RU2008680C1

RU2008680C1 - Method of assay of substance biological activity

Info

Publication number: RU2008680C1
Authority: RU
Inventors: Валентина Васильевна Банкова; Владимир Николаевич Банков; Ирина Владимировна Кислова
Original assignee: Валентина Васильевна Банкова; Владимир Николаевич Банков; Ирина Владимировна Кислова
Priority date: 1992-04-14
Filing date: 1992-04-14
Publication date: 1994-02-28

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: examined substance is incubated with freshly prepared erythrocytes, and indices of erythrocyte metabolism are recorded: content of malonic aldehyde, degree of erythrocyte hemolysis, intensity of malonic aldehyde degradation and antioxidant activity. Activity of substance is determined on the basis of calculated ratios and value of absolute meanings of measured indices in experimental and control samples. EFFECT: increased confidence, simplified method, enlarged information content. 4 dwg, 1 tbl

Description

Изобретение относится к области биохимии, а более конкретно - к определению биологической активности (БА) веществ. Областью его применения являются преимущественно фармакология, медицина, экология, производство продуктов питания. Оно может использоваться для определения БА фармакологических средств, пленок медицинского назначения, продуктов питания, питательных смесей, фитонапитков, примесей в питьевой воде, различных органических и неорганических веществ и материалов. The invention relates to the field of biochemistry, and more specifically to the determination of the biological activity (BA) of substances. Its scope is mainly pharmacology, medicine, ecology, food production. It can be used to determine BA pharmacological agents, films of medical use, food, nutritional mixtures, herbal drinks, impurities in drinking water, various organic and inorganic substances and materials.

Известны способы определения БА веществ, основанные на введении животному испытуемого вещества и наблюдении за изменениями у него обменных процессов, например липидного обмена [1] . Known methods for determining AD of substances based on the introduction of the test substance to the animal and monitoring changes in its metabolic processes, such as lipid metabolism [1].

При этом дополнительно у животного может вызываться воспалительный процесс, например введением четыреххлористого углерода, что резко увеличивает мембранный метаболизм, в частности перекисное окисление липидов [2] . In addition, an inflammatory process can be caused in an animal, for example, by the introduction of carbon tetrachloride, which dramatically increases membrane metabolism, in particular lipid peroxidation [2].

Эти способы позволяют определить БА вещества по реакции живого организма в целом, которая состоит как из непосредственного действия биологически активного вещества на клеточные мембраны, так и опосредованного действия на них через другие системы организма. Это не позволяет определить прямое действие биологически активных веществ на клетку. Недостатком этих способов является и необходимость использования для их реализации животных. These methods make it possible to determine the BA of a substance by the reaction of a living organism as a whole, which consists of both the direct action of a biologically active substance on cell membranes and the indirect effect on them through other body systems. This does not allow to determine the direct effect of biologically active substances on the cell. The disadvantage of these methods is the need to use animals for their implementation.

Известен способ определения БА веществ (витамина Е в сочетании с витамином A), представляющий собой метод исследования БА в модельных условиях с заданными параметрами, основанный на определении влияния испытуемого вещества (витамина) на перекисное окисление лецитина (аскорбат-зависимое) в суспензии липосом [3] . There is a method of determining AD of substances (vitamin E in combination with vitamin A), which is a method for studying AD in model conditions with specified parameters, based on determining the effect of the test substance (vitamin) on the peroxidation of lecithin (ascorbate-dependent) in a suspension of liposomes [3 ].

При этом способе потенциальная возможность проявления БА вещества уменьшена, поскольку БА исследуется при определенных заданных условиях повышения перекисного окисления липидов (ПОЛ). Кроме того, модельная система не обеспечивает полной объективности результатов, поскольку в такой системе нет многих составляющих биологической клеточной мембраны, т. е. этот способ не дает результата, полно свидетельствующего об изменении мембранного метаболизма и системы адаптации, так как в нем изучается влияние биологически активного вещества только на образование метаболита ПОЛ - малонового альдегида и не исследуется влияние биологически активного вещества на способность клетки деградировать малоновый альдегид, на антиокислительную активность и др. With this method, the potential for the manifestation of AD of a substance is reduced, since AD is studied under certain given conditions for increasing lipid peroxidation (LP). In addition, the model system does not provide complete objectivity of the results, since such a system does not have many components of the biological cell membrane, i.e., this method does not give a result that fully indicates a change in membrane metabolism and the adaptation system, since it studies the effect of biologically active substances only on the formation of the metabolite of LPO - malonic aldehyde and the effect of biologically active substances on the ability of a cell to degrade malonic aldehyde on antioxidant is not studied nuyu activity and others.

