RU2005784C1

RU2005784C1 - Method of immobilized peroxidase preparing

Info

Publication number: RU2005784C1
Authority: RU
Inventors: А.В. Брыкалов; О.В. Воронина; И.В. Несмеянова; И.В. Маслова
Original assignee: Ставропольский сельскохозяйственный институт
Priority date: 1990-06-05
Filing date: 1990-06-05
Publication date: 1994-01-15

Abstract

FIELD: biotechnology. SUBSTANCE: method involves the use of aerosil as a carrier, which is modified with dextran. Dextran is a polysaccharide - a linear polymer on glucase-base, in which links α-1,6 are connected by glucoside bonds. After oxidation of product with perchlorate solution carrier is activated with aldehyde groups which are able to interact with molecules of enzyme peroxidase. EFFECT: improved method of peroxidase immobilization. 1 tbl

Description

Изобретение относится к получению иммобилизованных ферментов, в частности пероксидаз. Иммобилизованные пероксидазы применяются для стерилизации пищевых и медицинских жидкостей, для предотвращения роста микроорганизмов в реакторах. The invention relates to the production of immobilized enzymes, in particular peroxidases. Immobilized peroxidases are used to sterilize food and medical fluids, to prevent the growth of microorganisms in reactors.

Известен способ получения иммобилизованной пероксидазы на альгинатном волокне. A known method of obtaining immobilized peroxidase on alginate fiber.

Недостатком способа является низкая активность иммобилизованной пероксидазы, кроме того, материал носителя непрочен, подвержен микробиологической атаке. The disadvantage of this method is the low activity of immobilized peroxidase, in addition, the carrier material is unstable, susceptible to microbiological attack.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения иммобилизованной пероксидазы обработкой полимерного носителя на основе модифицированного полистирола водным раствором пероксидазы хрена в присутствии бикарбоната натрия при 0-4^оС с продолжительностью процесса 20 ч.The closest to the proposed method is a method for treating the immobilized peroxidase polymeric carrier on the basis of modified polystyrene with an aqueous solution of horseradish peroxidase in the presence of sodium bicarbonate at 0-4 ^{° C} with a duration of 20 hours of the process.

Недостатком указанного способа является низкая удельная активность иммобилизованной пероксидазы, длительность и многостадийность процесса иммобилизации. The disadvantage of this method is the low specific activity of immobilized peroxidase, the duration and multi-stage process of immobilization.

Цель изобретения - повышение удельной активности препарата иммобилизованной пероксидазы. The purpose of the invention is to increase the specific activity of the preparation of immobilized peroxidase.

Цель достигается тем, что для увеличения удельной активности иммобилизованной пероксидазы проводят модифицирование кремнеземного носителя - аэросила 2-3% -ным раствором декстрана с последующим окислением продукта перхлоратом натрия. The goal is achieved in that in order to increase the specific activity of immobilized peroxidase, a silica support is modified - aerosil with a 2-3% solution of dextran followed by oxidation of the product with sodium perchlorate.

Существо предлагаемого способа в активировании аэросила декстраном, представляющем собой полисахарид - линейный полимер на основе глюкозы, в котором звенья связаны α = 1,6-гликозидной связью. При последующем окислении модифицированного носителя раствором перхлората получаемый продукт активирован альдегидными группами, способными к взаимодействию с молекулами фермента пероксидазы. The essence of the proposed method in the activation of Aerosil dextran, which is a polysaccharide - a linear polymer based on glucose, in which the units are linked α = 1,6-glycosidic bond. In the subsequent oxidation of the modified support with a perchlorate solution, the resulting product is activated by aldehyde groups capable of interacting with peroxidase enzyme molecules.

П р и м е р 1. 10 г аэросила суспендируют в 100 мл 4% -ного водного раствора декстрана. Смесь выдерживают при комнатной температуре 1 ч. Полученный носитель далее высушивают при 100-120^оС в течение 1 ч. К полученному аппарату добавляют 50 мл водного раствора, содержащего 3 г перхлората натрия, и ингибируют в течение 30 мин. Затем носитель отмывают 250 мл дистиллированной воды. К 1 г носителя приливают 10 мл ацетатного буфера рН 4,8, содержащего 0,03 г пероксидазы. Смесь оставляют в течение 1 ч при 4^оС, далее надосадочную жидкость сливают, а носитель промывают трижды по 30 мл ацетатным буфером рН 4,8. Активность иммобилизованной пероксидазы 0,86 Е/мг. Иммобилизованный фермент сохраняет 98% активность по отношению к нативному состоянию.PRI me R 1. 10 g of Aerosil suspended in 100 ml of a 4% aqueous solution of dextran. The mixture was kept at room temperature for 1 hour. The resultant carrier was further dried at 100-120 ^C for 1 h. To this apparatus was added 50 ml of an aqueous solution containing 3 g of sodium perchlorate and inhibit for 30 min. Then the carrier is washed with 250 ml of distilled water. To 1 g of the carrier is poured 10 ml of acetate buffer pH 4.8, containing 0.03 g of peroxidase. The mixture is left for 1 hour at ⁴ ° C, then the supernatant was decanted and the support washed three times with 30 ml of acetate buffer pH 4.8. The activity of immobilized peroxidase 0.86 U / mg The immobilized enzyme retains 98% activity in relation to the native state.

