Claims (3)
1. Рекомбинантная плазмида pPIC9HAbIL-2, обеспечивающая биосинтез и секрецию гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека, трансформированными ею клетками дрожжей, имеющая размер 10148 п.о. и состоящая из следующих элементов:1. Recombinant plasmid pPIC9HAbIL-2, providing biosynthesis and secretion of a hybrid protein consisting of human plasma albumin and human IL-2, transformed by yeast cells with a size of 10148 bp and consisting of the following elements:
EcoR1-Xho1 - фрагмента плазмидной ДНК бифункционального бактериально-дрожжевого вектора рР1С9 размером 8,00 т.п.о., ограниченного сайтами рестрикции EcoR1-Xho1 и включающего бактериальный ген устойчивости к ампициллину; бактериальную область инициации репликации; ген HIS4 дрожжей; фрагмент 5'-некодирующей области дрожжевого гена АОХ1 размером 0, 95 т.п.о., содержащий область, обеспечивающую активацию транскрипции этого гена в присутствии метанола в качестве источника углерода в культуральной среде; препрообласть гена MFα дрожжей Saccharomyces cerevisiae размером 0,27 т.п.о., обеспечивающую секрецию гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека, в культуральную среду; фрагмент гена АОХ1 размером 0,33 т.п.о., содержащий область терминации транскрипции этого гена; и фрагмент 3'-нетранслируемой области гена АОХ1 размером 0,76 т.п.о.;EcoR1-Xho1 - a fragment of plasmid DNA of a bifunctional bacterial yeast vector pP1C9 of size 8.00 kbp restricted to EcoR1-Xho1 restriction sites and including the bacterial ampicillin resistance gene; bacterial replication initiation region; yeast HIS4 gene; a fragment of the 5'-non-coding region of the yeast gene AOX1 with a size of 0.95 kbp containing a region that activates the transcription of this gene in the presence of methanol as a carbon source in the culture medium; a prepreg of the MFα gene of the Saccharomyces cerevisiae yeast 0.27 kbp in size, securing the secretion of a fusion protein consisting of human plasma albumin and human IL-2 into the culture medium; a 0.33 kbp AOX1 gene fragment containing a transcription termination region of this gene; and a fragment of the 3'-untranslated region of the AOX1 gene of 0.76 kbp .;
Xhol-Bsu36I - фрагмента размером 1749 п.о., содержащего кодирующую часть гена альбумина плазмы крови человека, за исключением области, кодирующей сигнальный пептид, и терминирующего кодона;Xhol-Bsu36I — fragment of 1749 bp containing the coding portion of the human plasma albumin gene, with the exception of the region encoding the signal peptide and the termination codon;
Bsu36I-EcoRl - фрагмента размером 399 п.о., содержащего кодирующую часть гена ИЛ-2 человека, за исключением области, кодирующей сигнальный пептид.Bsu36I-EcoRl - 399 bp fragment containing the coding portion of the human IL-2 gene, with the exception of the region encoding the signal peptide.
2. Штамм дрожжей Pichia pastoris PS107(pPIC9HAbIL-2) - продуцент гибридного белка, состоящего из альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека, представляющий собой штамм Pichia pastoris PS99 (his4 pep4::PHO85), трансформированный плазмидой pPIC9HAbIL-2 по п.1.2. The yeast strain Pichia pastoris PS107 (pPIC9HAbIL-2) is a producer of a hybrid protein consisting of human plasma albumin and human IL-2, which is a strain of Pichia pastoris PS99 (his4 pep4 :: PHO85) transformed with plasmid pPIC9HAbIL-2 according to claim .one.
3. Способ конструирования рекомбинантной плазмиды pPIC9HAbIL-2 по п.1, при котором ген альбумина плазмы крови человека, за исключением области, кодирующей сигнальный пептид, и терминирующего кодона, получают при помощи обратной ПЦР с использованием матрицы мРНК, полученной из гепатоцитов человека, прямого праймера SEQ ID NO: 1, содержащего сайт для рестриктазы Xho1, обратного праймера SEQ ID NO: 2, содержащего сайт для рестриктазы MstII;3. The method of constructing the recombinant plasmid pPIC9HAbIL-2 according to claim 1, wherein the human plasma albumin gene, with the exception of the region encoding the signal peptide and the termination codon, is obtained by reverse PCR using an mRNA matrix obtained from human hepatocytes, direct a primer of SEQ ID NO: 1 containing the Xho1 restriction enzyme site; a reverse primer of SEQ ID NO: 2 containing the MstII restriction enzyme site;
ген ИЛ-2 человека, за исключением области, кодирующей сигнальный пептид, получают при помощи ПЦР с использованием матрицы плазмиды pJDB(MSIL), прямого праймера SEQ ID NO: 3, содержащего сайт для рестриктазы Bsu36I, обратного праймера SEQ ID NO: 4, содержащего сайт для рестриктазы EcoR1;the human IL-2 gene, with the exception of the region encoding the signal peptide, is obtained by PCR using the plasmid matrix pJDB (MSIL), direct primer SEQ ID NO: 3 containing the site for the restriction enzyme Bsu36I, reverse primer SEQ ID NO: 4, containing restriction enzyme site EcoR1;
полученный ген альбумина плазмы крови человека обрабатывают рестриктазами Xho1 и MstII;the resulting human plasma albumin gene is treated with restriction enzymes Xho1 and MstII;
полученный ген ИЛ-2 человека обрабатывают рестриктазами Bsu36I и EcoR1;the obtained human IL-2 gene is treated with restriction enzymes Bsu36I and EcoR1;
лигируют гены альбумина плазмы крови человека и ИЛ-2 человека, обработанные как указано выше, с плазмидой рРIС9, предварительно обработанной рестриктазами Xho1 и EcoR1, иligated human plasma albumin genes and human IL-2, processed as described above, with plasmid pIPC9 pretreated with restriction enzymes Xho1 and EcoR1, and
полученной лигазной смесью трансформируют клетки Escherichia coli и отбирают клоны, содержащие рекомбинантную плазмиду pPIC9HAbIL-2.Escherichia coli cells were transformed with the obtained ligase mixture and clones containing the recombinant plasmid pPIC9HAbIL-2 were selected.