Claims (134)
1. Донорная матрица, включающая:1. Donor matrix, including:
(a) одну или несколько нуклеотидных последовательностей, гомологичных фрагменту вызывающего ауксотрофию локуса или гомологичных комплементарной последовательности данного локуса, вызывающего ауксотрофию, и (a) one or more nucleotide sequences homologous to a fragment of the auxotrophy-causing locus or homologous to the complementary sequence of that auxotrophy-causing locus, and
(b) трансген, кодирующий терапевтический фактор, необязательно связанный с последовательностью контроля экспрессии.(b) a transgene encoding a therapeutic factor, optionally linked to an expression control sequence.
2. Донорная матрица по п. 1, которая является одноцепочечной.2. The donor matrix according to claim 1, which is single stranded.
3. Донорная матрица по п. 1, которая является двухцепочечной.3. Donor matrix according to claim 1, which is double-stranded.
4. Донорная матрица по п. 1, которая представляет собой плазмиду, фрагмент ДНК или вектор.4. The donor matrix according to claim 1, which is a plasmid, a DNA fragment or a vector.
5. Донорная матрица по п. 4, которая представляет собой плазмиду, содержащую элементы, необходимые для репликации, необязательно содержащие промотор и 3'-UTR.5. The donor template according to claim 4, which is a plasmid containing elements necessary for replication, optionally containing a promoter and a 3'-UTR.
6. Донорная матрица по любому из пп. 1-5, где трансген фланкирован с двух сторон нуклеотидными последовательностями, гомологичными фрагменту локуса, индуцирующего ауксотрофию или комплементарного ему.6. Donor matrix according to any one of paragraphs. 1-5, where the transgene is flanked on both sides by nucleotide sequences homologous to or complementary to a fragment of the auxotrophy-inducing locus.
7. Донорная матрица по любому из пп. 1-6, где индуцирующий ауксотрофность локус является геном, кодирующим белок, который вовлечен в синтез, рециркуляцию или утилизацию ауксотрофного фактора. 7. Donor matrix according to any one of paragraphs. 1-6, where the auxotrophy-inducing locus is a gene encoding a protein that is involved in the synthesis, recycling, or utilization of an auxotrophic factor.
8. Донорная матрица по любому из пп. 1-6, где вызывающий ауксотрофию локус находится в пределах гена из табл. 1 или области, контролирующей экспрессию гена из табл. 1.8. Donor matrix according to any one of paragraphs. 1-6, where the auxotrophy-causing locus is located within the gene from table. 1 or the area that controls the expression of the gene from the table. one.
9. Донорная матрица по любому из пп. 1-6, где вызывающий ауксотрофию локус находится в пределах гена, кодирующего уридинмонофосфатсинтетазу.9. Donor matrix according to any one of paragraphs. 1-6, where the auxotrophy-causing locus is within the gene encoding uridine monophosphate synthetase.
10. Донорная матрица по любому из пп. 1-6, где вызывающий ауксотрофию локус находится в пределах гена, кодирующего холокарбоксилазу-синтетазу.10. Donor matrix according to any one of paragraphs. 1-6, where the auxotrophy-causing locus is within the gene encoding holocarboxylase synthetase.
11. Донорная матрица по любому из пп. 1-6, где нуклеотидная последовательность, гомологичная фрагменту вызывающего ауксотрофию локуса, на 98% идентична по меньшей мере 200 последовательным нуклеотидам вызывающего ауксотрофию локуса.11. Donor matrix according to any one of paragraphs. 1-6, wherein the nucleotide sequence homologous to a fragment of the auxotrophic locus is 98% identical to at least 200 consecutive nucleotides of the auxotrophic locus.
12. Донорная матрица по п. 11, где нуклеотидная последовательность, гомологичная фрагменту вызывающего ауксотрофию локуса, на 98% идентична по меньшей мере 200 последовательным нуклеотидам гена уридинмонофосфатсинтетазы или холокарбоксилазы-синтетазы человека или любого из генов в табл. 1. 12. The donor matrix according to claim 11, where the nucleotide sequence homologous to the fragment of the auxotrophy-causing locus is 98% identical to at least 200 consecutive nucleotides of the human uridine monophosphate synthetase or holocarboxylase synthetase gene or any of the genes in table. one.
13. Донорная матрица по любому из пп. 1-12, где последовательность контроля экспрессии, функционально связанную с данным трансгеном.13. Donor matrix according to any one of paragraphs. 1-12, where the expression control sequence is operably linked to the given transgene.
14. Донорная матрица по п. 13, где последовательность контроля экспрессии представляет собой тканеспецифичную последовательность контроля экспрессии.14. The donor matrix of claim 13, wherein the expression control sequence is a tissue-specific expression control sequence.
15. Донорная матрица по п. 13, где последовательность контроля экспрессии представляет собой промотор или энхансер.15. The donor matrix of claim 13, wherein the expression control sequence is a promoter or enhancer.
16. Донорная матрица по п. 13, где последовательность контроля экспрессии является индуцибельным промотором.16. The donor matrix of claim 13, wherein the expression control sequence is an inducible promoter.
17. Донорная матрица по п. 13, где последовательность контроля экспрессии является конститутивным промотором.17. The donor matrix of claim 13, wherein the expression control sequence is a constitutive promoter.
