, 987Р, F41; ТЛ и ТС-анатоксины эшерихий; адъювант, консервант, бульон Хоттингера и фосфатно-мочевинный буфер. This goal was achieved by creating a vaccine against escherichiosis of animals containing polysaccharide capsular antigens K80, K87, somatic antigens 078, 0141; adhesion antigens K88, K99, 987P, F41; Escherichia TL and TS-toxoids; adjuvant, preservative, Hottinger broth and phosphate-urea buffer.

В качестве продуцентов антигенов использованы следующие штаммы:
1. Escherichia coli ВГНКИ N 305-37/11 (078:K80)
2. Escherichia coli ВГНКИ N 334-37/12 (0141:K87:K88)
3. Escherichia coli ВГНКИ N 453-37/17 (0115:K88)
4. Escherichia coli ВГНКИ N 353-37/17 (0141:K99)
5. Escherichia coli ВГНКИ N 397-37/14 (09:K103:987P)
6. Escherichia coli ВГНКИ N 398-37/14 (0101:F41)
Штаммы Eschericgia coli: ВГНКИ N 397-37/14, ВГНКИ N 305-37/11, ВГНКИ N 398-37/14, ВГНКИ N 454-37/17, ВГНКИ N 334-37/12, ВГНКИ N 453-37/17 депонированы в коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов.The following strains were used as producers of antigens:
1. Escherichia coli VGNKI N 305-37 / 11 (078: K80)
2. Escherichia coli VGNKI N 334-37 / 12 (0141: K87: K88)
3. Escherichia coli VGNKI N 453-37 / 17 (0115: K88)
4. Escherichia coli VGNKI N 353-37 / 17 (0141: K99)
5. Escherichia coli VGNKI N 397-37 / 14 (09: K103: 987P)
6. Escherichia coli VGNKI N 398-37 / 14 (0101: F41)
Strains of Eschericgia coli: VGNKI N 397-37 / 14, VGNKI N 305-37 / 11, VGNKI N 398-37 / 14, VGNKI N 454-37 / 17, VGNKI N 334-37 / 12, VGNKI N 453-37 / 17 were deposited in the collection of microorganisms of the All-Russian State Research Institute for Control, Standardization and Certification of Veterinary Medicines.

Штаммы Escherichia coli, предназначенные для изготовления вакцины, характеризуются следующими свойствами. The strains of Escherichia coli, intended for the manufacture of a vaccine, are characterized by the following properties.

Морфологические свойства. Полиморфные палочки размером 0,8-1,5 х 2,0-6,0 мкм, не образуют спор, перитрихи, окрашиваются по Граму отрицательно. Morphological properties. Polymorphic sticks with a size of 0.8-1.5 x 2.0-6.0 microns, do not form spores, peritrichi, are stained by Gram negatively.

Культуральные свойства. На мясопептонном агаре все штаммы образуют круглые колонии с ровными краями, слегка выпуклые, серо-белого цвета без пигмента, слизистые, мелкозернистые с диаметром 2-4 мм и более. На среде Эндо колонии малинового цвета с металлическим отливом. Все штаммы находятся в стойкой S форме и в обычных условиях не диссоциируют. На мясопопептонном бульоне видимое помутнение среды наблюдается через 4-5 ч культивирования при температуре 37-38^оС, через 14-16 ч рост бывает обильным. Генерированное время у штаммов составляет 21±3 мин.Cultural properties. On meat-peptone agar, all strains form round colonies with smooth edges, slightly convex, gray-white color without pigment, mucous, fine-grained with a diameter of 2-4 mm or more. On Endo's environment, raspberry-colored colonies with a metallic tint. All strains are in a stable S form and do not dissociate under normal conditions. On myasopopeptonnom broth visible turbidity of the medium is observed after 4-5 hours of culture at a temperature of 37-38 ^{° C,} 14-16 h growth is abundant. The generated time for the strains is 21 ± 3 min.

Ферментативные свойства. Все штаммы имеют следующие ферментативные свойства: образуют индол, не образуют сероводород, дают положительную реакцию с митиленовым красным на среде Кларка, не образуют ацетил-метил-карбинол, не растут на среде Симонса, не растут на среде с цианистым калием, не разжижают желатину и свернутую кровяную сыворотку, свертывают, но не пептонизируют молоко, восстанавливают нитраты в нитриты, сбраживают с образованием кислоты и газа глюкозу, лактозу, маннит, арабинозу, мальтозу, ксилозу, тригалозу, сорбит, рафинозу (кроме штаммов 397-37/14, 398-37/14, 453-37/17), несбраживают дульпит (кроме штаммов ВГНКИ N 305-37/11, 334-37/12), сахарозу, адонит, инозит, целлобиозу. Enzymatic properties. All strains have the following enzymatic properties: form indole, do not form hydrogen sulfide, give a positive reaction with mitylene red on Clark medium, do not form acetyl methyl carbinol, do not grow on Simons medium, do not grow on potassium cyanide medium, do not thin gelatin and coagulated blood serum, coagulate, but not peptone, milk, restore nitrates to nitrites, ferment glucose, lactose, mannitol, arabinose, maltose, xylose, trigalose, sorbitol, raffinose to form acid and gas (except for strains 397-37 / 14, 398- 37/14, 453-37 / 1 7) do not ferment dulpite (except for the VGNKI strains N 305-37 / 11, 334-37 / 12), sucrose, adonite, inositol, and cellobiose.

