Claims (43)
1. Быстрый, имеющий высокий выход, способ очистки капсульного полисахарида Neisseria meningitidis серогруппы X, включающий стадии:1. A fast, high yield, method for purifying the serogroup X Neisseria meningitidis capsular polysaccharide, comprising the steps of:
(a) обработка ферментационного бульона Neisseria meningitidis серогруппы X путем добавления предварительно определенных растворов простой соли и сухого порошка соли конкретной концентрации;(a) treating the serogroup X Neisseria meningitidis fermentation broth by adding predetermined simple salt solutions and dry salt powder of a specific concentration;
(b) добавление конкретного объема органического растворителя к раствору, обработанному солью на стадии (а);(b) adding a specific volume of organic solvent to the salt-treated solution in step (a);
(c) смешивание раствора со стадии (b) при комнатной температуре в течение конкретного периода времени;(c) mixing the solution from step (b) at room temperature for a specific period of time;
(d) проведение центрифугирования раствора со стадии (с) при конкретных оборотах в минуту в течение предварительно определенного периода;(d) centrifuging the solution from step (c) at a specific rpm for a predetermined period;
(e) сбор супернатанта, полученного из центрифугированного раствора со стадии (d);(e) collecting the supernatant obtained from the centrifuged solution from step (d);
(f) концентрирование и диафильтрация указанного супернатанта со стадии (е) с применением мембраны с отсечением по молекулярной массе, с получением частично очищенного бактериального полисахарида;(f) concentrating and diafiltering said supernatant from step (e) using a molecular weight cut-off membrane to obtain a partially purified bacterial polysaccharide;
(g) осаждение указанного частично очищенного полисахарида со стадии (f) по меньшей мере одним катионным детергентом в конкретных условиях с последующим центрифугированием при конкретных оборотах в минуту в течение предварительно определенного периода для получения первого осадка;(g) precipitating said partially purified polysaccharide from step (f) with at least one cationic detergent under specified conditions, followed by centrifugation at specified rpm for a predetermined period to obtain a first precipitate;
(h) растворение указанного первого осадка в неорганическом осаждающем агенте;(h) dissolving said first precipitate in an inorganic precipitating agent;
(i) добавление к указанному растворенному первому осадку со стадии (h) по меньшей мере одного органического растворителя с последующей инкубацией в предварительно определенных условиях;(i) adding to said dissolved first precipitate from step (h) at least one organic solvent, followed by incubation under predetermined conditions;
(j) центрифугирование указанного раствора со стадии (i) в конкретных условиях с последующим сбором второго осадка;(j) centrifuging said solution from step (i) under specific conditions, followed by collecting a second precipitate;
(k) растворение указанного второго осадка в MQW и обработка конкретными химическими реагентами и конкретным органическим растворителем с последующей инкубацией в конкретных условиях;(k) dissolving the specified second precipitate in MQW and treatment with specific chemicals and a specific organic solvent, followed by incubation under specific conditions;
(l) центрифугирование указанного инкубированного раствора со стадии (k) в конкретных условиях центрифугирования с последующим сбором супернатанта;(l) centrifuging said incubated solution from step (k) under specific centrifugation conditions, followed by collecting the supernatant;
(m) фильтрация на угле указанного супернатанта со стадии (l) с получением фильтрата на угле до достижения необходимой оптической плотности;(m) filtering on charcoal said supernatant from step (l) to obtain a filtrate on charcoal until the desired optical density is reached;
(n) фильтрация указанного фильтрата на угле со стадии (m) с применением фильтрационной установки PES с последующим концентрированием и диафильтрацией в конкретных условиях;(n) filtering said coal filtrate from step (m) using a PES filtration unit, followed by concentration and diafiltration under specified conditions;
(o) фильтрация указанного диафильтрованного супернатанта со стадии (n) с применением конкретной фильтрационной установки PES для получения очищенного полисахарида;(o) filtering said diafiltered supernatant from step (n) using a particular PES filtration unit to obtain a purified polysaccharide;
(p) хранение указанного очищенного полисахарида со стадии (о) в конкретных условиях,(p) storing said purified polysaccharide from step (o) under specific conditions,
при этом способ является экономичным, масштабируемым, и обеспечивает получение очищенного полисахарида Neisseria meningitidis серогруппы X в диапазоне 147-323 мг/л ферментационного бульона.the method is economical, scalable, and provides a purified serogroup X Neisseria meningitidis polysaccharide in the range of 147-323 mg / l fermentation broth.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный предварительно определенный раствор простой соли и сухой порошок соли конкретной концентрации представляют собой 0,25 ± 0,1 M цитрат тринатрия и 25 ± 5% об./об. раствор сульфата натрия из 2М исходного раствора.2. The method according to claim 1, characterized in that said predetermined simple salt solution and dry salt powder of a specific concentration are 0.25 ± 0.1 M trisodium citrate and 25 ± 5% v / v. sodium sulfate solution from 2M stock solution.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный органический растворитель со стадии (b) представляет собой 25 ± 5% об./об. абсолютного спирта.3. The method according to claim 1, characterized in that said organic solvent from step (b) is 25 ± 5% v / v. absolute alcohol.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная конкретная продолжительность стадии (с) перемешивания составляет 2 ± 0,5 часов.4. A method according to claim 1, characterized in that said specific duration of the stirring stage (c) is 2 ± 0.5 hours.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанное центрифугирование на стадии (d) проводят при 10000-11000 × g в течение 30 ± 5 минут.5. The method according to claim 1, characterized in that said centrifugation in step (d) is carried out at 10,000-11,000 × g for 30 ± 5 minutes.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанную диафильтрацию на стадии (f) проводят с применением 100 кДа PES мембраны с 10-12 объемами MQW.6. A method according to claim 1, characterized in that said diafiltration in step (f) is carried out using a 100 kDa PES membrane with 10-12 volumes of MQW.
