RU1471559C

RU1471559C - Method of preparation of extracellular invertase from yeast

Info

Publication number: RU1471559C
Authority: RU
Inventors: В.М. Ушаков; А.Б. Циоменко; В.В. Лупашин; И.С. Кулаев; Б.А. Фихте
Original assignee: Институт Биохимии И Физиологии Микроорганизмов Ан Ссср
Priority date: 1987-01-19
Filing date: 1987-01-19
Publication date: 1993-11-30

Abstract

Изобретение позвол ет получать фермент из фильтрата культуральной жидкости пекарских дрожжей. С целью повышени выхода целевого продукта в среду культивировани в процессе выращивани дрожжей в начале и в конце логариф- fAwecKoR фазы роаа провод т обработку культу- рапьной жцдкэаи в баллистическом дезинтеграторе в рециркул ционном режиме до аепени разрушени клеток не более 15-20 мас.%. 1 идThe invention makes it possible to obtain an enzyme from a filtrate of a culture fluid of baker's yeast. In order to increase the yield of the target product into the culture medium during the cultivation of yeast, at the beginning and at the end of the logarithmic-fAwecKoR phase of the roaa, the culture lumps are processed in a ballistic disintegrator in a recirculation mode until the cell destruction reaches not more than 15-20 wt%. 1 id

Description

Изобретение относитс к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности, а кондитерской промышленности дл приготовлени некристаллизуемых начинок, в производстве безалкогольных напитков и кзк биохимический препарат.The invention relates to biotechnology and can be used in the microbiological industry, and in the confectionery industry for the preparation of non-crystallizable fillings, in the production of soft drinks and csk biochemical preparation.

Цель изобретени - повышение выхода целевого продукта.The purpose of the invention is to increase the yield of the target product.

Способ заключаетс в том, что дрожжи культивируют на среде, содержащей источники углерода и азота, до начала логарифмической фазы роста,провод т обработки в баллистическом дезинтеграторе в рециркул ционном рехшме. продолжают культивирование до конца логарифмической фазы роста, повтор ют дезинтеграцию и культивируют дрожжи до максимального накоплени инвертазы в среде.The method consists in the fact that the yeast is cultivated on a medium containing sources of carbon and nitrogen, before the start of the logarithmic growth phase, the treatments are carried out in a ballistic disintegrator in a recirculation rech. cultivation is continued until the end of the logarithmic growth phase, disintegration is repeated, and yeast is cultured to maximize invertase accumulation in the medium.