Характеристика свойств штаммов приведена в табл.1. The characteristics of the properties of the strains are given in table 1.

В качестве продуцента адгезивного антигена К88 использован штамм Escherichia coli ВГНКИ N 453-37/17, в качестве продуцентов адгезивного антигена К99 использован штамм Escherichia coli N 454-37/11. As a producer of adhesive antigen K88, the strain Escherichia coli VGNKI N 453-37 / 17 was used, as producers of adhesive antigen K99, the strain Escherichia coli N 454-37 / 11 was used.

Антигены К88 и К99 представляют собой филаментозные образования на поверхности бактериальных клеток. Данные антигены выделяют из бактериальной массы штаммов-продуцентов путем тепловой обработки как описано в примере 1. Антиген К88 имеет белковую природу и состоит из белковых субъединиц с мол.м. 25000-26200 дальтон, определенной путем электрофореза в SDS 11% полиакриламидном геле (в качестве стандартов использованы бычий альбумин, пепсин, трипсин и лизоцим с мол.м. соответственно 68000, 35000, 24000 и 14600 дальтон). В лиофилизованном препарате содержит 95-96% белка; 2-3% липидов и 1-2% углеводов. Антиген К88 термолабилен и денатурируется при температуре 70^оС в течение 30 мин. Изоэлектрическая точка антигена К88 при рН 3,5. При электронно-микроскопическом исследовании антиген имеет палочковидную структуру следующих размеров: 4,5 нм в диаметре и до 120 нм в длину. Подлинность и серологическую активность адгезивного антигена К88 определяют в РДП с МкАт или моноспецифической анти-К88 сывороткой (титр 1:64). Титр антигена в этой реакции составляет (1:16)-(1:32). Антигенную активность определяют в опытах на кроликах путем внутрибрюшинного введения антигена с последующим тестированием сыворотки в РА с моноплазмидным штаммом. Титр антител в сыворотке крови кроликов должен быть не ниже 1:1600. Антиген К99 представляет собой белок и состоит из субъединиц с мол.м. 18500-22500 дальтон. В лиофилизированном препарате содержится 93-94% белка, 4-5% липидов и 1-2% углеводов. Антиген К99 термолабилен и денатурируется при температуре 70^оС в течение 30 мин. Изоэлектрическая точка антигена К99 при рН 9,5. При электронно-микроскопическом исследовании антиген имеет палочковидную структуру с диаметром 8,4 нм и длиною до 130 нм с большой склонностью к агрегации. Титр адгезивного антигена К99 в РДП с МкАт или моноспецифической анти-К99 сывоpоткой (титр 1:64) составляет (1:8)-(1:16). Антигенную активность определяют методом, описанным для антигена К88. Титр антител в сыворотке крови кроликов должен быть не ниже 1:1280.K88 and K99 antigens are filamentous formations on the surface of bacterial cells. These antigens are isolated from the bacterial mass of producer strains by heat treatment as described in Example 1. The K88 antigen is protein in nature and consists of protein subunits with a mol.m. 25000-26200 daltons determined by SDS electrophoresis in 11% polyacrylamide gel (bovine albumin, pepsin, trypsin and lysozyme with mol.m. of 68000, 35000, 24000 and 14600 daltons, respectively, were used as standards). In the lyophilized preparation contains 95-96% protein; 2-3% lipids and 1-2% carbohydrates. K88 antigen thermolabile and denatured at ⁷⁰ ° C for 30 min. Isoelectric point of K88 antigen at pH 3.5. In electron microscopy, the antigen has a rod-shaped structure in the following sizes: 4.5 nm in diameter and up to 120 nm in length. The authenticity and serological activity of the K88 adhesive antigen is determined in RDP with MkAt or monospecific anti-K88 serum (titer 1:64). The titer of antigen in this reaction is (1:16) - (1:32). Antigenic activity is determined in experiments on rabbits by intraperitoneal administration of antigen, followed by testing of serum in RA with a monoplasmid strain. The titer of antibodies in the blood serum of rabbits should be at least 1: 1600. K99 antigen is a protein and consists of subunits with a mol.m. 18500-22500 daltons. The lyophilized preparation contains 93-94% protein, 4-5% lipids and 1-2% carbohydrates. K99 antigen thermolabile and denatured at ⁷⁰ ° C for 30 min. Isoelectric point of K99 antigen at pH 9.5. In electron microscopy, the antigen has a rod-shaped structure with a diameter of 8.4 nm and a length of up to 130 nm with a high propensity for aggregation. The titer of adhesive antigen K99 in RDP with MkAt or monospecific anti-K99 serum (titer 1:64) is (1: 8) - (1:16). Antigenic activity is determined by the method described for K88 antigen. The titer of antibodies in the blood serum of rabbits should be at least 1: 1280.

