RU1806195C

RU1806195C - Способ селекции попул ции клеток IN VIVo

Info

Publication number: RU1806195C
Application number: SU914906954A
Authority: RU
Inventors: Вячеслав Юрьевич Кравцов; Александр Федорович Яковлев; Елена Викторовна Федорова; Юрий Борисович Вахтин
Original assignee: Вячеслав Юрьевич Кравцов; Александр Федорович Яковлев; Елена Викторовна Федорова; Юрий Борисович Вахтин
Priority date: 1991-01-03
Filing date: 1991-01-03
Publication date: 1993-03-30

Abstract

Использование: биотехнологи , способы изменени наследственных признаков клеточных линий путем отбора опухолевых узлов по показател м микро дерного теста. Сущность изобретени : отбирают внутри- брюшинные опухолевые узлы с минимальными показател ми микро дерного теста, полученные попул ции клеток сёлекциони- руют. 1 ил..

Description

СО

С

Изобретение относитс к биотехнологии , а точнее к способам изменени наследственных признаков клеточных линий.

Целью изобретени вл етс снижение кариотипической нестабильности попул ций клеток миелом.

Сущность известного способа, вз того в качестве прототипа, заключаетс в следующем: путем внутривенной инъекции получают легочные экспериментальные метастазы уницеллюл рного происхождени рабдоми- осаркомы крыс; полученные метастазы анализируют микро дерным тестом (МЯТ), отбирают один экспериментальный метастаз с максимальной частотой клеток с микро драми , получают из него суспензию дл внутривенного введени с целью реклонировани . Выросшие экспериментальные метастазы-потомки подвергаютс выше описанной процедуре, т.е. оценке МЯТ, отбору одного клона с максимальным показателем МЯТ, получению из него суспензии дл последующего внутривенного введени с целью реклонировани . Таким образом, отбор идет по одному экспериментальному метастазу на фоне реклонировани .

Известный способ-прототип примен етс с целью изучени коррел ции между степенью нестабильности кариотипа злокачественности попул ций опухолевых клеток . . .

В результате применени известного способа селекции на повышение частоты спонтанного образовани микро дер в клонах экспериментальных легочных метастазов перевивной рабдомиосаркомы крыс удалось получить попул цию клеток с достаточно большей частотой клеток с микро драми и достоверно меньшим метастатическим потенциалом (степенью злокачественности). Установлена отрицательна зависимость между степенью нестабильности кариотипа

00

о

Os

Ю

(Л

СО

и степенью злокачественности в попул ци х опухолевых клеток.

Известно что в ходе опухолевой прогрессии степень нестабильности кариотипа клеток возрастает, а также сохран етс на высоком уровне при пассировании опухолевых клеток линий In vivo и In vitro.

В литературе не известны работы по проведению искусственного отбора, на- правлёйнЬгр на снижение частоты спонтан- ных нарушений кариотипов в попул ци х перевивных клеточных линий.

Целью изобретени вл етс степени кариотипической нестабильности попул ций перевивных клеточных линий миелом мышей, т.е. получение попул ций клеток миелом с относительно стабильным кариотипом и, следовательно, со стабильным фенотипом, используемых в дальнейшем дл получени гибридов-продуцентов.

Известно, что при использовании в гиб- ридомной технологии миелом, не, тестированный на стабильность кариотипа, наблюдаетс высока степень кариотипической нестабильности и низка эффективность секреции гибридом. Вследствие нестабильности , несбалансированности кариотипа, элиминаци хромосом с желаемыми генами может проходить с высокой частотой.

Одной из причин кариотипической не- стабильности гибридов-продуцентов вл етс изначальна кариотипическа нестабильность клеток перевивных линий, вз тых в качестве партнеров дл гибридизации .

В св зи с этим существует необходимость получени клеточных попул ций миелом с пониженной частотой спонтанной кариотипической изменчивости.

По причине наследственной гетероген- ности в попул ци х клеток перевивных линий по признаку спонтанна частота клеток с МЯТ авторы предлагают проводить искусственный отбор, направленный на снижение спонтанной частоты клеток, с микро драми. В ходе отбора установлено достоверное снижение частоты спонтанного образовани микро дер в клетках, что вл етс показателем снижени степени кариотипической изменчивости в попул ци х клеток миелом.

Сущность за вленного способа заключаетс в том, что мышам линии BALB/c инъецируют внутрибрюшинную суспензию клеток миеломы, получают внутрибрюшин- ные (в/б) опухолевые узлы, анализируют их методом МЯТ, отбирают в/б узлы с минимальными показател ми МЯТ, получают из них суспензию дл очередного цикла отбора .

