RU158177U1 - Трансплантат для стимуляции регенерации гепатоцитов - Google Patents

Abstract

1. Трансплантат для стимуляции регенерации гепатоцитов, содержащий матрикс, отличающийся тем, что матрикс выполнен из титана с нанесенным с двух сторон кальцийфосфатным покрытием с индексом шероховатости поверхности Ra в диапазоне 1-9 мкм и диаметром пор от 2-10 мкм.2 Трансплантат по п. 1, отличающийся тем, что покрытие матрикса содержит предварительно нанесенный костный мозг донора.3. Трансплантат по п. 1, отличающийся тем, что матрикс выполнен в виде диска, пирамиды, цилиндра, параллелепипеда.

Description

Полезная модель относится к регенеративной медицине, а именно к трансплантатам для стимуляции регенерации гепатоцитов и может быть использована для коррекции структурно-функциональных нарушений печени.

Разработка новых средств стимуляции регенерации печени, в первую очередь, ее физиологической компоненты, является одной из важнейших социально-экономических задач антивозрастной (регенеративной) медицины, направленной на сохранение активного долголетия в условиях увеличения среднего возраста населения планеты.

Известен широкий спектр средств, прежде всего лекарственных препаратов: биотехнологических (гормоны, рекомбинантные факторы роста клеток, цитокины, биологически активные вещества и т.п.) и клеточных составов, способных оказывать стимулирующее влияние на рост и регенерацию гепатоцитов, функциональную активность печени, прежде всего, при репаративной и патологической регенерации органа.

С точки зрения клеточных технологий, известно использование трансплантатов для лечения любых хронических заболеваний, включая жировую дистрофию печени [Shumakov V.I., Gureev S.V., Onischenko N.A., Temnov A.A. Method for treating chronic illnesses (variants), method for producing a biograft (variants) and a biograft (variants): WO 2007091919 (A1) - 2007-08-16].

Известно использование клеточного трансплантата, который вводят в организм самостоятельно или имплантируют подложку (матрикс) с предварительно подсаженным вне организма клеточным трансплантатом. Подобные способы значительно продлевают срок службы клеточных трансплантатов, которые функционируют по типу “интракорпоральная вспомогательная печень”.

Матрикс (подложка) - основа для структуры обеспечивающей механическую поддержку клеток и транспорт химических веществ. В состав, например, внеклеточного матрикса входит множество других компонентов: белки фибрин, эластин, а также фибронектины, ламинины и нидогены; в состав внеклеточного матрикса костной ткани входят минералы, такие как гидроксиапатит. Матриксы могут быть выполнены из различных химических веществ и соединений.

Для получения трансплантата матрикс предпочтительно заранее заселяют специфичными для данной ткани клетками, клетками-предшественниками, клетками костного мозга, периферической крови, жировой ткани и/или фиброзной ткани, например зрелыми клетками-предшественниками из костного мозга взрослых людей. Предварительное заселение приводит к тому, что процесс регенерации начинается уже in vitro, а после имплантации матрикса в организм время регенерации in vivo сокращается.

Наиболее близким к предлагаемому является трансплантат для лечения печеночной недостаточности используемый для доставки аутологичных клеток печени и прогениторных клеток костного мозга [Патент РФ на изобретение №2425648 от 10.08.2011]. Трансплантат представляет собой трехмерный матрикс, выполненный из биодеградируемого полимерного материала. На первом этапе проводят сокультивирование аутологичных клеток печени и прогениторных клеток костного мозга в течение 2-3 суток. После этого проводят иммобилизацию смеси аутологичных клеток печени и прогениторных клеток костного мозга на носитель - биодеградируемый полимерный трехмерный матрикс. После этого обеспечивают введение трансплантата в брыжейку тонкой кишки.

