RS65703B1 - Himerna i humanizovana anti-humana ctla4 monoklonska antitela i njihova upotreba - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na himerna i humanizovana antitela koja se vezuju za humani CTLA4 molekul i na postupke njihove upotrebe.

Stanje tehnike

[0002] Imuni sistem ljudi i drugih sisara je odgovoran za zaštitu od infekcija i bolesti. Takvu zaštitu obezbeđuje i humoralni imuni odgovor i imuni odgovor posredovan ćelijama. Humoralni odgovor rezultuje proizvodnjom antitela i drugih biomolekula koji su sposobni da prepoznaju i neutrališu strane mete (antigene). Nasuprot tome, ćelijski posredovan imuni odgovor uključuje aktivaciju makrofaga, neutrofila, prirodnih ćelija ubica (NK) i antigenspecifičnih citotoksičnih T-limfocita od strane T ćelija, i oslobađanje različitih citokina kao odgovor na prepoznavanje antigena.

[0003] Sposobnost T ćelija da optimalno posreduju u imunološkom odgovoru protiv antigena zahteva dve različite signalne interakcije. Prvo, antigen koji se nalazi na površini ćelija koje predstavljaju antigen (APC) mora biti prikazan naivnim T ćelijama specifičnim za antigen u obliku MHC: peptidnog kompleksa (1, 2). Takvo prikazivanje isporučuje signal preko T ćelijskog receptora (TCR) koji usmerava T ćeliju da pokrene imuni odgovor koji će biti specifičan za prikazani antigen. Drugo, niz kostimulativnih signala, posredovanih interakcijama između APC i različitih površinskih molekula T ćelija, pokreće prvo aktivaciju i proliferaciju T ćelija i na kraju njihovu inhibiciju (3-5). Dakle, prvi signal daje specifičnost imunološkom odgovoru, dok drugi signal služi za određivanje prirode, veličine i trajanja odgovora dok ograničava imunitet na sebe. Od posebnog značaja među ovim drugim signalnim molekulima je vezivanje između B7.1 (CD80) (6) i B7.2 (CD86) (7-9) liganda ćelije koja prikazuje antigen i CD28 i CTLA4 receptora (10-12) T-limfocita.

[0004] Citotoksični antigen T limfocita-4 (CTLA4) je prepoznat kao ključni regulator adaptivnih imunih odgovora, koji ima centralnu ulogu u održavanju periferne tolerancije i u oblikovanju repertoara nastalih T ćelijskih odgovora i, prema tome, terapijski cilj za lečenje od raka i upale. Pokazalo se da je lečenje anti-CTLA4 antitelima moćno sredstvo za jačanje antitumorskog imuniteta u pretkliničkim modelima (10). Monoterapija sa antitelom protiv CTLA4 promovisala je odbacivanje transplantabilnih tumora različitog porekla.

[0005] Na osnovu obećavajućih pretkliničkih studija modela tumora, klinički potencijal antitela protiv CTLA4 istražen je kod različitih maligniteta kod ljudi. Iako je anti-CTLA4 (Ipilimumab, koji se prodaje kao Yervoy) pokazao efikasnost u lečenju melanoma, lečenje i ciljanje CTLA4 je povezano sa autoimunom toksičnošću. Karakteristični neželjeni efekti inhibicije CTLA4 se generalno nazivaju neželjeni događaji povezani sa imunitetom (irAEs), a najčešći IRAE su kožni osip, hepatitis, kolitis i endokrinopatije, posebno hipopituitarizam. Stoga, postoji želja da se poboljša terapeutski potencijal anti-CTLA4 antitela povećanjem efikasnosti uz smanjenje povezanih irAE.

[0006] WO 2014/089113 A1 opisuje postupak za poboljšanje antitumorske efikasnosti Fc fuzionog proteina koji se specifično vezuje za metu, na primer, ko-inhibitorni ili ko-stimulativni receptor liganda, na T ćeliji kod subjekta koji boluje od raka ili bolesti uzrokovano infektivnim agensom i menja aktivnost imunomodulatorne mete, čime se potencira endogeni imuni odgovor protiv ćelija raka ili infektivnog agensa, pri čemu postupak obuhvata izbor, dizajniranje ili modifikaciju Fc regiona Fc fuzionog proteina tako da se pojačavaju vezivanje pomenutog Fc regiona za aktivirajući Fc receptor (FcR).

[0007] WO 2012/120125 A1 opisuje anti-CTLA4 antitelo koje inhibira vezivanje CTLA4 za humani B7, posebno, ono inhibira vezivanje CTLA4 za humani B7.1 i/ili humani B7.2.

[0008] CN 101628 940 A opisuje anti-CTLA-4 antitela i anti-4-1BB antitela.

[0009] US 2013/136749 A1 opisuje humanu sekvencu antitela protiv humanog CTLA-4 i postupak lečenja humanih bolesti, infekcija i drugih stanja korišćenjem ovih antitela.

[0010] May et al. opisuje da anti-humano CTLA-4 monoklonsko antitelo promoviše ekspanziju T-ćelija i imunitet u modelu hu-PBL-SCID ((May KF Jr, Roychowdhury S, Bhatt D, Kocak E, Bai XF, Liu JQ, Ferketich AK, Martin EW Jr, Caligiuri MA, Zheng P, Liu Y. Anti-human CTLA-4 monoclonal antibody promotes T-cell expansion and immunity in a hu-PBL-SCID model: a new method for preclinical screening of costimulatory monoclonal antibodies. Blood.

2005 Feb 1; 105(3):1114-20. doi: 10.1182/blood-2004-07-2561. Epub 2004 Oct 14. PMID: 15486062).

[0011] Još jedan fokus na polju imunoterapije i lečenja tumora je kombinacija različitih inhibitora provere imuniteta u cilju poboljšanja antitumorske aktivnosti, posebno protiv slabo imunogenih tumora. Međutim, ovaj pristup je povezan sa rizikom daljeg povećanja autoimunih nuspojava dodatno naglašavajući potrebu da se selektivno modulira imunitet protiv raka bez povećanja autoimunosti.

[0012] Dalja istraživanja liganda CD28 receptora dovela su do identifikacije i karakterizacije skupa srodnih molekula B7 („Superfamilija B7“) (32-33). Trenutno postoji nekoliko poznatih članova porodice: B7.1 (CD80), B7.2 (CD86), inducibilni kostimulator ligand (ICOS-L), programirani ligand smrti-1 (PD-L1; B7-H1 ), programirani ligand smrti-2 (PD-L2; B7-DC), B7-H3, B7-H4 i B7-H6 (35-36).

[0013] B7-H1 je široko eksprimiran u različitim humanim i mišjim tkivima, kao što su srce, placenta, mišići, fetalna jetra, slezina, limfni čvorovi i timus za obe vrste, kao i jetra, pluća i bubrezi samo kod miševa (37). B7-H1 (PD-L1, CD274) je posebno značajan član superfamilije B7 jer je ključno uključen u oblikovanje imunološkog odgovora na tumore (38; U.S. Pat. Nos.

6,803,192; 7,794,710; United States Patent Application Publication Nos. 2005/0059051; 2009/0055944; 2009/0274666; 2009/0313687; PCT Publication No. WO 01/39722; WO 02/086083).

[0014] Programirana smrt-1 („PD-1“) je receptor za B7-H1 kao i za B7-DC. PD-1 je član membranskog proteina tipa I proširene CD28/CTLA4 porodice regulatora T ćelija (39; United States Patent Application Publication No.2007/0202100; 2008/0311117; 2009/00110667; U.S. Pat. Nos. 6,808,710; 7,101,550; 7,488,802; 7,635,757; 7,722,868; PCT Publication No. WO 01/14557). U poređenju sa CTLA4, PD-1 šire negativno reguliše imune odgovore. PD-1 se eksprimira na aktiviranim T ćelijama, B ćelijama i monocitima (40-41) i na niskim nivoima u T ćelijama prirodnim ubicama (NK) (42-43).

[0015] Utvrđeno je da interakcija B7-H1 i PD-1 obezbeđuje ključni negativni kostimulatorni signal T i B ćelijama (43) i funkcioniše kao induktor ćelijske smrti (39). Uloga B7-H1 i PD-1 u inhibiciji aktivacije i proliferacije T ćelija sugeriše da ovi biomolekuli mogu poslužiti kao terapeutske mete za lečenje upale i raka. Shodno tome, upotreba anti-PD1 i anti-B7-H1 antitela za lečenje infekcija i tumora i za povećanje adaptivnog imunog odgovora je predložena i pokazano je da je efikasna za lečenje brojnih humanih tumora. Međutim, ne reaguju svi subjekti ili imaju potpune odgovore na tretman sa anti-PD-1 ili anti-B7-H1 i stoga postoji veliki interes za kombinovanje anti-PD-1 ili anti-B7-H1 antitela sa drugim inhibitorima provere imuniteta kako bi se poboljšala antitumorska aktivnost.

[0016] 4-1BB (takođe poznat kao CD137 i TNFRSF9) je još jedan molekul imunološke kontrolne tačke. Najbolje okarakterisana aktivnost CD137 je njegova kostimulatorna aktivnost za aktivirane T ćelije. Unakrsno povezivanje CD137 povećava proliferaciju T ćelija, sekreciju IL-2, preživljavanje i citolitičku aktivnost. Dalje, kao i anti-CTLA4, anti-4-1BB antitela mogu poboljšati imunološku aktivnost kako bi eliminisali tumore kod miševa (27-29). Međutim, za razliku od tendencije anti-CTLA4 antitela da pogoršavaju autoimune bolesti, pokazalo se da terapijska anti-4-1BB mAbs za kancer poništavaju razvoj autoimunih bolesti kod miševa sklonih lupusu, kod kojih su inhibirali proizvodnju anti-dsDNA antitela i smanjivali patologiju bubrega (25, 26). Prethodni podaci su pokazali da je moguće smanjiti autoimune neželjene efekte tretmana anti-CTLA4 u modelu tumora raka debelog creva miša kombinovanjem tretmana anti-CTLA4 sa anti-4-1BB antitelom, uz istovremeno povećanje antitumorske aktivnosti (19 ). Ovo pokazuje da je moguće nadoknaditi autoimune neželjene efekte terapije anti-CTLA4 tumora.

[0017] Pretklinički skrining anti-humanih CTLA4 antitela je prepun poteškoća jer in vitro imunološki korelati su ponekad od male vrednosti, kao što je pokazano iskustvom sa antimišjim CTLA4 antitelima. Ista anti-mišja CTLA4 antitela koja indukuju snažan antitumorski imunitet in vivo može imati promenljive efekte na T ćelije in vitro. Anti-CTLA4 antitela su pojačala proliferaciju T ćelija kao odgovor na aloantigen, ali su potisnula proliferaciju T ćelija kao odgovor na kostimulaciju anti-CD 28 (30, 31). Takođe, angažovanje CTLA4 sa antitelom može ili da promoviše ili inhibira proliferaciju različitih podskupova T ćelija u istoj kulturi (32). Ova komplikacija se može prevazići ako se mogu proučavati odgovori humanih T ćelija na modelu glodara.

[0018] Ovde su opisana anti-CTLA4 antitela sa smanjenim autoimunim sporednim efektima kada se koriste za poboljšanje imunoloških odgovora i za upotrebu u antitumorskoj terapiji. Dodatno, ova antitela se mogu koristiti u kombinaciji sa drugim inhibitorima kontrolnih tačaka, kao što su anti-PD-1 i anti-4-1BB, da bi se poboljšao antitumorski uz istovremeno poništavanje autoimunih neželjenih efekata.

Suština pronalaska

[0019] Ovaj pronalazak je usmeren na anti-CTLA4 antitelo sposobno da veže humani CTLA4 koje sadrži: teški lanac koji sadrži sekvencu aminokiselina datu u SEQ ID NO: 64, laki lanac koji sadrži sekvencu aminokiselina datu u SEQ ID NO: 71 i IgG1 Fc region koji sadrži sekvencu datu u SEQ ID NO: 4. Pronalazak je izložen u priloženom skupu patentnih zahteva.