В качестве опухоленосителей при селекции за вленным способом могут использоватьс МЫШИ ДруГИХ ЛИНИЙ;

Критерием способа вл етс спонтанна частота возникновени клеток с микро драми. Но при селекции по высокой спонтанной частоте возникновени клеток с микро драми (в способе-прототипе) - повышаетс степень злокачественности клеток и степень кариотипической нестабильности..

При селекции на снижение частоты возникновени клеток с микро драми (за вленным способом) в результате 4-х циклов отбора получают попул ции клеток миеломы о достоверно высокой стабильностью кариотипа (до 0,60% изменчивости кариотипа ), т.е. получают клетки иного качества, обладающие стабильными фенотипическими свойствами, представл ющие большой интерес дл гибридомной технологии.

Отличительными признаками за вленного решени вл ютс следующие признаки: . -

внутрибрюшинна инъекци мышей линии BALB/ с суспензией клеток миеломы. Лини BALB/c вл етс сингенной линией дл получени конкретной миеломы SP 2/0, котора используетс дл получени гибридом;

оценка и отбор внутрибрюшинных опухолевых узлов с минимальными показател ми микро дерного теста дл последующего реклонировани ;

получение суспензии из отобранных узлов дл очередного цикла отбора.

Существенным признаком вл етс отбор внутрибрюшинных узлов с минимальными показател ми микро дерного теста. В результате 4-х циклов отбора по этому критерию получают потомство попул ции клеток миеломы, имеющее достоверно низкую частоту клеток с микро драми (до 0,60% в среднем по попул ции). В исходной же попул ции средн частота клеток с микро драми составл ет 2,1% (с изменчивостью от 0,6 до 5,3%).

Преимуществом отбора внутрибрюшинных узлов перед легочными метастазами заключаетс в следующем: в их высокой скорости формировани (7-14 суток) и достаточном количестве дл проведени попул - ционного теста и отбора.

Легочные метастазы формируютс в течение 30 дней и более, и количество их значительно и недостаточно дл проведени селекции.

Кроме того, при отборе внутрибрюшинных узлов после нескольких циклов отбора получают попул ции клеток миеломы с достоверно стабильным кариотипом и, следовательно , стабильными фенотипическими признаками, обеспечивающими высокую жизнеспособность клеток, и при использовании их дл получени гибридом-стабильную секрецию антител.

Таким образом, в результате селекции по признаку низкой спонтанной частоты возникновени клеток с микро драми в каждом последующем поколении попул ции клеток мие омы. происходит снижение степени спонтанной частоты возникновени клеток с микро драми, т.е. снижение степени кариотипической нестабильности и степени злокачественности клеток. Селекци клеток за вленным способом позвол ет снизить частоту встречаемости клеток с микро драми в 3 и более раз, что свидетельствует о повышении жизнеспособности клеток и о высокой стабильности их кариотипа, что вл етс целью изобретени .

Известным же способом изучаетс и определ етс степень злокачественности и св зь ее с нестабильностью кариотипа в получаемых попул ци х клеток, не представл ющих интереса дл гибридомной биотехнологии из-за их нестабильных фенотипичес ких свойств, обусловленных нестабильностью кариотипа.

В способе-прототипе проводитс отбор одного метастаза с максимальной частотой клеток с микро драми и в результате нескольких циклов отбора установлено возрастание степени нестабильности кариотипа и степени злокачественности клеток, т.е. обеспечиваетс получение попул ции клеток с высокой спонтанной частотой возникновени микро дер.

Использование отселектированных за вл емым способом на стабильность кариотипа клеток миелом при получении гибридом повысит уровень селекции гибридом , что даст в. итоге экономию в народном хоз йстве.

Предлагаемый способ может примен тьс на предпри ти х биотехнологической, медицинской промышленности и в научно-исследовательских цел х,

На чертеже Показана частота клеток с микро драми (ЧКМ) во внутрибрюшинных узлах перевивной миеломы SP 2/0.

По оси абсцисс - частота клеток с микро драми (ЧКМ), %. По оси ординат - число внутрибрюшинных узлов, %, а - 40 в/б узлов до отбора; б - 20 в/б узлов после 1-го цикла отбора: в - 26 в/б узлов после 2-го цикла отбора; г - 33 в/б узла после 3 цикла отбора; д - 25 в/б узлов после 4 цикла отбора , направленного на снижение спонтанной ЧКМ в в/б узлах.

Пример. Отбор в/б узлов миеломы SP 2/0 проводили по Следующей схеме. Вычлененные из брюшной полости декапити- рованной мыши 40 в/б узлов (в/б узлы

5 фиксированы на кишечнике и брызжейке)

отдельно помещают в лунки иммунологического планшета 64-2-279-79) со средой

199.