18. Донорная матрица по п. 13, где последовательность контроля экспрессии представляет собой посттранскрипционную регуляторную последовательность.18. The donor matrix of claim 13, wherein the expression control sequence is a post-transcriptional regulatory sequence.
19. Донорная матрица по п. 13, где последовательность контроля экспрессии представляет собой микроРНК.19. The donor matrix according to claim 13, where the expression control sequence is a microRNA.
20. Донорная матрица по любому из пп. 1-19, где донорная матрица или вектор также содержит маркерный ген.20. Donor matrix according to any one of paragraphs. 1-19, where the donor matrix or vector also contains a marker gene.
21. Донорная матрица по п. 20, где маркерный ген содержит по крайней мере фрагмент NGFR или EGFR, по крайней мере фрагмент CD20 или CD19, Myc, HA, FLAG, GFP, гена устойчивости к антибиотикам.21. The donor matrix according to claim 20, wherein the marker gene contains at least a fragment of NGFR or EGFR, at least a fragment of CD20 or CD19, Myc, HA, FLAG, GFP, an antibiotic resistance gene.
22. Донорная матрица по любому из пп. 1-21, где трансген кодирует терапевтический фактор, выбранный из группы, состоящей из: гормонов, цитокинов, хемокинов, интерферонов, интерлейкинов, связывающих интерлейкины белков, ферментов, антител, слитых с Fc белков, факторов роста, факторов транскрипции, факторов свертывания крови, вакцин, структурных белков, белковых лигандов, рецепторов, антигенов клеточной поверхности, антагонистов рецепторов и костимулирующих факторов, структурных белков, антигенов клеточной поверхности, ионных каналов, эпигенетических модификаторов или белков, редактирующих РНК.22. The donor matrix according to any one of paragraphs. 1-21, where the transgene encodes a therapeutic factor selected from the group consisting of: hormones, cytokines, chemokines, interferons, interleukins, interleukin-binding proteins, enzymes, antibodies, Fc fusion proteins, growth factors, transcription factors, blood coagulation factors, vaccines, structural proteins, protein ligands, receptors, cell surface antigens, receptor antagonists and costimulatory factors, structural proteins, cell surface antigens, ion channels, epigenetic modifiers or RNA editing proteins.
23. Донорная матрица по любому из пп. 1-21, где трансген кодирует T-клеточный антигеновый рецептор.23. The donor matrix according to any one of paragraphs. 1-21, where the transgene encodes a T-cell antigen receptor.
24. Донорная матрица по любому из пп. 1-21, где трансген кодирует РНК, необязательно регуляторную микроРНК.24. The donor matrix according to any one of paragraphs. 1-21, where the transgene encodes an RNA, optionally a regulatory miRNA.
25. Вектор, включающий:25. Vector including:
(a) одну или несколько нуклеотидных последовательностей, гомологичных фрагменту вызывающего ауксотрофию локуса, или гомологичных комплементарной последовательности данного локуса, вызывающего ауксотрофию, и (a) one or more nucleotide sequences homologous to a fragment of the auxotrophy-causing locus or homologous to the complementary sequence of that auxotrophy-causing locus, and
(b) трансген, кодирующий терапевтический фактор.(b) a transgene encoding a therapeutic factor.
26. Вектор по п. 25, который представляет собой вирусный вектор.26. The vector of claim 25, which is a viral vector.
27. Вектор по п. 26, который выбран из группы, состоящей из ретровирусных, лентивирусных, аденовирусных, аденоассоциированных вирусных и герпесвирусных векторов.27. The vector of claim 26, which is selected from the group consisting of retroviral, lentiviral, adenovirus, adeno-associated viral, and herpesvirus vectors.
28. Вектор по п. 26 или 27, дополнительно содержащий гены, необходимые для репликации вирусного вектора.28. The vector according to claim 26 or 27, additionally containing the genes necessary for the replication of the viral vector.
29. Вектор по любому из пп. 25-28, при этом трансген с обеих сторон фланкирован нуклеотидными последовательностями, гомологичными фрагменту вызывающего ауксотрофию локуса или комплементарного ему.29. Vector according to any one of paragraphs. 25-28, wherein the transgene is flanked on both sides by nucleotide sequences homologous to or complementary to the fragment of the auxotrophy-causing locus.
30. Вектор по любому из пп. 25-29, при этом вызывающий ауксотрофию локус представляет собой ген, кодирующий белок, который участвует в синтезе, рециркуляции или утилизации ауксотрофного фактора.30. Vector according to any one of paragraphs. 25-29, wherein the auxotrophic locus is a gene encoding a protein that is involved in the synthesis, recycling, or utilization of an auxotrophic factor.
31. Вектор по любому из пп. 25-29, при этом вызывающий ауксотрофию локус находится в пределах гена из табл. 1 или участка, контролирующего экспрессию гена из табл. 1.31. Vector according to any one of paragraphs. 25-29, while the auxotrophy-causing locus is located within the gene from table. 1 or plot that controls the expression of the gene from the table. one.
32. Вектор по любому из пп. 25-29, при этом вызывающий ауксотрофию локус находится в пределах гена, кодирующего уридинмонофосфатсинтетазу.32. Vector according to any one of paragraphs. 25-29, wherein the auxotrophic locus is within the gene encoding uridine monophosphate synthetase.