[0020] Sve reference u opisu na postupke lečenja ili dijagnoze odnose se na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove ovog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja ili dijagnoze ljudskog ili životinjskog tela terapijom.

[0021] Konkretno, pronalazak se odnosi na antitela sa pojačanom aktivnošću blokiranja CTLA4 za CTLA4 ligande B7.1 i B7.2, poboljšanom efektorskom funkcijom, ili smanjenim vezivanjem za rastvorljivi CTLA4 u odnosu na membranski vezan ili imobilizovan CTLA4.

[0022] Antitelo kao što je ovde opisano može sadržati varijabilnu aminokiselinsku sekvencu lakog lanca koja ima sekvencu aminokiselina koja sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog lakog lanca koja ima sekvencu aminokiselina datu u SEQ ID NO: 1, i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog teškog lanca čija je aminokiselinska sekvenca navedena u SEQ ID NO: 2. Antitelo takođe može da sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca koja ima sekvencu aminokiselina datu u SEQ ID NO: 27, 28 ili 29, i varijabilnu aminokiselinsku lakog lanca sekvenca koja ima sekvencu aminokiselina datu u SEQ ID NO: 30, 31 ili 32. Antitelo može da sadrži varijabilni region lakog lanca koji ima CDR sekvence navedene u SEQ ID NOS: 21, 22 i 23, i varijabilni region teškog lanca imaju CDR sekvence navedene u SEQ ID NO: 24, 25 i 26. Tačnije, antitelo može da sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 33, 34 ili 35, i varijabilni region lakog lanca koji ima CDR sekvence navedene u SEQ ID NO: 36, 37 ili 38.

[0023] Konstantni regioni teškog lanca imunoglobulina antitela mogu sadržati aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 3 ili 4. Prema pronalasku, konstantni region teškog lanca imunoglobulina antitela sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 4. Konstantni region teškog lanca imunoglobulina antitela takođe sadrži mutaciju. U odnosu na sekvencu kičme hlgG1 u SEQ ID NO: 3, mutacija može biti M135I, S137T, T139E, S181A, E216A ili K217A, ili njihova kombinacija. Prema pronalasku, konstantni region teškog lanca imunoglobulina antitela obuhvata svih šest mutacija. Ovde opisano antitelo može da sadrži aminokiselinsku sekvencu teškog lanca koja ima sekvencu aminokiselina datu u SEQ ID NO: 6 i sekvencu aminokiselina lakog lanca koja ima sekvencu aminokiselina datu u SEQ ID NO: 8. Antitelo može takođe sadrže aminokiselinsku sekvencu teškog lanca koja ima sekvencu aminokiselina datu u SEQ ID NO: 9, 11 ili 13, i sekvencu aminokiselina lakog lanca koja ima sekvencu aminokiselina datu u SEQ ID NO: 15, 17 ili 19. Antitelo je sposobno da veže humani CTLA4. Antitelo takođe može inhibirati vezivanje humanog CTLA4 za B7-1 ili B7-2.

[0024] Ovde je dalje otkriven fragment koji se vezuje za antigen ovde opisanih antitela.

[0025] Ovde je takođe obezbeđena farmaceutska kompozicija koja sadrži terapeutski efikasnu količinu ovde opisanih antitela. Farmaceutska kompozicija sadrži fiziološki prihvatljiv nosač ili ekscipijent.

[0026] U drugom aspektu, ovde su predstavljeni postupci za poboljšanje jedne ili više imunoloških funkcija ili odgovora kod subjekta, koji obuhvataju davanje subjektu kome je to potrebno kompozicija anti-CTLA4 antitela i farmaceutskih kompozicija opisanih ovde. U specifičnom primeru izvođenja, ovde su predstavljeni postupci za prevenciju, lečenje i/ili upravljanje bolešću u kojoj je poželjno aktivirati ili poboljšati jednu ili više imunoloških funkcija ili odgovora. Bolest može biti kancer, što može biti ljudski malignitet. Konkretno, humani malignitet može biti melanom, karcinom pluća, karcinom dojke, hepatocelularni karcinom, karcinom jajnika, karcinom prostate, Hodgkin ili ne-Hodgkin limfom, akutna mijelogena leukemija, hronična mijelogena leukemija, akutna limfocitna leukemija, hronična limfocitna leukemija, ili karcinom bubrežnij ćelija. U drugom izvođenju, bolest koja se leči je zarazna bolest. Ovde opisani postupak može da minimizira autoimune neželjene efekte povezane sa imunoterapijom.

[0027] U drugim specifičnim primerima izvođenja koji su ovde otkriveni, postupak obuhvata kombinovanu terapiju, pri čemu se kompozicije anti-CTLA4 antitela koje su ovde opisane daju subjektu u kombinaciji sa drugom terapijom, koja može aktivirati ili poboljšati jednu ili više imunoloških funkcija ili odgovora. U drugom aspektu, kompozicije anti-CTLA4 antitela opisane ovde se primenjuju kao pomoćno sredstvo u kombinaciji sa antigenskom kompozicijom. U posebnom aspektu, kompozicije anti-CTLA4 antitela opisane ovde se primenjuju u kombinaciji sa kompozicijom vakcine da bi se indukovao ili aktivirao ili pojačao imuni odgovor izazvan kompozicijom vakcine.

[0028] U specifičnom aspektu koji je ovde otkriven, kompozicije anti-CTLA4 antitela opisane ovde se daju subjektu u kombinaciji sa jednom ili više drugih terapija koje ciljaju različite imunomodulatorne puteve. U poželjnoj varijanti koja je ovde otkrivena, aktivnost terapije koja cilja na drugačiji imunomodulatorni put je komplementarna ili sinergistička sa kompozicijama anti-CTLA4 antitela opisanim ovde. U jednom slučaju, kompozicije anti-CTLA4 antitela opisane ovde se primenjuju u kombinaciji sa drugim inhibitorima kontrolnih tačaka ili malim onkoimunološkim modulatorima kao što su inhibitori indoleamin 2,3-dioksigenaze (IDO).

[0029] U drugom slučaju, kompozicije anti-CTLA4 antitela koje su ovde opisane daju se u kombinaciji sa molekulima koji stimulišu imunitet. Specifične realizacije uključuju kombinovanje kompozicija anti-CTLA4 antitela opisanih ovde sa anti-PD-1 (pembrolizumab (Keytruda) ili Nivolumab (Opdivo)), anti-B7-H1 (atezolizumab (Tecentrik) ili durvalumab), anti-B7-H3, anti-B7-H4, anti-LAG3, anti-Tim3, anti-CD40, anti-OX40, anti-BTLA, anti-CD27, anti-ICOS ili anti-41BB. U drugom aspektu, kompozicije anti-CTLA4 antitela koje su ovde opisane i drugi imunostimulišući molekul su kombinovani u jedno bi-specifično antitelo.

[0030] U drugom aspektu, ovde opisano anti-humano CTLA4 antitelo može prvenstveno da se veže za humani CTLA-4 eksprimiran na površini ćelije u odnosu na rastvorljive CTLA4 molekule. Anti-humano CTLA4 antitelo može da se veže za humani CTLA4 i prvenstveno da pojača ekspresiju B7.1 ili B7.2 in vivo. Antitelo može biti sadržano u kompoziciji za upotrebu u modulaciji imunoloških odgovora (imunoterapija) i lečenju kancera.

[0031] Otkriće se dalje odnosi na postupak skrininga za anti-humane CTLA4 mAbs sa poželjnom aktivnošću. Pretklinički skrining za antihumane CTLA4 mAbs je prepun poteškoća jer in vitro imunološki korelati za imunitet kancera i autoimuno neželjeno dejstvo nisu definisani. U kliničkim ispitivanjima sa humanim anti-CTLA4 (Ipilimumab) primećeni su značajni autoimuni neželjeni efekti, posebno kada se kombinuju sa anti-PD-1. Da bi se identifikovala anti-CTLA4 antitela sa smanjenom toksičnošću vezanom za imunitet, antitela koja pokazuju antitumorsku aktivnost kod humanizovanih miševa mogu se pregledati na njihovu sposobnost da smanje autoimune neželjene efekte in vivo koristeći humani CTLA4 gen knock-in miševa.

[0032] Otkriće se dalje odnosi na postupak skrininga za anti-humane CTLA4 mAbs sa pojačanim antitumorskim efektom pri čemu antitela pokazuju pojačano lokalno iscrpljivanje Treg ćelija u okruženju tumora.

[0033] Otkriće se dalje odnosi na postupke praćenja efekata blokiranja anti-CTLA4 antitela in vivo praćenjem nivoa ekspresije B7.1 i B7.2 na imunim ćelijama kao što su ćelije koje predstavljaju antigen (APC). Otkriće dalje razmatra biomarkere za merenje biološke aktivnosti anti-CTLA4 antitela in vivo i praćenje patentnih odgovora na tretman anti-CTLA4 merenjem nivoa ekspresije B7.1 i B7.2 na imunim ćelijama ex vivo.

[0034] Da bi se mapirao epitop koji se vezuje za CTLA4 roditeljskog antitela L3D10 i humanizovanih varijanti, PP4631 i PP4637, korišćena je činjenica da su mišji i humani CTLA4 proteini unakrsno reaktivni na B7-1, ali ne i na anti-CTLA-4 antitela. Shodno tome, dizajniran je veliki broj mutanata humanog CTLA-4Fc proteina u kojima su klasteri aminokiselina iz humanog CTLA-4 proteina zamenjeni aminokiselinama iz mišjeg Ctla-4 proteina. Pošto se anti-CTLA-4 antitela korišćena u ovoj studiji ne vezuju za mišji Ctla-4, vezivanje anti-humanih CTLA-4 antitela može biti ukinuto kada se ključni ostaci epitopa za vezivanje antitela zamene mišjim aminokiselinama.

Kratak opis crteža

[0035]

SL. 1. Šematski dijagram himernih (levo) i humanizovanih (desno) L3D10 antitela sa novom kombinacijom mutacija u IgG1 Fc regionu. Položaji mutacija u Fc regionu se identifikuju po broju njihove aminokiselinske pozicije, a aminokiseline se identifikuju pomoću jednoslovnog koda, sa slovom ispred broja koji predstavlja zamenu aminokiseline i slovom iza broja koji predstavlja uvedenu aminokiselinu. kiselina. Varijabilni region antitela je prikazan otvorenim ovalima, a ljudska sekvenca je prikazana sivim pravougaonicima. V = varijabilni region; C = konstantni region; L = laki lanac; H = teški lanac.

SL. 2. CTLA4 Vezivanje himernih L3D10 i 10D1 za imobilisani CTLA4 na ploči, kao što je određeno ELISA. ELISA ploče su obložene sa 1 µg/ml CTLA4-His proteina (Sino Biological, Kina). Dodata je data koncentracija biotinilovanih vezujućih proteina i vezivanje je mereno korišćenjem HRP-konjugovanog streptavidina. 10D1-1 i -2 su dve nezavisne partije materijala istog antitela. B7.1-Fc je pozitivna kontrola, a Fc je negativna kontrola.

SL. 3. L3D10 test konkurencije. 10D1 je manje efikasan u blokiranju vezivanja himernog L3D10 za CTLA4 od himernog L3D10. Eksperiment je izveden kao na Sl. 2, osim što je biotinilovani himerni L3D10 pomešan sa datom koncentracijom neobeleženih CTLA4-vezujućih proteina ili CTLA4-Fc pre dodavanja na ELISA ploče. Obratite pažnju na mnogo bolje blokiranje neobeleženim L3D10 nego 10D1, što sugeriše da ova mesta vezivanja antitela nisu identična.