В качестве продуцента адгезивного антигена 987Р использован штамм Escherichia coli ВГНКИ N 397-37/14 с антигенной формулой 09:K103:987P. Штамм выделен от поросенка 5-дневного возраста; агглютинируется гомологичной О-коли сывороткой до титра 1:9000, сывороткой 0137 1:200; с О-коли сыворотками других серогрупп в реакцию не вступает. Эшерихиозная анти-987Р сыворотка агглютинирует штамм до титра 1:800. Штамм активно продуцирует адгезивный антиген 987Р при культивировании в реакторе на среде Хоттингера при аэрации, активном перемешивании и температуре 37-38,5^оС. Антиген 987Р расположен на поверхности бактериальной клетки в виде филаментозных образований и выделяется из нее путем тепловой обработки как описано в примере 1. Адгезивный антиген 987Р имеет белковую природу и состоит из белковых субъединиц с мол.м. 19400-22500 дальтон. В лиофилизированном препарате содержится 97-98,5% белка; 2-2,5% липидов и 0,5-1% аминосахаров. Антиген 987Р термолабилен и денатурируется при температуре 70^оС в течение 30 мин. Изоэлектрическая точка антигена 987Р при рН 3,7. При электронно-микроскопическом исследовании антиген имеет палочковидную структуру следующих размеров: 7 нм в диаметре и до 200 нм в длину. Титр адгезивного антигена 987Р в РДП с МкАт или моноспецифический анти-987Р сывороткой (титр 1:64) составляет 1:8 1:16. Антигенную активность определяют в РА. Титр антител в сыворотке крови кроликов должен быть не ниже 1:1280.As a producer of adhesive antigen 987P, the strain Escherichia coli VGNKI N 397-37 / 14 with antigenic formula 09: K103: 987P was used. The strain is isolated from a piglet of 5 days of age; agglutinated with homologous O-coli serum to a titer of 1: 9000, serum 0137 1: 200; does not react with O-serum from other serogroups. Escherichial anti-987P serum agglutinates the strain to a titer of 1: 800. The strain actively produces antigen adhesive 987R when cultured in the reactor Hottinger medium with aeration, stirring and the active temperature 37-38,5 ° ^C. Antigen 987R located on the bacterial cell surface as filamentous formations and is released therefrom by heat treatment as described in Example 1. Adhesive antigen 987P has a protein nature and consists of protein subunits with a mol.m. 19400-22500 Daltons. The lyophilized preparation contains 97-98.5% protein; 2-2.5% lipids and 0.5-1% amino sugars. Antigen 987R thermolabile and denatured at ⁷⁰ ° C for 30 min. Isoelectric point of 987P antigen at pH 3.7. In electron microscopy, the antigen has a rod-shaped structure in the following sizes: 7 nm in diameter and up to 200 nm in length. The titer of adhesive antigen 987P in RDP with MkAt or monospecific anti-987P serum (titer 1:64) is 1: 8 1:16. Antigenic activity is determined in RA. The titer of antibodies in the blood serum of rabbits should be at least 1: 1280.

В качестве продуцента адгезивного антигена F-41 использован штамм Escherichia coli ВГНКИ N 398-37/14 с антигенной формулой 0101:F41. Штамм выделен от теленка 3-дневного возраста; агглютинируется гомологичной О-коли сывороткой до титра 1:3200 и гетерологичными сыворотками 04-1:400, 09, 015, 0138-1: 200, 02, 018-1:100, 0117, 0142-1:50; анти-F41 сывороткой до титра 1:800; активно продуцирует адгезивный антиген F-41 на среде Хоттингера при культивировании в реакторе при температуре 37-38^оС, аэрации и активном перемешивании.As a producer of the adhesive antigen F-41, the strain Escherichia coli VGNKI N 398-37 / 14 with antigenic formula 0101: F41 was used. The strain is isolated from a 3-day-old calf; agglutinated with homologous O-coli serum to a titer of 1: 3200 and heterologous sera 04-1: 400, 09, 015, 0138-1: 200, 02, 018-1: 100, 0117, 0142-1: 50; anti-F41 serum to a titer of 1: 800; actively produces F-antigen adhesive 41 on Hottinger medium when cultured in the reactor at a temperature of 37-38 ^{° C,} aeration and vigorous stirring.

Антиген F41 расположен на поверхности бактериальной клетки в виде филаментозных образований и выделяется из нее путем тепловой обработки как описано в примере 1. Адгезивный антиген F41 представляет собой белок и состоит из субъединиц с мол.м. 28000-29000 дальтон. В лиофилизированном препарате содержится 95,5-96% белка; 3-3,5% липидов и 0,5-1% углеводов. Антиген F41 термолабилен и полностью денатурируется при температуре 70^оС в течение 30 мин. Изоэлектрическая точка антигена F41 при рН 4,0. При электронно-микроскопическом исследовании антиген имеет палочковидную структуру с диаметром 4 нм и длиною до 110 нм. Титр адгезивного антигена F41 в РДП с МкАт или моноспецифической анти-F41 сывороткой (титр 1:64) составляет 1:8-1:16. Антигенную активность определяют в РА. Титр антител в сыворотке крови кроликов должен быть не ниже 1:1280.The F41 antigen is located on the surface of the bacterial cell in the form of filamentous formations and is isolated from it by heat treatment as described in Example 1. The F41 adhesive antigen is a protein and consists of subunits with mol.m. 28000-29000 daltons. The lyophilized preparation contains 95.5-96% protein; 3-3.5% lipids and 0.5-1% carbohydrates. F41 antigen thermolabile and completely denatured at ⁷⁰ ° C for 30 min. The isoelectric point of the F41 antigen at pH 4.0. In electron microscopy, the antigen has a rod-shaped structure with a diameter of 4 nm and a length of up to 110 nm. The titer of adhesive antigen F41 in RDP with MkAt or monospecific anti-F41 serum (titer 1:64) is 1: 8-1: 16. Antigenic activity is determined in RA. The titer of antibodies in the blood serum of rabbits should be at least 1: 1280.

