RU2039818C1 - Method for isolation of superoxydismutase of cells of eucariots - Google Patents
Method for isolation of superoxydismutase of cells of eucariots Download PDFInfo
- Publication number
- RU2039818C1 RU2039818C1 RU92009197A RU92009197A RU2039818C1 RU 2039818 C1 RU2039818 C1 RU 2039818C1 RU 92009197 A RU92009197 A RU 92009197A RU 92009197 A RU92009197 A RU 92009197A RU 2039818 C1 RU2039818 C1 RU 2039818C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- superoxide dismutase
- isolation
- fraction
- enzyme
- carried out
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии и касается выделения фермента супероксиддисмутазы из его природных источников. The invention relates to biotechnology and for the isolation of the superoxide dismutase enzyme from its natural sources.
Супероксиддисмутаза перспективный фермент для использования в медицине как лекарственного средства и для применения в пищевой промышленности в качестве консерванта. Superoxide dismutase is a promising enzyme for use in medicine as a medicine and for use in the food industry as a preservative.
Супероксиддисмутаза содержится в эритроцитах крови, в животных тканях (в печени, почках, легких и других органах животных), может биосинтезироваться такими микроорганизмами, как бактерии и дрожжи. Superoxide dismutase is found in red blood cells, in animal tissues (in the liver, kidneys, lungs and other organs of animals), and can be biosynthesized by microorganisms such as bacteria and yeast.
В зависимости от используемого источника супероксиддисмутазы способы выделения и очистки этого фермента могут существенно отличаться друг от друга. Depending on the source of superoxide dismutase used, the methods for isolation and purification of this enzyme can differ significantly from each other.
Известен, например, способ выделения супероксиддисмутазы из животных тканей, заключающийся в том, что исходную ткань гомогенизируют в ацетоне, собирают ацетоновый осадок, гомогенизируют его в фосфатном буфере, гомогенат подкисляют и осветляют. Раствор насыщают сульфатом аммония, добавляют ацетон, декантируют белковую фракцию, собравшуюся в верхнем слое, и растворяют ее в воде. После 50%-ного насыщения раствора сульфатом аммония отделяют и отбрасывают осадок, а затем осаждают активную фракцию при 90%-ном насыщении раствора сульфатом аммония, еще раз растворяют осадок в воде и очищают раствор диализом. Диализат пропускают через колонну с ДЭ-52 целлюлозой, элюируют фермент фосфатным буфером, пропускают через колонку с ДЭАЭ А-50 сефадексом и вновь элюируют целевой продукт буфером. Раствор пропускают через сефадекс G-75 и концентрируют супероксиддисмутазу на ДЭ-52 целлюлозе. For example, there is a known method for the isolation of superoxide dismutase from animal tissues, namely, that the initial tissue is homogenized in acetone, an acetone precipitate is collected, it is homogenized in phosphate buffer, the homogenate is acidified and clarified. The solution is saturated with ammonium sulfate, acetone is added, the protein fraction collected in the upper layer is decanted and dissolved in water. After 50% saturation of the solution with ammonium sulfate, the precipitate is separated and discarded, and then the active fraction is precipitated at 90% saturation of the solution with ammonium sulfate, the precipitate is again dissolved in water and the solution is purified by dialysis. The dialysate is passed through a column of DE-52 cellulose, the enzyme is eluted with phosphate buffer, passed through a column of DEAE A-50 by Sephadex and the target product is again eluted with buffer. The solution was passed through Sephadex G-75 and superoxide dismutase was concentrated on DE-52 cellulose.
Выход чистого препарата супероксиддисмутазы составляет в среднем 65-67% от исходного количества фермента в гомогенате, его удельная активность равняется 3500-3900 Е/мг белка. The yield of the pure superoxide dismutase preparation is on average 65-67% of the initial amount of the enzyme in the homogenate; its specific activity is 3500-3900 U / mg protein.
Из 1 кг ткани можно получить 50-300 мг фермента в зависимости от используемого исходного материала [1]
Относительными недостатками способа являются его многостадийность и длительность, процесс продолжается 3 дня.From 1 kg of tissue, you can get 50-300 mg of the enzyme, depending on the source material used [1]
The relative disadvantages of the method are its multi-stage and duration, the process lasts 3 days.
