RU1836954C - Способ получени иммуномодулирующих пептидов - Google Patents

Abstract

Способ получени  пептидов иммуномо- дулирующего действи  включает экстракцию биологически активного вещества из костного мозга млекопитающих, отделение балластных веществ, вли ющих на иммунную систему, вызыва  выработку антител к высоко молекул рным фракци м полипептида . Способ позвол ет получать биологиче- ски активное вещество с низкой молекул рной массой, что снимает межвидовую чужеродность, дает возможность примен ть его в лечении человека. Фракционирование комплекса белков, полученных из костного мозга млекопитающих, привело к повышению его активности за счет изолировани  фракции 1 и фракции 2. Иммуномо- дулирующее его действие направлено на В- и Т- системы иммунитета, повыша  количество иммунокомпетентных клеток, статистически значимо при их дефиците, т.е. при вторичных иммунодефицитах. Одновременно происходит активизаци  резерва клеток иммунной системы, создава  базу дл  размножени  иммунокомпетентных клеток. Способ позвол ет уменьшить обьем реагентов , что делает его технологичным и обеспечивает экологически чистое производство, одномоментно повышает выход конечного продукта. 2 ил., 4 табл. СП С

Description

Изобретение относитс  к медицине, в частности к медицинской биотехнологии, и может быть использовано при производстве лекарственных препаратов, стимулирующих иммунную систему организма.

Целью изобретени   вл етс  получение целевого продукта с высокой модулирующей активностью.

Способ осуществл етс  следующим образом .

Свежий костный субстрат морского животного очищают, измельчают обычным способом, дел т на три порции и каждую заливают 3% трихлоруксусной кислотой. Смесь перемешивают в экстракционной колбе на холоде при -4°С в течение суток, экстракцию провод т трижды и объедин ют выт жки всех порций, провод т диализ.против дистиллированной воды. Высаливание осуществл ют предварительно подсушенным сульфатом аммони  (5 г соли на 1л выт жки ). Надосадочную жидкость декантируют и к полученному прозрачному раствору приливают.ацетон (чда), предварительно охлажденный до -5°С. Осаждение протеинового комплекса ведетс  в течение 24 часов в холодной камере. Полученный осадок фильтруют через бумажный фильтр и высушивают на воздухе. Протеиновый комплекс извлекают многократной экстракцией бидистилл том, предварительно нагретым до +37°С при посто нном перемешивании. В результате получают слегка опалесцирующую бледно-желтую жидкость, которую лиофилизуют. Высушенный препарат представл ет собой легкий

00

со

О О

ел

4

порошок кремового цвета. Дальнейшее обессрливание и концентрирование ведут на ультрафильтрационной мембране Amlcon РМ-10. Фильтрат лиофилизуют, порошок раствор ют в малом объеме ацетз- таммонийного буфера с рН б (0,556 г в 2 мл буфера), немного подкисл   0,1 Н раствором СНзСООН до полного растворени .

Гетерогенность комплексного пептида доказывают, подверга  его гёльхроматогра- фии. Дл  этого элюирование фракций ведут на колонке с сефадексом G-50, предварительно уравновешенном в буфере. Контроль фракционировани  осуществл ют обычным способом при помощи автоматического коллектора и аппарата Wicord. Профиль гель- фильтрации устанавливали измер   оптическую активность фракций на СФ-26 . Профиль элюции имел три пика, вид которых изображен на фиг. 1.

фракции выделены препаративно. С помощью диск-электрофореза в полиакри- ламидном геле с кумаеси голубым в присутствии додецйлсульфата установлено, что мол рна  масса фракций соответственно равна 10 КД, 8 КД, 5-6 КД.

Точечна  мол рна  масса активной фракции была определена на колонке с Р-60 в присутствии декастрана голубого при элюции сукцинатным буфером обычным способом . Мол рна  масса равна 5100-5300 Д.

Наиболее оптимальные услови  получени  протеинового комплекса были подобраны экспериментально.

8 частности, режим высаливани  предполагает применение насыщенных растворов . С этой целью была подобрана концентраци  высаливающего раствора, котора  составила 5 г/л сульфата аммони .

Дл  достижени  полноты экстракции протеиновых комплексов были проведены эксперименты при разных температурах, Результаты показаны на фиг,2,

Как следует из результатов исследовани , наибольша  полнота экстракции комплекса достигаетс  при 37°С, поэтому это значение было отобрано в качестве окончательного .

Дл  установлени  пептидной природы комплекса был проведен аминокислотный анализ.

. Химический анализ суммарного полипептида представлен в табл, 1, аминокислотный спектр - в табл.2.

Аминокислотный спектр активной фракции пентапептидной природы охарактеризован глутаминовой (4.45%), аспарагиновой (3.59%). лизином (2,82%), пролином (1.43%), аргинином (1.49), т желых металлов и алю0

5

0

мини  в активной фракции не обнаружено. Пептиды были лиофилизированы при -10QC.