Адгезивные антигены К88, К990 987Р, F41 входят в состав вакцины в качестве основных иммуногенных компонентов, которые вызывают образование антител, препятствующих адсорбции энтеропатогенных эшерихий в тонком отделе кишечника молодняка сельскохозяйственных животных. Adhesive antigens K88, K990 987P, F41 are part of the vaccine as the main immunogenic components that cause the formation of antibodies that interfere with the adsorption of enteropathogenic Escherichia in the small intestine of young farm animals.

Штамм Escherichia coli ВГНКИ N 334-37/12 с антигенной формулой 0141:K87: K88 выделен от поросенка 7-дневного возраста; агглютинируется гомологичной О-коли сывороткой до титра 1: 3200 и гетерологичными сыворотками 08, 09, 0142, 047 1:100 и 0103-1:300; анти-К88 сывороткой до титра 1:800; вызывает гемолиз типа β и гемолизирует с равной интенсивностью эритроциты барана и кролика. The strain Escherichia coli VGNKI N 334-37 / 12 with antigenic formula 0141: K87: K88 isolated from a piglet of 7 days of age; agglutinated with homologous O-coli serum to a titer of 1: 3200 and heterologous sera 08, 09, 0142, 047 1: 100 and 0103-1: 300; anti-K88 serum to a titer of 1: 800; causes hemolysis of type β and hemolyses with equal intensity red sheep and rabbit erythrocytes.

Штамм Escherichia coli ВГКИ N 305-37/111 с антигенной формулой 078:К80 выделен от теленка 2-дневного возраста; агглютинируется гомологичной сывороткой 078 до титра 1:10000 и гетерологичными сыворотками 08 1:500, 0103, 0127 и 0137 1:400, 086 1:100, 0139 1:200, 10141 1:800; высоко вирулентен для белых мышей, ЛД₅₀ составляет 1,2 х 10⁷ микробных клеток при внутрибрюшинном введении.The strain Escherichia coli VGKI N 305-37 / 111 with antigenic formula 078: K80 isolated from calf 2 days of age; agglutinated with homologous serum 078 to a titer of 1: 10000 and heterologous sera 08 1: 500, 0103, 0127 and 0137 1: 400, 086 1: 100, 0139 1: 200, 10141 1: 800; highly virulent for white mice, LD ₅₀ is 1.2 x 10 ⁷ microbial cells with intraperitoneal administration.

Штаммы Escherichia coli ВГНКИ N 334-37/12, ВГНКИ N 397-37/14, ВГНКИ N 454-37/17 и ВГНКИ N 453-37/17 являются активными продуцентами термолабильного токсина. Термолабильный токсин стабильно накапливается в бульоне Хоттингера при реакторном культивировании штаммов. Индекс дилятации на изолированной петле кишечника поросенка составляет: для штамма ВГНКИ N 334-37/12 1,6-2,0; ВГНКИ N 397-37/14 1,0-1,2; ВГНКИ N 454-37/17 1,0-1,6 и ВГНКИ N 453-37/17 1,8-2,4. Оптимальными условиями, для которых наблюдается максимальное накопление ТЛ токсина в культуральной жидкости, являются: рН среды от 7,0 до 8,0 и температуре 36-38^оС. ТЛ токсин представляет собой белок и состоит из субъединиц с мол.м. 22000-24000 дальтон. В лиофилизированном препарате содержит 97-98% белка; 0,5-1% липидов и 1,5-2% углеводов. ТЛ токсин термолабилен и полностью инактивируется при температуре 60^оС в течение 15 мин. Изоэлектрическая точка ТЛ токсина при рН 4,0. Серологическую активность термолабильного токсина, содержащегося в среде культивирования, определяют в РДП с моноспецифической антисывороткой (титр 1:32). Титр ТЛ токсина в этой реакции составляет (1:4)-(1:8). Термолабильный токсин имеет антигенное родство с токсином холерного вибриона и дает перекрестные реакции с сыворотками, полученными к этому антигену.The strains of Escherichia coli VGNKI N 334-37 / 12, VGNKI N 397-37 / 14, VGNKI N 454-37 / 17 and VGNKI N 453-37 / 17 are active producers of thermolabile toxin. Thermolabile toxin stably accumulates in the Hottinger broth during reactor cultivation of strains. The dilatation index on an isolated loop of the intestine of the piglet is: for strain VGNKI N 334-37 / 12 1.6-2.0; VGNKI N 397-37 / 14 1.0-1.2; VGNKI N 454-37 / 17 1.0-1.6 and VGNKI N 453-37 / 17 1.8-2.4. Optimum conditions for which there is the maximum accumulation TL toxin in the culture fluid, are: pH 7.0 to 8.0 and a temperature of 36-38 ^° C TL toxin is a protein and consists of subunits having a molecular weight 22000-24000 Daltons. The lyophilized preparation contains 97-98% protein; 0.5-1% lipids and 1.5-2% carbohydrates. TL thermolabile toxin and completely inactivated at ⁶⁰ ° C for 15 min. The isoelectric point of the toxin TL at pH 4.0. The serological activity of the thermolabile toxin contained in the culture medium is determined in RDP with monospecific antiserum (titer 1:32). The titer of toxin TL in this reaction is (1: 4) - (1: 8). The thermolabile toxin is antigenically related to the cholera vibrio toxin and cross-reacts with the sera obtained for this antigen.

