RU1777080C

RU1777080C - Method for identifying malignant process

Info

Publication number: RU1777080C
Application number: SU884487110A
Authority: RU
Inventors: Юрий Сергеевич Сидоренко; Нонна Дмитриевна Кислякова; Галина Ярославна Чернявская; Галина Аркадьевна Попова; Галина Яковлевна Марьяновская; Галина Андреевна Неродо; Сергей Анатольевич Зинькович
Original assignee: Ростовский научно-исследовательский онкологический институт
Priority date: 1988-09-26
Filing date: 1988-09-26
Publication date: 1992-11-23

Abstract

Использование: при диспансеризации населени с целью вы влени больных со злокачественными новообразовани ми. Цель: повышение точности и расширение функциональных возможностей способа. Сущность изобретени : в сыворотке крови определ ют магнийнезависимую ДНКаз- ную активность при рН 5,0-7,5 и количественное содержание перхлорнорастворимой фракции. При ДНКазной активности определ ют наличие злокачественного процесса , а при отсутствии магнийнезависимой ДНКазной активности и одновременном повышении показател количественного содержани перхлорнорастворимой фракции до 0,118 Ей более определ ют наличие злокачественного процесса с метастазирова- нием. Положительный эффект высока чувствительность при достаточной точности Usage: during the medical examination of the population in order to identify patients with malignant neoplasms. Purpose: improving accuracy and expanding the functionality of the method. SUMMARY OF THE INVENTION: In the blood serum, magnesium-independent DNase activity is determined at pH 5.0-7.5 and the quantitative content of the perchloro-soluble fraction. With a DNase activity, the presence of a malignant process is determined, and in the absence of a magnesium-independent DNase activity and a simultaneous increase in the quantitative content of the perchloro-soluble fraction to 0.118 She, the presence of a malignant process with metastasis is more determined. Positive effect high sensitivity with sufficient accuracy

Description

Изобретение относитс к медицине, в частности к клинической онкологии, и может быть использовано при диспансеризации населени с целью диагностического вы влени методом выбора (скриннинга) больных со злокачественными новообразовани ми, независимо от стадии и локализации опухолевого процесса.The invention relates to medicine, in particular to clinical oncology, and can be used in medical examination of a population for the purpose of diagnostic detection by the method of selection (screening) of patients with malignant neoplasms, regardless of the stage and localization of the tumor process.

Известен способ диагностики злокачественных новообразований путем определени активности ферментов в сыворотке крови человеке: изменение изоферментно- го спектра фермента лактатдегидрогеназы (ЛДГ). При сопоставлении активности изо- ферментов ЛДГ, а именно ЛДГе и ЛДП, определен термин индекс малигнизации, значение которого при злокачественном росте опухолей превышает единицу. Однако широкое использование этого способа диагностики лимитировано сложностью выполнени исследований, проводимых в клинико-диагностической лаборатории.A known method for the diagnosis of malignant neoplasms by determining the activity of enzymes in human serum is to change the isoenzyme spectrum of the enzyme lactate dehydrogenase (LDH). When comparing the activity of LDH isoenzymes, namely LDHe and LDP, the term malignization index is defined, the value of which in case of malignant tumor growth exceeds unity. However, the widespread use of this diagnostic method is limited by the complexity of the studies performed in the clinical diagnostic laboratory.

Известен способ ранней диагностики злокачественных новообразований путем определени в сыворотке активности фермента ДНКазы 1, оптимальное действие которого вы вл етс в слабо щелочной среде (рН 7,4) при об зательном присутствии ионов магни . Активность ДНКазы 1 в сыворотке крови человека определ ют вискози- метрически по изменению в зкости коллоидного раствора ДНК после действи на него фермента. Наход т относительную в зкость опытной пробы по отношению к воде до 2-часовой инкубации в термостате и после нее. Опытна проба состоит из реакционных компонентов: сыворотки крови, натриевой соли ДНК и раствора МдЗОд (ионы магни ), т.е. реакци идет в присутствии ионов магни в слабо щелочной среде - рН крови 7,4, Активность фермента вырэжа 1A method for the early diagnosis of malignant neoplasms is known by determining the activity of the enzyme DNase 1 in serum, the optimal effect of which is found in a slightly alkaline medium (pH 7.4) in the presence of magnesium ions. The activity of DNase 1 in human serum is determined viscometrically by the change in the viscosity of the colloidal DNA solution after the action of the enzyme on it. The relative viscosity of the test sample is found with respect to water before 2-hour incubation in and after the thermostat. The experimental sample consists of the reaction components: blood serum, sodium salt of DNA and a solution of MgSO4 (magnesium ions), i.e. the reaction occurs in the presence of magnesium ions in a weakly alkaline medium - blood pH 7.4, enzyme activity vyreza 1