33. Вектор по любому из пп. 25-29, при этом вызывающий ауксотрофию локус находится в пределах гена, кодирующего холокарбоксилазу-синтетазу.33. Vector according to any one of paragraphs. 25-29, wherein the auxotrophy-causing locus is within the gene encoding holocarboxylase synthetase.
34. Вектор по любому из пп. 25-29, при этом нуклеотидная последовательность, гомологичная фрагменту вызывающего ауксотрофию локуса, на 98% идентична по меньшей мере 200 последовательным нуклеотидам вызывающего ауксотрофию локуса.34. Vector according to any one of paragraphs. 25-29, wherein the nucleotide sequence homologous to a fragment of the auxotrophy-inducing locus is 98% identical to at least 200 consecutive nucleotides of the auxotrophy-inducing locus.
35. Вектор по п.34, при этом нуклеотидная последовательность, гомологичная фрагменту вызывающего ауксотрофию локуса, на 98% идентична по меньшей мере 200 последовательным нуклеотидам гена уридинмонофосфатсинтетазы или холокарбоксилазы-синтетазы человека или любого из генов в табл. 1.35. The vector of claim 34, wherein the nucleotide sequence homologous to the fragment of the auxotrophy-causing locus is 98% identical to at least 200 consecutive nucleotides of the human uridine monophosphate synthetase or human holocarboxylase synthetase gene or any of the genes in Table. one.
36. Вектор по любому из пп. 25-35, дополнительно содержащие последовательность контроля экспрессии, функционально связанную с данным трансгеном.36. Vector according to any one of paragraphs. 25-35, further containing an expression control sequence operably linked to the transgene.
37. Вектор по п. 36, при этом последовательность контроля экспрессии представляет собой тканеспецифичную последовательность контроля экспрессии.37. The vector of claim 36, wherein the expression control sequence is a tissue-specific expression control sequence.
38. Вектор по п. 36, при этом последовательность контроля экспрессии представляет собой промотор или энхансер.38. The vector of claim 36, wherein the expression control sequence is a promoter or enhancer.
39. Вектор по п. 36, при этом последовательность контроля экспрессии представляет собой индуцибельный промотор.39. The vector of claim 36, wherein the expression control sequence is an inducible promoter.
40. Вектор по п. 36, при этом последовательность контроля экспрессии представляет собой конститутивный промотор.40. The vector of claim 36, wherein the expression control sequence is a constitutive promoter.
41. Вектор по п. 36, при этом последовательность контроля экспрессии представляет собой посттранскрипционную регуляторную последовательность.41. The vector of claim 36, wherein the expression control sequence is a post-transcriptional regulatory sequence.
42. Вектор по п. 36, при этом последовательность контроля экспрессии представляет собой микроРНК.42. The vector according to claim 36, wherein the expression control sequence is a microRNA.
43. Вектор по любому из пп. 25-42, дополнительно содержащие маркерный ген.43. Vector according to any one of paragraphs. 25-42, additionally containing a marker gene.
44. Вектор по п. 43, при этом маркерный ген содержит по крайней мере фрагмент NGFR или EGFR, по крайней мере фрагмент CD20 или CD19, Myc, HA, FLAG, GFP или гена устойчивости к антибиотикам.44. The vector of claim 43, wherein the marker gene contains at least a fragment of NGFR or EGFR, at least a fragment of CD20 or CD19, Myc, HA, FLAG, GFP, or an antibiotic resistance gene.
45. Вектор по любому из пп. 25-44, при этом трансген кодирует терапевтический фактор, выбранный из группы, состоящей из: гормонов, цитокинов, хемокинов, интерферонов, интерлейкинов, связывающих интерлейкины белков, ферментов, антител, слитых с Fc белков, факторов роста, факторов транскрипции, факторов свертывания крови, вакцин, структурных белков, белковых лигандов, рецепторов, антигенов клеточной поверхности, антагонистов рецепторов и костимулирующих факторов, структурных белков, антигенов клеточной поверхности, ионных каналов, эпигенетических модификаторов или белков, редактирующих РНК.45. Vector according to any one of paragraphs. 25-44, wherein the transgene encodes a therapeutic factor selected from the group consisting of: hormones, cytokines, chemokines, interferons, interleukins, interleukin binding proteins, enzymes, antibodies, Fc fusion proteins, growth factors, transcription factors, blood coagulation factors , vaccines, structural proteins, protein ligands, receptors, cell surface antigens, receptor antagonists and costimulatory factors, structural proteins, cell surface antigens, ion channels, epigenetic modifiers or RNA editing proteins.
46. Вектор по любому из пп. 25-44, при этом трансген кодирует T-клеточный антигеновый рецептор.46. Vector according to any one of paragraphs. 25-44, wherein the transgene encodes a T-cell antigen receptor.
47. Вектор по любому из пп. 25-44, при этом трансген кодирует РНК, необязательно регуляторную микроРНК.47. Vector according to any one of paragraphs. 25-44, wherein the transgene encodes an RNA, optionally a regulatory miRNA.
48. Нуклеазная система для направленного встраивания трансгена в вызывающий ауксотрофию локус, включающая:48. Nuclease system for targeted insertion of a transgene into a auxotrophy-causing locus, including:
(a) белок cas9 и (a) cas9 protein and
(b) направляющую РНК, специфичную для вызывающего ауксотрофию локуса.(b) a guide RNA specific for the auxotrophy-causing locus.