Описан способ выделения супероксиддисмутазы из эритроцитов крови, заключающийся в том, что кровь подвергают гемолизу, к гемолизату при температуре 4оС быстро добавляют 0,8 объема смеси хлороформ этанол или хлористый метилен этанол (соотношение компонентов 3:5) и отделяют большинство посторонних белков. В надосадочную жидкость вносят примерно 300 г/л двузамещенного фосфата калия или натрия и оставляют до образования двух фаз.Discloses a method for isolating superoxide dismutase from red blood cells, which consists in the fact that blood hemolysis subjected to hemolysate at 4 ° C was rapidly added 0.8 volume of ethanol, chloroform or methylene chloride, ethanol (mixing ratio 3: 5) and separated most of the foreign proteins. About 300 g / l of disubstituted potassium or sodium phosphate are added to the supernatant and left to form two phases.
Верхнюю фазу отделяют, охлаждают до 4оС и обрабатывают 0,75 объемами охлажденного ацетона для осаждения сырого фермента.The upper phase is separated, cooled to 4 ° C and treated with 0.75 volumes of chilled acetone to precipitate the crude enzyme.
Осадок супероксиддисмутазы растворяют в воде и раствор подвергают диализу через мембрану, задерживающую вещества с мол.м. выше 10 кДа. The superoxide dismutase precipitate is dissolved in water and the solution is dialyzed through a membrane retaining substances from mol.m. above 10 kDa.
Диализат наносят на колонку ДЭАЭ-сефацела, уравновешенную фосфатным буфером с рН 7,8, целевой продукт элюируют фосфатным буфером и при необходимости повторно хроматографируют. The dialysate is applied to a column of DEAE-sephacel equilibrated with phosphate buffer with a pH of 7.8, the target product is eluted with phosphate buffer and, if necessary, rechromatographed.
Сырая супероксиддисмутаза, полученная осаждением ацетоном, имеет зеленоватый цвет в растворе и удельную активность 2000-2500 Е/мг белка, а очищенная супероксиддисмутаза обладает в растворе сине-зеленой окраской и удельной активностью 2600-3200 Е/мг белка. Crude superoxide dismutase obtained by precipitation with acetone has a greenish color in solution and a specific activity of 2000-2500 U / mg protein, and purified superoxide dismutase has a blue-green color in the solution and a specific activity of 2600-3200 U / mg protein.
Способ позволяет получить 35-40 мг сырого фермента или 26-32 мг очищенного фермента из 1 л крови [2]
Наиболее близким к предложенному изобретению по технической сущности можно признать способ выделения супероксиддисмутазы из биомассы дрожжей Saccharo- myces cerevisiae, предусматривающий разрушение дрожжевых клеток, обработку щелочной суспензии смесью хлороформ этанол и отделение осадка. В последующем к надосадочной жидкости добавляют двузамещенный фосфат калия, выдерживают систему до образования двух фаз водно-органической, содержащей фермент, и водной, содержащей соли. Сырую супероксиддисмутазу получают осаждением из водно-органической фазы ацетоном.The method allows to obtain 35-40 mg of crude enzyme or 26-32 mg of purified enzyme from 1 liter of blood [2]
The closest to the proposed invention in technical essence can be recognized as a method for the isolation of superoxide dismutase from Saccharomyces cerevisiae yeast biomass, which involves the destruction of yeast cells, treatment of an alkaline suspension with a mixture of chloroform ethanol and separation of the precipitate. Subsequently, disubstituted potassium phosphate is added to the supernatant, the system is maintained until the formation of two phases, aqueous-organic, containing the enzyme, and aqueous, containing salts. Crude superoxide dismutase is obtained by precipitation from the aqueous-organic phase with acetone.
Для дополнительной очистки солюбилизированный ацетоновый осадок наносят на колонку ДЭ-53 целлюлозы, элюируют фермент фосфатным буфером, элюат пропускают через колонку ДЭАЭ с А-50 сефадексом и вновь элюируют целевой продукт фосфатным буфером. For additional purification, a solubilized acetone precipitate was applied to a DE-53 cellulose column, the enzyme was eluted with phosphate buffer, the eluate was passed through a DEAE column with A-50 Sephadex, and the target product was again eluted with phosphate buffer.
В результате осуществления способа получают супероксиддисмутазу с удельной активностью до 3300 Е/мг белка. As a result of the method, superoxide dismutase with specific activity of up to 3300 U / mg of protein is obtained.