V4V4

-ч-h

О 00About 00

ОABOUT

ют в относительных единицах -угловых градусах: угол 90° означает, что относительна в зкость опытной смеси за врем инкубации не изменилась, т.е. активность фермента ДНКазы 1 отсутствует. В сыворотке крови доноров (здоровые лица) активность ДНКазы 1 отсутствует. Клинически выраженный рак III-IV стадии также характеризуетс отсутствием активности ДНКазы 1.yut in relative units - angular degrees: an angle of 90 ° means that the relative viscosity of the test mixture did not change during the incubation period, i.e. the activity of the enzyme DNase 1 is absent. In the blood serum of donors (healthy individuals), DNase 1 activity is absent. Clinically expressed stage III-IV cancer is also characterized by a lack of DNase 1 activity.

При наличии активности ДНКззы 1 в сыворотке крови диагностируют рак только на ранних стади х (1-И).In the presence of DNAse 1 activity in blood serum, cancer is diagnosed only in the early stages x (1-I).

Этот способ не находит широкого применени дл диагностики рака, так как имеет р д существенных недостатков:This method is not widely used for the diagnosis of cancer, as it has a number of significant disadvantages:

1.Вы вЛ емость рака составл ет всего 48,2%: из 29 случаев рака положительна активность ДНКазы 1 в сыворотке крови обнаружена только у 14 человек. 1. You have a cancer incidence of only 48.2%: out of 29 cases of cancer, only 14 people have been found to have positive DNase 1 activity in blood serum.

2.Отсутствует вы вл емость III - IV стадии рака, особенно при недостаточно выраженной специфической симптоматике злокачественного роста.2. There is no evidence of stage III - IV cancer, especially with insufficiently expressed specific symptoms of malignant growth.

3.Невозможно вискозиметрическое определение показател количественного содержани перхлорнорастворимой фракции.3. It is not possible to viscometricly determine the quantitative index of the perchloro-soluble fraction.

4.Способ не пригоден дл диагностического вы влени саркоматозных опухолей, при которых активность фермента чаще не вы вл етс .4. The method is not suitable for the diagnostic detection of sarcomatous tumors, in which the enzyme activity is often not detected.

5.Большие затраты времени на проведение анализа: врем подготовки анализа, 2-часова инкубаци в термостате, по 5-6 отсчетов времени вытекани жидкостей в вискозиметре до и после инкубации, построение графика.5.Large expenditures of time for analysis: preparation time for analysis, 2-hour incubation in a thermostat, 5-6 counts of the outflow time of liquids in the viscometer before and after incubation, plotting.

Целью изобретени вл етс повышение точности и расширение функциональных возможностей способа.The aim of the invention is to improve the accuracy and functionality of the method.

Поставленна цель достигаетс тем, что определ ют в сыворотке крови обследуемого лица магнийнезавиоимую ДНКазиую активность при рН 5,0-7,5 и одноврзменно показатель количественного содержани перхлорнорастворимой фракции (ПФС) спектрофотометрическим методом при 260 нм. При наличии магнийнезависимой ДНКазной активности и нормальном или повышенном показателе количественного содержани перхлорнорастворимой фракции диагностируют наличие злокачественного процесса, при отсутствии магнийнезависимой ДНКазной активности и одновременном повышении показател количественного содержани перхлорнорастворимой фракции до 0,118 Е и более определ ют наличие злокачественного процесса в запущенной стадии развити , т.е. с мета- стазированием; при отсутствии магнийнезависимой ДНКазной активности иThe goal is achieved by determining the magnesium-independent DNase activity in the blood serum of the subject at pH 5.0-7.5 and at the same time the quantitative content of the perchloro-soluble fraction (PPS) by spectrophotometric method at 260 nm. In the presence of a magnesium-independent DNase activity and a normal or elevated indicator of the quantitative content of the perchloro-soluble fraction, the presence of a malignant process is diagnosed, in the absence of a magnesium-independent DNase activity and a simultaneous increase in the quantity indicator of the perchloro-soluble fraction to 0.118 E or more, the presence of a malignant process in the advanced stage of development, i.e. . with metastasis; in the absence of magnesium-independent DNase activity and

нормальном показателе количественного содержани перхлорнорастворимой фракции определ ют отсутствие злокачественного процесса.a normal indicator of the quantitative content of the perchloro-soluble fraction is determined by the absence of a malignant process.

