RU2012100197A

RU2012100197A - СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННОЙ ФОРМУЛЫ ТРИПТОФАНИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗЫ

Info

Publication number: RU2012100197A
Application number: RU2012100197/10A
Authority: RU
Inventors: Максуд Мухамеджанович Расулов; Малик Кубанычбекович Нурбеков; Наталья Юрьевна Бурнашова; Ольга Анатольевна Сперанская; Денис Викторович Ярыгин; Наталья Олеговна Минькова; Мария Игоревна Сусова
Priority date: 2012-01-11
Filing date: 2012-01-11
Publication date: 2013-07-20
Also published as: RU2495123C2

Abstract

1. Способ получения модифицированной формы триптофанил-тРНК-синтетазы, включающий измельчение тканей поджелудочной железы животных (КРС и свиней), экстрагирование, отделение экстракта от жмыха, осаждение и удаление примесных нуклеиновых кислот с помощью стрептомицин сульфата, повторное осаждение примесей из супернатанта высаливанием сульфатом аммония и постадийное фракционирование экстракта, отличающийся тем, что для получения модифицированной формы на стадии получения экстракта не использовались ингибиторы протеаз, экстракт фракционируют методом хроматографии с использованием анионнообменных смол, проводят ступенчатую элюцию буферным раствором, содержащим стабилизатор модифицированной формы ТРСазы в виде комплекса субстратов - L-триптофана и АТФ-Mg, концентрируют собранные фракции методом переосаждения сульфатом аммония, с последующей второй стадией ионообменной хроматографии и использованием линейного градиента при элюции ионообменной колонки с ДЕАЕ-целлюлозой ДЕ-52, отобранные пики с модифицированной формой собирают и концентрируют целевой продукт высаливанием сульфатом аммония, растворяют его в буферном растворе, содержащем буфер, субстраты и другие стабилизаторы и замораживают на -70°С в аликвотах или при -20°С в глицерине.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве ингибитора протеаз используется ДФФ до конечной концентрации 5 мМ.3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что в качестве источника препарата используется нативная исходная ТРСазы, а для стимуляции перехода нативная ТРСаза - модифицированная ТРСаза используется активированный уголь.4. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что �

Claims

1. Способ получения модифицированной формы триптофанил-тРНК-синтетазы, включающий измельчение тканей поджелудочной железы животных (КРС и свиней), экстрагирование, отделение экстракта от жмыха, осаждение и удаление примесных нуклеиновых кислот с помощью стрептомицин сульфата, повторное осаждение примесей из супернатанта высаливанием сульфатом аммония и постадийное фракционирование экстракта, отличающийся тем, что для получения модифицированной формы на стадии получения экстракта не использовались ингибиторы протеаз, экстракт фракционируют методом хроматографии с использованием анионнообменных смол, проводят ступенчатую элюцию буферным раствором, содержащим стабилизатор модифицированной формы ТРСазы в виде комплекса субстратов - L-триптофана и АТФ-Mg, концентрируют собранные фракции методом переосаждения сульфатом аммония, с последующей второй стадией ионообменной хроматографии и использованием линейного градиента при элюции ионообменной колонки с ДЕАЕ-целлюлозой ДЕ-52, отобранные пики с модифицированной формой собирают и концентрируют целевой продукт высаливанием сульфатом аммония, растворяют его в буферном растворе, содержащем буфер, субстраты и другие стабилизаторы и замораживают на -70°С в аликвотах или при -20°С в глицерине.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве ингибитора протеаз используется ДФФ до конечной концентрации 5 мМ.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что в качестве источника препарата используется нативная исходная ТРСазы, а для стимуляции перехода нативная ТРСаза - модифицированная ТРСаза используется активированный уголь.

4. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что переход нативная ТРСаза - модифицированная ТРСаза осуществляется путем ограниченного протеолиза эластазой.

5. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что добавление ингибитора протеаз ФМСФ осуществляли перед первой ионообменной колонкой с ДЕ-52.

6. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что в качестве ускорителя перехода нативной ТРСазы в модифицированную используется препарат исходной ТРСазы, обработка активированным углем и ограниченный протеолиз в присутствии субстратов L-триптофана и АТФ.