П р и м е р 2. Способ получения иммобилизованной пероксидазы осуществляют по методике примера 1, но для модифицирования аэросила используют 3% -ный раствор декстрана. Активность иммобилизованной пероксидазы 0,86 Е/мг. Иммобилизованный фермент сохраняет 96% активности по отношению к нативному состоянию. PRI me R 2. The method of obtaining immobilized peroxidase is carried out according to the method of example 1, but to modify aerosil using a 3% solution of dextran. The activity of immobilized peroxidase 0.86 U / mg The immobilized enzyme retains 96% activity in relation to the native state.

П р и м е р 3. Способ получения иммобилизованной пероксидазы осуществляют по методике примера 1, но для модифицирования аэросила используют 2% -ный раствор декстрина. Активность иммобилизованной пероксидазы 0,72 Е/мг. Иммобилизованный фермент сохраняет 98% активности по отношению к нативному состоянию. PRI me R 3. The method of obtaining immobilized peroxidase is carried out according to the method of example 1, but to modify aerosil using a 2% solution of dextrin. The activity of immobilized peroxidase 0.72 U / mg The immobilized enzyme retains 98% activity in relation to the native state.

П р и м е р 4. Способ получения иммобилизованной пероксидазы осуществляют по методике примера 1, но для модифицирования аэросила используют 1% -ный раствор декстрана. Активность иммобилизованной пероксидазы 0,43 Е/мг. Иммобилизованный фермент сохраняет 98% активности по отношению к нативному состоянию. PRI me R 4. The method of obtaining immobilized peroxidase is carried out according to the method of example 1, but for the modification of aerosil using a 1% solution of dextran. The activity of immobilized peroxidase 0.43 U / mg The immobilized enzyme retains 98% activity in relation to the native state.

П р и м е р 5. Способ получения иммобилизованной пероксидазы осуществляют по методике примера 1, но для модифицирования аэросила используют 2,5% -ный раствор декстрана. Активность иммобилизованной пероксидазы 0,78 Е/мг. Иммобилизованный фермент сохраняет 96% активности по отношению к нативному состоянию. В отличие от прототипа предлагаемый способ иммобилизации повышает удельную активность фермента пероксидазы в 3-4 раза.
Как видно из таблицы для модифицирования аэросила оптимален раствор декстрана с концентрацией 2-3% . При увеличении концентрации до 4% не наблюдается увеличение активности иммобилизованной пероксидазы, тогда как уменьшение до 1% снижает значение удельной активности фермента.PRI me R 5. The method of obtaining immobilized peroxidase is carried out according to the method of example 1, but for the modification of Aerosil using a 2.5% solution of dextran. The activity of immobilized peroxidase 0.78 U / mg The immobilized enzyme retains 96% activity in relation to the native state. In contrast to the prototype, the proposed method of immobilization increases the specific activity of the peroxidase enzyme by 3-4 times.
As can be seen from the table for the modification of Aerosil optimal solution of dextran with a concentration of 2-3%. With an increase in concentration to 4%, an increase in the activity of immobilized peroxidase is not observed, while a decrease to 1% reduces the value of the specific activity of the enzyme.

Положительный эффект и преимущества предлагаемого способа получения иммобилизованной пероксидазы в том, что в процессе гелеобразования в водном растворе непористого кремнезема аэросила в присутствии органического вещества декстрана образуется органо-минеральный носитель, имеющий пористую структуру. В процессе формирования пористой структуры кремнеземной матрицы происходит активирование поверхности органическим полимером-декстрином. Последующее поверхностное окисление функциональных групп декстрана приводит к образованию химически активных альдегидных групп, которые реагируют с молекулами фермента пероксидазы при иммобилизации. Кремнеземный носитель используемый для иммобилизации пероксидазы, обеспечивает повышение удельной активности иммобилизованного препарата, кроме того, выгодно отличается механической, химической, микробиологической и термической устойчивостью. (56) Авторское свидетельство СССР N 742434, кл. С 12 N 11/10, 1980. The positive effect and advantages of the proposed method for producing immobilized peroxidase are that in the process of gelation in an aqueous solution of non-porous silica aerosil in the presence of organic matter dextran an organic-mineral carrier is formed having a porous structure. In the process of formation of the porous structure of the silica matrix, the surface is activated by an organic polymer-dextrin. Subsequent surface oxidation of the functional groups of dextran leads to the formation of chemically active aldehyde groups, which react with peroxidase enzyme molecules upon immobilization. The silica carrier used to immobilize peroxidase provides an increase in the specific activity of the immobilized preparation; moreover, it compares favorably with mechanical, chemical, microbiological, and thermal stability. (56) Copyright certificate of the USSR N 742434, cl. C 12 N 11/10, 1980.

Патент США N 3860486, кл. 195-68, опублик. 1975. U.S. Patent No. 3,860,486, cl. 195-68, published. 1975.

Claims

METHOD FOR PRODUCING IMMOBILIZED PEROXIDASE, which involves the interaction of an enzyme-containing solution with a modified carrier, characterized in that, in order to increase the specific activity of the enzyme, aerosil modified with a 2 - 3% solution of dextran and oxidized with sodium perchlorate is used as a carrier.