49. Нуклеазная система для направленного встраивания трансгена в вызывающий ауксотрофию локус, включающая мегануклеазу, специфичную для данного вызывающего ауксотрофию локуса.49. A nuclease system for targeted insertion of a transgene into an auxotrophy-causing locus, comprising a meganuclease specific for that auxotrophic-causing locus.
50. Нуклеазная система по п. 49, при этом мегануклеаза представляет собой ZFN или TALEN.50. The nuclease system according to claim 49, wherein the meganuclease is ZFN or TALEN.
51. Нуклеазная система по любому из пп. 48-50, дополнительно включающая донорную матрицу по любому из пп.1-24 или вектор по любому из пп. 25-47.51. Nuclease system according to any one of paragraphs. 48-50, further comprising a donor matrix according to any one of paragraphs.1-24 or a vector according to any one of paragraphs. 25-47.
52. Модифицированные клетки-хозяева ex vivo, содержащие трансген, кодирующий терапевтический фактор, встроенный в вызывающий ауксотрофию локус, причем данные модифицированные клетки-хозяева ауксотрофны по ауксотрофному фактору и способны экспрессировать терапевтический фактор.52. Ex vivo modified host cells containing a transgene encoding a therapeutic factor inserted at an auxotrophic locus, wherein the modified host cells are auxotrophic for the auxotrophic factor and capable of expressing the therapeutic factor.
53. Модифицированные клетки-хозяева по п. 52, которые представляют собой клетки млекопитающих.53. Modified host cells according to claim 52, which are mammalian cells.
54. Модифицированные клетки-хозяева по п. 52, которые представляют собой клетки человека.54. Modified host cells according to claim 52, which are human cells.
55. Модифицированные клетки-хозяева по п. 52, при этом модифицированные клетки-хозяева выбраны из группы, состоящей из эмбриональных стволовых клеток, стволовых клеток, клеток-предшественников, плюрипотентных стволовых клеток, индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPS), соматических стволовых клеток, дифференцированных клеток, мезенхимальных стволовых клеток, нервных стволовых клеток, гемопоэтических стволовых клеток или гемопоэтических клеток-предшественников, жировых стволовых клеток, кератиноцитов, скелетных стволовых клеток, мышечных стволовых клеток, фибробластов, NK-клеток, B-клеток, T-клеток или мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC).55. The modified host cells of claim 52, wherein the modified host cells are selected from the group consisting of embryonic stem cells, stem cells, progenitor cells, pluripotent stem cells, induced pluripotent stem cells (iPS), somatic stem cells, differentiated cells, mesenchymal stem cells, neural stem cells, hematopoietic stem cells or hematopoietic progenitor cells, adipose stem cells, keratinocytes, skeletal stem cells, muscle stem cells, fibroblasts, NK cells, B cells, T cells, or mononuclear cells peripheral blood (PBMC).
56. Модифицированные клетки-хозяева по п. 52, которые происходят из клеток от субъекта, подлежащего лечению модифицированными клетками хозяина.56. Modified host cells according to claim 52, which are derived from cells from a subject to be treated with modified host cells.
57. Способ получения модифицированных клеток-хозяев от млекопитающих, включающий: (a) введение в клетки данного хозяина-млекопитающего одной или нескольких нуклеазных систем, поражающих и расщепляющих ДНК в вызывающем ауксотрофию локусе, или нуклеиновой кислоты, кодирующей один или несколько компонентов данной одной или нескольких нуклеазных систем, и (b) донорной матрицы по любому из пп.1-24 или вектора по любому из пп. 25-47.57. A method for obtaining modified host cells from mammals, comprising: (a) introducing into cells of a given mammalian host one or more nuclease systems that damage and cleave DNA at an auxotrophy-causing locus, or a nucleic acid encoding one or more components of this one or more several nuclease systems, and (b) a donor matrix according to any one of claims 1 to 24 or a vector according to any one of claims. 25-47.
58. Способ по п. 57, дополнительно включающий введение второй нуклеазы или второй направляющей РНК для наведения на и расщепления ДНК во втором геномном локусе или нуклеиновой кислоты, кодирующей данную вторую нуклеазу или вторую направляющую РНК, а также необязательно (b) второй донорной матрицы или вектора.58. The method of claim 57, further comprising introducing a second nuclease or a second guide RNA to target and cleave DNA at the second genomic locus or a nucleic acid encoding the second nuclease or second guide RNA, and optionally (b) a second donor template, or vector.
59. Способ направленного встраивания трансгена в вызывающий ауксотрофию локус в клетках млекопитающих ex vivo, включающий контактирование клеток данного млекопитающего с донорной матрицей по любому из пп.1-24 или вектором по любому из пп. 25-47 и нуклеазой.59. A method for targeted insertion of a transgene into an auxotrophy-causing locus in mammalian cells ex vivo, comprising contacting the cells of a given mammal with a donor matrix according to any one of claims 1 to 24 or a vector according to any one of claims. 25-47 and nuclease.
60. Способ по любому из пп. 57-59, при этом нуклеаза представляет собой ZFN.60. The method according to any one of paragraphs. 57-59, wherein the nuclease is ZFN.
61. Способ по любому из пп.57-59, при этом нуклеаза представляет собой TALEN.61. The method according to any one of claims 57-59, wherein the nuclease is TALEN.