Обработка культуральной жидкости в баллистическом дезинтеграторе в рецирку ЛЯЦ1ЛОННОМ режиме не приводит к нарушению {или временной остановке) процесса культивировани . В момент дезинтеграц /1и происходит разрушение части клеток не более 15-20 мас.%, которые через 2-3 ч культивировани не обнаруживаютс . Содержимое разрушенных клеток выходит в среду, за счет чего, веро тно, может интенсифицироватьс как рост культуры, так и синтез ферментов, в том числе и инвертазы. Остальные клетки в попул ции сохран ют свою жизнеспособность, чем и оОь сн етс отсутствие нарушени роста культуры. Однако , как показывает электронна микроскопи , клеточна стенка этих клеток видоизмен етс , что, по-видимому, и обуславливает нарушение св зи иивертазы с клеткой и выход основной ее массы в среду в процессе дальнейшего культивировани . Если в момент дезинтеграции разрушаетс более 20% клеток процесс проходит также с выходом инвертазы в среду, но увеличиваетс его длительность. Обработка культуральной жидкости о баллистическом дезинтеграторе может быть проведена и в другие моменты логарифмической фазы роста культуры, но осуществление ее предлагаемым способом (в начале и е конце лоКорифмической фазы роста) обеспечивает наилучшие результаты как по выходу инвертазы , так и по длительности процесса. Проведение дезинтеграции во врем стационарной фазы нецелесообразно, так как не приводит к дальнейшему увеличению содержани инвертазы в среде (см. чертеж). П р м м е р 1. Дрожжи Saccharomyces cerevH,lae Т-32 выращивают в 10-литровом ферментере (АК-10) с 5 л среды, содержащей г/л: пегпон 20. сахароза (TexH.)30.jBProcessing the culture fluid in a ballistic disintegrator into the LAC1-LONOR recirculator does not disturb (or temporarily stop) the cultivation process. At the time of disintegration / 1i, part of the cells is destroyed no more than 15-20 wt.%, Which after 2-3 hours of cultivation are not detected. The contents of the destroyed cells are released into the medium, due to which, probably, both the growth of the culture and the synthesis of enzymes, including invertase, can be intensified. The remaining cells in the population retain their viability, which explains the absence of impaired culture growth. However, as shown by electron microscopy, the cell wall of these cells undergoes a modification, which, apparently, causes a disruption in the connection of ivertase with the cell and the release of its bulk into the medium during further cultivation. If at the time of disintegration more than 20% of the cells are destroyed, the process also proceeds with the release of invertase into the medium, but its duration increases. Processing of the culture fluid with a ballistic disintegrator can be carried out at other moments of the logarithmic phase of growth of the culture, but its implementation by the proposed method (at the beginning and end of the loCorithmic growth phase) provides the best results both in terms of invertase yield and the duration of the process. Disintegration during the stationary phase is impractical because it does not lead to a further increase in the invertase content in the medium (see drawing). PRI me R 1. Yeast Saccharomyces cerevH, lae T-32 is grown in a 10-liter fermenter (AK-10) with 5 l of medium containing g / l: pegpon 20. sucrose (TexH.) 30.jB

качестве инокул та используют 2-суточную культуру, выращенную в колбах на той же среде. Режим ферментации: 80%. насыщени 02; 800 об/мин; рН 5,8. В процессе ферментации в начале логарифмической фазы роста дрожжей провод т обработку всего содержимого ферментера в баллистическом дезинтеграторе ФУГ-1 в течение 2 мин. Дезинтеграцию (обработку) провод т в импульсно-рециркул ционном режиме D течение 2 мин, скорость вращени ротора 1500 об/мин; абразивный материал - дивинилбензолстирол (микрошзрики дма- метром 200-300 мкм) в количестве 100 мл насыпного объема. Получающийс при этом нативный дезинтеграт с процентом разрушенных клеток не более 15-20 мас.% от общей биомассы подают в ферментер. Через 2-3 ч роста в ферментере не обнаружи- вают разрушенных клеток.A 2-day-old culture grown in flasks on the same medium was used as an inoculum. Fermentation mode: 80%. saturation 02; 800 rpm; pH 5.8. During the fermentation process, at the beginning of the logarithmic phase of yeast growth, the entire contents of the fermenter are processed in the FUG-1 ballistic disintegrator for 2 minutes. Disintegration (processing) is carried out in a pulse-recirculation mode D for 2 minutes, the rotor speed is 1500 rpm; the abrasive material is divinylbenzene styrene (microspheres with a diameter of 200-300 microns) in an amount of 100 ml of bulk volume. The resulting native disintegrate with a percentage of destroyed cells of not more than 15-20 wt.% Of the total biomass is fed to the fermenter. After 2-3 hours of growth, no destroyed cells were detected in the fermenter.