SL. 4. Blokiranje vezivanja CTLA4 za imobilisanu ploču B7.1. B7.1Fc protein je obložen na ELISA ploče pri 0,5 ug/ml. Posle ispiranja i blokiranja, biotinilovani CTLA4-Fc protein je dodat u količini od 0,25 µg/ml u prisustvu datih koncentracija konkurentnih proteina. Prikazani podaci su srednje vrednosti duple optičke gustine na 405 nM. Dok B7.1-Fc, himerni L3D10 i CTLA4-Fc blokiraju interakciju CTLA4:B7.1 na način koji zavisi od doze, dve odvojene serije 10D1 antitela nisu uspela da blokiraju pri svim testiranim dozama. Biotinilacija CTLA4 ne uništava epitope 10D1 na CTLA4 pošto obe serije 10D1 pokazuju snažno vezivanje za biotinilovani CTLA4 (podaci nisu prikazani).

SL. 5. Blokiranje vezivanja CTLA4 za imobilisanu ploču B7.2. B7.2Fc protein je obložen na ELISA ploče pri 0,5 ug/ml. Posle ispiranja i blokiranja, biotinilovani CTLA4-Fc protein je dodat u količini od 0,25 µg/ml u prisustvu datih koncentracija konkurentnih proteina. Dok himerni L3D10 blokira interakciju CTLA4:B7.2 na način koji zavisi od doze, dve odvojene serije 10D1 antitela nisu uspele da u potpunosti blokiraju interakciju CTLA4:B7.2 čak i pri najvišoj koncentraciji.

SL. 6. I 10D1 i L3D10 snažno blokiraju interakciju B7-CTLA4 koristeći rastvorljive B7-1 i B7-2 i imobilizovani CTLA4-Fc. Različite doze anti-humanih CTLA4 mAbs dodavane su zajedno sa 0,25 µg/ml biotinilovanog humanog CTLA4-Fc na ploču obloženu humanim B7-1Fc. Količine CTLA4 vezane za ploče merene su korišćenjem streptavidina konjugovanog sa HRP.

Prikazani podaci su srednje vrednosti duplikata i reprezentativni su za dva nezavisna eksperimenta.

SL. 7. Blokiranje vezivanja CTLA4 za ćelijsku površinu eksprimiranog B7.1. Biotinilovani CTLA4-Fc protein je dodat u B7.1 eksprimirajuće CHO ćelije na 0,5 µg/ml u prisustvu date koncentracije konkurentnih proteina. Vezivanje biotinilovanog fuzionog proteina za CHO ćelije transfektovane mišjim ili humanim B7-1 i B7-2 detektovano je protočnom citometrijom. Količine vezanih receptora merene su korišćenjem streptavidina konjugovanog sa fikoeritrinom. Prikazani podaci su srednji intenzitet fluorescencije trostrukih uzoraka. Dok himerni L3D10 blokira interakciju CTLA4:B7.1 na način koji zavisi od doze, dve odvojene serije 10D1 antitela nisu uspele da blokiraju pri svim testiranim dozama.

SL. 8. Blokiranje vezivanja CTLA4 za ćelijsku površinu eksprimiranih mišjih B7.1. Skromno, ali uočljivo blokiranje mišjeg B7-1-humanog CTLA4 interakcije od strane 10D1 kada je mB7-1 eksprimiran na CHO ćelijama. Različite doze anti-humanih CTLA4 mAbs dodate su zajedno sa 0,25 µg/ml humanog CTLA4-Fc u CHO ćelije koje eksprimiraju mišji B7-1. Prikazani podaci su srednja vrednost i SEM ili trostruki podaci i reprezentativni su za dva nezavisna eksperimenta.

SL. 9. Blokiranje vezivanja CTLA4 za ćelijsku površinu eksprimiranog B7.2. Biotinilovani CTLA4-Fc protein je dodat u B7.2 koje eksprimiraju CHO ćelije pri 0,5 µg/ml u prisustvu date koncentracije konkurentnih proteina. Dok himerni L3D10 blokira interakciju CTLA4:B7.2 na način koji zavisi od doze, dve odvojene serije 10D1 antitela nisu uspele da u potpunosti blokiraju interakciju CTLA4:B7.2 čak i pri najvišoj koncentraciji. Podaci prikazani na ovoj slici su ponovljeni najmanje 5 puta.

SL. 10. 10D1 se bolje vezuje za biotinilovani humani CTLA4-Fc nego L3D10. Različite doze anti-humanih CTLA4 mAbs ili kontrolnih IgG su obložene na ploču. Biotinilovani CTLA4-Fc je dodat u količini od 0,25 ug/ml. Količine CTLA4 vezane za ploče merene su korišćenjem streptavidina konjugovanog sa HRP. Prikazani podaci su srednje vrednosti duplikata i reprezentativni su za dva nezavisna eksperimenta.

SL. 11. L3D10, ali ne i 10D1, blokira interakciju između CTLA4 označenih polihistininom i CHO ćelija koje eksprimiraju humani B7-1. CHO ćelije koje eksprimiraju humani B7-1 su inkubirane sa CTLA4 označenim polihistidinom zajedno sa datim dozama antitela, količine CTLA4-Fc su detektovane sa PE-streptavidinom i merene pomoću FACSCanto II. Prikazani podaci su srednji intenzitet fluorescencije trostrukih uzoraka i reprezentativni su za dva nezavisna eksperimenta.

SL. 12. Himerni L3D10 indukuje potpunu remisiju ustanovljenih tumora u singenom MC38 modelu. Gornji panel prikazuje eksperimentalni dizajn, a donji paneli pokazuju kinetiku rasta MC38 tumora kod miševa koji su primili ili kontrolni IgG (donji levi panel, n=6) ili himerni L3D10 (donji desni panel, n=5).

SL. 13. Terapijski efekat himernih L3D10 i 10D1 u modelu tumora MC38. Za studiju su korišćeni humani CTLA4-knock-in miševi sa telesnom težinom od približno 20 grama. 1×10<6>MC38 tumorske ćelije su ubrizgane subkutano u Ctla4<H/H>miševi i kada je tumor dostigao veličinu od 0,5 cm u prečniku, miševi sa tumorom su randomizovani u tri grupe sa po 5 ili 6 miševa. Miševi su zatim tretirani (i.p.) sa 100 ug/injekcija 10D1, himernog L3D10 ili kontrolnog hlgGFc dana 7, 10, 13 i 16 kao što je naznačeno strelicama. Prikazani su rezultati duplikata izuzimanja (leva i desna tabla), a prikazani podaci su srednje vrednosti i S.D. veličine tumora (n = 6 po grupi na levom panelu, n = 5 po grupi na desnom panelu). L3D10 i 10D1 imaju sličan terapeutski efekat u ovom modelu i oba su u stanju da izazovu potpunu remisiju ustanovljenih tumora. Prečnici (d) tumora su izračunati korišćenjem sledeće formule: D= √ (ab), V=ab2/2, gde je a dugi prečnik, dok je b kratki prečnik. Statističke analize su obavljene dvosmernim ponovljenim merama ANOVA (tretman x vreme). Za levi panel: P = 10D1 naspram hlgGFc: 5.71e-07; L3D10 naspram hlgGFc: P = 5,53e-07; 10D1 naspram L3D10: P = 0,869.

SL. 14. Efikasno odbacivanje MC38 anti-CTLA-4 mAbs u CTLA4<h/m>miševima. Kao na Sl.13, osim što se koriste heterozigotni CTLA4<h/m>miševi. Prikazani podaci su srednje vrednosti i SEM prečnika tumora (6 miševa po grupi); 10D1 naspram hlgGFc: P = 0,0011; L3D10 naspram hlgGFc: P = 5,55e-05; 10D1 naspram L3D10: P = 0,0346.

SL. 15. Terapijski efekat himernih L3D10 i 10D1 u modelu tumora melanoma B16-F1. Za studiju su korišćeni humani CTLA4-knock in miševi sa telesnom težinom od približno 20 grama. Strelice pokazuju vreme tretmana (50 µg/miševi/tretman). Prikazani podaci su srednja vrednost i S.D. veličine tumora (n = 4 po grupi). L3D10 ima sličan terapeutski efekat u ovom modelu i oba su u stanju da odlože rast tumora u ovom agresivnom i slabo imunogenom modelu tumora.

SL. 16. Test za merenje blokiranja CTLA4 in vivo. B7.1 ili B7.2 se vezuju za dendritske ćelije vezuju se za CTLA4 na površini T ćelija i regulišu ih naniže. Međutim, vezivanje blokirajućih anti-CTLA4 antitela sprečava vezivanje B7.1/B7.2 za CTLA4 i na taj način sprečava smanjenje regulacije B7.1 i B7.2, što dovodi do neto povećanja ekspresije B7.1/B7.2. Međutim, sa himernim T ćelijama koje eksprimiraju i humani i mišji CTLA4, antitela koja vezuju humani CTLA4 ne sprečavaju vezivanje B7.1/B7.2 za mišji CTLA4, što obnavlja inhibiciju B7.1/B7.2.

Sl. 17A-F. 10D1 ne blokira interakciju B7-CTLA4 in vivo. Korišćenjem testa opisanog na Sl.

11, ćelije miševa tretiranih anti-CTLA4 antitelima su korišćene za ispitivanje ekspresije B7.1 i B7.2. SL.17A prikazuje dijagram eksperimentalnog dizajna. Ukratko, miševi koji upareni po starosti i polu su primili 500 µg antitela ili njihove kontrole intraperitonealno. 24 sata nakon injekcije, miševi su žrtvovani i njihove ćelije slezine su obojene anti-CD11c, CD11b, anti-B7-1 i anti-B7-2 mAbs. SL.17B prikazuje reprezentativne podatke koji pokazuju fenotip CD11c<hi>DC analiziran na ekspresiju B7. SL. 17C prikazuje reprezentativne histograme koji prikazuju nivoe B7-1 na DC od miševa koji su primili kontrolu IgG1-Fc, L3D10 ili 10D1. Podaci na gornjem panelu pokazuju efekat antitela kod homozigotnih knock in miševa, dok oni na donjem panelu pokazuju efekat antitela kod heterozigotnih miševa. SL. 17D prikazuje kao na Sl.17C, osim što je prikazana ekspresija B7-2. Podaci prikazani na sl.17C i D su reprezentativni za one od 3 miša po grupi i ponovljeni su jednom sa tri miša po grupi. SL. 17E pokazuje da je kod humanih CTLA4 homozigotnih miševa, L3D10, ali ne i 10D1, indukovao ekspresiju B7-1 (levi panel) i B7-2 (desni panel). Prikazani podaci su sumirani iz dva eksperimenta koji uključuju ukupno 6 miševa po grupi. U svakom eksperimentu, srednje vrednosti podataka kod kontrolnih miševa su veštački definisani kao 100%, a oni u eksperimentalnim grupama su normalizovani u odnosu na kontrolu. SL. 17F kao na Sl. 17E, osim što se koriste heterozigotni miševi. Ni L3D10 ni 10D1 ne blokiraju interakciju B7-CTLA4 kod miševa koji ko-dominantno eksprimiraju i mišji i humani Ctla4 gena.

SL. 18. L3D10 se vezuje za humani, ali ne i mišji CTLA4. Podaci koji su prikazani su tačkice intracelularnog bojenja CTLA4 među gejtovanim Cd3<+>Cd4<+>ćelijama, koristeći ćelije slezine iz Ctla4<h/h>(gore) ili Ctla4<m/m>(donji) miševi. Kao kontrola korišćeno je anti-mišje CTLA4 mAb 4F10.

SL. 19. Terapijski efekat himernih L3D10 i 10D1 u CTLA4<h/m>miševima. Gornji panel prikazuje eksperimentalni dizajn. The Ctla4<h/h>miševi su bili izazvani ćelijskom linijom raka debelog creva MC38 i kada je tumor dostigao veličinu od približno 5 mm u prečniku, miševi su tretirani 4 puta kontrolnim humanim IgG-Fc, L3D10 ili 10D1 i posmatrana je veličina tumora tokom perioda od 6 nedelja. Donji paneli pokazuju kinetiku rasta MC38 tumora kod miševa koji su primili ili kontrolni IgG, himerni L3D10 ili 10D1 (n=6 po grupi). Uprkos očiglednim razlikama u aktivnosti blokiranja CTLA4 in vivo kao što je prikazano na Sl.16, i L3D10 i 10D1 pokazuju snažnu antitumorsku aktivnost protiv MC38 modela u himernim CTLA4<m/h>miševima.