Штаммы Escherichia coli ВГНКИ N 305-37/11 и ВГНКИ N 398-37/14 являются активными продуцентами термостабильного токсина, который стабильно накапливается в бульоне Хоттингера при культивировании в реакторе. Индекс дилятации на изолированной петле кишечника кролика после введения прогретого (80^оС 20 мин) токсина составляет: для штамма ВГНКИ N 305-37/11 1,2-1,5 и ВГНКИ N 398-37/14 1,0-1,2. Оптимальными условиями, при которых наблюдается максимальное накопление ТС токсина в культуральной жидкости, являются: рН среды 8,0-8,5 и температуре 36-36,5^оС. ТС токсин представляет собой низкомолекулярный белок и состоит из субъединиц с мол.м. 4400-5100 дальтон. В лиофилизированном препарате содержитcя 93-94% белка; 4-5% липидов и 1-2% углеводов. ТС токсин термолабилен и инактивируется при температуре 100^оС в течение 30 мин. Изоэлектрическая точка ТС токсина при рН 10. Титр ТС токсина в РДП с моноспецифической антисывороткой (титр 1:16) составляет 1:4 1:8. Термолабильный и термостабильный анатоксины входят в состав вакцины как и адгезивные антигены в качестве основных иммуногенных компонентов и предназначены для стимуляции образования антител, нейтрализующих действие токсинов эшерихий.The strains of Escherichia coli VGNKI N 305-37 / 11 and VGNKI N 398-37 / 14 are active producers of thermostable toxin, which stably accumulates in the Hottinger broth when cultured in a reactor. Dilatation index isolated rabbit intestinal loop after administration warmed (80 ^{° C} for 20 minutes) toxin is: for strain VGNKI N 305-37 / 11 and VGNKI 1.2-1.5 N 398-37 / 14 1,0-1, 2. The optimal conditions under which there is a maximum accumulation of TS of the toxin in the culture fluid are: pH 8.0-8.5 and a temperature of 36-36.5 ^о С. TS toxin is a low molecular weight protein and consists of subunits with mol.m. 4400-5100 Daltons. The lyophilized preparation contains 93-94% protein; 4-5% lipids and 1-2% carbohydrates. TC toxin thermolabile and is inactivated at ¹⁰⁰ ° C for 30 min. The isoelectric point of the TS of the toxin at pH 10. The titer of the TS of the toxin in the RDP with monospecific antiserum (titer 1:16) is 1: 4 1: 8. Thermolabile and thermostable toxoids are included in the vaccine as well as adhesive antigens as the main immunogenic components and are intended to stimulate the formation of antibodies that neutralize the action of Escherichia toxins.

П р и м е р 1. Способ изготовления вакцины против эшерихиоза животных заключается в следующем. PRI me R 1. A method of manufacturing a vaccine against escherichiosis of animals is as follows.

Реактивацию штаммов и приготовление матровых расплодок проводят в соответствии с действующей Инструкцией по изготовлению и контролю поливалентной гидрооксиалюминиевой формолтиомерсаловой вакцины против колибактериоза (эшерихиоза) поросят, телят, ягнят, утвержденной ГУВ МСХ СССР 16 июня 1987 г. Штаммы выращивают раздельно в бульоне Хоттингера, содержащим аминный азот 150-200 мг/% триптофан 50-100 мг/% при рН 7,8-8,0. Способ получения адгезивных антигенов и токсинов заключается в следующем. Выращенные в реакторах штаммы NN 397-37/14, 398-37/14, 453-37/17, 454-37/17 отделяют от культуральной жидкости на сепараторе или центрифуге при 10-15 тыс.об/мин. Культуральную жидкость сливают в отдельную емкость и определяют концентрацию ТЛ и ТС токсинов в РДП. Титр термолабильного и термостабильного токсинов в культуральной жидкости должен быть не менее (1:4)-(1:8). Бактериальную массу штаммов ресуспендируют в фосфатно-мочевинном буфере до концентрации не менее 100 млрд/см³ микробных клеток; прогревают при температуре 60-65^оС в течение 20-25 мин; супернатант отделяют от бактериальной массы сепарированием при 10-15 тыс. об/мин и проверяют на концентрацию адгезивного антигена в РДП. Титр каждого антигена в супернатанте должен быть не менее 1:8-1:16. Полученные супернатанты смешивают в разных частях, консервируют формалином до 0,3% -ной концентрации и используют для изготовления вакцины. Бактериальную массу утилизируют. В выращенных культурах штаммов N 305-37/11 и N 334-37/12 определяют концентрацию микробных тел и разбавляют культуральной жидкостью полученной при выращивании штаммов 397-37/14, 398-37/14, 453-37/17, 454-37/17 до концентрации 15,0-16,0 млрд/см³ микробных тел. Культуры штаммов N 305-37/11 и N 334-37/12 cмешивают в равных частях, добавляют формалин до 0,3%-ной концентрации, выдерживают 15-16 дней при температуре 37-38^оС, затем добавляют содержащий адгезивные антигены супернатант до 25-30%-ной концентрации, гидроокись алюминия 6%-ную до 30%-ной концентрации и дополнительно формалин до 0,12-0,15% -ной концентрации. Доводят рН 10%-ным раствором NaoH до 7,2-7,4, оставляют вакцину при температуре 10-22^оС и проводят контроль на стерильность. Стерильную вакцину расфасовывают во флаконы при включенной мешалке, закрывают резиновыми пробками, обкатывают металлическими колпачками и этикетируют.Reactivation of strains and preparation of brood seedlings is carried out in accordance with the current Instructions for the manufacture and control of polyvalent hydroxyaluminium formolthiomersal vaccine against colibacteriosis (Escherichiosis) of piglets, calves, lambs, approved by the GUV of the USSR Ministry of Agriculture on June 16, 1987. Strains are grown separately in Hottinger amine broth, 150-200 mg /% tryptophan 50-100 mg /% at pH 7.8-8.0. A method of producing adhesive antigens and toxins is as follows. The strains NN 397-37 / 14, 398-37 / 14, 453-37 / 17, 454-37 / 17 grown in the reactors are separated from the culture fluid in a separator or centrifuge at 10-15 thousand rpm. The culture fluid is poured into a separate container and determine the concentration of TL and TS toxins in the RDP. The titer of thermolabile and thermostable toxins in the culture fluid should be at least (1: 4) - (1: 8). The bacterial mass of the strains is resuspended in phosphate-urea buffer to a concentration of at least 100 billion / cm ³ microbial cells; warm at a temperature of 60-65 ^about C for 20-25 minutes; the supernatant is separated from the bacterial mass by separation at 10-15 thousand rpm and checked for the concentration of adhesive antigen in the RDP. The titer of each antigen in the supernatant should be at least 1: 8-1: 16. The resulting supernatants are mixed in different parts, canned with formalin to a 0.3% concentration and used to make the vaccine. The bacterial mass is disposed of. In the grown cultures of strains N 305-37 / 11 and N 334-37 / 12, the concentration of microbial bodies is determined and diluted with the culture fluid obtained by growing strains 397-37 / 14, 398-37 / 14, 453-37 / 17, 454-37 / 17 to a concentration of 15.0-16.0 billion / cm ³ microbial bodies. Cultures of strains N 305-37 / 11 and N 334-37 / 12 cmeshivayut in equal parts, was added formalin to 0.3% concentration, can withstand 15-16 days at 37-38 ^{° C,} then added the supernatant containing the adherent antigens to 25-30% concentration, aluminum hydroxide 6% to 30% concentration and additional formalin to 0.12-0.15% concentration. The pH is adjusted with 10% NaoH solution to 7.2-7.4, the vaccine is left at a temperature of 10-22 ^C, and are monitored for sterility. The sterile vaccine is packaged in vials with the stirrer turned on, closed with rubber stoppers, wrapped in metal caps and labeled.

