RU2007452C1

RU2007452C1 - Strain of hybrid cultured cells mus musculus - a producer of monoclonal anti- bodies used for viral hemorrhagic rabbit disease diagnosis

Info

Publication number: RU2007452C1
Authority: RU
Inventors: А.А. Черных; С.А. Малоголовкин; Н.А. Власов
Original assignee: Всесоюзный научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии
Priority date: 1992-01-16
Filing date: 1992-01-16
Publication date: 1994-02-15

Abstract

FIELD: biotechnology, veterinary. SUBSTANCE: strain is obtained by fusion of transplantable murine myeloma line sp2/0-Ag. 14-1 with lymphocytes of murine spleen (line BALB/c) immunized with high-purified hemorrhagic rabbit disease. Hybrid cells of strain retain stable production of monoclonal antibodies in cultural medium for 25 passages. By intraperitoneal administration to mice of line BALB/c cells induce formation of ascitic tumors with titer of monoclonal antibodies in ascitic fluid up to 1:10⁶. Antigenic specificity of antibodies with regard to VP58 virus of hemorrhagic rabbit disease is confirmed by Western blotting and radioimmunoprecipitation assay. Strain is designated as VGKB x sp 2/0-4C11,89, and stored at number VSKK(P) 560 D. EFFECT: preparing of strain indicated above. 1 tbl

Description

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к штамму гибридных клеток, продуцирующему моноклональные антитела к вирусу геморрагической болезни кроликов (ВГБК), которые могу быть использованы в диагностических и научных исследованиях. The invention relates to biotechnology, and in particular to a strain of hybrid cells producing monoclonal antibodies to rabbit hemorrhagic disease virus (HBVC), which can be used in diagnostic and scientific studies.

Известны способы получения гибридных клонов, продуцирующих моноклональные антитела к различным вирусам животных (Sasaki. O et al. 1990, NobisP. 1985) и в частности, к полипептидам вируса геморрагической болезни кроликов (Liang M. , 1989). Known methods for producing hybrid clones producing monoclonal antibodies to various animal viruses (Sasaki. O et al. 1990, NobisP. 1985) and, in particular, to polypeptides of the rabbit hemorrhagic disease virus (Liang M., 1989).

Однако эти моноклональные антитела не позволяют выявлять вирус геморрагической болезни кроликов в органах больных и павших животных и поэтому не могут быть использованы для быстрой диагностики данного заболевания. Известен также штамм гибридных клеток, секретирующий моноклональные антитела к ВП60 вируса ГБК (Rodak L. etal 1990), полученный путем слияния клеток миеломы Sp 2/0 - Ag 14.1 с иммунными лимфоцитами мышей линии Bald/c в соотношении 1: 5. Иммунизацию проводят путем подкожной инокуляции очищенного препарата ВГБК в масляном адъюванте. За три - четыре дня до слияния мышам вводят внутрибрюшинно суспензию ВГБК. Описанные моноклональные антитела позволяют выявлять вирусный антиген в мазках-отпечатках из органов больных и павших животных с помощью метода флюоресцирующих антител (МФА). Однако предложенная схема иммунизации не достаточна эффективна, так как при сочетании только подкожного и внутрибрюшинного введения препарата выход положительных клонов невысок и аффинность секретируемых ими антител ниже по сравнению с длительной иммунизацией и внутривенным введением бустер-дозы. Вышеуказанное соотношение клеток миеломы с лимфоцитами мыши 1: 5 при гибридизации не является оптимальным, особенно в случае нефракционированных спленоцитов. Наилучший выход полезных клонов получают при соотношении клеток миеломы к лимфоцитам 1: 10 (Игнатьева Г. А. , 1989). Не приводят данных о классе иммуноглобулинов и о количестве пассажей гибридом как in vitro, так и in vivo, что, во-первых, имеет важное значение для очистки и дальнейшего использования моноклональных антител, и, во-вторых, характеризует стабильность штамма гибридных клеток, секретирующего моноклональные антитела. Следует также отметить, что не показана возможность антигена в органах больных и павших животных, а также для серологической диагностики с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). However, these monoclonal antibodies do not allow detection of the rabbit hemorrhagic disease virus in the organs of sick and dead animals and therefore cannot be used to quickly diagnose this disease. A hybrid cell strain is also known that secrets monoclonal antibodies to VP60 of the GBA virus (Rodak L. etal 1990), obtained by fusion of Sp 2/0 - Ag 14.1 myeloma cells with immune lymphocytes of Bald / c mice in a 1: 5 ratio. Immunization is carried out by subcutaneous inoculation of the purified HBVC preparation in an oil adjuvant. Three to four days prior to confluence, mice are given an intraperitoneal suspension of HBVC. The described monoclonal antibodies make it possible to detect a viral antigen in fingerprint smears from organs of sick and dead animals using the method of fluorescent antibodies (MFA). However, the proposed immunization schedule is not sufficiently effective, since with the combination of only subcutaneous and intraperitoneal administration of the drug, the yield of positive clones is low and the affinity of the antibodies secreted by them is lower compared to long-term immunization and intravenous administration of a booster dose. The above ratio of myeloma cells to mouse lymphocytes of 1: 5 during hybridization is not optimal, especially in the case of unfractionated splenocytes. The best yield of useful clones is obtained when the ratio of myeloma cells to lymphocytes is 1: 10 (Ignatyev G.A., 1989). They do not provide data on the class of immunoglobulins and on the number of passages of hybridomas both in vitro and in vivo, which, firstly, is important for the purification and further use of monoclonal antibodies, and, secondly, characterizes the stability of the hybrid cell strain secreting monoclonal antibodies. It should also be noted that the possibility of antigen in the organs of sick and dead animals, as well as for serological diagnosis using enzyme immunoassay (ELISA), is not shown.