Sl. 20A-B. 10D1 i L3D10 imaju sličan terapeutski efekat na rast melanoma B16. 1×10<5>B16 tumorske ćelije su ubrizgane (sc) u Ctla4<h/h>miševe (n=4-5) i tretirani (i.p.) sa 100 µg (Slika 20A) ili 250 µg (Slika 20B) 10D1, L3D10 ili kontrolni IgGFc dana 11, 14, 17 (Slika 20A) ili na dan 2, 5 i 8 (Slika 20B), kao što je prikazano strelicama. Za Sl.20A, 10D1 naspram hlgGFc: P = 0,0265; L3D10 naspram hlgGFc: 10D1 naspram L3D10: P = 0,0487; P= 0,302. Za Sl.20B, 10D1 naspram hlgGFc: P = 0,00616; L3D10 naspram hlgGFc: P = 0,0269: 10D1 naspram L3D10: P=0,370,. Podaci predstavljaju srednju vrednost ± SEM od 4-5 miševa po grupi. Statističke analize su obavljene dvosmernim ponovljenim merama ANOVA.

Sl. 21A-B. Imunoterapeutski efekti između L3D10 i 10D1 u Ctla4<h/h>(Slika 21A) i Ctla4<m/h>(Slika 21B) kod miševa koji su terminirani pre potpunog odbacivanja da bi se procenilo iscrpljivanje Treg u mikrookruženju tumora. Prikazani podaci su srednje vrednosti i SEM prečnika tumora za dva nezavisna eksperimenta, uključujući 5 miševa po grupi.

Sl. 22A-F. Blokiranje interakcije B7-CTLA4 ne doprinosi imunoterapeutskoj aktivnosti anti-CTLA4 mAb protiv raka. SL.22A pokazuje uporedivi imunoterapeutski efekat uprkos znatno različitoj aktivnosti blokiranja dva anti-CTLA4 mAb. 5×10<5>MC38 tumorske ćelije su ubrizgane (sc) u Ctla4<h/h>miševi (n=6) i tretirani (i.p.) sa 100 µg 10D1, L3D10 ili kontrolnog hlgG-Fc dana 7, 10, 13 i 16, kao što je prikazano strelicama. Podaci predstavljaju srednju vrednost ± SEM od šest miševa po grupi. Statističke analize su obavljene dvosmernim ponovljenim merama ANOVA (tretman x vreme).10D1 naspram hlgG-Fc: P = 5.71<e-07>; L3D10 naspram hlgG-Fc: P = 5,53e<-07>; 10D1 naspram L3D10: P = 0,869. Podaci su reprezentativni za tri nezavisna eksperimenta. SL. 22B. Kod miševa kod kojih nijedno antitelo ne blokira interakciju B7-CTLA4, oba izazivaju snažno odbacivanje tumora. Kao na Sl.22A, osim što su korišćeni heterozigotni miševi koji eksprimiraju i mišji i ljudski CTLA4. 10D1 naspram hlgG-Fc: P = 0,0011; L3D10 naspram hlgG-Fc: P = 5,55e<-05>; 10D1 naspram L3D10: P = 0,0346. Podaci su reprezentativni za tri nezavisna eksperimenta. Sl.22C-F, Blokirajuća interakcija B7-CTLA4 ne doprinosi selektivnom iscrpljivanju Treg u mikrookruženju tumora. Sl.22C i D. Bez obzira na njihovu sposobnost da blokiraju interakciju B7-CTLA4, L3D10 i 10D1 ne brišu Treg u slezini. Prikazani podaci su % Fokp3+ ćelija među CD4 T ćelijama slezine u Ctla4<h/h>(Slika 22C) i Ctla4<m/h>(Slika 22D) miševima. n=6. e i f, i L3D10 i 10D1 brišu Treg među tumorskim infiltriranim CD4 T ćelijama u Ctla4<h/h>(Slika 22E) i Ctla4<m/h>(Slika 22F) miševi. Podaci prikazani u c-f su % Treg na 17 (eksperiment 1) ili 19 dana (eksperiment 2) nakon izazivanja tumorskih ćelija i 10 ili 12 dana nakon početka 4 tretmana anti-CTLA4 mAb kao što je naznačeno strelicama.

Sl. 23A-F. Procena aktivnosti blokiranja najčešće korišćenih anti-mišjih CTLA4 mAbs 9H10 i 9D9. Sl.23A i B pokazuju da 9H10 ne blokira interakciju B7-CTLA4 ako su B7-1 (Slika 23A) i B7-2 (Slika 23B) obložene na ploče. Biotinilovani mišji CTLA4-Fc fuzioni protein je inkubiran sa pločama obloženim B7 u prisustvu date koncentracije kontrolnog IgG ili antimišjeg CTLA4 mAb 9D9 i 9H10. Vezivanje CTLA4 se detektuje pomoću streptavidina konjugovanog sa HRP. Prikazani podaci su srednja vrednost dupliranja i reprezentativni su za dva nezavisna eksperimenta. Sl. 23C i D pokazuju da 9D9 i 9H10 pokazuju diferencijalno vezivanje za rastvorljiv (Slika 23C) i pločicu vezan CTLA4-Fc (Slika 23D). Prikazani podaci su srednja vrednost dupliranja i reprezentativni su za najmanje dva nezavisna eksperimenta. Sl.

23E i F pokazuju efekte antimišjih CTLA4 mAbs 9D9 i 9H10 na nivoe B7-1 (Slika 23E) i B7-2 (Slika 23F) na CD11c<hi>DC iz WT (Ctla4<m/m>) ćelije slezine 24 sata nakon tretmana sa 500 ug antitela i.p. Podaci su sumirani od 6 nezavisnih miševa po grupi u dva nezavisna eksperimenta koji uključuju po 3 miša po grupi.

Sl. 24A-D. Izrazito in vivo i in vivo blokirajuće aktivnosti antimišjeg CTLA4 mAb 4F10. Sl.

24A i B pokazuju efekat 4F10 na interakciju CTLA4-Fc sa B7-1 obloženim pločama (Slika 24A) ili B7-2 (Slika 24B). Biotinilovani mišji CTLA4-Fc fuzioni protein je inkubiran sa pločama obloženim B7 u prisustvu date koncentracije kontrolnog IgG ili anti-mišjeg CTLA4 mAb 4F10. Vezivanje CTLA4 se detektuje pomoću streptavidina konjugovanog sa HRP. Prikazani podaci su srednja vrednost dupliranja i reprezentativni su za dva nezavisna eksperimenta. Sl. 24C i D pokazuju uticaj 4F10 na ekspresiju B7-1 i B7-2. Zbirni podaci o nivoima B7-1 (slika 24C) i B7-2 (slika 24D) od 6 miševa po grupi. Nivoi B7 u kontrolnoj grupi tretiranoj IgG su veštački definisani kao 100%.

SL. 25. Neželjeni efekti himernih L3D10 i 10D1 u kombinaciji sa anti-PD-1. Gornja ploča prikazuje eksperimentalni dizajn. Za studiju su korišćeni humani CTLA4-knock in miševi stari 10 dana samo ženke sa telesnom težinom većom od 4 grama. Dobili su naznačene proteine ili njihove kombinacije. Strelice pokazuju vreme tretmana (100 µg/miševi/tretman). Prikazani podaci su srednja vrednost i S.D. od % povećanja telesne težine. Himerni L3D10 i 10D1 imaju uporediv terapeutski efekat protiv raka kod odraslih miševa (Slika 13), ali se primećuju različiti neželjeni efekti kada se 10D1 kombinuje sa anti-PD-1 mAb.

SL. 26. Neželjeni efekti himernih L3D10 i 10D1 u kombinaciji sa anti-PD-1. Grafikon prikazuje terminalnu telesnu težinu 42. dana kod miševa iz eksperimenta prikazanog na Sl. 25 koji su primili ili kontrolni IgG, 10D1 anti-PD-1 ili himerni L3D10 anti-PD-1 (n=5 po grupi). Primećeno je značajno smanjenje telesne težine kod kombinacije anti-PD1+10D1, što nije primećeno kod kombinacije anti-PD-1+himerni L3D10.

SL. 27. Patološki efekti himernih L3D10 i 10D1 u kombinaciji sa anti-PD-1. Da bismo dalje ispitali relativnu toksičnost L3D10 u poređenju sa 10D1 kada se primenjuje u kombinaciji sa anti-PD-1, pogledali smo grubu anatomiju miševa opisanih na Sl.26 gore. Uterus/Jajnik/Bešika i timus su bili primetno manji kod miševa tretiranih sa 10D1 PD-1, dok su organi kod miševa tretiranih sa L3D10 anti-PD-1 bili uporedivi sa hlgG kontrolom. Nasuprot tome, srca secirana od miševa tretiranih sa 10D1 izgledala su veća po veličini sa primetno beljim izgledom.

Sl. 28A-D. Tretman sa 10D1 u kombinaciji sa anti-PD-1 dovodi do abnormalne eritropoeze. S obzirom na razlike u srcima uočenim na Sl. 27, posmatrali smo eritropoezu kod miševa i primetili jasne razlike kod miševa tretiranih sa 10D1 anti-PD-1 u odnosu na grupe tretirane sa L3D10 anti-PD-1 ili kontrolnim antitelom (hIgG), koje su bile prilično slične. Koštana srž miševa tretiranih sa 10D1 anti-PD-1 imala je primetno belju boju (Slika 28A), a izolovana krv je bila skoro potpuno bele boje (Slika 28B). U skladu sa tim, kada smo analizirali diferencijaciju crvenih krvnih zrnaca korišćenjem distribucije CD119 i CD71 markera, primetili smo statistički značajno smanjenje broja ćelija koje prolaze kroz fazu IV razvoja kod miševa tretiranih 10D1 anti-PD-1. Reprezentativni FACS profili su prikazani na Sl. 28C, dok su zbirni podaci predstavljeni na Sl.28D.

SL. 29. Protočnom citometrijom analizirana antitela protiv crvenih krvnih zrnaca. Uzorci krvi NOD.SCID.II2rg-/- (NSG) miševa su obojeni uzorcima plazme miševa koji su bili tretirani antitelima tokom perinatalnog perioda. Serumi NSG miševa i onih bez seruma korišćeni su kao negativna kontrola. Svi serumi su korišćeni u razblaženju 1:50. Ovi podaci pokazuju da nijedan od miševa nije proizveo antitela protiv crvenih ćelija.

SL. 30. Patologija srca kod miševa tretiranih himernim L3D10 i 10D1 u kombinaciji sa anti-PD-1. Da bismo dalje odredili toksikologiju L3D10 naspram 10D1 u kombinaciji sa anti-PD-1, izvršili smo histološku analizu srca kod miševa opisanih na Sl.26. Miševi tretirani sa 10D1 anti-PD-1 pokazali su visok nivo infiltracije T ćelija koji nije primećen kod miševa tretiranih sa L3D10 anti-PD-1 ili kod miševa tretiranih humanim IgG kontrolom.

SL. 31. Patologija pluća kod miševa tretiranih himernim L3D10 i 10D1 u kombinaciji sa anti-PD-1. Da bismo dalje odredili toksikologiju L3D10 naspram 10D1 u kombinaciji sa anti-PD-1, izvršili smo histološku analizu pluća kod miševa opisanih na Sl.26. Miševi tretirani sa 10D1 anti-PD-1 pokazali su visok nivo infiltracije T ćelija koji nije primećen kod miševa tretiranih sa L3D10 anti-PD-1 ili kod miševa tretiranih humanom IgG kontrolom.

SL. 32. Patologija pljuvačne žlezde kod miševa tretiranih himernim L3D10 i 10D1 u kombinaciji sa anti-PD-1. Da bismo dalje odredili toksikologiju L3D10 naspram 10D1 u kombinaciji sa anti-PD-1, izvršili smo histološku analizu pljuvačke kod miševa opisanih na Sl.