В качестве матрикса использовали биоматериал, созданный на основе полиоксибутирата (3-оксибутирата) - ЭластоПОБ. Полиоксибутират - гомополимер, синтезируемый различными видами прокариотических клеток. Они являются субстратом эндогенного дыхания и поддерживают жизнеспособность клеток в неоптимальных условиях среды (Севастьянов В.И., Перова Н.В., Довжик И.А., Титушкин И.А., Немец Е.А., Беломестная З.М., Шишацкая Е.И., Волова Т.Г. Медико-биологические свойства полиоксиалканоатов - биодеградируемых бактериальных полимеров // Перспективные материалы, 2001, №5. - С. 46-55; Sevastianov V.I., Perova N.V., Shishatskaya E.I., Kalacheva G.S., Volova T.G., Production of purified polyhydroxyalkanoates (PHAs) for applications in contact with blood. J. Biomater. Sci. Polymer Edn., 2003, V. 14(10). - P. 1029-1042; Volova Т., Shishatskaya E., Sevastianov V., Efremov S., Mogilnaya O., Results of biomedical investigations of PHB and PHB/PHV fibers, Biochem. Eng. J., 2003, №3736. - P. 1-9). Основным компонентом ЭластоПоБ является биодеградируемый бактериальный сополимер β-оксибутирата и β-оксивалерата (ПОБ-со-ПОВ) с включением оксивалерата 15÷30 мол. % (M_w=295-360 КДа, кристалличность 50-60%), полученный из Института биофизики СО РАН, г. Красноярск. В состав ЭластоПоБ входит также высокомолекулярный гидрофильный пластификатор (ВГП), повышающий гидрофильность и эластичность материала. Используемые матриксы ЭластоПОБ имели следующие размеры и параметры: диаметр пористой губки - 10±2 мм; толщина - 1,2±0,5 мм; масса - 6,0-12,0 мг. Пористость - не менее 95±2%. Размер макропор - 300±100 мкм.

Однако, вызывает сомнения эффективность использования предлагаемого матрикса для экзогенных клеток печени. Эксперименты авторов предлагаемой полезной модели на мышах показали, что подкожное введение даже сингенных - от животных одной линии, гепатоцитов с использованием подложки неэффективно для длительной стимуляции регенерации печени, поскольку через 45 суток после имплантации происходит их гибель и полная утилизация макрофагами. На препаратах взамен клеток печени обнаруживаются гемосидерофаги, кровеносные сосуды, соединительная и жировая ткани, замещающие ткань печени (Фиг. 1).

К недостаткам известного транплантата относятся:

- дороговизна и сложность подготовительных процедур вне организма (до 7-10 этапов манипуляций с клетками), требующих высококлассного специализированного оборудования и квалифицированного персонала, повышенный риск инфицирования клеточного материала;

- воспалительная реакция на трансплантат

- малая выживаемость введенных гепатоцитов или других клеток вследствие нарушения кровообращения в трансплантате, особенно на фоне фиброза печени;

- использование фармакологических препаратов, увеличивающих нагрузку на восстанавливающуюся печень;

- травматичный путь введения трансплантата с использованием полостной операции, или эндоскопического или лапароскопического введения в брыжейку тонкой кишки, в портальную или пупочную вену или паренхиму печени, возможность осложнений (кровотечение, тромбообразование, нагноение, риск опухолевой трансформации и т.п.), необходимость навигации для доставки трансплантата (под контролем УЗИ или эндоскопа), что использование устройства только в специализированных отделениях, занимающихся лечением и коррекцией печеночной недостаточности, с привлечением высококвалифицированных специалистов;

- коррекция печеночной недостаточности происходит за счет пролиферации и функционирования введенных извне гепатоцитов (заместительная терапия), при этом не доказана стимуляция регенерации гепатоцитов в поврежденной печени;

- ограниченная область применения, обусловленная тем, что отсутствуют сведения о применении биотрансплантата для дистантной стимуляции регенерации гепатоцитов

- пористая структура матрикса обуславливает его недостаточную прочность, снижает эффективность процесса регенерации из-за недостаточного по длительности срока пребывания в организме.