7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный катионный детергент со стадии (g) представляет собой 15 ± 2% об./об. исходного раствора 10% CTAB.7. The method according to claim 1, wherein said cationic detergent from step (g) is 15 ± 2% v / v. stock solution of 10% CTAB.
8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные конкретные условия на стадии (g) для осаждения с катионным детергентом представляют собой 4 ± 1 часа при комнатной температуре.8. A method according to claim 1, wherein said specific conditions in step (g) for precipitation with a cationic detergent are 4 ± 1 hours at room temperature.
9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанное центрифугирование на стадии (g) проводят при 10000-11000 × g в течение 40 ± 10 минут.9. The method according to claim 1, characterized in that said centrifugation in step (g) is carried out at 10,000-11,000 × g for 40 ± 10 minutes.
10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный неорганический осаждающий агент представляет собой 0,15 ± 0,03 M раствор хлорида кальция.10. A method according to claim 1, wherein said inorganic precipitating agent is a 0.15 ± 0.03 M calcium chloride solution.
11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что по меньшей мере один указанный органический растворитель на стадии (i) представляет собой 90 ± 5% об./об. абсолютного спирта.11. The method according to claim 1, characterized in that at least one said organic solvent in step (i) is 90 ± 5% v / v. absolute alcohol.
12. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные предварительно определенные условия инкубации на стадии (i) представляют собой инкубацию в течение ночи при 2-8°С.12. A method according to claim 1, wherein said predetermined incubation conditions in step (i) are overnight incubation at 2-8 ° C.
13. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные конкретные условия центрифугирования представляют собой 10000-11000 × g в течение 40 ± 10 минут.13. The method of claim 1, wherein said specific centrifugation conditions are 10,000-11,000 xg for 40 ± 10 minutes.
14. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные конкретные химические реагенты на стадии (k) включают, но не ограничиваются ими, 10 ± 2 % масс./об. ацетат натрия и 1,1 ± 0,1 % масс./об. дезоксихолат.14. The method according to p. 1, characterized in that said specific chemical reagents in stage (k) include, but are not limited to, 10 ± 2% wt./about. sodium acetate and 1.1 ± 0.1% w / v. deoxycholate.
15. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный конкретный органический растворитель со стадии (k) представляет собой 30 ± 5 % об./об. абсолютного этанола.15. The method according to claim 1, wherein said specific organic solvent from step (k) is 30 ± 5% v / v. absolute ethanol.
16. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные конкретные условия инкубации на стадии (k) представляют собой 2-8°C в течение 2 ± 0,5 часов.16. The method according to claim 1, characterized in that said specific incubation conditions in step (k) are 2-8 ° C for 2 ± 0.5 hours.
17. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные конкретные условия центрифугирования на стадии (l) представляют собой 10000-11000 × g в течение 30 ± 5 минут.17. The method of claim 1, wherein said specific centrifugation conditions in step (l) are 10,000-11,000 xg for 30 ± 5 minutes.
18. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанную фильтрацию на угле на стадии (m) проводят на обработанных этанолом угольных фильтрах миллистак.18. A method according to claim 1, characterized in that said carbon filtration in step (m) is carried out on ethanol-treated millistac carbon filters.
19. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная необходимая оптическая плотность на стадии (m) представляет собой OD260 нм, менее или равную 0,2.19. The method according to claim 1, characterized in that said required optical density in step (m) is OD260 nm, less than or equal to 0.2.
20. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные конкретные условия концентрирования и диафильтрации на стадии (n) представляют собой применение 100 кДа PES мембраны с отсечением по молекулярной массе с 10-20 объемами MQW.20. The method of claim 1, wherein said specific concentration and diafiltration conditions in step (n) are the use of a 100 kDa PES molecular weight cutoff membrane with 10-20 MQW volumes.
21. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная конкретная фильтрационная установка PES на стадии (о) представляет собой 0,2 мкм фильтрационную установку PES.21. The method of claim 1, wherein said particular PES filtration unit in step (o) is a 0.2 μm PES filtration unit.
22. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные конкретные условия хранения указанного очищенного полисахарида представляют собой -20±2°C.22. The method of claim 1, wherein said specific storage conditions for said purified polysaccharide are -20 ± 2 ° C.
23. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный способ отвечает конкретным стандартам качества для полисахаридов.23. A method according to claim 1, wherein said method meets specific quality standards for polysaccharides.
24. Способ по п. 1, отличающийся тем, что выход очищенного полисахарида Neisseria meningitidis серогруппы X составляет не более 323 мг/л.24. The method according to claim 1, characterized in that the yield of the purified serogroup X Neisseria meningitidis polysaccharide is not more than 323 mg / l.
25. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный способ получения указанного очищенного полисахарида Neisseria meningitidis серогруппы X завершается в течение 24 ± 2 часов.25. The method according to claim 1, wherein said method for producing said purified serogroup X Neisseria meningitidis polysaccharide is completed within 24 ± 2 hours.
26. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный очищенный бактериальный полисахарид можно применять для получения экономичной моновалентной капсульной полисахаридной или полисахарид-белковой конъюгатной вакцины или поливалентной комбинированной вакцины, а также в качестве диагностического средства против менингококковых инфекций серогруппы X. также в качестве диагностического средства против менингококковых инфекций серогруппы X.26. The method according to claim 1, characterized in that said purified bacterial polysaccharide can be used to obtain an economical monovalent capsular polysaccharide or polysaccharide-protein conjugate vaccine or a multivalent combination vaccine, and also as a diagnostic agent against meningococcal infections of serogroup X. also as diagnostic agent against meningococcal infections of serogroup X.