Известен способ определения БА веществ, например, биологических жидкостей и реагентов, при котором определяют их антиокислительную активность [4] . Для определения антиокислительной активности биологической жидкости используют ее способность окислять SH-группы, присутствующие в растворимых белках хрусталика глаза млекопитающих. A known method for determining AD of substances, for example, biological fluids and reagents, in which they determine their antioxidant activity [4]. To determine the antioxidant activity of a biological fluid, its ability to oxidize SH groups present in soluble proteins of the lens of the mammalian eye is used.

Этот способ сложен, так как он требует выделения, гомогенизации и очистки хрусталика глаза. Кроме того, этот способ малоинформативен, поскольку он позволяет определить БА веществ только в отношении антиокислительной активности. Он не позволяет выявить влияние биологически активного вещества на метаболизм малонового альдегида. Способ требует забоя животного. This method is complex because it requires isolation, homogenization and purification of the lens of the eye. In addition, this method is uninformative, since it allows the determination of AD of substances only with respect to antioxidant activity. It does not allow to reveal the effect of a biologically active substance on the metabolism of malonic aldehyde. The method requires the slaughter of an animal.

Из известных способов наиболее близким к заявленному по совокупности признаков является способ определения биологической активности веществ, включающий приготовление контрольного и рабочего биологических препаратов клеточной субстанции животного организма, добавление испытуемого вещества в рабочий биологический препарат, инкубацию контрольного и рабочего биологических препаратов, определение в них показателей метаболизма, в качестве одного из которых используют содержание в биологическом препарате малонового альдегида, сравнение показателей метаболизма в контрольном и рабочем биологических препаратах и суждение о степени биологической активности испытуемого вещества по величине показателей метаболизма [5] . Of the known methods, the closest to the claimed combination of characteristics is a method for determining the biological activity of substances, including the preparation of a control and working biological preparations of the cellular substance of an animal organism, adding a test substance to a working biological preparation, incubating a control and working biological preparations, determining metabolic parameters in them, as one of which use the content in the biological preparation of malonic aldehyde, equal s metabolic indicators in the reference and working of biological preparations and the judgment of the degree of the biological activity of the test substance in magnitude metabolism indices [5].

Определение БА веществ при этом способе основано на влиянии биологически активного вещества на показатели метаболизма в микросомах печени взрослых крыс "ин витро". При этом вначале приготавливают микросомы печени и хранят их при отрицательной температуре (- 18^оС) до использования, т. е. в качестве клеточной субстанции используют замороженные микросомы печени. Рабочий биологический препарат получают добавлением в него испытуемого вещества. После инкубации контрольного и рабочего биологических препаратов в среде с перекисью водорода определяют в них содержание малонового альдегида, продукцию пентана и этана и уровень хемилюминесценции.The determination of AD of substances in this method is based on the influence of a biologically active substance on metabolic parameters in the liver microsomes of adult rats in vitro. Thus initially prepared liver microsomes and store them at negative temperatures (- 18 ^C) until use, ie as cellular substance used frozen liver microsomes... A working biological preparation is obtained by adding a test substance to it. After incubation of the control and working biological preparations in a medium with hydrogen peroxide, the content of malonic aldehyde, the production of pentane and ethane, and the level of chemiluminescence are determined in them.

Этот способ недостаточно информативен, имеет недостаточно высокую достоверность и сложен. Для осуществления способа необходимо использовать животных и забивать их. Выделение микросом печени (по сравнению, например, с выделением эритроцитов) представляет собой сложный и длительный процесс. Кроме того, используются микросомы с заранее заданной интенсивностью мембранного метаболизма (условия активации ПОЛ), что сужает возможность проявления БА. Все показатели способа характеризуют активность ПОЛ, который является лишь одной из составляющих мембранного метаболизма. This method is not informative enough, has a low reliability and is complicated. To implement the method, it is necessary to use animals and slaughter them. Isolation of liver microsomes (compared, for example, with the release of red blood cells) is a complex and lengthy process. In addition, microsomes are used with a predetermined intensity of membrane metabolism (LPO activation conditions), which narrows the possibility of AD. All indicators of the method characterize the activity of LPO, which is only one of the components of membrane metabolism.

Задача, на решение которой направлено изобретение, состоит в создании высокоэффективного способа определения БА веществ, лишенного недостатков, свойственных прототипу. Технический результат заключается в расширении информативности способа за счет выявления характера БА вещества, повышении достоверности и упрощении способа. The problem to which the invention is directed, is to create a highly effective method for determining AD of substances, devoid of the disadvantages inherent in the prototype. The technical result consists in expanding the information content of the method by identifying the nature of the BA of the substance, increasing the reliability and simplification of the method.