По сравнению с аналогами предлагаемое техническое решение обладает новиз- ной и р дом преимуществ (табл.З).

Более подробные сведени  об иммуно- модул торах представлены в табл.4.

Комплексный полипептид, как видно , оказывал существенное вли ние как на Т- так и В-лимфоциты. Однако, если в целом количество Т-лимфоцитов увеличивалось незначительно (на 4,8%), то на выход Т-лимфоцитов разной степени зрелости это действие было более выраженным. Уровень b ауто-РОК возрастал в 2,5 раза, стабильных Е-РОК - почти в 2 раза. Количество активности Е-РОК клеток регул торного р да (ТР- РОК, ТЧ-РОК) измен лось в меньшей п степени - соответственно на 2,61 %, 7,36%, 3,04%. Синхронное этим измен лс  индекс -ТР/ТЧ - с 0,99 до 1,19.

Более выраженным оказалось воздействие на общее количество В-лимфоцитов. Их количество возрастало на .9.21 %, то есть почти вдвое, но численность зрелых М-РОК имела тенденцию к уменьшению.

Таким образом, комплексный полипептид обнаружил боле е высокую иммуномод- улирующую активность в отношении ; общего количества В-лимфоцитов. стабильных и аутосубпопул ций Т-лимфоцитов, несколько меньшую - в отношении ТР-РОК с хелперной функцией (рост в 2,5 раза), обще- го количества Т-лимфоцитов (в 1,5 раза), активных Е-РОК (в 1,5 раза), стабильных Е-РОК (в 2,2 раза), А-РОК (в 4 раза), общего количества В-лимфоцитов в 3.1 раза, при нейтральном отношении к Тч-РОК С супрес- сорной .функцией, благодар  чему соотношение Тр/Тч приближалось к норме.

Та же направленность изменений в уровне Т- и В- лимфоцитов, их субпопул ций , но менее выраженна  отмечена у фракции II.

фракци -til практически иммунномоду- лирующий эффект не обеспечивала.

Таким образом, иммуномодулирующее действие на Т- и В- лимфоциты с учетом степени их зрелости и активности регул торного звена Т-лимфоцитов наиболее выражено (убывающей степени) вфракции-1, . фракции-2, комплексного полипептида.

Они найдут широкое применение в практическом здравоохранении дл  лече- ни  больных иммунодефицитами различной глубины и направленности.

Claims (1)

1. Формула изо.бретени 

   Способ получени  иммуномодулирую- щих пептидов, включающий измельчение костного мозга, экстракцию уксусной кислотой , отделение примесей последующим осаждением целевого продукта, его очисткой и лиофилизацией, о тли ч а ю щ и и с   тем. что, с целью повышени  выхода и специфической активности продукта, в качестве сырь  используют костный мозг морских млекопитающих , экстракцию провод т трехпроцентным раствором трихлоруксусной кислоты , а после осаждени  сульфатом аммони  целевой продукт экстрагируют бидистмлли- рованной водой, нагретой до 37°С. а очистку провод т ультрафильтрацйей и гельхроМатографией.

   Табл и ца 1 Результаты исследований общего химического состава полипептидов.

   Результаты исследовани  аминокислотного состава по ипептидов.

   Таблица 3

   Сравнительна  характеристика предлагаемого способа получени  пептидов и иммуномодул торое с аналогами

   Признаки

   Предлагаемый способ Аналог 1

   ть

   Морское сырье Высока 

   3% Р-Р трихлорукг сусна  к-та

   Высша  с малым объемом экстраген- та

   Та бл и ца2

   I

   Аналог

   Наземное сырье Убойный скот

   Низка  и крайне Низка  низка 

   Уксусна  к-та Уксусна  к-та

   Низка 

   Низка 

   Отсутствует

   Высока  за счет малой токсичности

   Бидистйлл т при +37 С., Обессоли- ваийе при ,5

   Гельфильтраци 

   :-....- Таблица 4

   ишюшдтгащй  живность кожшсного шастншш к ЕГО «РАКШИ НА ГЛЕТОЧНУЮ ишуШю сжтаа1 тгош у БОЛЪШ с втоишзл жмудадаЕЦитАЖ

   Продолжение табл.3

   Высока 

   Высока 

   Низка  за счет Высока  высокой токеичн.

   Ие указано

   Не указано

   Не проводитс  Не проводитс 

   f.B

   Ј1.4

   %1,г

   I1,0

   i#

   о,в

   I

   «

   too

   °°

   60 40

   20

   20ЗОЗО 40Sff

   фе/&. 27e 0reper ry/ eti C

   ж

   6b

   75

   84

   фаа,1