Выход очищенного фермента составляет до 163 мг с 1 кг абсолютно сухого веса дрожжевой биомассы [3]
Пооперационное сравнение двух последних упомянутых способов показывает их практически полную аналогию, хотя в одном случае супероксиддисмутазу выделяли из эритроцитов крови, а во втором случае из биомассы микроорганизмов.The yield of purified enzyme is up to 163 mg with 1 kg of absolutely dry weight of yeast biomass [3]
The operational comparison of the last two mentioned methods shows their almost complete analogy, although in one case superoxide dismutase was isolated from red blood cells, and in the second case from the biomass of microorganisms.
Это свидетельствует, в частности, о том, что принципиально могут существовать достаточно универсальные способы выделения супероксиддисмутазы из различных природных источников. This testifies, in particular, to the fact that, in principle, there can exist quite universal methods for isolating superoxide dismutase from various natural sources.
По этой же причине оба обсуждаемых способа обладают общим относительным недостатком многостадийностью и определенными технологическими сложностями практической реализации метода в промышленных масштабах. For the same reason, both discussed methods have a common relative disadvantage of multistage and certain technological difficulties in the practical implementation of the method on an industrial scale.
Цель изобретения упростить способ выделения супероксиддисмутазы и повысить его технологичность. The purpose of the invention is to simplify the method of isolation of superoxide dismutase and increase its manufacturability.
Цель была достигнута за счет того, что после разрушения клеток исходного биологического материала изолировали активную фракцию с мол. м. 10-100 кДа, сорбировали из нее целевой продукт на ионообменной смоле типа КБ-2Т, а из элюата осаждали примеси органическим растворителем. The goal was achieved due to the fact that after the destruction of the cells of the original biological material, the active fraction was isolated from mol. m. 10-100 kDa, the target product was sorbed from it on an ion-exchange resin of the KB-2T type, and impurities were precipitated from the eluate with an organic solvent.
Отличия и технологические преимущества предложенного способа перед известными становятся очевидными при анализе данных табл. 1. The differences and technological advantages of the proposed method over the known ones become apparent when analyzing the data in table. 1.
Четко видно, что предложенный способ проще и технологичнее любого из известных и, кроме того, более экологичен, так как сводит к минимуму использование органических растворителей и сокращает общий объем производственных отходов. It is clearly seen that the proposed method is simpler and more technologically advanced than any of the known ones and, in addition, is more environmentally friendly, since it minimizes the use of organic solvents and reduces the total amount of industrial waste.
Существенные отличия предложенного способа от известных показаны в табл. 2, в которой для большей наглядности сравниваются лишь принципиальные схемы выделения супероксиддисмутазы. Significant differences of the proposed method from the known are shown in table. 2, in which, for clarity, only the basic schemes for the isolation of superoxide dismutase are compared.
К числу явных существенных отличий предложенного способа от известных можно отнести следующие:
при первичном изолировании активной фракции, содержащей целевой продукт, критерием разделения активных и неактивных веществ, в соответствии с предложенным способом, служил непосредственно размер биологических молекул, а не их относительная способность к дегидратации, как в известных способах;
в процессе очистки изолированной активной фракции по предложенному способу первоначально осуществляют этап освобождения от примесей с помощью ионообменной смолы, а затем с помощью органического растворителя, в то время как известные способы предусматривают обратный порядок действий;
при фракционировании активной фракции органическим растворителем по предложенному способу добиваются осаждения посторонних примесей, а в известных способах фракционирование активной фракции органическими растворителями предполагает осаждение целевого продукта.Among the obvious significant differences of the proposed method from the known include the following:
during primary isolation of the active fraction containing the target product, the criterion for the separation of active and inactive substances, in accordance with the proposed method, was directly the size of the biological molecules, and not their relative ability to dehydration, as in the known methods;
in the process of purification of an isolated active fraction according to the proposed method, the step is first of releasing impurities using an ion exchange resin, and then using an organic solvent, while the known methods provide the reverse procedure;
when fractionating the active fraction with an organic solvent according to the proposed method, precipitation of foreign impurities is achieved, and in the known methods, fractionation of the active fraction with organic solvents involves the precipitation of the target product.
Сущность предложенного способа состоит в следующем. The essence of the proposed method is as follows.
Исходный биологический материал дезинтегрируют до разрушения клеток любым известным методом и клеточный дебрис удаляют. The starting biological material is disintegrated until the cells are destroyed by any known method, and the cell debris is removed.
В качестве исходного материала предпочтительнее использовать биомассу микроорганизмов, в частности дрожжей, но могут быть использованы и другие биоматериалы. It is preferable to use the biomass of microorganisms, in particular yeast, as the starting material, but other biomaterials can be used.