Сравнение чувствительности на рак поCancer Sensitivity Comparison

стади м заболевани по предлагаемому способу и прототипу иллюстрируетс табл,1. Способ осуществл етс следующим образом .The stages of the disease according to the proposed method and prototype are illustrated in Table 1. The method is carried out as follows.

0 Процедура проведени анализа. Анализ можно производить, только если больной в ближайшие 3-5 мес цев не получал фитотерапии , химио- и лучевой терапии, не проводил самолечение дами (например,0 Analysis procedure. The analysis can be done only if the patient in the next 3-5 months did not receive herbal medicine, chemotherapy and radiation therapy, did not self-administer Damie (for example,

5 сулемой, креолином и т.д.), а также не принимал биологически активных вещесго (гормонов , нуклеотидов, адаптогенов и т.д.).5 sublimate, creolin, etc.), and also did not take biologically active things (hormones, nucleotides, adaptogens, etc.).

I.Подготовка анализа.I. Preparation of the analysis.

а)Приготовление extempore 0,05% рас- 0 твора ДНК на 0,1 М ацетатном буфере: слегка перемешав коллоидный раствор ДНК, став т его на лед ную баню на 1 ч, изредка перемешива м гким встр хиванием. Все растворы и штативы с пробирками держатa) Preparation of an extempore 0.05% DNA solution in 0.1 M acetate buffer: lightly stirring the colloidal DNA solution, placing it in an ice bath for 1 hour, occasionally stirring with gentle shaking. All solutions and test tube racks hold

5 на лед ной бане и хран т в холодильнике. Затем раствор ДНК перед употреблением щад ще центрифугируют.5 in an ice bath and stored in the refrigerator. Then, the DNA solution is centrifuged before use.

б)Подготовка сыворотки: забор крови производ т натощак свободным вытекани0 ем (одной только иглой). Сыворотку быстро отдел ют и держат на лед ной бане. Перед употреблением ее развод т лед ным физраствором в 10 раз (1:9 по объему), перемешивают путем сильного встр хивани иb) Preparation of serum: blood sampling is performed on an empty stomach by free flowing out (with a needle only). The serum is quickly separated and kept in an ice bath. Before use, it is diluted with ice-cold saline 10 times (1: 9 by volume), mixed by vigorous shaking and

5 отсасывают пастеровской пипеткой образующуюс пену, которую отбрасывают. Разведенную сыворотку держат на лед ной бане.5, the resulting foam is sucked off with a Pasteur pipette and discarded. The diluted serum is kept in an ice bath.

II.Проведение анализа.II.Analysis.

1). Разлив реактивов производ т в поли- 0 этиленовые пробирки (объемом 3,5-4 мл) в лед ной бане в следующем составе и пор дке:1). Reagents are bottled in polyethylene ethylene tubes (volume 3.5–4 ml) in an ice bath in the following composition and order:

а)опытные пробы: (5 параллелей) - к 1 мл 0,05% раствора ДНК приливают 1 млa) experimental samples: (5 parallels) - 1 ml is added to 1 ml of a 0.05% DNA solution

5 разбавленной в 10 раз сыворотки;5 diluted 10 times serum;

б)контроль I (5 параллелей) - на содержание нуклеотидов в растворе ДНК: к 1 мл физраствооа приливают 1 мл 0,05% раствора ДНК.b) control I (5 parallels) - on the content of nucleotides in a DNA solution: 1 ml of a 0.05% DNA solution is added to 1 ml of saline.