Это достигается тем, что при способе определения БА веществ, включающем приготовление контрольного и рабочего биологических препаратов клеточной субстанции живого организма, добавление испытуемого вещества в рабочий биологический препарат, инкубацию контрольного и рабочего биологических препаратов, определение в них показателей метаболизма, в качестве одного из которых используют содержание в биологическом препарате малонового альдегида, сравнение показателей метаболизма в контрольном и рабочем биологических препаратах и суждение о степени биологической активности испытуемого вещества по величине изменений показателей метаболизма, в качестве клеточной субстанции биологических препаратов используют свежеприготовленные эритроциты, в качестве показателей метаболизма дополнительно используют степень гемолиза эритроцитов, интенсивность деградации малонового альдегида и антиокислительную активность, а после определения показателей метаболизма в контрольном и рабочем биологических препаратах рассчитывают соотношения
МА_р/Г_р, МА_к/Г_к, Д_р/МА_р, Д_к/МА_к, АОА_р/МА_р, АОА_к/МА_к, где МА_к, МА_р - содержание малонового альдегида в контрольном и рабочем биологических препаратах соответственно;
Г_к, Г_р - степень гемолиза эритроцитов в контрольном и рабочем биологических препаратах соответственно;
Д_к, Д_р - интенсивность деградации малонового альдегида в контрольном и рабочем биологических препаратах соответственно;
АОА_к, АОА_р - антиокислительная активность в контрольном и рабочем биологических препаратах соответственно;
при этом делают вывод об отсутствии биологической активности у испытуемого вещества, если между величинами соответствующих показателей метаболизма и их соотношений в контрольном и рабочем биологических препаратах различий нет, о наличии у испытуемого вещества слабой биологической активности, если
Г_р - Г_к

0,
МА_р - МА_к

0,
Д_р - Д_к

0,
АОА_р - АОА_к

0,
МА_р/Г_р - МА_к/Г_к ≈ 0,
Д_р/МА_р - Д_к/МА_к ≈ 0,
АОА_р/МА_р - АОА_к/МА_к ≈ 0, о наличии у испытуемого вещества высокой биологической активности, инициирующей мембранный метаболизм, если
Г_р - Г_к > 0,
МА_р - МА_к > 0,
Д_р - Д_к > 0,
АОА_р - АОА_к > 0,
МА_р/Г_р - МА_к/Г_к < 0,
Д_р/МА_р - Д_к/МА_к > 0,
АОА_р/МА_р - АОА_к/МА_к > 0, о наличии у испытуемого вещества высокой биологической активности, угнетающей мембранный метаболизм, если
Г_р - Г_к < 0,
МА_р - МА_к < 0,
Д_р - Дк < 0,
АОА_р - АОА_к < 0,
МА_р/Г_р - МА_к/Г_к > 0,
Д_р/МА_р - Д_к/МА_к < 0,
АОА_р/МА_р - АОА_к/МА_к < 0, о наличии у испытуемого вещества токсической биологической активности, если изменения величин показателей метаболизма и их соотношений в контрольном и рабочем биологических препаратах имеют резкий несбалансированный характер.This is achieved by the fact that with the method for determining AD of substances, including the preparation of a control and working biological preparations of a cellular substance of a living organism, adding a test substance to a working biological preparation, incubating a control and working biological preparations, determining metabolic parameters in them, one of which is used the content of malonic aldehyde in the biological preparation, comparison of metabolic parameters in the control and working biological preparations, and is destined e about the degree of biological activity of the test substance in terms of changes in metabolic rates, freshly prepared red blood cells are used as the cellular substance of biological preparations, the degree of erythrocyte hemolysis, the rate of malondialdehyde degradation and antioxidant activity are additionally used, and after determining the metabolic rate in the control and working biological preparations calculate the ratio
MA _r / G _p , MA _k / G _k , D _p / MA _p , D _k / MA _k , AOA _p / MA _p , AOA _k / MA _k , where MA _k , MA _p is the content of malondialdehyde in the control and working biological preparations, respectively;
G _to , G _p - the degree of hemolysis of red blood cells in the control and working biological products, respectively;
D _to , D _p - the intensity of degradation of malondialdehyde in the control and working biological preparations, respectively;
AOA _k , AOA _p - antioxidant activity in the control and working biological preparations, respectively;
at the same time, they conclude that there is no biological activity in the test substance, if there are no differences between the values of the corresponding metabolic parameters and their ratios in the control and working biological preparations, and the test substance has weak biological activity if
G _r - G _to

0
MA _r - MA _to

0
D _r - D _to

0
AOA _r - AOA _to

0
MA _r / G _p - MA _k / G _k ≈ 0,
D _r / MA _r - D _to / MA _to ≈ 0,
AOA _p / MA _p - AOA _k / MA _k ≈ 0, the presence of a test substance of high biological activity that initiates membrane metabolism, if
Г _р - Г _к > 0,
MA _p - MA _to > 0,
D _p - D _to > 0,
AOA _p - AOA _to > 0,
MA _r / G _p - MA _k / G _k <0,
D _r / MA _r - D _to / MA _to > 0,
AOA _p / MA _p - AOA _k / MA _k > 0, the presence of a test substance of high biological activity that inhibits membrane metabolism, if
Г _р - Г _к <0,
MA _p - MA _k <0,
D _p - Dk <0,
AOA _p - AOA _k <0,
MA _r / G _p - MA _k / G _k > 0,
D _p / MA _p - D _k / MA _k <0,
AOA _r / MA _p - AOA _k / MA _k <0, indicating the presence of a toxic biological activity of a test substance if changes in the values of metabolic parameters and their ratios in the control and working biological preparations are sharply unbalanced.