62. Способ получения модифицированных клеток-хозяев от млекопитающих, включающий введение в клетки данного хозяина-млекопитающего: (a) полипептида Cas9 или нуклеиновой кислоты, кодирующей данный полипептид Cas9, (b) направляющей РНК, специфичной для вызывающего ауксотрофию локуса, или нуклеиновой кислоты, кодирующей данную направляющую РНК, и (c) донорной матрицы по любому из пп.1-24 или вектора по любому из пп. 25-47.62. A method for obtaining modified host cells from mammals, comprising introducing into cells of a given mammalian host: (a) a Cas9 polypeptide or a nucleic acid encoding a given Cas9 polypeptide, (b) a guide RNA specific for an auxotrophy-causing locus or nucleic acid, encoding this guide RNA, and (c) a donor matrix according to any one of paragraphs.1-24 or a vector according to any one of paragraphs. 25-47.
63. Способ по п. 62, дополнительно включающий введение в клетки данного хозяина-млекопитающего: (a) второй направляющей РНК, специфичной ко второму вызывающему ауксотрофию локусу, или нуклеиновой кислоты, кодирующей данную направляющую РНК, и необязательно (b) второй донорной матрицы или вектора.63. The method of claim 62, further comprising introducing into the cells of the mammalian host: (a) a second guide RNA specific for the second auxotrophy-causing locus, or a nucleic acid encoding the guide RNA, and optionally (b) a second donor template, or vector.
64. Способ направленного встраивания трансгена в вызывающий ауксотрофию локус в клетках млекопитающих ex vivo, включающий контактирование клеток данного млекопитающего с донорной матрицей по любому из пп. 1-24 или вектором по любому из пп. 25-47, полипептидом cas9 и направляющей РНК.64. A method for targeted insertion of a transgene into an auxotrophy-causing locus in mammalian cells ex vivo, comprising contacting cells of a given mammal with a donor matrix according to any one of paragraphs. 1-24 or a vector according to any one of paragraphs. 25-47, cas9 polypeptide and guide RNA.
65. Способ по любому из пп. 62-64, при этом направляющая РНК представляет собой химерную РНК.65. The method according to any one of paragraphs. 62-64, wherein the guide RNA is a chimeric RNA.
66. Способ по любому из пп. 62-64, при этом направляющая РНК включает две гибридизованные РНК.66. The method according to any one of paragraphs. 62-64, wherein the guide RNA includes two hybridized RNAs.
67. Способ по любому из пп. 57-64, дополнительно включающий образование одного или нескольких одноцепочечных разрывов в вызывающем ауксотрофию локусе.67. The method according to any one of paragraphs. 57-64, further comprising the formation of one or more single strand breaks at the auxotrophy-causing locus.
68. Способ по любому из пп. 57-64, дополнительно включающий образование двухцепочечного разрыва в вызывающем ауксотрофию локусе.68. The method according to any one of paragraphs. 57-64, further comprising the formation of a double-strand break at the auxotrophy-causing locus.
69. Способ по любому из пп. 57-68, при этом вызывающий ауксотрофию локус подвергается модификации путем гомологической рекомбинации с помощью данной донорной матрицы или вектора.69. The method according to any one of paragraphs. 57-68, wherein the auxotrophic locus is modified by homologous recombination with a given donor template or vector.
70. Способ по любому из пп. 57-68, при этом стадии (a) и (b) выполняются до или после размножения данных клеток и необязательно культивирования данных клеток.70. The method according to any one of paragraphs. 57-68, wherein steps (a) and (b) are performed before or after expansion of these cells and optionally culturing of these cells.
71. Способ по п. 70, дополнительно включающий (c) отбор клеток, содержащих трансген, встроенный в вызывающий ауксотрофию локус.71. The method of claim 70, further comprising (c) selecting cells containing a transgene inserted into an auxotrophy-causing locus.
72. Способ по п. 71, при этом отбор включает: (i) отбор клеток, которым для выживания требуется ауксотрофный фактор, и необязательно (ii) отбор клеток, которые содержат трансген, встроенный в вызывающий ауксотрофию локус.72. The method of claim 71, wherein the selection comprises: (i) selecting cells that require an auxotrophic factor for survival, and optionally (ii) selecting cells that contain a transgene inserted at an auxotrophic locus.
73. Способ по п. 71, при этом вызывающий ауксотрофию локус представляет собой ген, кодирующий уридинмонофосфатсинтетазу, а клетки отбирают путем контактирования с 5-FOA.73. The method of claim 71, wherein the auxotrophy-causing locus is a gene encoding uridine monophosphate synthetase and the cells are selected by contacting 5-FOA.
74. Стерильная композиция, содержащая донорную матрицу по любому из пп. 1-24 или вектор по любому из пп. 25-47 либо нуклеазную систему по любому из пп. 48-51 и стерильную воду или фармацевтически приемлемый наполнитель.74. A sterile composition containing a donor matrix according to any one of paragraphs. 1-24 or a vector according to any one of paragraphs. 25-47 or a nuclease system according to any one of paragraphs. 48-51 and sterile water or a pharmaceutically acceptable vehicle.
75. Стерильная композиция, содержащая модифицированные клетки-хозяева от млекопитающих по любому из пп. 52-56 и стерильную воду или фармацевтически приемлемый наполнитель.75. A sterile composition containing modified mammalian host cells according to any one of paragraphs. 52-56 and sterile water or a pharmaceutically acceptable vehicle.