0 в) контроль II (5 параллелей) (на количественное содержание перхлорнераствори- мой фракции в сыворотке крови): к 1 мл ацетатного буфера приливают 1 мл разбавленной в 10 раз сыворотки кроаи;0 c) control II (5 parallels) (for the quantitative content of the perchloro-insoluble fraction in blood serum): 1 ml of diluted 10 times diluted blood serum is added to 1 ml of acetate buffer;

5 2), Инкубаци после перемешивани путем тщательного встр хивани всех проб при 37°С в течение 30 мин на вод ной бане. 3). Остановка ферментативной реакции путем быстрого помещени всех проб в лед ную баню и быстрого добавлени в кэхдую пробу по 1 мл раствора НС1См(до конечной концентрации в реакционной смеси 0,5 М Н.СЮд). После тщательного встр хивани пробы оставл ют на 1 ч в лед ной бане дл лучшего формировани осадка.5 2), Incubation after stirring by thoroughly shaking all samples at 37 ° C for 30 minutes in a water bath. 3). Stop the enzymatic reaction by quickly placing all samples in an ice bath and quickly adding 1 ml of HC1Cm solution to the cached sample (to a final concentration in the reaction mixture of 0.5 M N.Ciud). After thorough shaking, the samples are left for 1 hour in an ice bath for better sedimentation.

4). Центрифугирование при 4000 об/мин в течение 10 мин,4). Centrifugation at 4000 rpm for 10 min,

5). Слив надосадочной жидкости и спек- трофотомегрирование при 260 нм.5). Drain supernatant and spectrophotomerization at 260 nm.

6). Расчет магнийнезависимой ДНКаз- ной активности и выражени показател количественного содержани перхлорнора- стеоримой фракции сыворотки(ПФС) крови:6). Calculation of magnesium-independent DNase activity and expression of a quantitative indicator of the perchloro-rara-storable fraction of serum (PPS) of blood:

а) рассчитывают истинную оптическую плотность в экстинкци х опытной пробы (ДЕ0) путем вычитани из среднеарифметического показател оптической плотности опыта суммы среднеарифметических пока- спелей плотности обоих контролен I и II по формулеa) calculate the true optical density in the extinctions of the experimental sample (DE0) by subtracting from the arithmetic mean of the optical density of the experiment the sum of the arithmetic mean density indices of both controls I and II according to the formula

(Ек1 + Еки).(Ek1 + Eki).

Обнаружение положительной ферментативной активности следует считать со значени ДЕ0 20 Е и выше с учетом расхождени в параллельных пробах (±10Е) и возможной ошибки прибора (±5 - 10 Е). ДНКазную активность условно можно выражать в величинах АЕо в экстинкци х.The detection of positive enzymatic activity should be considered with a DE0 value of 20 E and above, taking into account the discrepancy in the parallel samples (± 10E) and the possible error of the device (± 5 - 10 E). DNase activity can conditionally be expressed in terms of AEo in extinctions.

По международной системе СИ производ т расчет в мкмоль/(л мин) кислотораст- воримых нуклеотидов, образовавшихс за 1 мин инкубации 1 л сыворотки крови с субстратом ДНК. Количество мкмолей кислото- растворимых продуктов гидролиза ДНК наход т по калибровочной кривой, построенной дл АМФ или по коэффициенту пересчета К, выведенному по этой кривой.The international SI system calculates, in µmol / (L min), acid-soluble nucleotides formed after 1 minute incubation of 1 L of blood serum with a DNA substrate. The number of micromoles of acid-soluble DNA hydrolysis products is found from the calibration curve constructed for AMP or from the conversion factor K derived from this curve.

Расчет по формуле:Calculation according to the formula:

АЕОХ 10000 х КAEOX 10000 x K

30thirty

где 10000 - пересчет объема 0.1 мл сыворотки крови в реакционной смеси на 1 л сыворотки; 30 - количество минут инкубации проб.where 10000 is the conversion of the volume of 0.1 ml of blood serum in the reaction mixture to 1 l of serum; 30 - the number of minutes of incubation of samples.

Показателем количественного содержани перхлорнорастворимой фракции в сыворотке крови (ПФС) служит среднеарифметический показатель оптический плотности контрол И, выраженный в экстинкци х.The arithmetic mean of the optical density of control I, expressed in extinctions, serves as an indicator of the quantitative content of the perchlorinated soluble fraction in blood serum (PPS).

Изобретение иллюстрируетс следующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.

Пример 1. Больна В., 1933 года рождени , ист. болезни № 2334/м, прооперирована в гинекологическом отделении Ростовского НИИ онкологии с диагнозом: рак тела матки, стади II; гистоанализ: аде- нокарцинома тела матки с инвазией мышечного сло (№ гистоанализа: 290 269-78).Example 1. Sick B., born in 1933, East. disease number 2334 / m, operated on in the gynecological department of the Rostov Research Institute of Oncology with a diagnosis of uterine body cancer, stage II; histoanalysis: adenocarcinoma of the uterine body with invasion of the muscle layer (No. histoanalysis: 290 269-78).