Новый технический результат - повышение регенераторного потенциала эндогенных гепатоцитов на протяжении длительного срока при дистантной стимуляции регенерации гепатоцитов, сокращение осложнений, снижение затрат, повышение удобства пользования.

Для решения поставленной задачи трансплантат для стимуляции регенерации гепатоцитов содержит матрикс, несущий клетки костного мозга, причем, матрикс выполнен из титана, с нанесенным с двух сторон кальцийфосфатным покрытием с индексом шероховатости поверхности Ra в диапазоне 1-9 мкм и диаметром пор от 2-10 мкм, несущий предварительно нанесенный сингенный костный мозг.

Также, матрикс трансплантата выполнен в виде диска, пирамиды, цилиндра, параллелепипеда.

Также, трансплантат содержит матрикс, выполненный из титана, с нанесенным с двух сторон кальцийфосфатным покрытием с индексом шероховатости поверхности Ra в диапазоне 1-9 мкм и диаметром пор от 2-10 мкм

Преимущества предлагаемого трансплантата:

- малая инвазивность при введении в организм;

- создание с помощью геометрических свойств и соответствующих технических параметров материала матрикса адекватных условий для врастания кровеносных сосудов, что способствует запуску процесса дистанционной стимуляции регенерации гепатоцитов, а также пролонгирует условия необходимые для жизнеобеспечения посаженных клеток;

- создание с помощью геометрических свойств и соответствующих технических параметров материала трехмерного матрикса условий для пролиферации, дифференцировки и созревания стромальных и кроветворных клеток костного мозга, формирования костной и кроветворной тканей;

- использование аутологичных (сингенных) клеток взрослых доноров, которые предупреждают нежелательную активацию иммунной системы, позволяют этой системе оказывать в организме длительное биорегуляторное воздействие, так как не используются ткани и/или клеточный материал эмбрионов человека;

- применение костного мозга, который в процессе ремоделирования и репаративной регенерации (на матриксе остаются донорские стромальные клетки, стволовые кроветворные клетки реципиента через врастающие кровеносные сосуды постепенно замещают погибающие кроветворные клетки пересаженного костного мозга) способствует установлению системы прямых и обратных связей с организмом хозяина, за счет чего регенерация гепатоцитов становится контролируемой.

Выбор костного мозга определяется следующими фактами:

- высокое содержание стволовых клеток;

- устойчивость к гипоксии, способность клеток выживать до момента врастания кровеносных сосудов в трансплантат;

- высокая активность регенераторных процессов (быстро пролиферирующая клеточная система) и способность к ремоделированию.

- активная секреция многочисленных биологически активных веществ и цитокинов, стимулирующих регенерацию различных клеток, включая гепатоциты (описано выше).

Выбор подложки (матрикса) определяется следующими фактами

- биосовместимость, так как фосфаты кальция аналогичны таковым в костях;

- многофункциональность (выполняет одновременно функции матрикса и стимулирует регенерацию костного мозга);

- достаточная механическая прочность для подкожного применения;

- шероховатая структура, обеспечивающая процессы неоваскуляризации имплантата, способствующая прикреплению и росту клеток (“up-growth”), активирующая их регенерацию;

- возможность стерилизации стандартными способами без изменения медико-технических свойств;

- способность к постепенной биодеградации;

- фосфаты кальция разрешены к клиническому применению.

При этом использование троакаров различного диаметра для подкожного (внутримышечного) введения трансплантатов позволяет легко применять разработанный трансплантат в клинической практике, поскольку троакаром владеет большинство хирургов и травматологов.

Устройство работает следующим образом

В качестве матрикса трансплантата применяли из титана (10×10×1 мм³), несущий двустороннее кальцийфосфатное покрытие, выполненный в форме, диска, пирамиды, цилиндра, параллелепипеда Оптимальным оказалось использование матрикса с индексом шероховатости поверхности покрытия Ra - в диапазоне 1-9 мкм.