Из надосадочной жидкости изолируют активную фракцию с мол.м. 10-100 кДа. From the supernatant isolate the active fraction with a mol.m. 10-100 kDa.
Наиболее удобно изолировать эту фракцию методами ультрафильтрации, но принципиально этого можно достигнуть и иным путем. It is most convenient to isolate this fraction by ultrafiltration methods, but in principle this can be achieved in another way.
При выделении активной фракции с использованием техники ультрафильтрации надосадочную жидкость пропускают через мембрану, задерживающую молекулы с мол. м. большей 100 кДа, а затем через мембрану, пропускающую частицы с размером молекулы менее 10 кДа. When isolating the active fraction using the ultrafiltration technique, the supernatant is passed through a membrane retaining molecules with a mol. m more than 100 kDa, and then through a membrane passing particles with a molecular size of less than 10 kDa.
Можно устанавливать и дополнительные мембраны для предварительного удаления более крупных молекул для повышения эффективности процесса. Additional membranes can be installed to pre-remove larger molecules to increase process efficiency.
Целесообразность изолирования именно фракции с размерами молекул 10-100 кДа обосновывается результатами проведенного экспериментального излучения распределения молекул супероксиддисмутазы в различных фракциях фильтрата гомогенатов исходного биологического материала. В качестве примера в табл. 3 приводятся сведения о распределении молекул суперокасиддисмутазы по фракциям гомогената дрожжей Kluyveromyces marxianus var.bulgaricus при различных вариантах ультрафильтрационного фракционирования. The expediency of isolating precisely the fractions with molecular sizes of 10-100 kDa is justified by the results of the experimental radiation of the distribution of superoxide dismutase molecules in various fractions of the homogenate filtrate of the starting biological material. As an example, in table. 3, information is given on the distribution of supercassid dismutase molecules over fractions of the yeast homogenate Kluyveromyces marxianus var.bulgaricus for various ultrafiltration fractionations.
Изолированную активную фракцию 10-100 кДа вводят в контакт с ионообменой смолой типа КБ-2Т, на которой фермент сорбируется. An isolated active fraction of 10-100 kDa is brought into contact with an ion-exchange resin of the KB-2T type, on which the enzyme is sorbed.
Ионообменная смола КБ-2Т слабокислый катионит на основе сополимера метилакрилата с тетравиниловым эфиром пентаэритрита. KB-2T ion exchange resin weakly acid cation exchange resin based on a copolymer of methyl acrylate with pentaerythritol tetravinyl ester.
Смола предварительно уравновешивается 2-10 мМ фосфатным буфером рН 5,4-6,4. The resin is pre-equilibrated with 2-10 mM phosphate buffer pH 5.4-6.4.
Супероксиддисмутазу элюируют со смолы солевым раствором, например 0,1-0,25 М раствором хлористого натрия с рН 7,0-7,8. Superoxide dismutase is eluted from the resin with a saline solution, for example a 0.1-0.25 M sodium chloride solution with a pH of 7.0-7.8.
Наибольшее достоинство ионообменных смол типа КБ-2Т состоит в том, что очистку фермента можно эффективно проводить в стационарных условиях (в объеме), не прибегая к использованию ионообменных колонок (т.е. не в динамическом режиме), о чем свидетельствуют данные табл. 4. The greatest advantage of KB-2T type ion-exchange resins is that the enzyme can be cleaned efficiently under stationary conditions (in volume) without resorting to ion-exchange columns (i.e., not in a dynamic mode), as evidenced by the data in Table. 4.
Полученные результаты свидетельствуют о высокой эффективности очистки суперокасиддисмутазы ионообменным методом в стационарных условиях, что имеет большое практическое значение при осуществлении предложенного способа в производственных масштабах. The results obtained indicate a high efficiency of purification of supercasside dismutase by the ion-exchange method under stationary conditions, which is of great practical importance in the implementation of the proposed method on an industrial scale.
Для ионообменной очистки в стационарном режиме активную фракцию, полученную изоляцией соединений с мол.м. 10-100 кДа, подвергают контакту с ионообменной смолой, взятой из расчета 15000 Е/г дренированной смолы. Время контакта составляет, как правило, 30 мин. Периодически систему перемешивают. For ion-exchange purification in stationary mode, the active fraction obtained by isolation of compounds with mol.m. 10-100 kDa, is subjected to contact with an ion exchange resin, taken at the rate of 15000 U / g of drained resin. The contact time is usually 30 minutes. The system is periodically mixed.
