RU2020124074A - Кофеилпируват-гидролазы и их применение - Google Patents

Claims (46)

1. Белок биосинтеза люциферина грибов, представляющий собой кофеилпируват-гидролазу, состоящий из:

а) аминокислотной последовательности, выбранной из группы SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75; или

б) аминокислотной последовательности, которая имеет не менее 60% идентичности с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75, где указанная кофеилпируват-гидролаза катализирует превращение 6-арил-2-гидрокси-4-оксогекса-2,5-диеновые кислоты, имеющей структурную формулу

,

где R - арил или гетероарил, в 3-арилакриловую кислоту со структурной формулой

.

2. Белок по п. 1, где аминокислотная последовательность кофеилпируват-гидролазы имеет не менее 65% идентичности, или не менее 70% идентичности, или не менее 75% идентичности, или не менее 80% идентичности, или не менее 85% идентичности, или не менее 90% идентичности, или не менее 95% идентичности с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75.

3. Белок по 2, где аминокислотная последовательность кофеилпируват-гидролазы имеет не менее 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98% или 99% идентичности с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75.

4. Белок по п. 1, где 3-арилакриловая кислота выбрана из группы: кофейная кислота, коричная кислота, паракумаровая кислота, кумаровая кислота, умбеллиновая кислота, синаповая кислота, феруловая кислота.

5. Применение белка биосинтеза люциферина грибов, состоящего из:

а) аминокислотной последовательности, выбранной из группы SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75; или

б) аминокислотной последовательности, которая имеет не менее 60% идентичности с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75,

в системах in vitro или in vivo как кофеилпируват-гидролазы, катализирующей реакцию превращения 6-арил-2-гидрокси-4-оксогекса-2,5-диеновые кислоты, имеющей структурную формулу

,

где R - арил или гетероарил, в 3-арилакриловую кислоту со структурной формулой

.

6. Применение по п. 5, где аминокислотная последовательность кофеилпируват-гидролазы имеет не менее 65% идентичности, или не менее 70% идентичности, или не менее 75% идентичности, или не менее 80% идентичности, или не менее 85% идентичности, или не менее 90% идентичности, или не менее 95% идентичности с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NOs: 65, 67, 69, 71, 73, 75.

7. Применение по п. 5, где 3-арилакриловая кислота выбрана из группы: кофейная кислота, коричная кислота, паракумаровая кислота, кумаровая кислота, умбеллиновая кислота, синаповая кислота, феруловая кислота.

8. Нуклеиновая кислота, кодирующая белок биосинтеза люциферина грибов по п. 1.

9. Кассета экспрессии, содержащая (а) регион инициации транскрипции функциональный в клетке-хозяине; (б) нуклеиновую кислоту по п. 8 и (в) регион терминации транскрипции, функциональный в клетке-хозяине, причем клетка-хозяин не является эмбриональной клеткой человека.

10. Клетка-хозяин, содержащая по крайней мере одну кассету экспрессии по п. 9 как часть экстрахромосомного элемента или интегрированную в геном клетки как результат внедрения указанной кассеты в указанную клетку, где указанная клетка экспрессирует по крайней мере один из функциональных белков биосинтеза люциферина грибов, представляющего собой кофеилпируват-гидролазу, а также указанная клетка не является эмбриональной клеткой человека.

11. Применение нуклеиновой кислоты, кодирующей белок биосинтеза люциферина грибов, представляющего собой кофеилпируват-гидролазу, по п. 8 для получения в системах in vitro или in vivo кофеилпируват-гидролазы по п. 1.

12. Применение по п. 11, где нуклеиновая кислота применяется для экспрессии белка биосинтеза люциферина грибов в составе кассеты экспрессии, которая также включает регион инициации транскрипции функциональный в клетке-хозяине и регион терминации транскрипции, функциональный в клетке-хозяине, причем клетка-хозяин не является эмбриональной клеткой человека.

13. Применение по п. 12, где кассета экспрессии применяется в клетке-хозяине, причем клетка-хозяин не является эмбриональной клеткой человека.

14. Трансгенный организм, способный к автономной биолюминесценции, где указанный организм содержит по крайней мере одну нуклеиновую кислоту по п. 8 как часть экстрахромосомного элемента или интегрированную в геном клетки как результат внедрения в указанную клетку кассеты экспрессии по п. 9, а также нуклеиновую кислоту, кодирующию:

(а) гиспидин-гидроксилазу, способную катализировать превращение 6-(2-арилвинил)-4- гидрокси-2H-пиран-2-она, имеющего структурную формулу

,

в 6-(2-арилвинил)-3,4-дигидрокси-2H-пиран-2-он, имеющий структурную формулу,

.

где R - арил или гетероарил; и нуклеиновую кислоту, кодирующую:

(б) люциферазу, способную окислять люциферин грибов с выделением света,

причем трансгенный организм не является человеком или человеческим эмбрионом.

15. Трансгенный организм по п. 14, также содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую гиспидин-синтазу, способную катализировать превращение 3-арилакриловой кислоты со структурной формулой,

,

где R - арил или гетероарил в 6-(2-арилвинил)-4-гидрокси-2H-пиран-2-он, имеющий структурную формулу

,

где R - арил или гетероарил.

16. Трансгенный организм по п. 15, также содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую поликетидсинтазу III типа, способную катализировать синтез гиспидин из кофеил-КоА.

17. Трансгенный организм по п. 15, также содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую 4'-фосфопантотеинил трансферазу и/или нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты биосинтеза 3-арилакриловой кислоты.

18. Трансгенный организм по 17, где ферменты биосинтеза 3-арилакриловой кислоты выбраны из группы:

(а) тирозин-аммоний-лиаза, аминокислотная последовательность которой представляет собой SEQ ID No: 107 или по крайней мере на 40% идентична последовательности, показанной в SEQ ID No: 107; компоненты HpaB и HpaC 4-гидроксифенилацетат 3-монооксигеназы-редуктазы, аминокислотные последовательности которых представляет собой SEQ ID Nos: 109 и 111 или по крайней мере на 40% идентичны последовательностями компонентов HpaB и HpaC 4-гидроксифенилацетат 3-монооксигеназы-редуктазы E. coli, показанными в SEQ ID Nos: 109 и 111;

(б) фенилаланин-аммоний-лиаза, аминокислотная последовательность которой представляет собой SEQ ID Nos: 117 или по крайней мере на 40% идентична аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID Nos: 117.

19. Трансгенный организм по п. 16, также содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую кумарат-КоА-лигазу и/или нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты биосинтеза 3-арилакриловой кислоты.

20. Трансгенный организм по 19, где ферменты биосинтеза 3-арилакриловой кислоты выбраны из группы:

(а) тирозин-аммоний-лиаза, аминокислотная последовательность которой представляет собой SEQ ID No: 107 или по крайней мере на 40% идентична последовательности, показанной в SEQ ID No: 107; компоненты HpaB и HpaC 4-гидроксифенилацетат 3-монооксигеназы-редуктазы, аминокислотные последовательности которых по крайней мере на 40% идентичны последовательностями компонентов HpaB и HpaC 4-гидроксифенилацетат 3-монооксигеназы-редуктазы E. coli, показанными в SEQ ID Nos: 109 и 111;

(б) фенилаланин-аммоний-лиаза, аминокислотная последовательность которой представляет собой SEQ ID Nos: 117 или по крайней мере на 40% идентична аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID Nos: 117.