Выбор технических параметров биотрансплантата основан на анализе результатов экспериментальных исследований. В качестве экспериментальных животных использовали мышей-самцов линии BALB/c, а также, лабораторные крыс, кроликов

Для получения трансплантата покрытие на матрикс нанесили с помощью анодно-искрового оксидирования в водном растворе 10-20% ортофосфорной кислоты с добавлением гидроксиапатита (ГАП) и карбоната кальция; микроплазменной технологии в электролите на основе истинного раствора кальция и полифосфатов щелочных металлов; плазменно-электролитическим оксидированием в цитрат-фосфатном и ацетат-фосфатном электролитах; шликерной технологии; детонационно-газовым методом. Объемные изделия получали путем холодного прессования с последующим отжигом порошка фосфатов кальция с добавлением порообразователя по известной методике.

Соотношение кальция к фосфору варьировало в пределах значений <1 до 1,67 и более (определяли на сканирующем электронном микроскопе Quanta 200 ESEM FEG со встроенным EDX-анализатором Genesis 4000). Соответственно, фазовый состав (определенный с помощью рентгеновского дифрактометра Shimadzu XRD-7000, Япония) варьировал от примитивных фаз фосфатов кальция, например, дикальцийфосфата, до трикальцийфосфата (ТКФ) и гидроксилапатита (ГАП);

Индекс шероховатости поверхности Ra (согласно ГОСТ 2789-73) выбран в диапазоне 1-9 мкм (определяли с помощью профилометра-296).

2) Костный мозг выделяли из костей (бедренной, берцовой, подвздошной, грудины и т.п.) путем аспирации, трепанобиопсии, стернальной пункции, размещали на подложке, например, с помощью шприца, автоматического дозатора, культивировали не более 1 часа при 35-37°C в синтетической питательной среде для культивирования клеток (например, ДМЕМ, MEM, RPMI-1640, F12 и т.п.) [Введение в методы культуры клеток, биоинженерии органов и тканей / Под ред. В.В. Новицкого, В.П. Шахова, И.А. Хлусова. - Томск: STT, 2004. - 386 с - С. 37-40; С. 141-143; с. 297-300].

3) вводили транстплантат, как без насыщения клетками, так и предварительно насыщенный клетками, под местным или системным обезболиванием подкожно или внутримышечно, например, с помощью троакара через малый разрез.

В постоперационном периоде, через 1-6 недель после введения, получали материал печени при вскрытии, готовили тонкие гистологические срезы ткани, фиксировали и окрашивали общепринятыми методами, на гистологических препаратах отмечали статистически значимое увеличение количества (доли) двуядерных и многоядерных гепатоцитов на срезе на протяжении продолжительного периода исследований или жизнедеятельности организма.

Эффективность применения трансплантата иллюстрируется следующим примером. Пример 1.

Мышам-самцам линии BALB/c под эфирным наркозом подкожно, через срединный разрез кожи, вводили по 1 трансплантату, включающему матрикс из титана (10×10×1 мм³), несущий двустороннее кальцийфосфатное покрытие, выполненный в форме диска, пирамиды, цилиндра, параллелепипеда анодно-искровым способом в водном растворе 20% ортофосфорной кислоты с добавлением ГАП и карбоната кальция (1-3 недели эксперимента); микроплазменной технологии в электролите на основе истинного раствора кальция и полифосфатов щелочных металлов (4-я неделя); плазменно-электролитическое оксидирование в цитрат-фосфатном и ацетат-фосфатном электролитах (5-6-я недели).

Индекс шероховатости кальцийфосфатной поверхности Ra составил 0,86-9,15 мкм (табл. 1), диаметр пор варьировал в диапазоне 1-20 мкм. Фазовый состав покрытия варьировал от рентгеноаморфных фосфатов кальция (CaP₄O₁₁; Ca₂P₄O₇ и др.) до ТКФ (Ca₃(PO₄)₂) и ГАП (Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂).