Накопление секретируемой инвертэзы после обработки с помощью баллистического дезинтегратора ФУГ-1 резко увеличиваетс в среде роста (см.чертеж). 5 3 конце логарифмической фазы роста вышеописанную процедуру повтор ют, Процесс культивировани продолжают до наступлени стационарной фазы роста (40 ч). Максимальна активность инвертэзы в 0 среде к этому моменту составл ет 26,5 Е/мл, удельна активность 13,2 Е/мг белка. Контроль. Осуществл ют, как описано в примере, но культивирование провод т по известному способу, т.е. без обработки 5 культуральной жидкости в процессе культивировани в баллистическом дезинтеграторе в рециркул ционном ремсиме. Максимальна активность инвертазы в среде составл ет 4,6 Е/мл. Больша часть ик- 0 вертазы остаетс св занной с клеткой (37,4 Е/мл), дл ее извлечени необходимо разрушение клеток, при этом удельна активность в получаемом дезиитегрэте составл ет 2,05 Е/мг бепка. 45 П р и м е р 2. Способ осуществл ют, как описано в примере 1, но в качестве продуцента используют д рожжи Saccharomyces cerevis aeD-15 (303-67 АТСС 26524). Процесс культивировани продо - 50 жают до наступлени стационарной фазы роста (30 ч). Максимальна активность иивертазы в среде к этому моменту 3,6 Е/мл, удельна активность 4,7 Е/мг белка.The accumulation of secreted invertase after treatment with the FUG-1 ballistic disintegrator increases dramatically in the growth medium (see drawing). 5 3 at the end of the logarithmic growth phase, the above procedure is repeated. The cultivation process is continued until the onset of the stationary growth phase (40 h). The maximum invertase activity in 0 medium at this point is 26.5 U / ml, specific activity 13.2 U / mg protein. Control. They are carried out as described in the example, but the cultivation is carried out by a known method, i.e. without treatment 5 of the culture fluid during cultivation in a ballistic disintegrator in a recirculation belt. The maximum invertase activity in the medium is 4.6 U / ml. Most of the IR-0 vertase remains bound to the cell (37.4 U / ml), cell destruction is required to extract it, and the specific activity in the resulting desiitegraate is 2.05 U / mg becap. 45 EXAMPLE 2. The method is carried out as described in Example 1, but Saccharomyces cerevis aeD-15 yeast (303-67 ATCC 26524) is used as producer. The cultivation process is continued until the onset of the stationary growth phase (30 hours). The maximum activity of ivertase in the medium at this point was 3.6 U / ml, specific activity 4.7 U / mg protein.

Примерз. Способ осуществл ют, как 55 описано о примере 1. но в качестве штамма- продуцентра используют Saccharomyces terres trls D-28, который выращивают в 100- литровом ферментере с 70 л среды, содержащей , г/л; пептон 20, сахароза (техн.) 20. В качестве инокуп та используют суточнуюSample The method is carried out as described in Example 55. Example 1. But as the producer strain, Saccharomyces terres trls D-28 is used, which is grown in a 100 liter fermenter with 70 L of medium containing, g / L; peptone 20, sucrose (tech.) 20. The daily allowance is used as inup

культуру, выращенную в колбах на той же среде. Режим ферментации: 80--90% насыщени Ог; 800 об/мин; рН 5,6. Максимальна активность инвертазы в момент выхода культуры в стационарную фазу роста (37 ч) составл ет 9,2 Е/мл; удельна активность 9,8 Е/мг белка.a culture grown in flasks in the same medium. Fermentation mode: 80-90% saturation of Og; 800 rpm; pH 5.6. The maximum activity of invertase at the moment the culture enters the stationary phase of growth (37 h) is 9.2 U / ml; specific activity of 9.8 U / mg protein.

П р и м е р 4. Способ осуществл ют, как описано в примере 1, но в качестве продуцента используют Saccharomycess carlsbergensls 48-16 ССУ, которые выращивают D 100-литровом ферментере с 70 л среды , содержащей, г/л: пептон 20, сахароза (техн.) 20. В качестве инокулпта используют 2-суточную культуру, выращенную в колбах на той же среде. Режим ферментации: 80- 85% насыщени Оа: 780 об/мин; рН 5,7. Максимальна активность инвертазы в момент выхода в стационарную фазу роста ( 12 ч) составл ет 16,8 Е/мл; удельна актив- ность 18,2 Е/мг белка.Example 4. The method is carried out as described in example 1, but Saccharomycess carlsbergensls 48-16 CCS are used as producer, which grow a D 100-liter fermenter with 70 l of medium containing, g / l: peptone 20 , sucrose (techn.) 20. As a inoculum, a 2-day-old culture grown in flasks on the same medium is used. Fermentation mode: 80-85% saturation Oa: 780 rpm; pH 5.7. The maximum invertase activity at the moment of entering the stationary phase of growth (12 h) is 16.8 U / ml; specific activity of 18.2 U / mg protein.