Признаки, отличающие предложенный способ от прототипа, характеризуют выбор клеточной субстанции биологических препаратов, использование в качестве показателей метаболизма дополнительно перекисного гемолиза, интенсивности деградации малонового альдегида и антиокислительной активности, расчет соотношений соответствующих показателей метаболизма в контрольном и рабочем биологических препаратах, суждение о степени и характере БА по изменению всех указанных показателей метаболизма и их соотношений. Signs that distinguish the proposed method from the prototype characterize the choice of the cellular substance of biological preparations, the use of additional peroxide hemolysis, the rate of degradation of malonic aldehyde and antioxidant activity as indicators of metabolism, the calculation of the ratios of the corresponding metabolic parameters in the control and working biological preparations, the judgment on the degree and nature of AD by a change in all of these metabolic parameters and their ratios.

Указанный технический результат обеспечивается всей совокупностью существенных признаков. The specified technical result is provided by the totality of essential features.

Биологически активные вещества (например, витамины, гормоны, питательные смеси, анти- и проаксиданты, фитонапитки, полисолодовые экстракты и др. ) являются препаратами неспецифического действия, влияющими на систему адаптации живого организма. При любых заболеваниях организма нарушается прежде всего эта система, которая непосредственно связана с интенсивностью мембранного метаболизма. Поэтому исследование БА веществ по их влиянию на показатели мембранного метаболизма позволяет выявить их прямое действие на мембраны, определить характер БА и дозовую зависимость. Мембранный метаболизм объективно связан со способностью клетки к ПОЛ и наработке его метаболита, к дальнейшей деградации образованного метаболита и его задержке путем связывания в клетке. Это и определило в качестве показателей метаболизма помимо содержания малонового альдегида, являющегося основным метаболитом, выбор степени гемолиза, интенсивности деградации малонового альдегида и антиокислительной активности. При этом оценка изменений не только абсолютных значений самих показателей, но и их соотношений обеспечивает повышение информативности способа, позволяя выявить характер БА. Использование соотношений показателей в относительных единицах облегчает построение алгоритмической модели способа. Biologically active substances (for example, vitamins, hormones, nutrient mixtures, anti- and proaxidants, phytonutrients, polysalt malt extracts, etc.) are nonspecific drugs that affect the adaptation system of a living organism. With any diseases of the body, this system is primarily disturbed, which is directly related to the intensity of membrane metabolism. Therefore, the study of AD substances according to their effect on the parameters of membrane metabolism allows us to identify their direct effect on the membrane, to determine the nature of AD and dose dependence. Membrane metabolism is objectively related to the ability of a cell to undergo lipid peroxidation and the production of its metabolite, to further degradation of the formed metabolite and its retention by binding in the cell. This determined, as indicators of metabolism, in addition to the content of malondialdehyde, which is the main metabolite, the choice of the degree of hemolysis, the degree of degradation of malondialdehyde and antioxidant activity. Moreover, the assessment of changes not only in the absolute values of the indicators themselves, but also in their ratios provides an increase in the information content of the method, making it possible to identify the nature of BA. The use of ratios of indicators in relative units facilitates the construction of an algorithmic model of the method.

На фиг. 1 и 2 показаны примеры дозовой зависимости характера БА фармакологических препаратов феноксана и анфена соответственно; на фиг. 3 и 4 приведены диаграммы, поясняющие выявление гемосовместимости полиуретановых пленок "Витур Т" и "Биомер" соответственно. In FIG. Figures 1 and 2 show examples of a dose dependence of the nature of AD of pharmacological preparations of phenoxane and anfen, respectively; in FIG. Figures 3 and 4 are diagrams explaining the identification of hemocompatibility of Vitur T and Biomer polyurethane films, respectively.