76. Набор, содержащий донорную матрицу по любому из пп. 1-24 или вектор по любому из пп. 25-47 либо нуклеазную систему по любому из пп. 48-51 или указанные модифицированные клетки-хозяева по любому из пп. 52-56 либо их комбинации, необязательно с контейнером или флаконом.76. A set containing a donor matrix according to any one of paragraphs. 1-24 or a vector according to any one of paragraphs. 25-47 or a nuclease system according to any one of paragraphs. 48-51 or said modified host cells according to any one of paragraphs. 52-56 or combinations thereof, optionally with a container or vial.
77. Способ экспрессиии терапевтического фактора у субъекта, включающий:77. A method for expressing a therapeutic factor in a subject, comprising:
(a) введение модифицированных клеток-хозяев по любому из пп. 52-56,(a) introducing modified host cells according to any one of paragraphs. 52-56,
(b) необязательно введение режима кондиционирования, способствующего приживлению модифицированных клеток, и (b) optionally administering a conditioning regimen to promote engraftment of the modified cells, and
(c) введение ауксотрофного фактора.(c) introduction of an auxotrophic factor.
78. Способ по п. 77, при этом введение модифицированных клеток-хозяев и ауксотрофного фактора проводится одновременно.78. The method of claim 77, wherein the administration of the modified host cells and the auxotrophic factor is carried out simultaneously.
79. Способ по п. 77, при этом введение модифицированных клеток-хозяев и ауксотрофного фактора проводится последовательно.79. The method according to claim 77, wherein the introduction of the modified host cells and the auxotrophic factor is carried out sequentially.
80. Способ по п. 77, дополнительно включающий продолжение введения данного ауксотрофного фактора регулярно в течение времени, достаточного для усиления экспрессии терапевтического фактора.80. The method of claim 77, further comprising continuing to administer the auxotrophic factor regularly for a period of time sufficient to enhance expression of the therapeutic factor.
81. Способ по п. 77, дополнительно включающий уменьшение введения данного ауксотрофного фактора для снижения экспрессии терапевтического фактора.81. The method of claim 77, further comprising reducing the administration of the auxotrophic factor to reduce expression of the therapeutic factor.
82. Способ по п. 77, дополнительно включающий увеличение введения данного ауксотрофного фактора для повышения экспрессии терапевтического фактора.82. The method of claim 77, further comprising increasing the administration of the auxotrophic factor to increase expression of the therapeutic factor.
83. Способ по п. 77, дополнительно включающий прекращение введения данного ауксотрофного фактора для создания условий, приводящих к ингибированию роста или гибели модифицированных клеток-хозяев.83. The method according to p. 77, further comprising stopping the introduction of this auxotrophic factor to create conditions leading to growth inhibition or death of the modified host cells.
84. Способ по п. 77, дополнительно включающий временное прерывание введения данного ауксотрофного фактора для создания условий, приводящих к ингибированию роста модифицированных клеток-хозяев.84. The method of claim 77, further comprising temporarily interrupting the administration of the given auxotrophic factor to create conditions leading to growth inhibition of the modified host cells.
85. Способ по п. 77, дополнительно включающий продолжение введения данного ауксотрофного фактора в течение времени, достаточного для оказания терапевтического эффекта у субъекта.85. The method of claim 77, further comprising continuing administration of the auxotrophic factor for a time period sufficient to produce a therapeutic effect in the subject.
86. Способ по п. 77, при этом модифицированные клетки-хозяева являются регенеративными.86. The method of claim 77, wherein the modified host cells are regenerative.
87. Способ по п. 77, при этом введение модифицированных клеток-хозяев включает локализованную доставку.87. The method of claim 77, wherein administration of the modified host cells comprises localized delivery.
88. Способ по п. 77, при этом введение модифицированных клеток-хозяев включает системную доставку.88. The method of claim 77, wherein administration of the modified host cells includes systemic delivery.
89. Способ по любому из пп. 77-88, дополнительно включающий получение клеток-хозяев перед модификацией от субъекта, подлежащего лечению.89. The method according to any one of paragraphs. 77-88, further comprising obtaining host cells prior to modification from a subject to be treated.
90. Способ лечения субъекта с заболеванием, расстройством или нарушением, который включает введение субъекту (a) указанных модифицированных клеток-хозяев по любому из пп.52-56 и (b) указанного ауксотрофного фактора в количестве, достаточном для обеспечения экспрессии терапевтического фактора в терапевтическом количестве.90. A method of treating a subject with a disease, disorder, or disorder, which comprises administering to the subject (a) said modified host cells according to any one of claims 52-56, and (b) said auxotrophic factor in an amount sufficient to allow expression of the therapeutic factor in the therapeutic quantity.
91. Способ по п. 90, при этом заболевание, расстройство или нарушение выбрано из группы, состоящей из рака, болезни Паркинсона, болезни “трансплантат против хозяина” (GvHD), аутоиммунных заболеваний, гиперпролиферативных заболеваний, злокачественного перерождения, заболеваний печени, генетических заболеваний, включая наследственные генетические дефекты, сахарного диабета с ювенильным началом и заболеваний глазных компартментов.91. The method of claim 90, wherein the disease, disorder, or disorder is selected from the group consisting of cancer, Parkinson's disease, graft-versus-host disease (GvHD), autoimmune diseases, hyperproliferative diseases, malignant transformation, liver diseases, genetic diseases including hereditary genetic defects, juvenile-onset diabetes mellitus, and ocular compartment diseases.