Расфасованную вакцину проверяют на стерильность, безвредность и активность. The packaged vaccine is checked for sterility, safety and activity.

Полученная вакцина имеет следующий компонентный состав:
суспензия штамма в культуральной среде N 305-37/1 (078:K80) (микробных клеток) 4,05 х 10¹²-5,0 х 10¹²
суспензия штамма в культуральной среде N 334-37/12 (0141:K87:K88) (микробных клеток) 4,5 х 10¹²-5,0 х 10¹²
адгезивный антиген К88 в фосфатно-мочевинном буфере с титром в РДП 1:8-1:16 60-80 см³
адгезивный антиген К99 в фосфатно-мочевинном буфере с титром с РДП 1:8-1:16 60-80 см³
адгезивный антиген 987Р в фосфатно-мочевинном буфере с титром в РДП 1:8-1: 16 60-80 см³
адгезивный антиген F41 в фосфатно-мочевинном буфере с титром в РДП 1:8-1:16 60-80 см³
гидрат окиси алюминия 6%-ный 270-320 см³
формалин 2,7-3,2 см³
культуральная жидкость (бульон Хоттингера) с термолабильным и термостабильным анатоксинами (титр в РДП (1:4)-(1:8) до 1 л.The resulting vaccine has the following component composition:
suspension of strain in culture medium N 305-37 / 1 (078: K80) (microbial cells) 4.05 x 10 ¹² -5.0 x 10 ¹²
suspension of the strain in a culture medium N 334-37 / 12 (0141: K87: K88) (microbial cells) 4.5 x 10 ¹² -5.0 x 10 ¹²
adhesive antigen K88 in phosphate-urea buffer with a titer in RDP 1: 8-1: 16 60-80 cm ³
adhesive antigen K99 in phosphate-urea buffer with a titer with an RDP of 1: 8-1: 16 60-80 cm ³
adhesive antigen 987P in phosphate-urea buffer with a titer in RDP 1: 8-1: 16 60-80 cm ³
adhesive antigen F41 in phosphate-urea buffer with a titer in RDP 1: 8-1: 16 60-80 cm ³
alumina hydrate 6% 270-320 cm ³
formalin 2.7-3.2 cm ³
culture fluid (Hottinger broth) with thermolabile and thermostable toxoids (titer in the RDP (1: 4) - (1: 8) up to 1 liter.

Вакцина приведенного состава содержит необходимое количество протектиновых антигенов, обеспечивающее формирование иммунитета высокой напряженности у животных различных видов по отношению к энтеропатогенным эшерихиям независимо от их серогрупповой принадлежности. Вакцина содержит соматические антигены 078 и 0141 в форме анаэндотоксинов, белковые адгезивные антигены К88, К99, 987Р, F41 широко распространенные полисахаридные капсульные антигены К80 и К87, термолабильный и термостабильный анатоксины. The vaccine of the given composition contains the necessary amount of protectin antigens, which ensures the formation of high-tension immunity in animals of various species with respect to enteropathogenic Escherichia, regardless of their serogroup affiliation. The vaccine contains somatic antigens 078 and 0141 in the form of anaendotoxins, protein adhesive antigens K88, K99, 987P, F41 widely distributed polysaccharide capsular antigens K80 and K87, thermolabile and thermostable toxoids.

