RU2013131855A

RU2013131855A - Днк, кодирующая дипептид-синтезирующий фермент (варианты), бактерия рода escherichia и способ получения дипептидов с ее использованием

Info

Publication number: RU2013131855A
Application number: RU2013131855/10A
Authority: RU
Inventors: Сергей Васильевич Смирнов; Павел Михайлович СОКОЛОВ; Такаюки Ито
Original assignee: Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ"); Аджиномото Ко., Инк.
Priority date: 2013-07-11
Filing date: 2013-07-11
Publication date: 2015-01-20
Also published as: RU2560980C2

Abstract

1. ДНК, кодирующая белок, имеющий дипептид-синтезирующую активность, отличающаяся тем, что указанная ДНК выбрана из группы, состоящей из:(A) ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NOs: 1, 3 и 5;(B) ДНК, гибридизующейся в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, комплементарной последовательности, представленной в SEQ ID NOs: 1, 3 и 5, отличающейся тем, что указанные жесткие условия включают промывание один или более раз в растворе, содержащем концентрацию солей 1×SSC, 0,1% SDS или 0,1×SSC, 0,1% SDS при 60°С или 65°С;(C) ДНК, кодирующей белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NOs: 2, 4 и 6;(D) ДНК, кодирующей вариант белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NOs: 2, 4 и 6, но которая содержит замену, делецию, вставку или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков, и имеющего дипептид-синтезирующую активность в соответствии с аминокислотной последовательностью SEQ ID NOs: 2, 4 и 6;(Е) ДНК, кодирующей белок, имеющего гомологию, определенную через значение |Log(E-value)|, не менее чем 128, не менее чем 142, не менее чем 162, не менее чем 175, не менее чем 182, не менее чем 196, или не менее чем 233 по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NOs: 2, 4 и 6, и имеющего дипептид-синтезирующую активность в соответствии с аминокислотной последовательностью SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 и 18.2. Рекомбинантная ДНК для экспрессии ДНК по п.1, содержащая ДНК по п.1.3. Дипептид-продуцирующая бактерия, принадлежащая к роду Escherichia и модифицированная таким образом, что содержит рекомбинантную ДНК по п.2.4. Бактерия по п.3, отличающаяся тем, что указанная бактерия принадлежит к виду Escherichia coli.5. Бактерия по любому из пп.3 или 4, отличающаяся тем, что указа

Claims

1. ДНК, кодирующая белок, имеющий дипептид-синтезирующую активность, отличающаяся тем, что указанная ДНК выбрана из группы, состоящей из:

(A) ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NOs: 1, 3 и 5;

(B) ДНК, гибридизующейся в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, комплементарной последовательности, представленной в SEQ ID NOs: 1, 3 и 5, отличающейся тем, что указанные жесткие условия включают промывание один или более раз в растворе, содержащем концентрацию солей 1×SSC, 0,1% SDS или 0,1×SSC, 0,1% SDS при 60°С или 65°С;

(C) ДНК, кодирующей белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NOs: 2, 4 и 6;

(D) ДНК, кодирующей вариант белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NOs: 2, 4 и 6, но которая содержит замену, делецию, вставку или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков, и имеющего дипептид-синтезирующую активность в соответствии с аминокислотной последовательностью SEQ ID NOs: 2, 4 и 6;

(Е) ДНК, кодирующей белок, имеющего гомологию, определенную через значение |Log₁₀(E-value)|, не менее чем 128, не менее чем 142, не менее чем 162, не менее чем 175, не менее чем 182, не менее чем 196, или не менее чем 233 по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NOs: 2, 4 и 6, и имеющего дипептид-синтезирующую активность в соответствии с аминокислотной последовательностью SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 и 18.

2. Рекомбинантная ДНК для экспрессии ДНК по п.1, содержащая ДНК по п.1.

3. Дипептид-продуцирующая бактерия, принадлежащая к роду Escherichia и модифицированная таким образом, что содержит рекомбинантную ДНК по п.2.

4. Бактерия по п.3, отличающаяся тем, что указанная бактерия принадлежит к виду Escherichia coli.

5. Бактерия по любому из пп.3 или 4, отличающаяся тем, что указанная бактерия модифицирована так, чтобы иметь ослабленные или инактивированные один или более генов, кодирующих белки, обладающие пептидазной активностью.

6. Бактерия по п.5, отличающаяся тем, что указанные гены, кодирующие белки, имеющие пептидазную активность, выбраны из группы, состоящей из рерА, рерВ, pepD, pepE, pepP, pepQ, pepN, рерТ, iadA, iaaA(ybiK) и dapE.