Сущность способа поясняется следующей последовательностью операций. Приготавливают контрольный и рабочий биологические препараты в виде контрольной и нескольких рабочих проб 5% -ной взвеси свежих эритроцитов с добавлением в рабочие пробы различных доз испытуемого вещества. Например, может быть приготовлено три рабочие пробы с низкой (10^-15 М), средней (10^-10 М) и высокой (10^-7 М) дозами. Все пробы выполняют одинаковыми, например, объемом по 2 мл. Затем инкубируют все пробы 20-30 мин в физиологической среде: трис-HCl буфер, рН 7,4 с добавлением хлористого калия. В каждой пробе по интенсивности мембранного метаболизма определяют в эритроцитах показатели (параметры), характеризующие клеточную систему адаптации: содержание в эритроцитах общего (и связанного) малонового альдегида (МА), степень гемолиза эритроцитов (Г), интенсивность деградации малонового альдегида (Д), антиокислительную активность (АОА) по задержке выхода иода из иодистого калия при добавлении в пробы перекиси водорода. Дополнительно может определяться также и содержание свободных радикалов и концентрация диеновых конъюгатов. Интенсивность деградации малонового альдегида может определяться, например, при добавлении в пробы синтезированного из 1,1,3,3-тетраметоксипропана малонового альдегида.The essence of the method is illustrated by the following sequence of operations. The control and working biological preparations are prepared in the form of a control and several working samples of a 5% suspension of fresh red blood cells with various doses of the test substance added to the working samples. For example, three working samples can be prepared with low (10 ^-15 M), medium (10 ^-10 M) and high (10 ^-7 M) doses. All samples are performed the same, for example, with a volume of 2 ml. Then all samples are incubated for 20-30 min in physiological medium: Tris-HCl buffer, pH 7.4 with the addition of potassium chloride. In each sample, according to the intensity of membrane metabolism, indicators (parameters) are determined in red blood cells that characterize the cellular system of adaptation: the content of total (and bound) malonic aldehyde (MA) in red blood cells, the degree of hemolysis of red blood cells (G), the rate of degradation of malonic aldehyde (D), and antioxidant activity (AOA) in delaying the release of iodine from potassium iodide when hydrogen peroxide is added to the samples. Additionally, the content of free radicals and the concentration of diene conjugates can also be determined. The degradation rate of malonic aldehyde can be determined, for example, by adding malonic aldehyde synthesized from 1,1,3,3-tetramethoxypropane into the samples.

По изменениям величин указанных показателей и их соотношений (МА, Г, Д, АОА, МА/Г, Д/МА, АОА/МА) во всех пробах с добавлением испытуемого вещества по сравнению с контрольной пробой судят о степени и характере БА. При этом отсутствие изменений этих величин свидетельствует об отсутствии БА у испытуемого вещества. Уменьшение величин Г и МА при повышении соотношения МА/Г указывает на угнетение ПОЛ. Уменьшение величин Д и особенно Д/МА свидетельствует о снижении способности клетки избавляться от метаболита. Уменьшение АОА и АОА/МА свидетельствует о снижении антиокислительной активности клетки. Изменение величин параметров в противоположную сторону предполагает и "противоположную" БА. Причем изменение только одного или двух показателей без изменения соотношений указывает на слабую БА испытуемого вещества. Изменения соотношений показателей свидетельствуют о более сильной БА, чем при изменении абсолютных значений одних показателей без изменения их соотношений. By the changes in the values of these indicators and their ratios (MA, G, D, AOA, MA / G, D / MA, AOA / MA) in all samples with the addition of the test substance compared to the control sample, the degree and nature of AD are judged. Moreover, the absence of changes in these values indicates the absence of AD in the test substance. A decrease in G and MA with increasing MA / G ratio indicates inhibition of LP. A decrease in D values and especially D / MA indicates a decrease in the ability of the cell to get rid of the metabolite. A decrease in AOA and AOA / MA indicates a decrease in the antioxidant activity of the cell. Changing the values of the parameters in the opposite direction also implies the "opposite" BA. Moreover, a change in only one or two indicators without changing the ratio indicates a weak BA of the test substance. Changes in the ratios of indicators indicate a stronger BA than when changing the absolute values of some indicators without changing their ratios.

Резкие разбалансированные изменения показателей и особенно их соотношений указывают на токсическое, нарушающее процессы адаптации (срыв адаптации на уровне клетки) действие биологически активного вещества. При этом испытуемое вещество на уровне целого организма имеет действие то же, что и на уровне клетки и ее мембраны. Таким образом, изобретение позволяет сделать объективные выводы о БА испытуемого вещества простым методом. Sharp unbalanced changes in indicators and especially their ratios indicate a toxic, disrupting adaptation processes (disruption of adaptation at the cell level) effect of a biologically active substance. In this case, the test substance at the level of the whole organism has the same effect as at the level of the cell and its membrane. Thus, the invention allows to draw objective conclusions about the AD of the test substance by a simple method.