Смолу предварительно уравновешивают 2-10 мМ фосфатным буфером с рН 5,4-6,4. Однако могут быть использованы и другие буферные растворы. The resin is pre-equilibrated with 2-10 mm phosphate buffer with a pH of 5.4-6.4. However, other buffer solutions may be used.
Исходный раствор удаляют, смолу промывают тем же буфером до отсутствия в промывных водах белка. The stock solution is removed, the resin is washed with the same buffer until there is no protein in the washings.
Фермент десорбируют со смолы 0,05-0,2 М солевым раствором при рН 7,0-7,8. В простейшем случае десорбцию можно проводить 0,1 М раствором хлористого натрия с рН 7,2-7,6. The enzyme is desorbed from the resin with 0.05-0.2 M saline at a pH of 7.0-7.8. In the simplest case, desorption can be carried out with a 0.1 M solution of sodium chloride with a pH of 7.2-7.6.
В принципе ионообменную очистку супероксиддисмутазы можно осуществлять и в динамическом режиме, используя колонки различной конфигурации. In principle, ion exchange purification of superoxide dismutase can also be carried out in a dynamic mode using columns of various configurations.
В элюат медленно при перемешивании добавляют органический растворитель, смешивающийся с водой, до конечной концентрации 25-30 об. Предпочтительно использовать этанол, но допустимо применение ацетона, метанола и других растворителей. An organic solvent miscible with water is slowly added to the eluate with stirring to a final concentration of 25-30 vol. Ethanol is preferred, but acetone, methanol and other solvents are acceptable.
После некоторой выдержки при комнатной или повышенной температуре осаждаются денатурированные посторонние белки, которые отделяют и отбрасывают. After some exposure at room or elevated temperature, denatured foreign proteins precipitate, which are separated and discarded.
При конечной концентрации органического растворителя ниже 25 об. денатурация примесных белков протекает неполно, и это снижает эффективность очистки. При повышении содержания органического растворителя выше 30 об. может происходить частичное осаждение супероксиддисмутазы. At a final concentration of organic solvent below 25 vol. denaturation of impurity proteins is incomplete, and this reduces the cleaning efficiency. With an increase in the content of organic solvent above 30 vol. partial precipitation of superoxide dismutase may occur.
Наибольший эффект денатурации примесных белков достигается в случае выдерживания реакционной смеси при температуре 38 ± 1оС. Особенно пригоден этот вариант очистки супероксиддисмутазы при выделении ее из биомассы дрожжей Kluyveromyces marxianus var.bulgaricus, ряд штаммов которых образует термостабильный фермент.The greatest effect denaturation of contaminating proteins is achieved in the case of keeping the reaction mixture at a temperature of 38 ± 1 ° C. A particularly suitable embodiment of the purification of superoxide dismutase at its separation from biomass of yeast Kluyveromyces marxianus var.bulgaricus, a number of strains of which forms the thermostable enzyme.
Некоторые сведения о влиянии концентрации органического растворителя и температуры обработки на эффективность очистки супероксиддисмутазы представлены в табл. 5. Some information on the influence of the concentration of organic solvent and processing temperature on the purification efficiency of superoxide dismutase is presented in Table. 5.
После отделения денатурированных примесных белков раствор, содержащий очищенную супероксидисмутазу, диализуют против дистиллированной воды и лиофильно высушивают. After separation of the denatured impurity proteins, the solution containing purified superoxide dismutase is dialyzed against distilled water and freeze-dried.
Эффективность предложенного способа в целом и отдельных его этапов поясняется табл. 6. The effectiveness of the proposed method as a whole and its individual stages is illustrated in table. 6.
В результате осуществления предложенного способа получают супероксиддисмутазу с удельной активностью 3000- 3100 Е/мг белка. As a result of the implementation of the proposed method receive superoxide dismutase with a specific activity of 3000-3100 U / mg protein.
Выход фермента составляет примерно 1 г из 1 кг биомассы дрожжей по абсолютно сухому весу или около 52,0% от содержания в гомогенате биомассы. The yield of the enzyme is about 1 g of 1 kg of yeast biomass in absolutely dry weight or about 52.0% of the content in the biomass homogenate.