П р и м е р 2. Концентрацию адгезивных и капсульных антигенов в предлагаемой вакцине против эшерихиоза, в отличие от прототипа, проверяли на кроликах. С этой целью кроликами массой 3-3,5 кг вводят внутрибрюшинно (можно внутримышечно) вакцину в дозе 0,75 см³. Через 24-27 дней у кроликов берут кровь и исследуют сыворотку в реакции агглютинации, используя в качестве антигенов производственные и моноплазмидные штаммы продуценты адгезивных антигенов. Результаты приведены в табл.2.PRI me R 2. The concentration of adhesive and capsular antigens in the proposed vaccine against Escherichiosis, in contrast to the prototype, was tested on rabbits. To this end, rabbits weighing 3-3.5 kg are injected intraperitoneally (intramuscularly) with a vaccine at a dose of 0.75 cm ³ . After 24-27 days, blood is taken from rabbits and the serum is examined in the agglutination reaction, using production and monoplasmid strains as producers of adhesive antigens. The results are shown in table.2.

Из приведенных материалов видно, что предлагаемая вакцина вызывает образование антител и адгезивным антигенам К88, К99, 987Р, F41 в титре от 1: 367,6 до 1:735,2, а к соматическим и полисахаридным капсульным антигенам 1: 211,1 278,6, при полном отсутствии антител у кроликов после введения поливалентной ГОА формолвакцины против колибактериоза (эшерихиоза) телят, ягнят и поросят к антигенам 987Р и F41 и значительно меньшем содержании к адгезивным антигенам К88 и К99, соматическим и полисахаридным капсульным антигенам. From the above materials it is seen that the proposed vaccine causes the formation of antibodies and adhesive antigens K88, K99, 987P, F41 in the titer from 1: 367.6 to 1: 735.2, and to somatic and polysaccharide capsular antigens 1: 211.1 278, 6, in the complete absence of antibodies in rabbits after administration of the polyvalent GOA of the formolvaccine against colibacteriosis (Escherichiosis) of calves, lambs and piglets to antigens 987P and F41 and significantly lower content to adhesive antigens K88 and K99, somatic and polysaccharide capsule antigens.

П р и м е р 3. Эффективность вакцины против эшерихиоза животных (Коли-Вак К88, К99, 987Р, F41 и ТЛ и ТС-анатоксины) проверена в остром опыте на поросятах. В опыт взято 12 свиноматок, из которых 5 вакцинировали предлагаемой вакциной, 5 вакциной прототипом и 2 оставлены не вакцинированными. В опыт отобрано 52 поросенка от вакцинированных и 20 от невакцинированных свиноматок. Поросят всех групп заражали перорально смесью контрольных штаммов эшерихий, продуцирующих адгезивные антигены, ТС и ТЛ токсины, в дозе ЭЛД₅₀. В группе поросят, иммунизированных предлагаемой вакциной, заболели 11, пали 4 и выжили 48 поросят; в группе животных, вакцинированных коммерческой вакциной заболели 26, пали 14 и выжили 38 поросят. В контрольной группе соответственно 20, 16 и 4 поросенка. Таким образом, выживаемость поросят при вакцинации предлагаемой вакциной составила 92,3% против 73,1% у поросят, иммунизированных коммерческой вакциной и 20% в контроле.PRI me R 3. The effectiveness of the vaccine against escherichiosis of animals (Koli-Wak K88, K99, 987P, F41 and TL and TS-toxoids) was tested in an acute experiment on piglets. The experiment took 12 sows, of which 5 were vaccinated with the proposed vaccine, 5 vaccine prototype and 2 left unvaccinated. 52 pigs from vaccinated and 20 from unvaccinated sows were selected for the experiment. Piglets of all groups were orally infected with a mixture of control Escherichia strains producing adhesive antigens, TS and TL toxins at a dose of ELD ₅₀ . In the group of piglets immunized with the proposed vaccine, 11 fell ill, 4 fell and 48 piglets survived; in the group of animals vaccinated with a commercial vaccine, 26 fell ill, 14 fell, and 38 piglets survived. In the control group, respectively, 20, 16 and 4 pigs. Thus, the survival rate of piglets during vaccination with the proposed vaccine was 92.3% versus 73.1% in piglets immunized with a commercial vaccine and 20% in the control.

П р и м е р 4. Способ профилактики эшерихиоза включает иммунизацию животных путем двукратного внутримычшечного введения с интервалом 10-15 дней вакцины против эшерихиоза животных (Коли-Вак К88, К99, 987Р, F41, ТЛ и ТС-анатоксины), содержащей суспензию в культуральной среде штаммов Escherichia coli ВГНКИ N 305-37/11, ВГНКИ N 334-37/12 в концентрации 9,0 х 10⁹-10¹⁰ микробных клеток в 1 см³; адгезивные антигены К88, К99, 987Р, F41 в фосфатно-мочевинном буфере с титром в РДП не менее (1:8)-(1:16); термолабильный и термостабильный анатоксины в культуральной жидкости с титром в РДП не менее (1: 4)-(1:8); гидрат окиси алюминия 6%-ный до 27-32% формалин 0,27-0,32%-ной концентрации.PRI me R 4. A method for the prevention of Escherichiosis includes immunization of animals by double intramuscular administration with an interval of 10-15 days of a vaccine against animal Escherichiosis (Koli-Vak K88, K99, 987P, F41, TL and TS-toxoids) containing suspension in the culture medium of strains of Escherichia coli VGNKI N 305-37 / 11, VGNKI N 334-37 / 12 at a concentration of 9.0 x 10 ⁹ -10 ¹⁰ microbial cells in 1 cm ³ ; adhesive antigens K88, K99, 987P, F41 in phosphate-urea buffer with a titer in the RDP not less than (1: 8) - (1:16); thermolabile and thermostable toxoids in the culture fluid with a titer in the RDP not less than (1: 4) - (1: 8); alumina hydrate 6% to 27-32% formalin 0.27-0.32% concentration.