Задачей изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующего моноклональные антитела к вирусу геморрагической болезни кроликов. The objective of the invention is to obtain a strain of hybrid cultured animal cells producing monoclonal antibodies to the rabbit hemorrhagic disease virus.

Предлагаемый штамм обозначен как ВГБК x Sp 2/0-4C11,89 и хранится во Всесоюзной специализированной коллекции клеточных культур (ВСКК (П)) института цитологии АН СССР под номером 560Д. The proposed strain is designated as HBGB x Sp 2 / 0-4C11.89 and is stored in the All-Union Specialized Collection of Cell Culture (VSCK (P)) of the Institute of Cytology of the Academy of Sciences of the USSR under the number 560D.

Штамм гибридных клеток ВГБК х Sp 2/0-4C11,89 получают путем гибридизации мышиной миеломной линии Sp 2/0_-Ag 14.1 с лимфоцитами селезенки иммунных мышей линии Balb/c по методу Келлера и Мильдштейна (1976). Иммунизацию проводят высокоочищенным препаратом вируса геморрагической болезни кроликов (10¹⁴ вирион/мл). В первый день вводят подкожно в три точки очищенного препарата вируса (с концентр. белка 3,5 мг/мл) с равным объемом полного адъюванта Фрейнда. На 14-й день вводят внутрибрюшинно 150 мкл того же вируса в смеси с неполным адъювантом Фрейнда. На 45-й, 46-й день инъецируют внутривенно по 200 мкл вирусного препарата, что приводит к активации лимфоцитов, синтезирующих антитела к антигенным детерминантам вируса геморрагической болезни кроликов. Гибридизацию проводят на 4-й день после последней инъекции антигена в соотношении клеток миеломы и лимфоцитов 1: 10. Гибридные клоны отбирают на селективной среде, содержащей гипоксантин, тимидин и аминоптерин. Продукцию специфических антител определяют методом твердофазного иммуноферментного анализа в непрямом варианте. В качестве антигена для сенсибилизации пластин использовали очищенный в градиенте плотности хлористого цезия вирус геморрагической болезни кроликов. Клоны, дающие положительную реакцию вы ИФА, отбирают и проводят 3-кратное их клонирование в "мягком" агаре с целью получения стабильных штаммов клеток. Клон считают стабильным, если при последующем клонировании не менее 90% субклонов сохраняют антителопродукцию.The strain of hybrid HBVC cells x Sp 2 / 0-4C11.89 is obtained by hybridization of the mouse myeloma line Sp 2/0 _-Ag 14.1 with lymphocytes of the spleen of immune mice of the Balb / c line according to the method of Keller and Mildstein (1976). Immunization is carried out with a highly purified rabbit hemorrhagic disease virus drug (10 ¹⁴ virion / ml). On the first day, they are injected subcutaneously at three points of a purified virus preparation (with a concentrate of protein 3.5 mg / ml) with an equal volume of Freund's complete adjuvant. On the 14th day, 150 μl of the same virus was administered intraperitoneally in a mixture with incomplete Freund's adjuvant. On the 45th, 46th day, 200 μl of the viral preparation is injected intravenously, which leads to the activation of lymphocytes synthesizing antibodies to the antigenic determinants of the rabbit hemorrhagic disease virus. Hybridization is carried out on the 4th day after the last injection of antigen in the ratio of myeloma cells and lymphocytes of 1: 10. Hybrid clones are selected on a selective medium containing hypoxanthine, thymidine and aminopterin. The production of specific antibodies is determined by the method of enzyme-linked immunosorbent assay in an indirect embodiment. The rabbit hemorrhagic disease virus purified in the density gradient of cesium chloride was used as an antigen for plate sensitization. Clones that give a positive ELISA, you select and spend 3 times their cloning in "soft" agar in order to obtain stable cell strains. A clone is considered stable if, with subsequent cloning, at least 90% of the subclones retain antibody production.