26. Miševi tretirani sa 10D1 anti-PD-1 pokazali su mnogo viši nivo infiltracije T ćelija nego što je primećeno kod miševa tretiranih sa L3D10 anti-PD-1 ili miševa lečenih kontrolom humanih IgG.

Sl. 33A-F. Patologija bubrega i jetre kod miševa tretiranih himernim L3D10 i 10D1 u kombinaciji sa anti-PD-1. Da bismo dalje odredili toksikologiju L3D10 protiv 10D1 u kombinaciji sa anti-PD-1, izvršili smo histološku analizu bubrega i jetre kod miševa opisanih na Sl.26. SLIKE 33A-C su preseci iz bubrega i

Sl. 33D-E su delovi uzeti iz jetre. Miševi tretirani sa 10D1 anti-PD-1 pokazali su visok nivo infiltracije T ćelija nego što je to primećeno kod miševa tretiranih sa L3D10 anti-PD-1 ili miševa tretiranih humanom IgG kontrolom.

SL. 34. Rezultati toksičnosti miševa tretiranih himernim L3D10 i 10D1 u kombinaciji sa anti-PD-1. Ovi podaci o tkivu prikazani na Sl.30-33 je sažet i pokazuje rezultate visoke toksičnosti miševa tretiranih sa 10D1 anti-PD-1 u odnosu na L3D10 anti-PD-1 koji ima samo neznatno veće rezultate od hlgG kontrolne grupe miševa.

SL. 35. 10D1+anti-PD-1 nemaju značajnu toksičnost u Ctla4<h/m>miševi, što je dokazano normalnim povećanjem telesne težine kod miševa koji su bili tretirani antitelima tokom perinatalnog perioda. Miševi su primali tretmane datim antitelom ili kombinacijama 10., 13., 16., 19. i 22. dana intraperitonealno (100 µg/miševi/injekcija/antitelo). Miševi su mereni najmanje jednom u 3 dana.

SL. 36. L3D10 i 10D1 pokazuju slične obrasce vezivanja za CTLA4 imobilisan na ploči. ELISA ploče su obložene sa 1 µg/ml CTLA4-His proteina (Sino Biological, Kina). Dodata je data koncentracija biotinilovanih vezujućih proteina i vezivanje je mereno korišćenjem HRP-konjugovanog streptavidina. 10D1-1 i -2 su dve nezavisne partije materijala istog antitela. hlgG-Fc je negativna kontrola humanog Ig.

SL. 37. L3D10 pokazuje smanjeno vezivanje rastvorljivog CTLA4. Date koncentracije antihumanih CTLA4 mAbs su obložene na ploču preko noći, nakon ispiranja i blokiranja albuminom goveđeg seruma, biotinilovani CTLA4-Fc je dodat u količini od 0,25 µg/ml. Posle inkubacije i ispiranja, količine uhvaćenog CTLA4-Fc merene su korišćenjem streptavidina obeleženog HRP.

SL. 38. Poravnanje varijabilnih regiona humanizovanog antitela sa roditeljskom sekvencom L3D10 antitela. Varijabilni region teškog lanca (gore) (SEQ ID NOS: 62-64) i varijabilni region lakog lanca (dole) (SEQ ID NOS: 70-72) sekvenci humanizovanih antitela su u skladu sa roditeljskim L3D10 antitelom (teški lanac: SEQ ID NO: 57: SEQ ID NO: 65) i odgovarajući okviri humanih antitela (teški lanac: SEQ ID NOS: 58-61; laki lanac: SEQ ID NOS: 66-69). Povratne mutacije roditeljske sekvence miša su označene žutom bojom. Nove aminokiseline, tj. aminokiselinski ostaci koji nisu prisutni u sekvenci roditeljskog antitela ili odgovarajućem okviru humanog antitela, označeni su zelenom bojom. Mutacije uvedene u CDR2 sekvence su prikazane ljubičastom bojom. CDR sekvence su prikazane crvenom bojom na osnovu www.bioinf.org.uk/abs/.

Sl. 39A-B. Antitumorska aktivnost humanizovanih L3D10 antitela u poređenju sa 10D1. Koristeći MC38 model mišjeg tumora kod humanih CTLA4 knock in miševa, posmatrali smo antitumorsku aktivnost humanizovanih L3D10 antitela u poređenju sa himernim L3D10 antitelom i 10D1. Gornji panel prikazuje raspored tretmana in vivo eksperimenta; miševima su date ukupno 4 doze antitela svaka 3 dana počevši od 7. dana nakon inokulacije. Sva humanizovana antitela (n = 6 po grupi) potpuno su iskorenila tumore i bila su uporediva sa 10D1 (donji panel).

SL. 40. Antitumorska aktivnost humanizovanih L3D10 antitela u CTLA4<h/m>miševima. Gornji panel prikazuje raspored tretmana in vivo eksperiment; Ctla4<h/m>miševi su primili kontrolni hlg ili jedno od tri različita anti-humana CTLA4 mab u dozama od 30 (-30, pune linije) ili 10 (-10, isprekidane linije) mg po injekciji na naznačene datume nakon injekcije tumora MC38. Veličina tumora je merena jednom svaka tri dana.

SL. 41. Terapijski efekat anti-CTLA-4 mAb u modelu tumora minimalne bolesti B16-F1. Koristeći model mišjeg tumora B16-F1 kod humanih CTLA4 knock in miševa, posmatrali smo antitumorsku aktivnost humanizovanih L3D10 antitela.1×10<5>B16 tumorske ćelije su ubrizgane (sc) u Ctla4<h/h>miševe (n=5-6). Dana 2, 5 i 8, miševi su tretirani kontrolnim Ig, 10D1, himernim L3D10 ili PP4637 i PP4638 (250 ug/miš, i.p.). Učestalost i veličine tumora mereni su svaki drugi dan. 10D1 naspram hlgGFc: P = 0,00616; L3D10 naspram hlgGFc: P = 0,0269; 10D1 naspram L3D10: P=0,370; PP4637 naspram hlgGFc: P=0,0005; PP4637 naspram 10D1: P=0,805; PP4638 naspram hlgGFc: P=0,0016; PP4638 naspram 10D1: P=0,856. Podaci predstavljaju srednju vrednost ± SEM od 5-6 miševa po grupi. Veličine tumora su smatrane kao 0 za miševe koji nikada nisu razvili tumor.

SL. 42. Poređenje između 10D1, PP4631 i PP4637 ženki zbog njihove kombinovane toksičnosti sa anti-PD-1 mAb. Female CTLA4<h/h>miševi su tretirani 10. ili 11. dana nakon rođenja sa 4 injekcije antitela (100 µg/miševa/injekcija, jednom svaka tri dana) ili kontrolnim Fc kako je navedeno u legendama. Miševi su mereni jednom svaka 3 dana. Prikazani podaci su srednje vrednosti i SEM % povećanja telesne težine tokom perioda od 30 dana. Svi miševi su žrtvovani 43. dana za histološku analizu. Broj miševa korišćenih po grupi prikazan je u zagradama etiketa. SL. 43. Kombinovana terapija sa 10D1 i anti-PD-1 izaziva anemiju, dok ona sa PP4631+anti-PD-1 ili PP4637+anti-PD-1 ne. Prikazani podaci su hematokrit miševa starih 43 dana koji su primili četiri tretmana antitelima 11., 14., 17. i 20. dana u dozama od 100 µg/miš/antitela.

Sl. 44A-B. Kombinovana terapija sa 1001+anti-PD-1 uzrokuje sistemsku aktivaciju T ćelija, dok ona sa PP4631+anti-PD-1 ili PP4637+anti-PD-1 ne. Prikazani podaci su % CD4 (gornji paneli) i CD8 T ćelija (donji paneli) sa fenotipovima naivnih (CD44<lo>CD62L<hi>), centralna memorija (CD44<hi>CD62L<hi>) i efektorska memorija (CD44<hi>CD62Llo) T ćelije u perifernoj krvi (Slika 44A) ili u slezini (Slika 44B). Ćelije su sakupljene od miševa starih 43 dana koji su primili četiri tretmana antitela 11., 14., 17. i 20. dana u dozama od 100 µg/miš/antitela.

SL. 45. Humanizacija L3D10 ne utiče na vezivanje za imobilisani CTLA4. Kapacitet humanizovanih L3D10 antitela da vežu imobilisani CTLA4 je određen kao što je opisano na Sl. 36. X-osa pokazuje koncentraciju anti-CTLA-4 mAbs dodatih u rastvor. Humanizacija ne utiče na vezivanje za imobilizovani CTLA4 i sva 3 humanizovana antitela su pokazala slično vezivanje za roditeljsko himerno L3D10 antitelo i 10D1. Slični obrasci su primećeni kada je CTLA4-lg korišćen umesto CTLA-4-his.

SL. 46. Humanizacija dalje smanjuje vezivanje L3D10 za rastvorljivi CTLA4. Kapacitet humanizovanih L3D10 antitela da vežu rastvorljivi CTLA4 je određen kao što je opisano na Sl.

37. X-osa pokazuje koncentraciju anti-CTLA-4 mAbs obloženih na ELISA pločama. Humanizacija dalje smanjuje vezivanje za rastvorljivi CTLA4 u odnosu na roditeljsko himerno antitelo L3D10. Slični obrasci su primećeni kada je CTLA4-lg korišćen umesto CTLA-4-his. Sl. 47A-B. PP4631, PP4638 i PP4637 ne blokiraju interakcije B7-CTLA-4 in vitro. SL. 47A prikazuje blokiranje interakcije B7-1-CTLA-4 anti-humanih CTLA-4 mAbs 10D1, PP4631, PP4637 i L3D10. B7-1Fc je imobilizovan u koncentraciji od 0,5 µg/ml. Biotinilovani CTLA4-Fc je dodat u količini od 0,25 µg/ml zajedno sa datim dozama antitela. Prikazani podaci su srednje vrednosti duple optičke gustine na 405 nM. SL. 47B prikazuje blokiranje interakcije B7-2-CTLA-4 anti-humanih CTLA-4 mAbs 10D1 i L3D10. Kao na sl.47A, osim što je B7-2-Fc bio imobilisan.

SL. 48. PP4631 i PP4637 ne blokiraju interakcije B7-CTLA-4 in vivo kao što je pokazano njihovim nedostatkom efekta na ekspresiju B7-1 i B7-2 na dendritskim ćelijama. Zbirni podaci o nivoima B7-1 (a) i B7-2 (b) od 3 miša po grupi. Nivoi B7 u kontrolnoj grupi tretiranoj IgG su veštački definisani kao 100%.

SL. 49. PP4637, koji pokazuje najbolji bezbednosni profil u kombinaciji sa anti-PD-1 mAb (videti SLIKU 42), je najmoćniji u izazivanju odbacivanja tumora na osnovu odbacivanja tumora pri najnižim terapeutskim dozama. Ctla4<h/m>miševi su primili kontrolni IgFc ili jedno od tri različita anti-humana CTLA4 mab u dozama od 30 (-30, pune linije) ili 10 (-10, isprekidane linije) µg po injekciji na naznačene datume. Veličine tumora su merene jednom svaka tri dana. Sa 10 µg/injekcija, PP4637 (HL32) je najefikasniji u izazivanju odbacivanja tumora.

SL. 50. Procena čistoće humanizovanih antitela. Prolazno eksprimirana humanizovana L3D10 antitela su prečišćena hromatografijom na proteinu A i uzorci iz sva 3 antitela su procenjeni redukujućim i neredukcionim SDS-PAGE. Prečišćeni proteini su proizveli gel trake indikativne veličine molekula antitela u redukcionim i neredukcionim uslovima. Trake „Izlaz“ pokazuju protok proteina A kolone, što ukazuje da se većina proteina antitela zalepila za kolonu proteina A.

SL. 51. Ekskluziona hromatografija (SE-HPLC) prolazno eksprimiranog proteina. Uzorci proteina za svako od humanizovanih antitela su analizirani pomoću SE-HPLC nakon jednostepene hromatografije na proteinu A. Gornji panel: antitelo PP4631. Srednji panel: antitelo PP4637. Donja ploča: antitelo PP4638.