Для удобства сравнения технико-экономические показатели предложенного и известных способов выделения супероксиддисмутазы приведены в табл. 7. For ease of comparison, the technical and economic indicators of the proposed and known methods for the isolation of superoxide dismutase are given in table. 7.
Анализируя представленные показатели, можно заключить, что предложенный способ позволяет увеличить выход фермента с высокой удельной активностью. Analyzing the presented indicators, we can conclude that the proposed method allows to increase the yield of the enzyme with high specific activity.
Возможность достижения поставленной цели была связана с необходимостью использования всех специфических приемов предложенного способа, т.е. при условии первоначальной изоляции соединений с мол.м. от 10 до 100 кДа, последующей их очистки на смоле типа КБ-2Т и завершающего осаждения посторонних примесей органическим растворителем. Несоблюдение, в частности, последовательности этих операций приводит к невозможности получения удовлетворительного результата, подтверждением чего служат материалы табл. 8. The ability to achieve this goal was associated with the need to use all the specific techniques of the proposed method, i.e. subject to initial isolation of compounds with mol.m. from 10 to 100 kDa, their subsequent purification on a resin of type KB-2T and the final deposition of impurities with an organic solvent. Non-observance, in particular, of the sequence of these operations leads to the inability to obtain a satisfactory result, as evidenced by the materials in table 8.
Кроме снижения выхода фермента использование последних двух вариантов способа требует увеличения расхода органических растворителей примерно на порядок, что затрудняет дальнейшие этапы выделения фермента и существенно увеличивает объем производственных отходов. In addition to reducing the yield of the enzyme, the use of the last two variants of the method requires an increase in the consumption of organic solvents by approximately an order of magnitude, which complicates the further stages of the isolation of the enzyme and significantly increases the volume of production waste.
Необходимость выполнения всех отличительных приемов предложенного способа обусловлена их логической взаимосвязанностью: первоначальное изолирование фракции 10-100 кДа позволяет избавиться от значительного числа примесей, а это в свою очередь способствует специфической сорбции супероксиддисмутазы на ионообменной смоле в отсутствии значительной конкуренции примесных белков, по причине чего оказывается возможным отделить небольшое число сорбировавшихся на смоле примесей их осаждением органическим растворителем. The need to perform all the distinctive techniques of the proposed method is due to their logical interconnectedness: the initial isolation of the 10-100 kDa fraction eliminates a significant number of impurities, and this in turn contributes to the specific sorption of superoxide dismutase on an ion-exchange resin in the absence of significant competition of impurity proteins, which makes it possible separate a small number of impurities adsorbed on the resin by precipitation with an organic solvent.
Разработанная схема выделения супероксиддисмутазы является оригинальной, в доступной патентной и научно-технической литературе не описана, а известные свойства супероксиддисмутазы не позволяли априорно утверждать о возможности и эффективности предлагаемого метода. The developed scheme for the isolation of superoxide dismutase is original, it is not described in the patent and scientific literature, and the known properties of superoxide dismutase did not allow a priori assertion about the possibility and effectiveness of the proposed method.
Кроме того, как уже выше отмечалось, предлагаемый способ особенно пригоден для выделения сувпероксиддисмутазы из биомассы дрожжей Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus, а свойства фермента из этого продуцента впервые изучены заявителем и несколько отличаются от свойств супероксиддисмутазы, получаемой из других источников. In addition, as already noted above, the proposed method is particularly suitable for the isolation of superoxide dismutase from the biomass of the yeast Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus, and the properties of the enzyme from this producer were first studied by the applicant and are somewhat different from the properties of superoxide dismutase obtained from other sources.
По мнению заявителя предлагаемый способ отвечает всем предъявляемым к изобретению требованиям и обладает изобретательским уровнем. According to the applicant, the proposed method meets all the requirements for the invention and has an inventive step.
П р и м е р 1. В качестве источника супероксиддисмутазы были использованы дрожжи Kluyveromyces marxianum var.bulgaricus T, которые выращивали при 40оС на питательной среде на основе фильтрата молочной сыворотки.EXAMPLE EXAMPLE 1. As a source of superoxide yeast Kluyveromyces marxianum var.bulgaricus T were used, which were grown at 40 ° C on a nutrient medium based on whey permeate.
Биомассу прессованных дрожжей в количестве 900 г суспендировали в 0,1 М растворе хлористого натрия со значением рН, равным 5,5. Суспензия готовилась из расчета 8 г дрожжевой биомассы по абсолютно сухому весу на 1 л раствора. 900 g of compressed yeast biomass was suspended in a 0.1 M sodium chloride solution with a pH value of 5.5. The suspension was prepared at the rate of 8 g of yeast biomass by absolutely dry weight per 1 liter of solution.