До введения животным на часть матриксов в асептических условиях наносили сингенный костный мозг выделенный из бедренной (берцовой) кости мышей по известной методике [Шахов В.П., Хлусов И.А., Дамбаев Г.Ц., Зайцев К.В., Егорова А.Б., Шахова С.С., Загребин Л.В., Волгушев С.А. Введение в методы культуры клеток, биоинженерии органов и тканей / Под ред. В.В. Новицкого, В.П. Шахова, И.А. Хлусова. - Томск: STT, 2004. - 386 с - С. 141-143]. Костный мозг служил источником стволовых клеток и ростовых факторов. Для адгезии клеток органную культуру костного мозга на подложке перед введением животным культивировали в течение 45 мин в культуральной среде DMEM/F12 в асептических условиях.

Использовали по 5 мышей в контрольной и подопытной группах в каждой точке эксперимента. Ложнооперированную группу составили 8 животных.

Через 1-6 недель животных умерщвляли эфирным наркозом, трансплантаты извлекали, тканевые пластинки, выросшие из нанесенного in vitro костного мозга, снимали с поверхности кальцийфосфатных подложек. Также, забирали часть печени для гистологического анализа методом световой микроскопии тонких (толщина менее 10 мкм) срезов. Тканевые пластинки фиксировали в 10% нейтральном формалине, декальцинировали, затем пластинки и части печени заливали парафином и выполняли тонкие (10 мкм) срезы перпендикулярно поверхности имплантатов, окрашивали гематоксилином-эозином по стандартной методике. Результаты выражали как среднее значение и ошибка среднего (M±m).

В гистологических срезах тканевых пластинок отмечали рост костного мозга и/или кости, срезы печени фотографировали с разрешением 8 мегапикселей. Количественную оценку регенераторных процессов проводили при помощи компьютерной морфометрии срезов печени на 10 цифровых микрофотографиях различных полей зрения [Автандилов Г.Г. Диагностическая медицинская плоидометрия. М.: Медицина, 2006. - 192 с]. Считали процент двуядерных гепатоцитов (Фиг 3) от общего количества печеночных клеток в поле зрения.

На Фиг 1 представлен гистологический состав тканевой пластинки, выросшей в подкожном тесте на шероховато-пористой кальцийфосфатном матриксе из костного мозга донора, нанесенного in vitro. (1) - красный костный мозг; (2) - костная ткань; (3) - просвет кровеносного капилляра. Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение 200.

Результаты показали, что в случае подкожной имплантации матриксов, несущих костный мозг донора, в 75-85% случаев на них формировались тканевые пластинки, которые состояли из грубоволокнистой костной ткани (Фиг. 2), замещающей базофильные участки хряща, в лакунах которой могут располагаться элементы кроветворной, жировой и соединительной тканей с выраженной васкуляризацией. При подкожном введении мышам фрагментов костного мозга без матриксов образования тканевых пластинок не наблюдалось.

Фигура 2 - Микрофотография среза печени. Стрелками отмечены двуядерные формы гепатоцитов. Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение 400.

При подкожном введении матриксов без костного мозга (контрольная группа) тканевые пластинки не формировались. Однако, поверхность кальцийфосфатного материала прорастала кровеносными сосудами реципиента (Фиг. 4). Незначительный диаметр пор материала (максимальный диаметр менее 10 мкм, средний диаметр 2 мкм) не позволял клеткам и кровеносным сосудам врасти внутрь.

Фигура 3 - Кровеносные капилляры на кальцийфосфатной подложке без костного мозга донора в подкожном тесте на мышах. Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение 400.