Полученный штамм ВГБК х Sp 2/0-4C11,89 иммет следующие морфологическую и физиологическую характеристики. The obtained strain HBV x Sp 2 / 0-4C11.89 has the following morphological and physiological characteristics.

Культура состоит из клеток округлой формы различной величины с ядром, занимающим большую часть клетки и расположенным эксцентрично. Каждое ядро содержит 2-4 ядрышка. Цитоплазма имеет вид тонкого ободка. Кариотип соответствует мышиному. Модальный класс 89 хромосом (модальный класс для родительской миеломной линии Sp 2/0_-Ag 14-1 72 хромосомы). В кариотипе клеток идентифицированы 6-я и 12-я хромосомы, несущие структурные гены иммуноглобулинов.The culture consists of round-shaped cells of various sizes with a nucleus occupying a large part of the cell and located eccentrically. Each core contains 2-4 nucleoli. The cytoplasm has the appearance of a thin rim. The karyotype corresponds to the mouse. The modal class of 89 chromosomes (the modal class for the parent myeloma line Sp 2/0 _-Ag 14-1 72 chromosomes). In the cell karyotype, the 6th and 12th chromosomes carrying structural genes of immunoglobulins were identified.

Клетки обладают слабой адгезивной способностью. Тип роста - стационарная суспензия. Клетки легко снимаются при встряхивании или пипетировании, образуя мелкую однородную взвесь. Частота пассирования 1 раз в 2-3 дня. Коэффициент пересева 1: 2-1: 3. Посевная доза 150-200 тыс. клеток в 1 мл. Cells have a weak adhesive ability. Type of growth - stationary suspension. Cells are easily removed by shaking or pipetting, forming a fine, uniform suspension. Passaging frequency 1 time in 2-3 days. Reseeding coefficient 1: 2-1: 3. Sowing dose of 150-200 thousand cells in 1 ml.

Среда культивирования - модифицированная Дульбекко, среда Игла с содержанием 15% эмбриональной сыворотки теленка, 2 мМ глутамина, 1 мМ пирувата натрия и 50 мкг/мл гентамицина. Оптимальный рН среды 6,8-7,2. The cultivation medium is modified Dulbecco, Needle medium containing 15% fetal calf serum, 2 mM glutamine, 1 mM sodium pyruvate and 50 μg / ml gentamicin. The optimal pH of the medium is 6.8-7.2.

При хранении в условиях низких температур клетки сохраняют жизнеспособность в течение 6 мес при -70^о С и неограниченно долго в жидком азоте (-196^оС). Клетки хранят в пластиковых ампулах после 2-3-кратного клонирования в "мягком" агаре и перевивания на мышах линии Balb/c в концентрации 5-10 млн. клеток в 1 мл. Криозащитная среда - ростовая среда с добавлением 40% эмбриональной сыворотки и 10% диметилсульфоксида. Жизнеспособность клеток после замораживания 72-75% . Гибридные клетки штамма ВГБК х Sp 2/0-4C11,89 сохраняют стабильную продукцию моноклональных антител в культуральной среде на протяжении 25 пассажей (срок наблюдения). При культивировании предлагаемых клеток в брюшинной полости мышей Balb/c (1-2 млн. кл. на мышь), предварительно сенсибилизированных пристаном, образуются асцитные опухоли. Асцитические жидкости (3-10 мл на мышь) получают на 10-14-й день после инокуляции клеток. Антитела, продуцируемые предлагаемым клоном, относятся к иммуноглобулинам класса М. Иммуноглобулины выделяют методом солевой преципитации гельпроникающей хроматографией (ультрагель АсА-34).When stored at low temperatures of the cells remain viable over 6 months at ^-70 ° C and indefinitely in liquid nitrogen (-196 ° ^C). Cells are stored in plastic ampoules after 2-3-fold cloning in soft agar and transplantation on Balb / c mice at a concentration of 5-10 million cells in 1 ml. Cryoprotective medium is a growth medium with the addition of 40% fetal serum and 10% dimethyl sulfoxide. Cell viability after freezing 72-75%. Hybrid cells of the strain HBV x Sp 2 / 0-4C11.89 maintain stable production of monoclonal antibodies in the culture medium for 25 passages (observation period). When culturing the proposed cells in the peritoneal cavity of Balb / c mice (1-2 million cells per mouse), previously sensitized by the pier, ascites tumors are formed. Ascitic fluids (3-10 ml per mouse) are obtained on the 10-14th day after inoculation of cells. Antibodies produced by the proposed clone belong to class M immunoglobulins. The immunoglobulins are isolated by salt precipitation by gel permeation chromatography (AsA-34 ultragel).