Узелки достают из лунки и методом от10 печатков делают мазки на стерильном предметном стекле (около 1000 клеток на 1 предметное стекло), пронумерованном соответственно номеру лунки.

Оставшуюс часть в/б узлов помещают

15 обратно в лунку, планшет закрывают и помещают в холодильник при +4°С на 8-12 ч. Приготовленные мазки фиксируют 96% этиловым спиртом с течение 5 мин, высушивают , окрашивают азур-эозином (в соот20 ношении 1 часть 0,1% эозина на 3 части 0,1 % азура, разбавленного в 50 раз дистиллированной водой) в течение 10 мин.

Затем провод т микро дерный тест под иммерсией (окул р 10, объектив 100). В каж25 дом мазке методом МЯТ анализируют по 300 клеток. Частоту клеток с микро драми выражают в процентах. Средн частота клеток с микро драми (ЧМК) в исходной выборке из 40 в/б узлов составила 2,1 %, раз30 мах изменчивости от 0,6% до 5,3 % (чертеж). Из исходной попул ции отбирают узлы с минимальными показател ми МЯТ, имеющие от 0,6 до 1,0% клеток с микро драми. Из «их готов т суспензию дл в/б инъеци35 ровани , дл чего их помещают в стерильные флаконы (бак-печатки), гомогенизируют с помощью ножниц, заливают 5 мл универсальной среды ТС-199 и пипетирукп шприцем в течение 3 мин. .

40Полученную суспензию фильтруют через 4 сло стерильной марли в центрифуж- ную пробирку и центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин. Надосадок сливают. К полученному осадку клеток добавл ют 3

45 мл среды ТС-199. определ ют концентрацию клеток с помощью камеры Гор чева и довод т концентрацию до 3 млн. клеток/мл. Подготовленную таким образом суспензию клеток миеломы инъецируют внутрибрю50 шинно мышам линии BALB/c в дозе 1 мл/особь.

Через 12 суток по вл ютс признаки внутрибрюшинного асцитного роста (видимое увеличение области живота животного).

55 Вскрывают брюшную полость, отпрепаро- вывают сформировавшиес опухолевые узлы, помещают их в лунки иммунологиче- ского планшета со средой ТС-199, делают мазки, провод т оценку методом МЯТ, анализиру по 300 клеток каждого из 20 исследуемых в этом цикле в/б узлов, определ ют частоту клеток с микро драми. Средн частота клеток с микро драми в результате 1-го цикла отбора составила 1,1% (чертеж). Отбирают 5 узлов с минимальными показа- тел ми МЯТ, имеющих от 0,3-0,6% клеток с микро драми и используют их дл очередных в/б прививок во 2-ой цикл отбора. Таким образом, описанные выше манипул ции повтор ютс на каждом цикле отбора.

В результате двух циклов отбора средн частота клеток с микро драми понизилась до 0,89%, а размах изменчивости сузилс (min - 0%, max - 3%) (чертеж). П ть из 26 исследованных в/б узлов с минималь- ными показател ми МЯТ (от 0 до 0,3 %) были отобраны дл 3-го цикла отбора.

В результате 3 цикла отбора, проведенного методом, описанным выше, средн частота клеток с микро драми в попул ции 33 в/б узлов составила 0,75% (чертеж). В очередной, четвертый цикл отбора были вз ты в/б узлы, имеющие 0% клеток с микро драми .

Четвертый цикл отбора также оказалс эффективным: средн частота клеток с

микро драми в выборке из 25 в/б узлов составила всего 0,60%, 56% в/б узлов имели показатели микро дерного теста не более 1 % (чертеж).

Таким образом проведены 4 цикла искусственной селекции попул ций клеток ми- елом на снижение степени частоты клеток с микро драми (кариотипической изменчивости ). Частота встречаемости клеток с микро драми в полученных путем за вл емого способа селекции попул ци х клеток мие- лом снизилась с 2,1 до 0,60%, т.е. в 3 с лишним раза (при Р 0,001 по непараметрическому критерию Вилкоксона-Манна- Уитин).

Claims

Формула изобретени Способ селекции попул ции клеток in vivo, включающий экспресс-анализ частоты микро дер в опухолевых узлах, отбор опухолевых узлов с их дальнейшей перевивкой, отличающийс тем, что, с целью снижени степени кариотипической нестабильности попул ции клеток миелом, отбирают внутрибрюшинные опухолевые узлы с минимальными показател ми микро дерного теста.

a

--I

± 2 s-tr/f r

j

jro3D tt

К

fp p

УР 20 SO

e / 2 t

%

S.

k

°

2e /f

/ 2 У

0 S 2 $

j

.

)

)

MJfty