Диагностический анализ крови до операции: от 15.03.88.Diagnostic blood test before surgery: from 03.15.88.

ДНКазна активность 0.756 мк моль/л/мин, показатель ПФС - перхлорно- 5 растворимой фракции сыворотки 0,162 Е.DNase activity 0.756 μmol / l / min, PPS indicator - perchloro-5 soluble fraction of serum 0.162 E.

Пример 2. Больна М., 1922 года рождени , истори болезни № 7073/Ф, прооперирована в институте, в гинекологическом отделении, с диагнозом: кистомаExample 2. Patient M., born in 1922, medical history No. 7073 / F, was operated on at the institute, in the gynecological department, with a diagnosis of cystoma

0 правого ичника и миома матки (№ гистоанализа 236 496-502).0 of the right ovary and uterine fibroids (No. histoanalysis 236 496-502).

Диагностический анилиз: кровь до операции от 22.06.88.Diagnostic analysis: blood before surgery from 06.22.88.

ДНКазна активность 0; показательDNase activity 0; index

5 ПФС 0,065 Е.5 PPS 0,065 E.

Пример 3. Больна Т., 1935 года рождени , N° ист. болезни 501/Ф. прооперирована в гинекологическом отделении института с диагнозом: рак ичников, стади Example 3. Sick T., born in 1935, N ° East. disease 501 / F. operated on in the gynecological department of the institute with a diagnosis of ovarian cancer, stad

0 IV. Гистоанализ Nfe 228 566-79: цистодено- карцинома с метастазами в большой сальник . Диагностический анализ крови от 14.01.88 до операции: ДНКазна активность 0. показатель ПФС 0,218 Е.0 IV. Histogram Nfe 228 566-79: cystodenocarcinoma with metastases in the greater omentum. Diagnostic blood test from 01/14/88 before surgery: DNase activity 0. indicator PPS 0.218 E.

5Доказательства положительного эффекта , предлагаемого способа представлены в табл 2.5 Evidence of the positive effect of the proposed method are presented in table 2.

Эффективность способа диагностики, способа определени злокачественногоThe effectiveness of the diagnostic method, the method for determining malignant

0 процесса. состоит в его высокой чувствительности (96%) при достаточной точности (82.7%) к наличию злокачественного роста в организме больного и, следовательно, высокой степени вы вл емое™ онкологических0 process. consists in its high sensitivity (96%) with sufficient accuracy (82.7%) to the presence of malignant growth in the patient's body and, therefore, a high degree of detectable oncological

5 заболеваний. За вл емый способ отличаетс простотой выполнени , небольшой затратой времени (на обследование 2-4 человек не более 3 ч) - анализы идут параллельно , не требу ют использовани сложной,5 diseases. The claimed method is notable for its simplicity, a small expenditure of time (for examination of 2-4 people no more than 3 hours) - the analyzes run in parallel, do not require the use of complex,

0 уникальной аппаратуры, и может найти широкое применение при диспансеризации населени как диагностический метод скриннинга (выбора) по определению наличи злокачественного новообразовани в0 unique equipment, and can be widely used in clinical examination of the population as a diagnostic method of screening (selection) to determine the presence of malignant neoplasms in

5 организме человека с целью вы влени лиц, нуждающихс в тщательном онкологическом обследовании и дальнейшем проведении специфического лечени .5 of the human body in order to identify individuals who need a thorough oncological examination and further specific treatment.

Claims

The claims

0 A method for determining the presence of a malignant process by biochemical examination of blood serum, characterized in that, in order to increase accuracy and expand functional

5 possibilities of the method, in the blood serum of the patient, magnesium-independent DNase activity is determined at pH 5.0-7.5 and the quantitative content of the perchloro-soluble fraction spectrophotometrically at 260 nm, and with DNase activity

determine the presence of a malignant process, in the absence of a magnesium-independent DNA-active activity and at the same time increase the quantitative content of the perchloro-soluble fraction to 0.118 U or more, determine the presence of a malignant process with metastasis.

Table Ј

The number of false negative and false positive answers for diagnostic tests performed by the proposed method

Editor G, Velska

Tehred M. Morgenthal

Order 4120 Mintage

VNIIP1 / 1 of the State Committee for Inventions and Discoveries under the USSR SCST 113035, Moscow, Zh-35. Rauska nab., 4/5

Proofreader O. Kravtsova