7. Белок, имеющий дипептид-синтезирующую активность, отличающийся тем, что указанный белок выбран из группы, состоящей из:

(F) белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NOs: 2, 4 и 6;

(G) варианта белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NOs: 2, 4 и 6, но которая содержит замену, делению, вставку или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков, и имеющего дипептид-синтезирующую активность в соответствии с аминокислотной последовательностью SEQ ID NOs: 2, 4 и 6;

(H) белка, имеющего гомологию, определенную через значение |Log₁₀(E-value)|, не менее чем 128, не менее чем 142, не менее чем 162, не менее чем 175, не менее чем 182, не менее чем 196, или не менее чем 233 по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NOs: 2, 4 и 6, и имеющего дипептид-синтезирующую активность в соответствии с аминокислотной последовательностью SEQ ID NOs: 2, 4 и 6.

8. Способ получения белка по п.7, включающий:

(a) выращивание бактерии по любому из пп.3-6 в питательной среде для продукции указанного белка;

(b) накопление указанного белка в бактерии и/или культуральной жидкости; и, если необходимо,

(с) выделение указанного белка из бактерии или культуральной жидкости.

9. Способ получения дипептида или его соли, включающий:

(a) реакцию L-аминокислот или производных L-аминокислот, или их солей в приемлемых условиях в присутствии белка по п.7;

(b) накопление указанного дипептида или его соли в приемлемом растворителе; и, если необходимо,

(c) выделение указанного дипептида или его соли из приемлемого растворителя.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что указанная L-аминокислота или ее производные выбраны из группы, состоящей из L-аланина, L-аргинина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-цистеина, L-глутаминовой кислоты, L-глутамина, глицина, L-гистидина, L-изолейцина, L-лейцина, L-лизина, L-метионина, L-фенилаланина, L-пролина, L-серина, L-треонина, L-триптофана, L-тирозина, L-валина и низшего алкильного эфира L-фенилаланина.

11. Способ по п.9, отличающийся тем, что указанный дипептид представлен формулой:

R1-R2,

отличающийся тем, что R1 есть остаток кислой L-аминокислоты или производное остатка кислой L-аминокислоты, и R2 есть остаток L-аминокислоты или производное остатка L-аминокислоты, причем указанный остаток L-аминокислоты выбран из группы, состоящей из остатка L-аланина, L-аргинина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-цистеина, L-глутаминовой кислоты, L-глутамина, глицина, L-гистидина, L-изолейцина, L-лейцина, L-лизина, L-метионина, L-фенилаланина, L-пролина, L-серина, L-треонина, L-триптофана, L-тирозина, L-валина и низшего алкилового эфира L-фенилаланина.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что R1 есть остаток L-аспарагиновой кислоты или остаток L-глутаминовой кислоты, и R2 есть остаток L-глутаминовой кислоты, L-изолейцина, L-фенилаланина, L-триптофана, L-валина или низшего алкильного эфира L-фенилаланина.

13. Способ по п.11, отличающийся тем, что R1 есть остаток L-аспарагиновой кислоты, и R2 есть остаток L-фенилаланина или низшего алкильного эфира L-фенилаланина.

14. Способ по п.10, отличающийся тем, что низший алкильный эфир L-фенилаланина есть метиловый, этиловый или пропиловый эфир L-фенилаланина.

15. Способ получения дипептида или его соли, включающий:

(a) выращивание бактерии по любому из пп.3-6 в питательной среде;

(b) накопление указанного дипептида в бактерии и/или культуральной жидкости; и, если необходимо,

(c) выделение указанного дипептида из бактерии или культуральной жидкости.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанная L-аминокислота или ее производные выбраны из группы, состоящей из L-аланина, L-аргинина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-цистеина, L-глутаминовой кислоты, L-глутамина, глицина, L-гистидина, L-изолейцина, L-лейцина, L-лизина, L-метионина, L-фенилаланина, L-пролина, L-серина, L-треонина, L-триптофана, L-тирозина, L-валина и низшего алкильного эфира L-фенилаланина.

17. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанный дипептид представлен формулой:

R1-R2,

18. Способ по п.17, отличающийся тем, что R1 есть остаток L-аспарагиновой кислоты или остаток L-глутаминовой кислоты, и R2 есть остаток L-глутаминовой кислоты, L-изолейцина, L-фенилаланина, L-триптофана, L-валина или низшего алкильного эфира L-фенилаланина.

19. Способ по п.17, отличающийся тем, что R1 есть остаток L-аспарагиновой кислоты, и R2 есть остаток L-фенилаланина или низшего алкильного эфира L-фенилаланина.

20. Способ по п.16, отличающийся тем, что низший алкильный эфир L-фенилаланина есть метиловый, этиловый или пропиловый эфир L-фенилаланина.