Таким образом, предлагаемый способ позвол ет увеличить выход фермента в среду , сократить продолжительность процесса культивировани с 72 до Q ч, т.е. в 1,8 раза. Thus, the proposed method allows to increase the yield of the enzyme in the medium, to reduce the duration of the cultivation process from 72 to Q h, i.e. 1.8 times.

Препарат иноертазы, полученный предлагаемым способом (удельна активностьInoertase preparation obtained by the proposed method (specific activity

13,2 Е/мг белка), содержит знзчителы с меньше посторонних белков и примесей других веществ в отличие от препаратов, получаемых выделением инвертазы непосредственно из клеток после их разрушени (2.05 Е/мг белка), что дает осиосание упростить процесс очистки фериентл.13.2 U / mg protein), contains counters with less extraneous proteins and impurities of other substances, in contrast to preparations obtained by isolating invertase directly from cells after their destruction (2.05 U / mg protein), which makes it easier to clean the enzyme.

Так как в предлагаемом способе используют хлебопекарные дрожжи, а пнпертаза накапливаетс в среде и дл ее выделени не требуетс разрушать биом ссу. то возникают предпосылки дл рассмотрени вопроса об использовании биомассы, остающейс после отделени жидкой фазы, содержащей внеклеточные ферменты, дл пищевых целей или дл выделени ценных внутриклеточных компонентов.Since baker's yeast is used in the proposed method, pnertase accumulates in the medium and it is not necessary to destroy biomass to isolate it. this creates prerequisites for considering the use of biomass remaining after separation of the liquid phase containing extracellular enzymes for food purposes or for the isolation of valuable intracellular components.

(56) Патент США N; 3887434, кл. С 12 D 13/10, 1975.(56) U.S. Patent N; 3887434, cl. C 12 D 13/10, 1975.

Tslomenko А.В., Lupasfiln V.V., Kulaev I.S. Export of enzymes In culture medium by jeast of Saccharomyces genus. In.: International sympozlum of extraceliular enzymes of microorganisms. Bechine castle. Czech, Abstracts, 1986, p,41-42.Tslomenko A.V., Lupasfiln V.V., Kulaev I.S. Export of enzymes In culture medium by jeast of Saccharomyces genus. In .: International sympozlum of extraceliular enzymes of microorganisms. Bechine castle. Czech, Abstracts, 1986, p, 41-42.

Claims

Formula of the invention 30

METHOD FOR PRODUCING EXTRACELLULAR INVERTASE FROM YEAST, including culturing a producing microorganism on a nutrient medium containing, .jg containing sources of carbon, nitrogen and water, to the maximum accumulation

invertase, characterized in that, in order to increase the yield of the target product, during cultivation at the beginning and at the end of the logarithmic growth phase, the culture fluid is treated in a ballistic disintegrator in a recirculation mode to achieve a degree

i cell disruption of not more than 15-20 wt.%.

- 1pt e / iyefiHfai.;

: o-se -permtitnwyke ipu and. / -.

(mt8itota lnett / temovteuuH8efmei. and KOHtnpoiHHOH eofutt mt.:

C - anmu8n (ffn SHfKffffttOVifa unStfieeiit .rS eavntneM (iafUtt ir№,

;,. } -Sfffenuf fffiUHfftftpstaa.

Wtm.w