92. Способ по п. 90, при этом заболевание, расстройство или нарушение затрагивает по меньшей мере одну систему организма, выбранную из группы, состоящей из мышечной, скелетной, кровеносной, нервной, лимфатической, респираторной, эндокринной, пищеварительной, выделительной и репродуктивной систем.92. The method of claim 90, wherein the disease, disorder, or disorder affects at least one body system selected from the group consisting of the muscular, skeletal, circulatory, nervous, lymphatic, respiratory, endocrine, digestive, excretory, and reproductive systems.
93. Применение модифицированных клеток-хозяев по любому из пп. 52-56 для лечения заболевания, расстройства или нарушения.93. The use of modified host cells according to any one of paragraphs. 52-56 for the treatment of a disease, disorder or disorder.
94. Модифицированные клетки-хозяева по любому из пп. 52-56 для применения при введении людям или для применения при лечении заболевания, расстройства или нарушения.94. Modified host cells according to any one of paragraphs. 52-56 for use when administered to humans or for use in the treatment of a disease, disorder or disorder.
95. Ауксотрофный фактор для применения при введении людям, получавшим модифицированные клетки-хозяева-человека по любому из пп. 52-56.95. An auxotrophic factor for use when administered to humans treated with modified human host cells according to any one of paragraphs. 52-56.
96. Способ облегчения или лечения заболевания или расстройства у нуждающегося в этом субъекта, который включает введение субъекту:96. A method of alleviating or treating a disease or disorder in a subject in need thereof, which comprises administering to the subject:
(a) композиции, включающей модифицированные клетки-хозяева, содержащие трансген, кодирующий белок, встроенный в вызывающий ауксотрофию локус, причем модифицированные клетки-хозяева ауксотрофны по ауксотрофному фактору; и (a) compositions comprising modified host cells containing a transgene encoding a protein inserted into an auxotrophic locus, wherein the modified host cells are auxotrophic for an auxotrophic factor; and
(b) ауксотрофного фактора в количестве, достаточном для обеспечения терапевтической экспрессии белка.(b) auxotrophic factor in an amount sufficient to provide therapeutic expression of the protein.
97. Способ по п. 96, при этом вызывающий ауксотрофию локус находится в пределах гена, кодирующего уридинмонофосфатсинтетазу (UMPS).97. The method of claim 96, wherein the auxotrophy-causing locus is within the gene encoding uridine monophosphate synthetase (UMPS).
98. Способ по п. 97, при этом ауксотрофным фактором является уридин.98. The method of claim 97, wherein the auxotrophic factor is uridine.
99. Способ по п. 96, при этом вызывающий ауксотрофию локус находится в пределах гена, кодирующего холокарбоксилазу-синтетазу (HLCS).99. The method of claim 96, wherein the auxotrophy-causing locus is within the gene encoding holocarboxylase synthetase (HLCS).
100. Способ по п. 99, при этом ауксотрофным фактором является биотин.100. The method of claim 99, wherein the auxotrophic factor is biotin.
101. Способ по п. 96, при этом белок представляет собой фермент.101. The method of claim 96, wherein the protein is an enzyme.
102. Способ по п. 96, при этом белок представляет собой антитело.102. The method of claim 96, wherein the protein is an antibody.
103. Способ по п. 96, при этом модифицированные клетки-хозяева представляют собой эмбриональные стволовые клетки, стволовые клетки, клетки-предшественники, плюрипотентные стволовые клетки, индуцированные плюрипотентные стволовые (iPS) клетки, соматические стволовые клетки, дифференцированные клетки, мезенхимальные стволовые клетки, нервные стволовые клетки, гемопоэтические стволовые клетки или гемопоэтические клетки-предшественники, жировые стволовые клетки, кератиноциты, скелетные стволовые клетки, мышечные стволовые клетки, фибробласты, NK-клетки, B-клетки, T-клетки или мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC).103. The method of claim 96, wherein the modified host cells are embryonic stem cells, stem cells, progenitor cells, pluripotent stem cells, induced pluripotent stem (iPS) cells, somatic stem cells, differentiated cells, mesenchymal stem cells, neural stem cells, hematopoietic stem cells or hematopoietic progenitor cells, adipose stem cells, keratinocytes, skeletal stem cells, muscle stem cells, fibroblasts, NK cells, B cells, T cells, or peripheral blood mononuclear cells (PBMCs).
104. Способ по п. 96, при этом модифицированные клетки-хозяева представляют собой клетки млекопитающих.104. The method of claim 96, wherein the modified host cells are mammalian cells.
105. Способ по п. 104, при этом клетки млекопитающих представляют собой клетки человека.105. The method of claim 104, wherein the mammalian cells are human cells.
106. Способ по п. 96, при этом модифицированные клетки-хозяева происходят от субъекта, подлежащего лечению модифицированными клетками хозяина.106. The method of claim 96, wherein the modified host cells originate from the subject to be treated with the modified host cells.
107. Способ по п. 96, при этом введение композиции и ауксотрофного фактора происходит одновременно.107. The method according to claim 96, wherein the administration of the composition and the auxotrophic factor occurs simultaneously.