SL. 52. CE-SDS analiza prolazno izraženog proteina. Uzorci proteina za svako od humanizovanih antitela su analizirani pomoću CE-SDS nakon jednostepene hromatografije na proteinu A. Levi paneli prikazuju rezultate u neredukujućim uslovima, a desni paneli prikazuju rezultate u redukujućim uslovima. Gornji panel: antitelo PP4631. Srednji panel: antitelo PP4637. Donja ploča: antitelo PP4638.

Sl. 53A-C. Profil izoforme punjenja i deamidacija humanizovanih L3D10 antitela kao što je određeno kapilarnim izoelektričnim fokusiranjem (clEF). Nivo deamidacije proteina pod visokim pH stresom je određen poređenjem humanizovanih L3D10 antitela pre i posle tretmana visokim pH tokom dva različita vremenska perioda (5 sati i 12,5 sati) analizirana su clEF analizom. Sl.53A-C pokazuju profile za antitela PP4631, PP4637 i PP4638, respektivno. Sl. 54A-C. Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (DSC) Termička analiza humanizovanih L3D10 antitela. Da bi se odredila termička stabilnost i temperature topljenja različitih antitela, oni su podvrgnuti termalnoj analizi diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC). Sl.54A-C prikazuju normalizovane DSC krive za antitela PP4631, PP4637 i PP4638, respektivno.

SL. 55. Poravnanje humanih, makaki i mišjih CTLA-4 ekstracelularnih domena. Aminokiselinske sekvence humanog (Hm, prikazano crvenom bojom) (SEQ ID NO: 73), makaki (Mk, prikazano crnom) i miša (Ms, prikazano zelenom) CTLA-4 proteinskih ekstracelularnih domena su poređane i očuvane aminokiseline (u odnosu na humanu sekvencu) su prikazane crticama (-). Da bi se pomoglo poravnanju, sekvenca miša ima deleciju i inserciju (u odnosu na sekvence čoveka i majmuna) na pozicijama označenim žutom bojom. Poznato mesto vezivanja B7-1lg je prikazano podebljano i podvučeno. Sekvence pokazuju da su sekvence čoveka i majmuna visoko očuvane, dok sekvenca miša ima brojne razlike u aminokiselinama. Na osnovu ovog poravnanja sekvence, dizajnirano je 11 mutantnih (M1 -M11) (SEQ ID NOS: 40-50) humanih CTLA-4Fc proteina koji uključuju mišje specifične aminokiseline - aminokiseline ugrađene u svaki mutantni protein su prikazane plavom bojom. Sl. 56A-B. Sastav aminokiselinske sekvence WT i mutantnih CTLA-4Fc proteina. DNK konstrukti koji kodiraju WT CTLA-4Fc protein (SEQ ID NO: 39) i 11 mutantnih proteina (SEQ ID NOS: 40-50) koji uključuju mišje Ctla-4 aminokiseline su dizajnirani kako je prikazano. Aminokiselinske sekvence su za zrele proteine, uključujući IgG1 Fc deo, ali ne i signalni peptid. Poznato mesto vezivanja B7-1lg prikazano je velikim plavim slovima i dvostruko podvučeno. Zamenjeni ostaci mišjih aminokiselina u mutantu prikazani su malim slovima crvenom bojom. IgG1 Fc deo proteina je podvučen.

SL. 57. Mutacija u M11 (AA103-106, ILGI>fcGm) selektivno ukida vezivanje antitela za humani CTLA-4. Prikazani podaci su srednja vrednost duplikata, koji prikazuju vezivanje B7-1Fc (a), L3D10 (b), PP4631 (c) i PP4637 (d) vezivanje za hCTLA4-Fc obložene ploče (otvoreni krugovi), mCTLA4-Fc (popunjeni trouglovi), M11 (popunjeni krugovi) i IgG1-Fc (otvoreni trouglovi).

SL. 58. Mapiranje L3D10, PP4631 i PP4637 na epitop pored mesta vezivanja B7-1 u 3-D strukturi kompleksa B7-1-CTLA4. Motiv vezivanja B7-1 je obojen crvenom bojom, dok je epitop antitela obojen ljubičastom bojom. B7-1 je prikazan iznad CTLA4 sa trakom ispunjenom prostorom, dok je CTLA-4 prikazan kao nepopunjena traka.

SL. 59. Sastav aminokiselinske sekvence WT (SEQ ID NO: 39) i mutantnih CTLA-4Fc proteina, M12-M17 (SEQ ID NO: 51-56). DNK konstrukti koji kodiraju 6 mutantnih CTLA-4Fc proteina, M12-M17, koji uključuju mišje Ctla-4 aminokiseline, dizajnirani su kako je prikazano. Aminokiselinske sekvence su za zrele proteine, uključujući IgG1 Fc deo, ali ne i signalni peptid. Poznato mesto vezivanja B7-1lg prikazano je velikim plavim slovima i dvostruko podvučeno. Zamenjeni ostaci mišjih aminokiselina u mutantu prikazani su malim slovima crvenom bojom. IgG1 Fc deo proteina je podvučen.

Sl. 60A-C. Mutaciona analiza otkriva različite zahteve vezivanja za 10D1 (slika 60A), PP4631 (slika 60B) i PP4637 (slika 60C) za CTLA-4. CTLA-4Fc mutanti su obloženi preko noći na 4oC pri 1 µm/ml. Nakon blokiranja sa BSA, dodata je data koncentracija biotinilovanih anti-CTLA-4 mAbs i inkubirana 2 sata. Nakon ispiranja nevezanih antitela, vezana antitela su detektovana streptavidinom obeleženim HRP.

Sl. 61A-B. Terapeutski efekat anti-4-1BB i anti-CTLA-4 antitela i kod modela minimalne bolesti (Slika 61A) i kod modela ustanovljenog tumora (Slika 61B). SL.61A prikazuje terapiju minimalne bolesti. C57BL/6 miševi su inokulisani potkožno sa 5×10<5>MC38 ćelije. Dana 2, 9 i 16 nakon injekcije tumorskih ćelija, ubrizgana su IgG kontrolnog hrčka i pacova, anti-CTLA-4 i/ili anti-4-1BB antitela. Fizičkim pregledom merene su veličine tumora. Prikazani podaci su kinetika rasta tumora, pri čemu svaka linija predstavlja rast tumora kod jednog miša. Prikazane veličine su proizvodi dugog i kratkog prečnika tumora. SL.61B prikazuje terapiju ustanovljenih tumora. Kao na sl.61A, osim što je terapija počela 14. dana nakon izazivanja tumora; svi miševi su imali ustanovljene tumore u rasponu od 9-60 mm<2>veličine pre nego što je započet tretman mAbs. Kombinovani efekat dva antitela na ustanovljene tumore je ponovljen 3 puta.