Суспензию пропускали через проточный дезинтегратор МЛ-1 со скоростью 30 л/ч при температуре 4оС. Степень разрушения клеток составила в этих условиях 90%
Гомогенат в течение 30 мин центрифугировали при 2500g, осадок промывали тем же солевым раствором и суспензию вновь центрифугировали.The suspension was passed through the flow disintegrator ML-1 at a rate 30 l / h at 4 ° C. The extent of destruction of cells under these conditions was 90%
The homogenate was centrifuged for 30 minutes at 2500g, the precipitate was washed with the same saline and the suspension was again centrifuged.
Объединенные супернатанты гомогената дрожжей на ультрафильтрационной установке последовательно пропускали через мембрану с размером пор 0,16 мкм, затем через мембрану с размером пор 100 кДа, а в заключение через мембрану с размером пор 10 кДа, фракция-ретентант на последней мембране содержала 889000 Е активности суперокасиддисмутазы. The combined supernatants of the yeast homogenate in an ultrafiltration unit were successively passed through a membrane with a pore size of 0.16 μm, then through a membrane with a pore size of 100 kDa, and finally through a membrane with a pore size of 10 kDa, the retentant fraction on the last membrane contained 889,000 E supercassid dismutase activity .
Фракцию 10-100 кДа диализовали на мембране с размером пор 10 кДа против дистиллированной воды с рН 5,3. Диализат добавляли к уравновешенной 5 мМ калийфосфатным буфером (рН 5,6) смоле КБ-2Т и перемешивали в течение 30 мин. Смолу отмывали тем же буфером, контролируя отмывку по наличию белка, для чего измеряли оптическую плотность промывных вод при 280 нм. The 10-100 kDa fraction was dialyzed on a membrane with a pore size of 10 kDa against distilled water with a pH of 5.3. The dialysate was added to a KB-2T resin balanced with 5 mM potassium phosphate buffer (pH 5.6) and stirred for 30 minutes. The resin was washed with the same buffer, controlling the washing by the presence of protein, for which the optical density of the washings was measured at 280 nm.
Отмытую смолу суспендировали в 0,1 М растворе хлористого натрия с рН 7,4 и перемешивали в течение 10 мин, в результате чего суперокасиддисмутаза была полностью десорбирована со смолы. The washed resin was suspended in a 0.1 M solution of sodium chloride with a pH of 7.4 and stirred for 10 minutes, as a result of which superocasid dismutase was completely desorbed from the resin.
Элюат содержал 710000 Е супероксиддисмутазы, ее удельная активность была равной 860 Е/мг белка. The eluate contained 710,000 U superoxide dismutase; its specific activity was 860 U / mg protein.
При перемешивании к элюату медленно добавили этанол до его конечной концентрации 29 об. нагрели раствор до 38оС и при медленном перемешивании выдержали 20 мин.With stirring, ethanol was slowly added to the eluate to a final concentration of 29 vol. solution was heated to 38 C and stood under slow stirring for 20 minutes.
Денатурированные белки отделили центрифугированием при 1500g в течение 10 мин, а супернатант диализовали против дистиллированной воды в течение ночи. Диализат лиофильно высушили. The denatured proteins were separated by centrifugation at 1500 g for 10 min, and the supernatant was dialyzed against distilled water overnight. The dialysate was freeze dried.
Удельная активность полученной супероксиддисмутазы равнялась 3150 Е/мг белка. The specific activity of the obtained superoxide dismutase was 3150 U / mg protein.
Суммарный выход суперокасиддисмутазы из 900 г биомассы дрожжей составил 209 мг. The total yield of supercassid dismutase from 900 g of yeast biomass was 209 mg.
