RU2022106276A

RU2022106276A - Способы очистки последующих продуктов транскрипции in vitro

Info

Publication number: RU2022106276A
Application number: RU2022106276A
Authority: RU
Inventors: Майкл ШАМАШКИН; Мэттью СКОТТ; Петер ВОЙЦЕХОВСКИЙ
Original assignee: МОДЕРНАТиЭкс, ИНК.
Priority date: 2019-08-14
Filing date: 2020-08-13
Publication date: 2023-09-19

Claims

1. Способ, включающий:

(а) обессоливание смеси, содержащей рибонуклеиновую кислоту (РНК), с получением композиции РНК с низким содержанием соли, имеющей концентрацию соли менее 20 мМ;

(б) нагревание композиции РНК с низким содержанием соли до температуры выше чем 60°С с получением денатурированной РНК;

(c) смешивание в потоке композиции, содержащей денатурированную РНК, с высокосолевым буфером с получением композиции, содержащей денатурированную РНК и соль в концентрации по меньшей мере 50 мМ;

(d) связывание денатурированной РНК в композиции, полученной в (c), со смолой олиго-dT при температуре ниже 40°С; и

(e) элюирование РНК со смолы олиго-dT.

2. Способ, включающий:

(а) обессоливание смеси, содержащей рибонуклеиновую кислоту (РНК), с получением композиции РНК с низким содержанием соли, имеющей проводимость менее 2 мСм/см;

(б) нагревание композиции РНК с низким содержанием соли до температуры выше 60°С с получением денатурированной РНК;

(c) смешивание в потоке композиции, содержащей денатурированную РНК, с высокосолевым буфером с получением композиции, содержащей денатурированную РНК и имеющей проводимость по меньшей мере 5 мСм/см;

(d) связывание денатурированной РНК в композиции, полученной в (c), со смолой олиго-dT при температуре ниже 40°C; и

(e) элюирование РНК со смолы олиго-dT.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что смесь (а) представляет собой реакцию транскрипции in vitro.

4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что соль (а) и/или (c) содержит NaCl.

5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что высокосолевой буфер имеет концентрацию соли от 100 мМ до 1000 мМ и/или проводимость от 5 мСм/см до 85 мСм/см.

6. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что обессоливание включает связывание РНК со смолой для хроматографии гидрофобных взаимодействий (ХГВ) и элюирование РНК со смолы ХГВ с получением композиции РНК с низким содержанием соли.

7. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что композиция РНК с низким содержанием соли имеет концентрацию соли от 1 до 20 мМ и/или проводимость от 0,1 до 2 мСм/см.

8. Способ по п. 6, отличающийся тем, что смола ХГВ представляет собой гранулированную смолу (поли)стирол-дивинилбензола (PS-DVB) R150 с порами 2000 Ангстрем.

9. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что нагревание на стадии (b) осуществляют в течение менее 1 минуты.

10. Способ по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что нагревание на стадии (b) осуществляют в течение по меньшей мере 10 секунд.

11. Способ по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что нагревание на стадии (b) осуществляют в течение от 10 до 60, от 10 до 30, от 20 до 40 или от 30 до 60 секунд.

12. Способ по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что нагревание на стадии (b) осуществляют при температуре от 60°C до 90°C.

13. Способ по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что композицию РНК с низким содержанием соли нагревают в присутствии молекулы денатуранта.

14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что молекула денатуранта представляет собой диметилсульфоксид, гуанидин или мочевину.

15. Способ по любому из пп. 1-14, дополнительно включающий в промежутке между стадиями (b) и (c) охлаждение в потоке композиции, содержащей денатурированную РНК, до температуры ниже 60°C.

16. Способ по любому из пунктов 1-15, дополнительно включающий в промежутке между стадиями (b) и (c), в потоке: охлаждение композиции, содержащей денатурированную РНК, до температуры ниже 40°C.

17. Способ по любому из пп. 1-16, дополнительно включающий в промежутке между стадиями (b) и (c) хранение композиции, содержащей денатурированную РНК, в разделительном резервуаре.

18. Способ по п. 17, отличающийся тем, что композицию, содержащую денатурированную РНК, хранят в разделительном резервуаре в течение от 1 до 5 дней при температуре от 2 до 8ºC.

19. Способ по любому из пп. 1-18, отличающийся тем, что смешивание в потоке (c) осуществляют в течение менее 1 минуты.

20. Способ по любому из пп. 1-19, отличающийся тем, что композиция, содержащая денатурированную РНК, полученную на стадии (с), имеет концентрацию соли от 50 до 500 мМ и/или проводимость от 5 до 85 мСм/см.

21. Способ по любому из пп. 1-20, отличающийся тем, что по меньшей мере 90% всей РНК в композиции (с) составляет денатурированная РНК.

22. Способ по любому из пп. 1-21, отличающийся тем, что связывание на стадии (d) осуществляют при температуре от 4°C до 25°C.

23. Способ по любому из пп. 1-22, отличающийся тем, что связывание на стадии (d) осуществляют в течение менее 20 минут.

24. Способ по любому из пп. 1-23, отличающийся тем, что смола олиго-dT представляет собой гранулированную смолу (поли)стирол-дивинилбензола (PS-DVB) с порами 2000 Ангстрем, дериватизированную с использованием поли dT.

25. Способ по любому из пп. 1-24, отличающийся тем, что РНК, элюированная со смолы олиго-dT, содержит по меньшей мере 90% мРНК с поли(А)-хвостом.

26. Способ по п. 25, отличающийся тем, что РНК, элюированная со смолы олиго-dT, содержит по меньшей мере 95% мРНК с поли(А)-хвостом.

