RU2020140600A - Варианты химозина с улучшенными молокосвертывающими свойствами - Google Patents

Claims (118)

1. Способ получения выделенного варианта полипептида химозина, включающий следующие стадии:

(а): создание изменения в одном или более положений в родительском полипептиде, обладающем активностью химозина, где изменение включает замену, делецию или инсерцию по меньшей мере в одном аминокислотном положении, соответствующем любому из положений 70 и 75; и

(б): продуцирование и выделение измененного полипептида стадии (а) и, таким образом, получение выделенного варианта полипептида химозина, где вариант обладает активностью химозина;

и где:

(1): аминокислотное положение родительского полипептида определяют путем выравнивания родительского полипептида с полипептидом с SEQ ID NO: 1 (бычий химозин), т.е. полипептид с SEQ ID NO: 1 используют для определения соответствующей аминокислотной последовательности в родительском полипептиде; и

(2): родительский полипептид обладает по меньшей мере 65%-ной идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 1 (бычий химозин), который находится от аминокислотного положения 59 до аминокислотного положения 381 SEQ ID NO: 1;

и при условии, что выделенный вариант полипептида химозина не представляет собой конкретный вариант, выбранный из группы, состоящей из:

Q246E+G309D+S329P+D337E;

R125Q+G128N+H204R+Q246E+S284T;

Y185F+R213Q+Q246E;

V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F;

G128D+L188I+Y326F;

G128N+R312S+S313Y+Y326F;

G128N+R312S+S313Y+Y326F;

D117N+V261A+R312S;

D216S+L224V+V263I+F281V+G309D;

Y79S+L224V+L311I; и

R119S+L224V+T297S,

где выделенный вариант полипептида химозина обладает:

- активностью химозина, обеспечивающей повышенное отношение С(удельная свертывающая активность)/Р(протеолитическая активность) по сравнению с отношением С/Р бычьего химозина, содержащего зрелый полипептид с SEQ ID NO: 1; и

- активностью химозина, обеспечивающей повышенное отношение С/Р по сравнению с отношением С/Р верблюжьего химозина, содержащего зрелый полипептид с SEQ ID NO: 2.

2. Способ получения выделенного варианта полипептида химозина по п. 1, где изменение включает замену по меньшей мере в одном аминокислотном положении, и где замена представляет собой L70M или F75Y.

3. Способ получения выделенного варианта полипептида химозина по п. 1, где изменение включает замену по меньшей мере в одном аминокислотном положении, и где замена представляет собой:

L280I+G309W+F75Y+Y79S;

L280I+G309D+F75Y+S331Y+Q346E;

L280I+G309D+L70M+T342S;

L280I+G309D+H134Q+М223Е+L70M;

L280I+G309D+Y326F+L70M+D325Q;

L280I+G309D+H134Q+М223Е+L70M;

L280I+G309D+L70M+T342S;

L280I+G309D+H134Q+М223Е+L70M;

L70M+K77T+N108D+D117N+H134Q+М223Е+L280I+Q346E;

L70M+K77T+V90L+D117N+H134Q+D202Q+М223Е+L280I+G309D;

L70M+V109L+D117N+F124Y+H134Q+М223Е+V261A+L280I+G309W;

или

L280I+G309D+F75Y+T342S+V261A.

4. Способ получения выделенного варианта полипептида химозина по любому из пп. 1-3, где родительский полипептид обладает по меньшей мере 95%-ной идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 1 (бычий химозин).

5. Способ получения выделенного варианта полипептида химозина по любому из пп. 1-3, где родительский полипептид обладает по меньшей мере 95%-ной идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 2 (верблюжий химозин), который находится от аминокислотного положения 59 до аминокислотного положения 381 SEQ ID NO: 2.

6. Выделенный вариант полипептида химозина, полученный способом по любому из пп. 1-5.

7. Выделенный вариант полипептида химозина, содержащий:

(а): изменение в одном или более положений в родительском полипептиде, обладающем активностью химозина, где изменение включает замену, делецию или инсерцию по меньшей мере в одном аминокислотном положении, соответствующем любому из положений 70 и 75; и

(б): где вариант обладает активностью химозина;

и где:

(1): аминокислотное положение родительского полипептида определяют путем выравнивания родительского полипептида с полипептидом с SEQ ID NO: 1 (бычий химозин), т.е. полипептид с SEQ ID NO: 1 используют для определения соответствующей аминокислотной последовательности в родительском полипептиде; и

(2): родительский полипептид обладает по меньшей мере 90%-ной идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 1 (бычий химозин), который находится от аминокислотного положения 59 до аминокислотного положения 381 SEQ ID NO: 1; и

(3): выделенный вариантный полипептид обладает менее чем 100%-ной идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 1 (бычий химозин);

и при условии, что выделенный вариант полипептида химозина НЕ представляет собой конкретный вариант, выбранный из группы, состоящей из:

Q246E+G309D+S329P+D337E;

R125Q+G128N+H204R+Q246E+S284T;

Y185F+R213Q+Q246E;

V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F;

G128D+L188I+Y326F;

G128N+R312S+S313Y+Y326F;

G128N+R312S+S313Y+Y326F; и

D117N+V261A+R312S;

D216S+L224V+V263I+F281V+G309D

Y79S+L224V+L311I и

R119S+L224V+T297S; и

где выделенный вариант обладает активностью химозина, обеспечивающей повышенное отношение С/Р по сравнению с отношением С/Р бычьего химозина, содержащего зрелый полипептид с SEQ ID NO: 1.

8. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 7, где родительский полипептид обладает по меньшей мере 97%-ной идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 1 (бычий химозин); и

где выделенный вариант бычьего химозина содержит менее 10 изменений аминокислот (например, замен) по сравнению со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 1 (бычий химозин).

9. Выделенный вариант полипептида химозина по любому из пп. 7, 8, где изменение включает замену по меньшей мере в одном аминокислотном положении, и где замена представляет собой L70M или F75Y.

10. Выделенный вариант полипептида химозина по любому из пп. 7, 8, где изменение включает замену по меньшей мере в одном аминокислотном положении, и где замена представляет собой:

L280I+G309W+F75Y+Y79S;

L280I+G309D+F75Y+S331Y+Q346E;

L280I+G309D+L70M+T342S;

L280I+G309D+H134Q+М223Е+L70M;

L280I+G309D+Y326F+L70M+D325Q;

L280I+G309D+H134Q+М223Е+L70M;

L280I+G309D+L70M+T342S;

L280I+G309D+H134Q+М223Е+L70M

L70M+K77T+N108D+D117N+H134Q+М223Е+L280I+Q346E;

L70M+K77T+V90L+D117N+H134Q+D202Q+М223Е+L280I+G309D;

L70M+V109L+D117N+F124Y+H134Q+М223Е+V261A+L280I+G309W;

или

L280I+G309D+F75Y+T342S+V261A.

11. Выделенный вариант полипептида химозина, содержащий:

(а): изменение в одном или более положений в родительском полипептиде, обладающем активностью химозина, где изменение включает замену, делецию или инсерцию по меньшей мере в одном аминокислотном положении, соответствующем любому из положений 70 и 75; и

(б): где вариант обладает активностью химозина;

и где:

(1): аминокислотное положение родительского полипептида определяют путем выравнивания родительского полипептида с полипептидом с SEQ ID NO: 1 (бычий химозин), т.е. полипептид с SEQ ID NO: 1 используют для определения соответствующей аминокислотной последовательности в родительском полипептиде; и

(2): родительский полипептид обладает по меньшей мере 90%-ной идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 2 (верблюжий химозин), который находится от аминокислотного положения 59 до аминокислотного положения 381 SEQ ID NO: 2; и

(3): выделенный вариантный полипептид обладает менее чем 100%-ной идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 2 (верблюжий химозин);

и при условии, что выделенный вариант полипептида химозина НЕ представляет собой конкретный вариант, выбранный из группы, состоящей из:

Q246E+G309D+S329P+D337E;

R125Q+G128N+H204R+Q246E+S284T;

Y185F+R213Q+Q246E;

V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F;

G128D+L188I+Y326F;

G128N+R312S+S313Y+Y326F;

G128N+R312S+S313Y+Y326F;

D117N+V261A+R312S;

D216S+L224V+V263I+F281V+G309D;

Y79S+L224V+L311I; и

R119S+L224V+T297S; и

где выделенный вариант обладает активностью химозина, обеспечивающей повышенное отношение С/Р по сравнению с отношением С/Р верблюжьего химозина, содержащего зрелый полипептид с SEQ ID NO: 2.

12. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 11, где изменение включает замену по меньшей мере в одном аминокислотном положении, и где замена представляет собой:

L280I+G309W+F75Y+Y79S;

L280I+G309D+F75Y+S331Y+Q346E;

L280I+G309D+L70M+T342S;

L280I+G309D+H134Q+М223Е+L70M;

L280I+G309D+Y326F+L70M+D325Q;

L280I+G309D+H134Q+М223Е+L70M;

L280I+G309D+L70M+T342S;

L280I+G309D+H134Q+М223Е+L70M

L70M+K77T+N108D+D117N+H134Q+М223Е+L280I+Q346E;

L70M+K77T+V90L+D117N+H134Q+D202Q+М223Е+L280I+G309D;

L70M+V109L+D117N+F124Y+H134Q+М223Е+V261A+L280I+G309W;

или

L280I+G309D+F75Y+T342S+V261A.

13. Способ изготовления пищевого продукта, включающий добавление эффективного количества выделенного варианта полипептида химозина по любому из пп. 6-12 к пищевому(ым) ингредиенту(ам) и осуществление дальнейших этапов производства с получением пищевого продукта; и

где продукт представляет собой продукт на основе молока, и где способ включает добавление эффективного количества выделенного варианта полипептида химозина по любому из пп. 6-12 к молоку и осуществление дальнейших этапов производства с получением продукта на основе молока; и

где молоко представляет собой соевое молоко, овечье молоко, козье молоко, молоко буйволиц, молоко яков, молоко лам, верблюжье молоко или коровье молоко; и

где продукт на основе молока представляет собой кисломолочный продукт, творог или сыр.

14: Способ изготовления кормового продукта, включающий добавление эффективного количества выделенного варианта полипептида химозина по любому из пп. 6-12 к кормовому(ым) ингредиенту(ам) и осуществление дальнейших этапов производства с получением кормового продукта; и

где продукт представляет собой продукт на основе молока, и где способ включает добавление эффективного количества выделенного варианта полипептида химозина по любому из пп. 6-12 к молоку и осуществление дальнейших этапов производства с получением продукта на основе молока; и

где молоко представляет собой соевое молоко, овечье молоко, козье молоко, молоко буйволиц, молоко яков, молоко лам, верблюжье молоко или коровье молоко; и

где продукт на основе молока представляет собой кисломолочный продукт, творог или сыр.