П р и м е р 1. Изучалась БА фармакологических препаратов - феноксана и анфена. Выявлено, что при низком исходном содержании малонового альдегида (МА), интенсивности его деградации (Д) и антиокислительной активности (АОА) в дозах 10^-8-10^-14 М, эти величины повышаются после экспозиции эритроцитов с этими препаратами. Причем соотношения МА/Г, Д/МА также меняются в сторону их нормализации. При высоких исходных значениях параметров экспозиция эритроцитов с этими препаратами приводит к снижению соответствующих параметров. Таким образом, феноксан и анфен обладают нормализующим действием на клеточные мембраны (при повышении МА снижают его, а при снижении - повышают). Однако их БА зависит не только от исходного состояния метаболических процессов в мембране, но и от дозы введенного препарата.PRI me R 1. We studied the BA of pharmacological preparations - phenoxane and phenol. It was found that with a low initial content of malondialdehyde (MA), its degradation rate (D) and antioxidant activity (AOA) at doses of 10 ^-8 -10 ^-14 M, these values increase after the exposure of red blood cells with these drugs. Moreover, the ratios MA / G, D / MA also change in the direction of their normalization. At high initial values of the parameters, the exposure of red blood cells with these drugs leads to a decrease in the corresponding parameters. Thus, phenoxane and anfen have a normalizing effect on cell membranes (with an increase in MA, they decrease it, and with a decrease, they increase it). However, their AD depends not only on the initial state of metabolic processes in the membrane, but also on the dose of the drug administered.

На фиг. 1 и 2 показаны относительные изменения соотношений МА/Г, Д/МА, АОА/МА в эритроцитах в зависимости от дозы препаратов, введенных в инкубационную среду, для феноксана и анфена соответственно. Например, как видно из фиг. 1, феноксан в дозе 10^-14 М дает резкое увеличение МА/Г (что указывает на уменьшение ПОЛ), уменьшение соотношения Д/МА (что обуславливает снижение способности клетки избавляться от метаболита) и снижение АОА/МА (антиокислительной защиты), т. е. приводит к общему угнетению метаболических процессов в клетке, а следовательно, к снижению клеточной адаптации. Доза 10^-11 М не ведет к существенным изменениям в соотношении параметров, а доза 10^-8 М вызывает увеличение Д/МА и АОА/МА и уменьшение МА/Г, что свидетельствует об активации мембранного метаболизма и клеточной адаптации. Анфен отличается от феноксана тем, что он вызывает обратный дозовый эффект лишь в отношении величины МА/Г, тогда как два других соотношения изменяются в дозах 10^-8 М и 10^-14 М однонаправленно. Это свидетельствует о большей физиологичности действия анфена по сравнению с феноксаном.In FIG. Figures 1 and 2 show the relative changes in the ratios MA / G, D / MA, AOA / MA in erythrocytes depending on the dose of the drugs introduced into the incubation medium for phenoxane and anfen, respectively. For example, as can be seen from FIG. 1, phenoxane at a dose of 10 ^-14 M gives a sharp increase in MA / G (which indicates a decrease in lipid peroxidation), a decrease in the D / MA ratio (which leads to a decrease in the ability of the cell to get rid of the metabolite) and a decrease in AOA / MA (antioxidant protection), t. e. leads to a general inhibition of metabolic processes in the cell, and therefore, to a decrease in cellular adaptation. A dose of 10 ^-11 M does not lead to significant changes in the ratio of parameters, and a dose of 10 ^-8 M causes an increase in D / MA and AOA / MA and a decrease in MA / G, which indicates the activation of membrane metabolism and cell adaptation. Anfen differs from phenoxan in that it causes the opposite dose effect only with respect to MA / G, while the other two ratios change in doses of 10 ^-8 M and 10 ^-14 M unidirectionally. This indicates a higher physiological effect of anfen compared to phenoxane.

П р и м е р 2. Выявлялась БА полиуретановых пленок медицинского назначения (их гемосовместимость). Экспозиция эритроцитов (5% -ная взвесь) осуществлялась с пленками, покрывающими внутреннюю поверхность бюкс, в течение 20-40 мин. На фиг. 3 показаны относительные изменения величин показателей метаболизма и их соотношений для пленки "Витур Т" (Витур Т непереосажденный), на фиг. 4 - для пленки "Биомер". Пленка "Витур Т" приводит к резкому повышению ПОЛ (повышению Г и МА) со снижением величин Д/МА и АОА. Это свидетельствует о резком ухудшении состояния клеточной мембраны, характеризующимся засорением клетки малоновым альдегидом и снижением защиты от окисления. Это указывает на снижение адаптационной способности клетки и позволяет сделать вывод о неудовлетворительной гемосовместимости такого материала. Пленка "Биомер" дает умеренное увеличение ПОЛ без изменения соотношений параметров, что позволяет сделать заключение о физиологическом характере изменений, не затрагивающем систему адаптации, а следовательно, об удовлетворительной гемосовместимости. PRI me R 2. Revealed BA polyurethane films for medical purposes (their hemocompatibility). The erythrocyte exposure (5% suspension) was carried out with films covering the inner surface of the bucks for 20-40 minutes. In FIG. 3 shows the relative changes in the values of the metabolic indices and their ratios for the Vitur T film (Vitur T not reprecipitated), FIG. 4 - for the film "Biomer". The Vitur T film leads to a sharp increase in lipid peroxidation (increase in G and MA) with a decrease in D / MA and AOA. This indicates a sharp deterioration in the state of the cell membrane, characterized by clogging of the cell with malonic aldehyde and a decrease in protection against oxidation. This indicates a decrease in the adaptive ability of the cell and allows us to conclude that the hemocompatibility of such material is unsatisfactory. The “Biomer” film gives a moderate increase in lipid peroxidation without changing the ratio of parameters, which allows us to conclude that the physiological nature of the changes does not affect the adaptation system, and therefore, about satisfactory hemocompatibility.

