RU2023101628A - Варианты протеаз и пути их применения - Google Patents

Claims (26)

1. Вариант субтилизина, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 80% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, содержащую аминокислотную замену P40E в комбинации с S101R, где аминокислотные положения варианта пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 26, и где вариант имеет одно или более улучшенных свойств по сравнению с эталонным субтилизином, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, при этом улучшенное свойство выбирают из улучшенной протеазной активности, улучшенного очищающего действия в моющем средстве и улучшенной термостабильности в моющем средстве.

2. Вариант субтилизина по п. 1, где вариант содержит комбинацию аминокислотных замен, выбранных из P40E-T58Y-E89D-N116Q-N248D; P40E-T58Y-E89D-N116Q; P40E-E89D-N248D; P40E-E89D-S101R-S128T-N248D; P40E-E89D-S101R-S130A-N248D; P40E-E89D; P40E-E89D-S101R-S128T; P40E-E89D-S101R-S130A и их комбинаций.

3. Вариант субтилизина по п. 1, где вариант содержит аминокислотную последовательность c по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или менее чем 100% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6.

4. Вариант субтилизина по п. 1, где вариант

(i) получен из исходной формы, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:6;

(ii) является выделенным или

(iii) предусматривает комбинацию (i)-(ii).

5. Вариант субтилизина по п. 1, где улучшенное свойство по сравнению с эталонным субтилизином представляет собой:

(i) улучшенную протеазную активность, где указанный вариант характеризуется PI > 1 в отношении N-suc-AAPF-pNA или диметилказеинового субстрата;

(ii) улучшенное очищающее действие в моющем средстве, где указанный вариант характеризуется очисткой от крови/молока/чернил на хлопчатобумажной ткани (BMI) и/или яичного загрязнения с PI >1; и/или

(iii) улучшенную термостабильность в моющем средстве, где указанный вариант характеризуется стабильностью с PI > 1,

где указанное моющее средство необязательно является композицией, не содержащей бор.

6. Композиция, содержащая один или несколько вариантов субтилизина по п. 1, где композиция представляет собой моющую композицию.

7. Композиция по п. 6, где моющая композиция выбрана из моющего средства для стирки, моющего средства для смягчения ткани, моющего средства для мытья посуды и моющего средства для очистки твердых поверхностей.

8. Композиция по п. 6, где композиция:

(i) дополнительно содержит один или несколько ионов, выбранных из кальция и цинка; один или нескольких стабилизаторов ферментов; от приблизительно 0,001% до приблизительно 1,0 вес. % указанного варианта; одно или несколько отбеливающих средств; один или несколько вспомогательных материалов; и/или один или несколько дополнительных ферментов или производных ферментов, выбранных из группы, состоящей из ацилтрансфераз, альфа-амилаз, бета-амилаз, альфа-галактозидаз, арабинозидаз, арилэстераз, бета-галактозидаз, каррагиназ, каталаз, целлобиогидролаз, целлюлаз, хондроитиназ, кутиназ, эндо-бета-1,4-глюканаз, ДНКаз, эндо-бета-маннаназ, эстераз, экзоманнаназ, галактаназ, глюкоамилаз, гемицеллюлаз, гиалуронидаз, кератиназ, лакказ, лактаз, лигниназ, липаз, липоксигеназ, маннаназ, оксидаз, оксидоредуктаз, пектатлиаз, пектинацетилэстераз, пектиназ, пентозаназ, пероксидаз, фенолоксидаз, фосфатаз, фосфолипаз, фитаз, полигалактуроназ, полиэстераз, дополнительных протеаз, пуллуланаз, редуктаз, рамногалактуроназ, бета-глюканаз, танназ, трансглутаминаз, ксиланацетилэстераз, ксиланаз, ксилоглюканаз, ксилозидаз, металлопротеаз, дополнительных серин-протеаз и их комбинаций; и/или

(ii) содержит фосфат или не содержит фосфат и/или содержит бор или не содержит бор; и/или

(iii) представляет собой гранулированную, порошкообразную, твердую, брусковую, жидкую, таблетированную, гелеобразную, пастообразную композицию или композицию с однократной дозой.

9. Способ очистки предмета, предусматривающий приведение в контакт предмета с вариантом по п. 1 или композицией по п. 6 и необязательно дополнительно включающий стадию ополаскивания поверхности или предмета после приведения в контакт предмета с вариантом или композицией, где указанный предмет представляет собой столовую посуду или ткань.

10. Нуклеиновая кислота, кодирующая вариант субтилизина по любому из пп. 1-5.

11. Нуклеиновая кислота по п. 10, где вариант, кодируемый полинуклеотидом, дополнительно содержит замену 248D по сравнению с эталонным субтилизином, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

12. Нуклеиновая кислота по п. 11, где нуклеиновая кислота представляет собой экспрессирующую конструкцию, содержащую в направлении от 5' к 3':

(i) промоторную последовательность, которая расположена выше (5') и функционально связана с сигнальной пептидной последовательностью, необязательно, где сигнальная пептидная последовательность содержит SEQ ID NO: 28,

(ii) пропептидную последовательность, которая расположена ниже (3') и функционально связана с 5' сигнальной пептидной последовательностью, необязательно, где пропептидная последовательность содержит SEQ ID NO: 3; (iii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант, содержащий дополнительную замену 248D, при этом последовательность нуклеиновой кислоты расположена ниже (3') и функционально связана с 5' пропептидной последовательностью, необязательно, где последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует вариант, кодирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41 и SEQ ID NO:45; и (iv) необязательную терминаторную последовательность, которая расположена ниже (3') и функционально связана с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант, содержащий дополнительную замену 248D, необязательно, где необязательная терминаторная последовательность содержит SEQ ID NO:30.

13. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 10.

14. Рекомбинантная клетка-хозяин для продуцирования варианта субтилизина по п. 1, содержащая вектор по п. 13, или нуклеиновую кислоту по п. 10.