Исследование регенераторной активности печени (табл. 1) показало, что у ложнооперированных животных, которым не вводили трансплантаты, средняя доля двуядерных гепатоцитов составила 13,5±0,66% (ложнооперированные животные, исходный уровень). Введение кальцийфосфатных подложек без костного мозга (контроль) при индексе шероховатости поверхности Ra=1-9 мкм вызывало статистически значимое (P<0,05 согласно t-критерию Стьюдента) увеличение (до 116-158% от исходного) показателя на 2-6-й неделях после операции. Фазовый состав фосфатов кальция (соответственно, соотношение кальция к фосфору) при этом варьировал в широких пределах (табл. 1). Добавление костного мозга на матриксы трансплантатов (опыт) приводило к повышенному уровню (до 113-180% от исходного, P<0,05 согласно t-критерию Стьюдента) двуядерных гепатоцитов на протяжении всех 6 недель (P<0,05 согласно Т-критерию Вилкоксона) в сравнении как с исходным значением, так и показателями у контрольных (подложка без костного мозга) мышей. В Таблице 1 представлены данные, характеризующие долю (%) двуядерных гепатоцитов в печени мышей в динамике регенерации после подкожной имплантации трансплантатов, включающих кальцийфосфатных матриксы (контроль), несущих нанесенный in vitro сингенный костный мозг (опыт), M±m

Примечание: ∗) - статистически значимые различия (P<0,05) с ложнооперированными животными согласно t-критерию Стьюдента; P_Т - статистические различия между соответствующими значениями опыта и контроля в 1-6 недели исследования согласно Т-критерию Вилкоксона.

Таким образом, на фоне ложнооперированных животных, малоинвазивное подкожное введение трансплантатов выполненных в виде матриксов с шероховатой поверхностью, несущей фосфаты кальция, в диапазоне индекса шероховатости поверхности Ra=1-9 мкм вызывает отдаленное (дистантное) регуляторное воздействие на печень реципиента, приводящее к длительной стимуляции регенерации гепатоцитов, одним из механизмов которой может быть регенерация капиллярного русла не только в месте имплантации, но и в ткани печени.

Предварительно нанесенный на матрикс трансплантата костный мозг донора усиливает и пролонгирует местные регенераторные процессы, что приводит к формированию на матриксах трансплантатов системы тканей с богатым кровоснабжением. При этом значительно возрастает (по амплитуде и продолжительности действия) дистантный стимулирующий эффект на регенерацию гепатоцитов.

Продолжительность регенераторного эффекта 1 процедуры введения трансплантата от 4-х до 6-и недель у мышей при пересчете через среднюю продолжительность жизни (70 лет у людей и 2-3 года у мышей) может составить до 210 недель у человека. При этом достигается универсальность, экономичность и удобство пользования.

Таким образом, предлагаемая полезная модель перспективна для практического применения в клинической практике.

Приложение

Фигура 1 - Гистологический состав тканевой пластинки, выросшей в подкожном тесте на шероховато-пористой кальцийфосфатной подложке из костного мозга донора, нанесенного in vitro. (1) - красный костный мозг; (2) - костная ткань; (3) - просвет кровеносного капилляра. Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение 200.

Фигура 2 - Микрофотография среза печени. Стрелками отмечены двуядерные формы гепатоцитов. Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение 400.

Фигура 3 - Кровеносные капилляры на кальцийфосфатной подложке без костного мозга донора в подкожном тесте на мышах. Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение 400.

Таблица 1 - Доля (%) двуядерных гепатоцитов в печени мышей в динамике регенерации после подкожной имплантации кальцийфосфатных подложек (контроль), несущих нанесенный in vitro сингенный костный мозг (опыт), M±m

Примечание: ∗) - статистически значимые различия (P<0,05) с ложнооперированными животными согласно t-критерию Стьюдента; P_т - статистические различия между соответствующими значениями опыта и контроля в 1-6 недели исследования согласно Т-критерию Вилкоксона.

Claims (2)

1. Трансплантат для стимуляции регенерации гепатоцитов, содержащий матрикс, отличающийся тем, что матрикс выполнен из титана с нанесенным с двух сторон кальцийфосфатным покрытием с индексом шероховатости поверхности Ra в диапазоне 1-9 мкм и диаметром пор от 2-10 мкм.

2 Трансплантат по п. 1, отличающийся тем, что покрытие матрикса содержит предварительно нанесенный костный мозг донора.

3. Трансплантат по п. 1, отличающийся тем, что матрикс выполнен в виде диска, пирамиды, цилиндра, параллелепипеда.

Images