Следовательно, моноклональные антитела, секретируемые штаммом ВГБК х Sp 2/0-4C11 89, имеют ряд преимуществ по сравнению с существующим прототипом. Они имеют несколько высокую активность в ИФА, позволяют выявлять антиген в органах больных и павших животных, а также могут быть использованы для серологической диагностики. Therefore, monoclonal antibodies secreted by the strain HBV x Sp 2 / 0-4C11 89, have several advantages compared to the existing prototype. They have a slightly high activity in ELISA, they can detect antigen in the organs of sick and dead animals, and can also be used for serological diagnostics.

Полипептидную специфичность к ВП58 вируса геморрагической болезни кроликов подтверждают методом иммуноблотинга и радиоиммунопреципитации. The polypeptide specificity for VP58 of the rabbit hemorrhagic disease virus is confirmed by immunoblotting and radioimmunoprecipitation.

Специфичность моноклональных антител к ВГБК подтверждена также, в непрямом и "сэндвич" - вариантах ИФА с гетерологичными антигенами, которые сходны в клиническом проявлении с ВГБК (пастерелл10¹⁴з, хламидиоз, листериоз, печень здорового кролика).The specificity of monoclonal antibodies to HBVC is also confirmed in indirect and “sandwich” ELISA variants with heterologous antigens that are similar in clinical manifestations to HBVC (pasteurell10 ¹⁴ s, chlamydia, listeriosis, liver of a healthy rabbit).

Для выявления специфического антигена в органах больного и павших животных, а также в вакцинных препаратах с помощью моноклональных антител, предлагаемого штамма, используют "сэндвич" - вариант ИФА. При этом лунки 96-луночных пластин предварительно сенсибилизируют моноклональными антителами в количестве 1-2 мкг на лунку, а затем вносят исследуемые пробы суспензии органов животных. Выявление специфического антигена, связывающегося с моноклональными антителами, проводят пероксидазным конъюгатом на основе иммуноглобулинов кролика, предварительно иммунизированного очищенным препаратом ВГБК. To identify a specific antigen in the organs of a patient and dead animals, as well as in vaccine preparations using monoclonal antibodies of the proposed strain, a “sandwich” is used - an ELISA variant. In this case, the wells of 96-well plates are pre-sensitized with monoclonal antibodies in an amount of 1-2 μg per well, and then the test samples of the suspension of animal organs are introduced. Identification of a specific antigen that binds to monoclonal antibodies is carried out with a peroxidase conjugate based on rabbit immunoglobulins previously immunized with a purified HBBC preparation.

С целью выявления антител в сыворотках крови кроликов, больных ВГБК, применяют двойной антительный "сэндвич" - вариант ИФА (ДАС-ИФА). Для этого в 96-луночные пластины, покрытые моноклональными антителами, вносят специфический антиген ВГБК в рабочем разведении. После инкубации (1 ч, 37^оС) и промывки добавляют разведения исследуемых сывороток. Обнаружение специфического комплекса антитело-антиген-антитело проводят антивидовым пероксидазным конъюгатом к иммуноглобулинам кролика.In order to detect antibodies in the blood serum of rabbits with HBV, a double antibody "sandwich" is used - the ELISA variant (DAS-ELISA). For this, 96-well plates coated with monoclonal antibodies are added with specific HBVK antigen in working dilution. After incubation (1 h, 37 ^° C) and washing, dilutions of the test sera are added. The detection of a specific antibody-antigen-antibody complex is carried out by an antispecies peroxidase conjugate to rabbit immunoglobulins.

Таким образом, применение штамма гибридных клеток ВГБК х Sp 2/0 89 в лабораторных условиях практически доступно и удобно. Продуцируемые штаммом моноклональные антитела высокочувствительны, специфичны и пригодны для изготовления диагностических препаратов в промышленных условиях. (56) Rodak L. et al. J. Gen. Virol. Thus, the use of a strain of hybrid HBVC cells x Sp 2/0 89 in the laboratory is practically affordable and convenient. Monoclonal antibodies produced by the strain are highly sensitive, specific, and suitable for the manufacture of diagnostic drugs in an industrial environment. (56) Rodak L. et al. J. Gen. Virol.

Claims

The strain of hybrid cultured cells of Mus musculus l. HSCC (P) 560D is a producer of monoclonal antibodies used to diagnose rabbit viral hemorrhagic disease.