Вакцину вводят животным в следующих дозах (табл.3). The vaccine is administered to animals in the following doses (table 3).

Эффективность вакцинации оценивают по количеству заболевших и павших от эшерихиоза животных. Результаты приведены в табл.4. The effectiveness of vaccination is estimated by the number of sick and dead animals from Escherichiosis. The results are shown in table 4.

Из табл. 4 видно, что иммунизация вакциной против эшерихиоза животных (Коли-Вак К88, К99, 987Р, F41, ТЛ и ТС-анатоксины) в указанных дозах обеспечивает более высокую сохранность по сравнению с поливалентной ГОА формолвакциной против колибактериоза (эшерихиоза) телят, ягнят и поросят. Сохранность составила поросят соответственно 95,5% против 87,9% телят 98% против 92,2% заболеваемость поросят 16,2% против 38,4% телят 11,2% против 33,3% From the table. Figure 4 shows that immunization with the vaccine against Escherichiosis in animals (Koli-Vak K88, K99, 987P, F41, TL and TS-toxoids) in the indicated doses provides higher preservation compared to polyvalent GOA formolvaccine against colibacteriosis (escherichiosis) of calves, lambs and piglets . The preservation rate was piglets, respectively, 95.5% against 87.9% of calves 98% against 92.2%, the incidence of pigs 16.2% against 38.4% of calves 11.2% against 33.3%

Claims

ANIMAL ECHERICHIOSIS VACCINE, including Escherichia antigens, formalin, aluminum hydroxide and culture medium, characterized in that it contains K 88 adhesive antigen and phosphate-urea buffer with a titer in RDP of 1 8 1 16 isolated from Escherichia coli strain N 453-37 / 17, which is a protein from subunits with a mol.m. 25000 26000 D, rod-shaped structure of 4.5 nm in diameter and up to 120 nm in length, with an isoelectric point of 3.5, adhesive antigen K 99 in phosphate-urea buffer with a titer in RDP 1 8 1 16 isolated from Escherichia coli strain VGNKI N 454-37 / 17, which is a protein from subunits with a mol.m. 18500 - 22500 D rod-shaped structure, 8.4 nm in diameter and up to 130 nm in length, with an isoelectric point of 9.5, adhesive antigen 987 P in phosphate-urea buffer with a titer in RDP of 1 8 1 16 isolated from Escherichia coli strain VGNKI N 397-37 / 14, which is a protein from subunits with mol.m. 19400 - 22500 D, rod-shaped structure, 7 nm in diameter and up to 200 nm in length, with an isoelectric point of 3.7, adhesive antigen F 41 in phosphate-urea buffer with a titer in RDP 1 8 1 16 isolated from Escherichia coli strain VGNKI N 398-37 / 14, which is a protein from subunits with a mol.m. 28000 - 29000 D, rod-shaped structure, 4 nm in diameter and up to 110 nm in length, with an isoelectric point of 4.0, thermolabile toxoid in a culture medium with a titer in RDP 1 4 1 8 obtained by culturing Escherichia coli strains VGNKI N 334- 37/12, VGNKI N 397-37 / 14, VGNKI N 454-37 / 14 and VGNKI N 453-37 / 17, which is a protein from subunits with mol.m. 22000 24000 D and isoelectric point 4.0, thermostable toxoid in a culture medium with a titer in RDP 1 4 1 8 obtained by culturing Escherichia coli strains VGNKI N 305-37 / 11 and VGNKI N 398-37 / 14, which is a protein from subunits with a pier. m. 4400 5100 and an isoelectric point of 10.0, a suspension of cells of the strain of Escherichia coli VGNKI N 305-37 / 11 in the culture medium, a suspension of cells of the strain of the Escherichia coli strain VGNKI N 334-37 / 12 in the culture medium with the following content of components, 1 l vaccines:
Suspension of cells of the strain Escherichia coli VGNKI N 305-37 / 11 in a culture medium, · 10 ¹ ² MK 4.5 5.0
Suspension of cells of the strain Escherichia coli VGNKI N 334-37 / 12 in a culture medium, · 10 ¹ ² MK 4.5 5.0
Adhesive antigen K 88 in phosphate-urea buffer with a titer in RDP 1 8 1 16, cm ³ 60 80
Adhesive antigen K 99 in phosphate-urea buffer with a titer in RDP 1 8 1 16, cm ³ 60 80
Adhesive antigen 987 P in phosphate-urea buffer with a titer in RDP 1 8 1 16, cm ³ 60 80
Adhesive antigen F 41 in phosphate-urea buffer with a titer in RDP 1 8 1 16, cm ³ 60 80
Aluminum hydroxide 6%, cm ³ 270 320
Formalin, cm ³ 2.7 3.2
Thermolabile and thermostable toxoids in a culture medium with a titer in RDP 1 4 1 8, l Up to 1