П р и м е р 3. Выявлялась БА фитонапитков. Фитонапиток N 1 содержит экстракт пустырника, кориандра, донника, порошок тыквы, лимонную и аскорбиновую кислоты, сахар. Фитонапиток N 2 содержит экстракт золотого корня, хрена, чеснока, кориандра, порошка свеклы, сахар, лимонную и аскорбиновую кислоты. PRI me R 3. Identified BA phytonutrients. Phyton drink N 1 contains motherwort, coriander, melilot extract, pumpkin powder, citric and ascorbic acid, sugar. Phyton drink N 2 contains an extract of golden root, horseradish, garlic, coriander, beet powder, sugar, citric and ascorbic acid.

В таблице приведены значения показателей метаболизма и их соотношений для трех доз "ин витро" фитонапитков. Из таблицы видно, что доза 50 мкл для обоих фитонапитков не является физиологичной, так как резко повышает ПОЛ, снижает соотношения Д/МА и АОА/МА, что свидетельствует об уменьшении адаптационных возможностей в клетке. По изменениям величин параметров можно заключить, что фитонапиток N 1 в минимальной дозе слабо снижает мембранный метаболизм (ПОЛ и Д) без изменения соотношений показателей. Это дает приближение к "комфортному" состоянию, имеющему место при покое. Поэтому можно сделать вывод, что в небольших количествах "ин виво" этот фитонапиток будет оказывать успокаивающее действие на организм. Увеличение дозы может привести к нежелательным изменениям клеточного метаболизма (повышению МА и снижению степени очистки от малонового альдегида). The table shows the values of metabolic rates and their ratios for three doses of in vitro phytonutrients. It can be seen from the table that the dose of 50 μl for both phytonutrients is not physiological, since it sharply increases LP, reduces the D / MA and AOA / MA ratios, which indicates a decrease in adaptive capabilities in the cell. According to the changes in the parameter values, it can be concluded that phytonutrient N 1 in the minimum dose weakly reduces membrane metabolism (POL and D) without changing the ratio of indicators. This gives an approximation to the "comfortable" state, which takes place at rest. Therefore, we can conclude that in small amounts "in vivo" this phyton drink will have a calming effect on the body. Increasing the dose can lead to undesirable changes in cellular metabolism (increase in MA and a decrease in the degree of purification from malonic aldehyde).

Фитонапиток N 2 резко повышает ПОЛ (судя по увеличению Г и снижению МА/Г), не меняя Д/МА, снижая АОА/МА уже в дозе 5 мкл. В дозе 10 мкл понижающее мембранный метаболизм действие усиливается. Так как повышение активности ПОЛ и Д сопровождается увеличением модификации клеточной мембраны и активности всего организма (аналогично действию стресса), можно полагать, что этот напиток обладает действием, повышающим работоспособность и активность человека. Однако снижение АОА/МА заставляет отказаться от применения этого напитка в больших количествах, а также в любых количествах людям, находящимся в стрессовом состоянии. Таким образом, изобретение не только выявляет БА фитонапитков, но и дает основу для выработки рекомендаций по их дозировке "ин виво", позволяет оценить, при каких состояниях организма фитонапитки дают оптимально положительный эффект. Phyton drink N 2 sharply increases LPO (judging by an increase in G and a decrease in MA / G), without changing D / MA, reducing AOA / MA already at a dose of 5 μl. At a dose of 10 μl, the membrane-lowering effect is enhanced. Since an increase in the activity of LPO and D is accompanied by an increase in the modification of the cell membrane and activity of the whole organism (similar to the effect of stress), it can be assumed that this drink has an effect that increases human performance and activity. However, a decrease in AOA / MA forces one to abandon the use of this drink in large quantities, as well as in any quantities, for people under stress. Thus, the invention not only reveals AD of phytonutrients, but also provides a basis for developing recommendations on their dosage “in vivo”, allows us to evaluate under which conditions of the organism phytodonds give an optimally positive effect.