108. Способ по п. 96, при этом введение композиции и ауксотрофного фактора происходит последовательно.108. The method of claim 96, wherein the administration of the composition and the auxotrophic factor occurs sequentially.
109. Способ по п. 108, при этом композиция вводится перед ауксотрофным фактором.109. The method of claim 108, wherein the composition is administered prior to the auxotrophic factor.
110. Способ по п. 96, при этом введение ауксотрофного фактора продолжается регулярно в течение времени, достаточного для усиления терапевтической экспрессии белка.110. The method of claim 96, wherein the administration of the auxotrophic factor continues regularly for a period of time sufficient to enhance therapeutic protein expression.
111. Способ по п. 96, при этом введение ауксотрофного фактора уменьшается для снижения экспрессии белка.111. The method of claim 96 wherein auxotrophic factor administration is reduced to reduce protein expression.
112. Способ по п. 96, при этом введение ауксотрофного фактора увеличивается для повышения экспрессии белка.112. The method of claim 96 wherein auxotrophic factor administration is increased to increase protein expression.
113. Способ по п. 96, при этом прекращение введения ауксотрофного фактора вызывает ингибирование роста или гибель модифицированных клеток-хозяев.113. The method of claim 96, wherein cessation of administration of the auxotrophic factor causes growth inhibition or death of the modified host cells.
114. Способ по п. 96, при этом введение ауксотрофного фактора продолжается в течение времени, достаточного для оказания терапевтического эффекта у субъекта.114. The method of claim 96, wherein the administration of the auxotrophic factor is continued for a time sufficient to produce a therapeutic effect in the subject.
115. Способ по п. 96, при этом модифицированные клетки-хозяева являются регенеративными.115. The method of claim 96, wherein the modified host cells are regenerative.
116. Способ по п. 96, при этом введение композиции включает локализованную доставку.116. The method of claim 96, wherein administration of the composition comprises localized delivery.
117. Способ по п. 96, при этом введение композиции включает системную доставку.117. The method of claim 96, wherein the administration of the composition comprises systemic delivery.
118. Способ по п. 96, при этом заболевание представляет собой лизосомную болезнь накопления (LSD).118. The method of claim 96, wherein the disease is lysosomal storage disease (LSD).
119. Способ по п. 118, при этом лизосомная болезнь накопления (LSD) представляет собой болезнь Гоше (типа 1/2/3), болезнь Хантера (MPS2), болезнь Помпе, болезнь Фабри, болезнь Краббе, гипофосфатазию, болезнь Ниманна-Пика типа A/B, MPS1, MPS3A, MPS3B, MPS3C, MPS3, MPS4, MPS6, MPS7, фенилкетонурию, MLD, болезнь Сандхоффа, болезнь Тея-Сакса или болезнь Баттенса.119. The method of claim 118, wherein the lysosomal storage disease (LSD) is Gaucher disease (type 1/2/3), Hunter disease (MPS2), Pompe disease, Fabry disease, Krabbe disease, hypophosphatasia, Niemann-Pick disease type A/B, MPS1, MPS3A, MPS3B, MPS3C, MPS3, MPS4, MPS6, MPS7, phenylketonuria, MLD, Sandhoff's disease, Tay-Sachs' disease, or Battens' disease.
120. Способ по п. 101, при этом фермент представляет собой глюкоцереброзидазу, идурсульфазу, б-аглюкозидазу, б-агалсидазу, в-агалсидазу, галактозилцерамидазу, б-асфотазу, кислую сфингомиелиназу, ларонидазу, гепаран-N-сульфатазу, б-N-ацетилглюкозаминидазу, гепаран-б-глюкозаминид-N-ацетилтрансферазу, N-ацетилглюкозамин-6-сульфатазу, б-элосульфазу, гласульфат, в-глюкуронидазу, фенилаланингидроксилазу, арилсульфатазу A, в-гексозаминидазу, б-гексозаминидазу или трипептидилпептидазу 1.120. The method according to p. 101, wherein the enzyme is glucocerebrosidase, idursulfase, β-aglucosidase, β-agalsidase, β-agalsidase, galactosylceramidase, β-asphotase, acid sphingomyelinase, laronidase, heparan-N-sulfatase, β-N- acetylglucosaminidase, heparan-b-glucosaminide-N-acetyltransferase, N-acetylglucosamine-6-sulfatase, β-elosulfase, glasulfate, β-glucuronidase, phenylalanine hydroxylase, arylsulfatase A, β-hexosaminidase, β-hexosaminidase, or tripeptidyl peptidase 1.
121. Способ по п. 96, при этом заболевание представляет собой атаксию Фридриха, наследственный ангионевротический отек или спинальную мышечную атрофию.121. The method of claim 96, wherein the disease is Friedrich's ataxia, hereditary angioedema, or spinal muscular atrophy.
122. Способ по п. 96, при этом белок представляет собой фратаксин, C1-ингибитор эстераз или SMN1.122. The method of claim 96, wherein the protein is frataxin, a C1 esterase inhibitor, or SMN1.
123. Способ уменьшения размера опухоли или снижения скорости роста опухоли у субъекта, который включает введение субъекту модифицированных клеток-хозяев по любому из пп. 52-56.123. A method for reducing the size of a tumor or reducing the rate of tumor growth in a subject, which includes administering the modified host cells to the subject according to any one of paragraphs. 52-56.