27. Способ по любому из пп. 1-26, отличающийся тем, что смешивание в потоке осуществляют одновременно со связыванием смеси со смолой олиго-dT.

28. Способ по любому из пп. 1-27, отличающийся тем, что вторичную структуру РНК контролируют до и после стадии (b) с использованием обнаружения в ультрафиолетовом диапазоне.

29. Способ по любому из пп. 1-28, отличающийся тем, что денатурацию РНК в процессе стадии (b) контролируют с использованием обнаружения в ультрафиолетовом диапазоне.

30. Способ, включающий:

смешивание в потоке высокосолевого буфера с композицией денатурированной РНК с низким содержанием соли, которая содержит денатурированную рибонуклеиновую кислоту (РНК), с получением композиции с высоким содержанием соли, содержащей денатурированную РНК; и

связывание денатурированной РНК со смолой олиго-dT.

31. Способ по п. 30, отличающийся тем, что смешивание в потоке осуществляют в течение менее 1 минуты до связывания денатурированной РНК со смолой олиго-dT.

32. Способ по п. 30 или 31, отличающийся тем, что высокосолевой буфер имеет концентрацию соли по меньшей мере 100 мМ и/или проводимость по меньшей мере 10 мСм/см.

33. Способ по п. 32, отличающийся тем, что высокосолевой буфер имеет концентрацию соли от 100 мМ до 1000 мМ NaCl.

34. Способ по любому из пп. 30-33, отличающийся тем, что композиция денатурированной РНК с низким содержанием соли имеет концентрацию соли менее 20 мМ и/или менее 2 мСм/см.

35. Способ по любому из пп. 30-34, отличающийся тем, что композиция денатурированной РНК с низким содержанием соли имеет концентрацию соли от 1 до 20 мМ и/или проводимость от 0,1 до 2 мСм/см.

36. Способ по любому из пп. 30-35, отличающийся тем, что композиция с высоким содержанием соли имеет концентрацию соли от 50 до 500 мМ и/или проводимость от 5 до 85 мСм/см.

37. Способ по любому из пп. 30-36, отличающийся тем, что денатурированная РНК в композиции с высоким содержанием соли составляет по меньшей мере 90% от всей РНК в композиции с высоким содержанием соли.

38. Способ по любому из пп. 30-37, отличающийся тем, что связывание осуществляют в течение менее 20 минут.

39. Способ по любому из пп. 30-38, отличающийся тем, что связывание осуществляют при температуре ниже 40°C.

40. Способ по п. 39, отличающийся тем, что связывание осуществляют при температуре от 4°C до 25°C.

41. Способ по любому из пп. 30-40, отличающийся тем, что смола олиго-dT представляет собой гранулированную смолу (поли)стирол-дивинилбензола (PS-DVB) с порами 2000 Ангстрем, дериватизированную с использованием поли dT.

42. Способ по любому из пп. 30-41, дополнительно включающий элюирование РНК со смолы олиго-dT в буфере с низким содержанием соли.

43. Способ по п. 42, отличающийся тем, что РНК, элюированная со смолы олиго-dT, содержит по меньшей мере 90% мРНК с поли(А)-хвостом.

44. Способ по п. 43, отличающийся тем, что РНК, элюированная со смолы олиго-dT, содержит по меньшей мере 95% мРНК с поли(А)-хвостом.

45. Способ по любому из пп. 30-44, дополнительно включающий:

перед смешиванием в потоке с высокосолевым буфером, нагревание композиции, содержащей РНК и имеющей концентрацию соли менее 20 мМ, до температуры выше чем 60°C с получением композиции денатурированной РНК.

46. Способ по любому из пп. 30-44, дополнительно включающий:

перед смешиванием в потоке с высокосолевым буфером, нагревание композиции, содержащей РНК и имеющей проводимость менее 2 мСм/см, до температуры выше чем 60°C с получением композиции денатурированной РНК.

47. Способ по п. 45 или 46, отличающийся тем, что нагревание осуществляют в течение менее 1 минуты.

48. Способ по любому из пп. 45-47, отличающийся тем, что нагревание осуществляют в течение по меньшей мере 10 секунд.

49. Способ по любому из пп. 45-48, отличающийся тем, что нагревание осуществляют в течение от 10 до 60, от 10 до 30, от 20 до 40 или от 30 до 60 секунд.

50. Способ по любому из пп. 45-49, отличающийся тем, что нагревание осуществляют при температуре от 60°C до 90°C.

51. Способ по любому из пп. 30-50, дополнительно включающий:

перед смешиванием в потоке с высокосолевым буфером, обессоливание смеси, содержащей РНК, с получением композиции РНК, имеющей концентрацию соли менее 20 мМ; и

нагревание композиции РНК, имеющей концентрацию соли менее 20 мМ, до температуры выше 60°C с получением композиции денатурированной РНК.

52. Способ по п. 51, отличающийся тем, что смесь представляет собой реакцию транскрипции in vitro.

53. Способ по любому из пп. 51 или 52, отличающийся тем, что обессоливание включает связывание РНК со смолой для хроматографии гидрофобных взаимодействий (ХГВ) и элюирование РНК со смолы ХГВ с получением композиции РНК.

54. Способ по п. 53, отличающийся тем, что смола ХГВ представляет собой гранулированную смолу (поли)стирол-дивинилбензола (PS-DVB) R150 с порами 2000 ангстрем.

55. Способ по любому из пп. 30-54, отличающийся тем, что вторичную структуру РНК контролируют с использованием обнаружения в ультрафиолетовом диапазоне в процессе нагревания композиции.

56. Способ по любому из пп. 30-55, отличающийся тем, что денатурацию РНК контролируют с использованием обнаружения в ультрафиолетовом диапазоне в процессе нагревания композиции.