Изобретение обеспечивает расширение информативности способа определения БА веществ за счет выявления характера БА, повышение достоверности и упрощение способа. Способ пригоден для определения БА веществ любой консистенции - жидкостей, пленок, порошков, твердых тел, конденсатов газов. Он эффективен при определении БА фармакологических препаратов, продуктов питания, питательных смесей, фитонапитков, пленок медицинского назначения, материалов для детских игрушек и пищевой тары, примесей в питьевой воде. (56) 1. Патент США N 4440786, кл. C 07 C 59/52, 1984. The invention provides an extension of the information content of the method for determining AD of substances by identifying the nature of AD, increasing reliability and simplifying the method. The method is suitable for determining BA of substances of any consistency - liquids, films, powders, solids, gas condensates. It is effective in determining the BA of pharmacological preparations, food, nutritional mixtures, phytonutrients, medical films, materials for children's toys and food packaging, and impurities in drinking water. (56) 1. U.S. Patent No. 4,440,786, cl. C 07 C 59/52, 1984.

2. Corongin F. P. et al. Antioxidants and Lipid Peroxidation. "in vivo" Studies. "Biochemical Pharmacology", 1985, v. 34, N 3, p. 397-398. 2. Corongin F. P. et al. Antioxidants and Lipid Peroxidation. "in vivo" Studies. "Biochemical Pharmacology", 1985, v. 34, N 3, p. 397-398.

3. Галкина С. И. Влияние различных форм витамина A и его сочетания с витамином Е на перекисное окисление липидов. Вопросы медицинской химии, 1984, N 4, с. 91-94. 3. Galkina S. I. Influence of various forms of vitamin A and its combination with vitamin E on lipid peroxidation. Questions of medical chemistry, 1984, N 4, p. 91-94.

4. Патент США N 4615877, кл. G 01 N 33/48, 1986. 4. US patent N 4615877, CL. G 01 N 33/48, 1986.

5. Muller A. et al. A Novel Biological Active Seleno-Organic Compound-I, Glutathione Peroxidase - Like Activity in vitro and Antioxidant Capacity of PZ51 (Ebselen). "Biochemical Pharmacology", 1989, v. 33, N 20, p. 3235-3239. 5. Muller A. et al. A Novel Biological Active Seleno-Organic Compound-I, Glutathione Peroxidase - Like Activity in vitro and Antioxidant Capacity of PZ51 (Ebselen). "Biochemical Pharmacology", 1989, v. 33, N 20, p. 3235-3239.

Claims

METHOD FOR DETERMINING SUBSTANCE BIOLOGICAL ACTIVITY, including preparation of a control and working biological preparations of a cellular substance of a living organism, adding a test substance to a working biological preparation, incubation of a control and working biological preparations, determination of metabolic indicators in them, as one of which the content of malonic aldehyde, a comparison of metabolic rates in the control and working biological preparations and the judgment of the degree of biological activity of the test substance of a given concentration in terms of changes in metabolic rates, characterized in that freshly prepared red blood cells are used as the cellular substance of biological preparations, the degree of erythrocyte hemolysis, the rate of malondialdehyde degradation and antioxidant activity are additionally used, and after determining the metabolic rate in the control and working biological preparations calculate the ratio
AI _p T _p, MA _k / T _k, R _p AI _p, D AI _to _k, AOA _p AI _p, AOA _to MA _k
where MA _to , MAR - the content of malondialdehyde in the control and working biological preparations, respectively;
G _to , G - respectively, the degree of hemolysis of red blood cells in the control and working drugs, respectively;
D _to , D _p - the degradation rate of malondialdehyde, respectively,
AOA _k , AOA _p - antioxidant activity in the control and working preparations, respectively;
while concluding that the ability of the test substance to slightly change the membrane metabolism, if G _p - G _k ≥ O, MA _p - MA _k ≥ O, D _p - D _k ≥ O, AOA _p - AOA _k ≥ O, MA _p / G _p - MA _k / T _to ≈ G, D _p / AI _p - D _c / MA _to ≈ G, AOA _p / IDA - AOA _to / MA _to ≈ G, about the presence of the test substance of high biological activity, initiating membrane metabolism, if G _r - G _k > O, MA _r - MA _k > O, D _r - D _k > O, AOA _p - AOA _k > O, MA _r / G _p - MA _k / G _k <O, D _r / AI _p - D _c / MA _k>, AOA _p / AI _p - _to AOA / MA _k>, about the presence of the test substance of high biological activity, depressing the membrane IU tabolizm if T _p - T _a <O, MA _p - MA _to <O, D _p - D _{to the} <O AOA _p - AOA _{to the} <O, MA _p / T _p - MA _/ r _k> O, D _p / MA _p - D _c / MA _{to the} <O AOA _p / MA _p - AOA _to / MA _to <Oh, about the presence of the test substance in biological activity, resulting in the pathological changes of membrane metabolism, if you change the values of its parameters are multidirectional unbalanced character.