П р и м е р 2. Все изложенное свидетельствует о том, что предложенный способ обладает ощутимыми преимуществами перед известными способами, и основные преимущества состоят в том, что предложенный способ позволяет выделять супероксиддисмутазу из разных природных источников, в том числе из биомассы ранее не известного продуцента дрожжей вида Kluyveromyces marxianus var.bulgaricus, причем способы выделения супероксиддисмутазы из этих дрожжей не были описаны, а возможность успешного применения известных методик не являлась очевидной;
предложенный способ позволяет получить супероксиддисмутазу с достаточно высокой удельной активностью 3000 3100 Е/мг белка наиболее технологичным методом, не требующим, в частности, использования хроматографических ионообенных колонок и большого объема органических растворителей;
предложенный способ допускает возможность проведения дополнительных этапов очистки уже товарного активного фермента и получения продукта с еще более высокой удельной активностью.PRI me R 2. All of the above indicates that the proposed method has tangible advantages over known methods, and the main advantages are that the proposed method allows you to select superoxide dismutase from various natural sources, including biomass from previously unknown a yeast producer of the species Kluyveromyces marxianus var.bulgaricus, and methods for isolating superoxide dismutase from these yeasts have not been described, and the possibility of successful application of known methods was not obvious;
the proposed method allows to obtain superoxide dismutase with a sufficiently high specific activity of 3,000 3,100 U / mg of protein by the most technologically advanced method, which does not require, in particular, the use of ionographic chromatographic columns and a large volume of organic solvents;
the proposed method allows the possibility of carrying out additional stages of purification of a commodity active enzyme and obtain a product with an even higher specific activity.
Claims (5)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU92009197A RU2039818C1 (en) | 1992-12-01 | 1992-12-01 | Method for isolation of superoxydismutase of cells of eucariots |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU92009197A RU2039818C1 (en) | 1992-12-01 | 1992-12-01 | Method for isolation of superoxydismutase of cells of eucariots |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2039818C1 true RU2039818C1 (en) | 1995-07-20 |
| RU92009197A RU92009197A (en) | 1997-03-20 |
Family
ID=20132882
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU92009197A RU2039818C1 (en) | 1992-12-01 | 1992-12-01 | Method for isolation of superoxydismutase of cells of eucariots |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2039818C1 (en) |
-
1992
- 1992-12-01 RU RU92009197A patent/RU2039818C1/en active
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 1. Авторское свидетельство СССР N 1 413313, кл. C 12N 9/02, опублик. 1988. * |
| 2. Заявка Франции N 2590274, кл. C 12N 9/02, опубл. 1987. * |
| 3. Goscin S., Fridovich J. The purification and properties of Sod from Saccharomyces cerevisial. "Biochem Biophys, Acta" 1972, Vol. 289, p.276. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105017412A (en) | Method for separating high-purity bovine serum albumin from bovine serum | |
| CN108047313B (en) | Chicken blood cell antioxidant peptide and fermentation preparation method thereof | |
| Goldsmith et al. | The epoxide nature of the carotenoid, neoxanthin | |
| RU2039818C1 (en) | Method for isolation of superoxydismutase of cells of eucariots | |
| DK155712B (en) | PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF AN OLIGOPE TIME SELECTIVELY INHIBITING THE REPRESENTATION OF NORMAL AND LEUKAEMIC MYELOID CELLS | |
| JPH05508546A (en) | Purification of Erwinia-L-asparaginase | |
| AU770294B2 (en) | Method of purifying whey of lactic acid fermentation by electrodialysis | |
| US3905870A (en) | Purification of kallikrein | |
| US4027012A (en) | Process for the extraction of components having anticoagulant activity "in vivo" from snake venoms and products obtained | |
| Rosenberg et al. | Properties of a purified sialidase and its action on brain mucolipid | |
| RU2230325C2 (en) | Method for preparing purified preparation of botulinic toxin type a | |
| US3951939A (en) | Polypeptides, process for their manufacture and their use as polyvalent isoinhibitors | |
| BG61001B1 (en) | Method for the superoxidedysmutase isolation | |
| JPS6160050B2 (en) | ||
| SU1477741A1 (en) | Method of producing hydrogenase | |
| RU2230119C1 (en) | Method for preparing disaccharide | |
| CN1563086A (en) | Technique for preparing bioactive peptide of bursa of Fabricius | |
| RU2225441C1 (en) | Method for preparing collagenase preparation | |
| SU575353A1 (en) | Method of obtaining carboxypepiidase | |
| CN108117597A (en) | A kind of preparation process of new dace fish collagen antioxidant peptide | |
| SU975797A1 (en) | Method for isolating leucineaminopeptitdase from aspergillus oryzae | |
| RU2046140C1 (en) | Method of isolation of enzyme complex from cultured plant cells | |
| SU890248A1 (en) | Method of autoprotrombine c extraction | |
| SU1359298A1 (en) | Method of obtaining molecular forms of carboanhydrase | |
| SU1184434A3 (en) | Method of isolating dismutase from protein solutions |