SL. 62. CD8 T ćelije, ali ne i CD4 ili NK ćelije, neophodne su za odbacivanje tumora izazvano antitelom. Miševi koji nose tumor su osiromašeni sa CD4, CD8 ili NK ćelijama tri injekcije antitela specifičnih za CD4, CD8 ili NK1.1 dana 9, 12 i 16 nakon inokulacije tumorskih ćelija (*). Terapijska antitela (anti-CTLA-4 plus anti-4-1BB) su ubrizgana 9., 16. i 23. dana (vertikalne strelice). Prikazani podaci su srednje vrednosti i SEM veličina tumora (n=3). P < 0,05 za grupu sa osiromašenim CD8 u poređenju sa svakom od ostalih grupa (†). ;Sl. 63A-B. Kombinovana terapija je smanjila odgovor domaćina na anti-CTLA-4 antitela. Antitela hrčka-anti-miš-CTLA-4 (slika 63A) ili pacova-anti-miš-4-1BB (slika 63B) su obložena u ELISA pločama. Na ploče su dodata različita razblaženja seruma iz grupa od po 5 miševa. Relativne količine vezanih antitela su određene korišćenjem reagensa sekundarnog koraka (biotinilovana kozja antimišja antitela koja su apsorpcijom izgubila reaktivnost na IgG pacova i hrčka). Prikazani podaci su srednja vrednost i SEM optičke gustine na 490 nm. Slično smanjenje odgovora antitela domaćina na anti-CTLA-4 i 4-1BB primećeno je kada su miševi bez tumora tretirani istim antitelima (podaci nisu prikazani). ;Sl. 64A-B. Kombinovana terapija sa anti-4-1BB i L3D10 (anti-human-CTLA4) antitelom kod humani CTLA-4 gen knock in miševa. SL.64A pokazuje terapeutski efekat. Humani CTLA4 knock in miševi su inokulisani sa 5×10<5>MC38 tumorske ćelije subkutano. Dva dana kasnije, grupe od 7 miševa su tretirane sa IgG pacova i miša, anti-4-1BB i mišjim IgG, L3D10 i IgG pacova, ili L3D10 i anti-4-1BB, kao što je naznačeno strelicama. Prikazani podaci su srednji volumen tumora i SEM (n=7). Svi tretmani značajno su smanjili rast tumora (P<0,001), a grupa koja je tretirana dvostrukim antitelom pokazuje značajno smanjenje veličine tumora u poređenju sa bilo kontrolnom (P<0,0001) ili L3D10 antitelom (P=0,0007) ili tretmanom anti-4-1BB antitelom (P=0,03). Svi miševi sa tumorom su žrtvovani kada je kontrolna grupa tretirana IgG dostigla kriterijume za rano uklanjanje. SL.64B pokazuje dugotrajan imunitet kod miševa koji su primali kombinovanu terapiju. Miševi bez tumora u grupi tretiranoj dvostrukim antitelima razvili su dugotrajan imunitet na MC38 tumore. 110 dana nakon prvog izazivanja tumorskih ćelija, miševi bez tumora tretirani dvostrukim antitelima ili kontrolni naivni miševi su bili izazvani sa 5×10<5>tumorskih ćelija subkutano. Rast tumora je praćen fizičkim pregledom. Napominje se da su svi miševi koji su odbili tumore u prvom krugu bili potpuno otporni na ponovno izazivanje, dok su svi naivni miševi imali progresivan rast tumora. ;;Definicije ;;[0036] Kako se ovde koristi, termin "antitelo" je namenjen da označi molekul imunoglobulina koji poseduje mesto za prepoznavanje antigena "varijabilnog regiona". Termin "varijabilni region" ima za cilj da razlikuje takav domen imunoglobulina od domena koji su široko zajednički za antitela (kao što je Fc domen antitela). Varijabilni region obuhvata "hipervarijabilni region" čiji su ostaci odgovorni za vezivanje antigena. Hipervarijabilni region sadrži aminokiselinske ostatke iz "regiona za određivanje komplementarnosti" ili "CDR" (tj., obično na približno ostacima 24-34 (L1), 50-56 (L2) i 89-97 (L3) u varijabilnom regionu lakog lanca i na približno 27-35 (H1), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) u promenljivom domenu teškog lanca 44) i/ili one ostatke iz "hipervarijabilne petlje" (tj., ostaci 26-32 (L1), 50-52 (L2) i 91-96 (L3) u varijabilnom domenu lakog lanca i 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) u varijabilni domen teškog lanca; "Okvirni region" ili "FR" ostaci su oni ostaci varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona kako je ovde definisano. Izraz antitela obuhvata monoklonska antitela, multispecifična antitela, humana antitela, humanizovana antitela, sintetička antitela, himerna antitela, kamelizovana antitela, jednolančana antitela, disulfidno povezana Fvs (sdFv), intratela i anti-idiotipska (anti-Id) antitela (uključujući, npr., anti-Id i anti-anti-ld antitela na antitela pronalaska). Konkretno, takva antitela obuhvataju molekule imunoglobulina bilo kog tipa (npr. IgG, IgE, IgM, IgD, IgA i IgI), klase (npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1i IgA2) ili podklase. ;[0037] Kako se ovde koristi, izraz „fragment koji se vezuje za antigen“ antitela odnosi se na jedan ili više delova antitela koji sadrže regione za određivanje komplementarnosti („CDR“) antitela i opciono ostatke okvira koji obuhvataju prepoznavanje antigena „varijabilnog regiona“ antitela, i pokazuju sposobnost da imunospecifično vezuju antigen. Takvi fragmenti uključuju Fab', F(ab').sub.2, Fv, jednolančani (ScFv), i njihove mutante, varijante koje se javljaju u prirodi, i fuzione proteine koji sadrže mesto za prepoznavanje antigena "varijabilnog regiona" antitela i heterologni protein (na primer, toksin, mesto za prepoznavanje antigena za drugačiji antigen, enzim, receptor ili receptorski ligand, itd.). Kako se ovde koristi, termin "fragment" se odnosi na peptid ili polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od najmanje 5 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 10 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 15 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 20 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 25 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 40 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 50 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 60 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 70 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 80 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 80 susednih aminokiselinskih ostataka najmanje 90 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 100 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 125 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 150 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 175 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 200 kontinualnih aminokiselinskih ostataka, najmanje 200 kontinualnih aminokiselinskih ostataka, najmanje 250 susednih aminokiselinskih ostataka. ;[0038] Humana, himerna ili humanizovana antitela su posebno poželjna za in vivo upotrebu kod ljudi, međutim, mišja antitela ili antitela drugih vrsta mogu se koristiti za mnoge upotrebe (npr. in vitro ili in situ testovi detekcije, akutna in vivo upotreba itd.). ;[0039] "Himerno antitelo" je molekul u kome su različiti delovi antitela izvedeni iz različitih molekula imunoglobulina, kao što su antitela koja imaju varijabilni region izveden iz nehumanog antitela i konstantnog regiona humanog imunoglobulina. Himerna antitela koja sadrže jedan ili više CDR iz ne-humane vrste i okvirnih regiona iz molekula humanog imunoglobulina mogu se proizvesti korišćenjem različitih tehnika poznatih u tehnici uključujući, na primer, CDR-grafting (EP 239,400; International Publication No. WWO 91/09967; i U.S. Pat. Nos. ;5,225,539, 5,530,101, i 5,585,089), fasetiranje ili obnavljanje (EP 592,106; EP 519,596;46-48), i mešanje lanca (U.S. Pat. No.5,565,332). ;[0040] Pronalazak se posebno odnosi na "humanizovana antitela". Kako se ovde koristi, termin "humanizovano antitelo" se odnosi na imunoglobulin koji sadrži humani okvirni region i jedan ili više CDR iz ne-humanog (obično miša ili pacova) imunoglobulina. Nehumani imunoglobulin koji obezbeđuje CDR naziva se „donator“, a humani imunoglobulin koji obezbeđuje okvir naziva se „akceptor“. Konstantni regioni ne moraju biti prisutni, ali ako jesu, moraju biti suštinski identični konstantnim regionima humanog imunoglobulina, tj. najmanje oko 85-90%, poželjno oko 95% ili više identični. Dakle, svi delovi humanizovanog imunoglobulina, osim eventualno CDR, su suštinski identični odgovarajućim delovima sekvenci prirodnog humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo je antitelo koje sadrži humanizovani laki lanac i humanizovani teški lanac imunoglobulina. Na primer, humanizovano antitelo ne bi obuhvatalo tipično himerno antitelo, jer, na primer, ceo varijabilni region himernog antitela nije human. U jednom slučaju donorsko antitelo je "humanizovano" procesom "humanizacije", jer se očekuje da se dobijeno humanizovano antitelo veže za isti antigen kao i donorsko antitelo koje obezbeđuje CDR. Uglavnom, humanizovana antitela su humani imunoglobulini (antitelo primaoca) u kojima su ostaci hipervarijabilnog regiona primaoca zamenjeni ostacima hipervarijabilnog regiona ne-humane vrste (donorsko antitelo) kao što su miš, pacov, zec ili ne-human primat koji ima željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci humanog imunoglobulina okvirnog regiona (FR) se zamenjuju odgovarajućim ostacima koji nisu humani. Dodatno, humanizovana antitela mogu da sadrže ostatke koji se ne nalaze u antitelu primaoca ili u antitelu donora. Ove modifikacije su napravljene da bi se dodatno poboljšale performanse antitela. Uopšteno govoreći, humanizovano antitelo će sadržati u suštini sve od najmanje jednog, a tipično dva, varijabilna domena, u kojima svi ili suštinski svi hipervarijabilni regioni odgovaraju onima ne-humanog imunoglobulina i svi ili suštinski svi FR su one sekvence humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo opciono će takođe sadržati najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično onaj humanog imunoglobulina koji se imunospecifično vezuje za Fc.gama.RIIB polipeptid, koji je izmenjen uvođenjem supstitucija, delecija ili dodavanja aminokiselinskih ostataka (tj. mutacija). ;;Detaljan opis ;;[0041] Pokazalo se da antitelo protiv humanog CTLA4 proteina, Ipilimumab, povećava preživljavanje pacijenata sa kancerom, bilo kao jedini imunoterapijski agens ili u kombinaciji sa drugim terapeutskim agensima kao što je, bez ograničenja, anti-PD-1 antitelo (13- 15). Međutim, terapeutski efekat je povezan sa značajnim neželjenim efektima (13-18). Postoji velika potreba za razvojem novih anti-CTLA4 antitela da bi se postigao bolji terapeutski efekat i/ili manje autoimuno neželjeno dejstvo. Pronalazači su otkrili anti-CTLA4 antitelo koje se, iznenađujuće, može koristiti da izazove odbacivanje kancera, istovremeno smanjujući autoimune neželjene efekte povezane sa imunoterapijom. ;[0042] Ovde su date kompozicije antitela i njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen. Pronalazak se dalje odnosi na izvođenje takvih molekula gde je molekul monoklonsko antitelo, ljudsko antitelo, himerno antitelo ili humanizovano antitelo. ;[0043] Detaljno, pronalazak obezbeđuje molekul, koji sadrži fragment antitela koji se vezuje za antigen koji se imunospecifično vezuje za humani CTLA4, poželjno eksprimiran na površini žive ćelije u endogenoj ili transfektovanoj koncentraciji. Pronalazak se posebno odnosi na izvođenje takvog molekula gde se fragment koji se vezuje za antigen vezuje za CTLA4, i gde je živa ćelija T ćelija. ;[0044] Ovaj pronalazak se odnosi na antitela koja su sposobna da se imunospecifično vežu za CTLA4. U nekim primerima izvođenja takvi molekuli su dodatno sposobni da blokiraju vezivanje B7.1 i B7.2 za CTLA4. ;[0045] Pronalazak se dalje odnosi na izvođenje takvih molekula gde je molekul monoklonsko antitelo, humano antitelo, himerno antitelo ili humanizovano antitelo. Otkriće uključuje primere izvođenja u kojima su takva antitela monospecifična, bispecifična, trispecifična ili multispecifična. ;[0046] Otkriće se dalje odnosi na izvođenje takvih molekula ili antitela koja se vezuju za CTLA4, i gde njihov fragment koji se vezuje za antigen sadrži šest CDR, pri čemu CDR sadrže CDR anti-CTLA4 antitela L3D10. Konkretno, antitelo sadrži tri laka lanca i tri teška lanca CDR anti-CTLA4 antitela L3D10. ;[0047] Otkriće se dalje odnosi na izvođenje gore opisanih antitela, gde je antitelo detektabilno obeleženo ili sadrži konjugovani toksin, lek, receptor, enzim, receptorski ligand. ;[0048] Pronalazak se dalje odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži terapeutski efikasnu količinu bilo koje od kompozicija antitela za koje je tražena zaštita, i fiziološki prihvatljiv nosač ili ekscipijent. Poželjno, kompozicije pronalaska sadrže profilaktički ili terapeutski efikasnu količinu humanizovanih antitela pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač ;[0049] U specifičnom primeru izvođenja, izraz "farmaceutski prihvatljiv" označava odobrenje od strane regulatorne agencije savezne ili državne vlade ili je naveden u Farmakopeji SAD ili drugoj opšte priznatoj farmakopeji za upotrebu kod životinja, a tačnije kod ljudi. Izraz "nosač" odnosi se na razblaživač, pomoćno sredstvo (npr. Frojndov adjuvans (kompletan i nepotpun), ekscipijent ili vehikulum sa kojim se primenjuje terapeutik. Takvi farmaceutski nosači mogu biti sterilne tečnosti, kao što su voda i ulja, uključujući one naftnog, životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla, kao što je ulje od kikirikija, sojino ulje, mineralno ulje, susamovo ulje i slično koji se koriste kao tečni nosači, posebno za rastvore za injekcije. Pogodni farmaceutski ekscipijenti uključuju skrob, glukozu, laktozu, saharozu, želatin, slad, pirinač, brašno, kredu, silika gel, natrijum stearat, glicerol monostearat, talk, natrijum hlorid. glicerol, propilen, glikol, vodu, etanol i slično. Kompozicija, ukoliko je poželjno, može takođe sadržati manje količine sredstava za vlaženje ili emulgiranja, ili pH pufera. Ove kompozicije mogu biti u obliku rastvora, suspenzija, emulzija, tableta, pilula, kapsula, prahova, formulacija sa produženim oslobađanjem i slično. ;[0050] Generalno, sastojci kompozicija pronalaska mogu da se isporučuju ili odvojeno ili pomešani zajedno u jediničnom doznom obliku, na primer, kao suvi liofilizovani prah ili koncentrat bez vode u hermetički zatvorenoj posudi kao što je ampula ili kesica koja pokazuje količinu aktivnog agensa. Tamo gde se smeša primenjuje infuzijom, ona se može izdati sa bocom za infuziju koja sadrži sterilnu vodu ili fiziološki rastvor farmaceutskog kvaliteta. Kada se kompozicija daje injekcijom, može se obezbediti ampula sterilne vode za injekcije ili fiziološkog rastvora tako da se sastojci mogu mešati pre primene. ;[0051] Kompozicije pronalaska mogu biti formulisane kao neutralni ili oblici soli. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju, ali nisu ograničene na, one formirane sa anjonima kao što su oni dobijeni iz hlorovodonične, fosforne, sirćetne, oksalne, vinske kiseline, itd., i one formirane sa katjonima kao što su oni dobijeni od natrijuma, kalijuma, amonijuma, kalcijuma, gvožđe hidroksida, izopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanola, histidina, prokaina itd. ;[0052] Otkriće se dalje odnosi na upotrebu ovde opisanih kompozicija antitela i njihovih farmaceutskih kompozicija za pojačanu regulaciju imunoloških odgovora. Povećana modulacija imunog sistema je posebno poželjna u lečenju kancera i hroničnih infekcija, i stoga ovaj pronalazak ima koristi u lečenju takvih poremećaja. Kako se ovde koristi, izraz "rak" se odnosi na neoplazmu ili tumor koji je rezultat abnormalnog nekontrolisanog rasta ćelija. Kako se ovde koristi, rak eksplicitno uključuje leukemije i limfome. Termin se odnosi na bolest koja uključuje ćelije koje imaju potencijal da metastaziraju na distalna mesta. ;[0053] Shodno tome, kompozicije pronalaska mogu takođe biti korisne u lečenju ili prevenciji različitih kancera ili drugih abnormalnih proliferativnih bolesti, uključujući (ali bez ograničenja na) sledeće: karcinom, uključujući karcinom bešike, dojke, debelog creva, bubrega, jetra, pluća, jajnika, pankreasa, želuca, grlića materice, štitne žlezde i kože; uključujući karcinom skvamoznih ćelija; hematopoetski tumori limfoidne loze, uključujući leukemiju, akutnu limfocitnu leukemiju, akutnu limfoblastnu leukemiju, B-ćelijski limfom, T-ćelijski limfom, Berketts limfom; hematopoetski tumori mijeloidne loze, uključujući akutne i hronične mijeloidne leukemije i promijelocitne leukemije; tumori mezenhimalnog porekla, uključujući fibrosarkom i rabdomiokarkom; drugi tumori, uključujući melanom, seminom, teratokarcinom, neuroblastom i gliom; tumori centralnog i perifernog nervnog sistema, uključujući astrocitom, neuroblastom, gliom i švanom; tumori mezenhimalnog porekla, uključujući fibrosarkom, rabdomiosarkom i osteosarkom; i drugi tumori, uključujući melanom, ksenodermu pegmentosum, keratoaktantom, seminom, folikularni karcinom štitne žlezde i teratokarcinom. Takođe se smatra da bi kanceri izazvani aberacijama u apoptozi takođe bili tretirani postupcima i kompozicijama pronalaska. Takvi karcinomi mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, folikularne limfome, karcinome sa p53 mutacijama, hormonski zavisne tumore dojke, prostate i jajnika, i prekancerozne lezije kao što su porodična adenomatozna polipoza i mijelodisplastični sindromi. U specifičnim primerima izvođenja, malignitet ili disproliferativne promene (kao što su metaplazije i displazije), ili hiperproliferativni poremećaji, se leče ili sprečavaju postupcima i kompozicijama pronalaska u jajnicima, bešici, dojci, debelom crevu, plućima, koži, pankreasu ili materici. U drugim specifičnim primerima izvođenja, sarkom, melanom ili leukemija se leče ili sprečavaju postupcima i kompozicijama pronalaska. ;[0054] U drugom aspektu pronalaska, njihove kompozicije antitela mogu se koristiti sa drugim antitumorskim terapijama, uključujući, ali ne ograničavajući se na, trenutne standardne i eksperimentalne hemoterapije, hormonske terapije, biološke terapije, imunoterapije, terapije zračenjem ili hirurgiju. U nekim primerima izvođenja, molekuli pronalaska se mogu davati u kombinaciji sa terapeutski ili profilaktički efikasnom količinom jednog ili više agenasa, terapeutskih antitela ili drugih agenasa poznatih stručnjacima za lečenje i/ili prevenciju raka, autoimunih bolesti, infektivne bolesti ili intoksikacije. Takvi agensi uključuju, na primer, bilo koji od gore diskutovanih modifikatora biološkog odgovora, citotoksine, antimetabolite, alkilujuće agense, antibiotike ili antimitotičke agense, kao i imunoterapeutike. ;[0055] U poželjnom primeru izvođenja pronalaska, njihove kompozicije antitela mogu se koristiti sa drugim antitumorskim imunoterapijama. U takvom primeru izvođenja, molekuli pronalaska se daju u kombinaciji sa molekulima koji ometaju ili poboljšavaju alternativne imunomodulatorne puteve (kao što su TIM3, TIM4, OX40, CD40, GITR, 4-1-BB, B7-H1, PD-1, B7 -H3, B7-H4, LIGHT, BTLA, ICOS, CD27 ili LAG3) ili moduliraju aktivnost efektorskih molekula kao što su citokini (npr. IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, GF-beta, IFNg, Flt3, Blis) i hemokini (npr. CCL21) u cilju poboljšanja imunomodulatornih efekata. Specifični primeri uključuju bispecifično antitelo koje sadrži kompozicije anti-CTLA4 antitela opisane ovde i anti-PD-1 (pembrolizumab (Keytruda) ili Nivolumab (Opdivo)), anti-B7-H1 (atezolizumab (Tecentrik) ili durvalumab), anti -B7-H3, anti-B7-H4, anti-LIGHT, anti-LAG3, anti-TIM3, anti-TIM4 anti-CD40, anti-OX40, anti-GITR, anti-BTLA, anti-CD27, anti-ICOS ili anti-4-1BB. Molekuli pronalaska se mogu davati u kombinaciji sa molekulima koji aktiviraju različite stadijume ili aspekte imunog odgovora da bi se postigao širi imuni odgovor. U poželjnijem primeru izvođenja, kompozicije antitela i njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen su kombinovani sa anti-PD-1 ili anti-4-1BB antitelima, bez pogoršanja autoimunih neželjenih efekata. ;[0056] Otkriće dalje uključuje bi-specifično antitelo koje sadrži antitelo koje se vezuje za CTLA4 premošćeno za antitelo koje vezuje druge imunostimulišuće molekule. Specifični primeri uključuju bi-specifično antitelo koje sadrži kompozicije anti-CTLA4 antitela opisane ovde i anti-PD-1, anti-B7-H1, anti-B7-H3, anti-B7-H4, anti-LIGHT, anti-LAG3, anti-TIM3, anti-TIM4 anti-CD40, anti-OX40, anti-GITR, anti-BTLA, anti-CD27, anti-ICOS ili anti-4-1BB. Otkriće se dalje odnosi na upotrebu takvih antitela za lečenje raka. ;[0057] Postupci primene kompozicija antitela prema pronalasku uključuju, ali nisu ograničene na, parenteralnu primenu (npr. intradermalno, intramuskularno, intraperitonealno, intravenozno i subkutano), epiduralnu i mukoznu (npr., intranazalni i oralni putevi). U specifičnom primeru izvođenja, antitela pronalaska se primenjuju intramuskularno, intravenozno ili subkutano. Kompozicije se mogu davati bilo kojim pogodnim putem, na primer, infuzijom ili bolus injekcijom, apsorpcijom kroz epitelne ili mukokutane obloge (npr. oralnu sluzokožu, rektalne i crevne sluzokože, itd.) i mogu se davati zajedno sa drugim biološki aktivnim agensima. Primena može biti sistemska ili lokalna. ;[0058] Još jedan primer izvođenja pronalaska se odnosi na praćenje efekata blokiranja anti-CTLA4 antitela in vivo praćenjem nivoa ekspresije B7.1 i B7.2 na imunim ćelijama kao što su ćelije koje predstavljaju antigen (APC). CTLA4 se pretežno eksprimira među Treg gde potiskuje autoimune bolesti tako što smanjuje ekspresiju B7-1 i B7-2 na APC kao što su dendritske ćelije. Stoga, regulacija B7 molekula, B7.1 i B7.2, može biti kao očitavanje za in vivo blokadu interakcija B7-CTLA4. U specifičnom primeru izvođenja, periferne ili intratumoralne imune ćelije se uklanjaju sa subjekta pre i posle tretmana anti-CTLA4 i testiraju npr. ex vivo za smanjenje nivoa B7.1 i/ili B7.2 na površini imune ćelije, pri čemu prisustvo blokirajućih anti-CTLA4 antitela sprečava vezivanje B7.1/B7.2 endogenim CTLA4, što zauzvrat sprečava smanjenje B7.1 i B7.2, što rezultuje neto povećanjem ekspresije B7.1/B7.2. U poželjnom izvođenju, nivo B7.1 i B7.1 se meri na ćelijama koje predstavljaju antigen. U najpoželjnijem izvođenju, nivo B7.1 i B7.1 se meri na dendritskim ćelijama. ;[0059] U daljem izvođenju, promena (smanjenje) u B7.1 i B7.2 na imunim ćelijama nakon tretmana sa anti-CTLA4 se koristi kao biomarker za merenje biološke aktivnosti anti-CTLA4 antitela in vivo i praćenje patentnih odgovora na tretman anti-CTLA4 merenjem nivoa ekspresije B7.1 i/ili B7.2 na imunim ćelijama, i poređenjem nivoa ekspresije pre i posle tretmana. U poželjnom izvođenju, nivo ekspresije B7.1 i/ili B7.2 se prati tokom vremena trajanja anti-CTLA4 terapije. ;;Primeri ;;Primer 1. Generisanje himernih anti-CTLA4 antitela ;[0060] Koristeći humani CTLA4 gen knock-in miševe i hu-PBL-Scid miševe, ranije je pokazano da mišja anti-humana CTLA4 antitela smanjuju rast tumora i identifikuju L3D10 kao najefikasniji među testiranim mAbs panelima. Međutim, nijedno od dobijenih antitela nije moglo da postigne potpuno odbacivanje tumora, čak i kada se koristi u relativno visokim dozama od (>10 mg/kg) i pre formiranja opipljivih tumora (već 2. dan) nakon izazivanja tumorskih ćelija (19-21). ). ;[0061] Pošto su mišja antitela bila IgG1 podklase koja nema jaku ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), i pošto je ADCC možda uključen u odbacivanje tumora, Fc mAb je modifikovan na nekoliko načina, kako bi se postigao bolji imunoterapeutski efekat. Prvo, mišji IgG1, koji je slab u ADCC, zamenjen je da bi se proizvelo himerno antitelo sa humanim IgG1, koje ima jaku ADCC aktivnost. Drugo, na osnovu poznate tehnike u literaturi (22), tri mutacije (S298A, E333A i K334A) su uvedene u CH da bi se povećala aktivnost ADCC. Treće, uvedene su tri mutacije (M252I, S254T i T256E) da bi se produžio poluživot antitela in vivo (23). Dizajn novog himernog antitela je prikazan na Sl.1, levi panel. ;[0062] Da bi se konstruisalo antitelo, varijabilni regioni L3D10 hibridoma su prvo identifikovani sekvenciranjem DNK korišćenjem standardnih metoda poznatih u tehnici. Nukleotidne sekvence su prevedene u aminokiseline navedene u SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2. Normalna humana IgG1 Fc sekvenca i mutantna Fc sekvenca su otkrivene u SEQ ID NO: 3 i SEQ ID NO: 4, respektivno. Nukleotidne sekvence sekvenci teških i lakih lanaca optimizovane za aminokiseline i kodone su date u SEQ ID NOS: 5-8. ;[0063] DNK koja odgovara SEQ ID NO: 5 i SEQ ID NO: 7 je sintetizovana i umetnuta u ekspresione vektore, a vektori su transfektovani dizajniranom sekvencom u ćelije HEK293. Ukratko, HEK293 ćelije su zasejane u bočicu za mućkanje jedan dan pre transfekcije i uzgajane su korišćenjem hemijski definisanog medijuma bez seruma. Konstrukti DNK ekspresije su privremeno transfektovani u 0.5 litara suspenzije HEK293 ćelija korišćenjem standardne operativne procedure za prolaznu transfekciju. Posle 20 sati, uzorkovane su ćelije da bi se dobila vitalnost i broj živih ćelija, a titar je meren (Octet QKe, ForteBio). Dodatna očitavanja su vršena tokom proizvodnih ciklusa prolazne transfekcije. Kultura je sakupljena 5. dana. Kondicionirani medijum za L3D10 je sakupljen i izbistren iz proizvodnje prolazne transfekcije sprovedene centrifugiranjem i filtracijom. Supernatant je pušten preko kolone Protein A i eluiran puferom sa niskim pH. Filtracija pomoću 0,2 µm membranskog filtera je izvedena pre alikvotiranja. Posle prečišćavanja i filtracije, koncentracija proteina je izračunata iz OD280 i koeficijenta ekstinkcije. Ukupno 43,2 mg Ig proteina dobijeno je iz jedne runde transfekcije. ;Primer 2. Himerna mesta vezivanja L3D10 antitela samo se delimično preklapaju sa 10D1 ;;[0064] U klinici se pokazalo da anti-CTLA4 antitelo, Ipilimumab, poboljšava preživljavanje pacijenata sa rakom, ali izaziva značajan autoimuni neželjeni efekat. Da bi se procenila uporedna mesta vezivanja himernog L3D10 antitela i 10D1, upoređeno je vezivanje za CTLA4 i sposobnost antitela da se takmiče za vezivanje za CTLA4. Dok se oba antitela vezuju za imobilizovane CTLA4 proteine sa uporedivom efikasnošću (Slika 2), 10D1 ne blokira u potpunosti vezivanje himernog L3D10 za CTLA4 (Slika 3). Kao što se očekivalo, neobeleženi L3D10 u potpunosti blokira obeleženo L3D10 vezivanje, što ukazuje da se mesta vezivanja antitela L3D10 i 10D1 samo delimično preklapaju. ;;Primer 3. Efikasnija blokada CTLA4:B7.1 i CTLA4:B7.2 interakcija himernim L3D10 antitelom nego 10D1 ;;[0065] Prijavljeno je da anti-humano CTLA4 mAb, 10D1, može blokirati interakciju B7-CTLA4 ako su rastvorljivi B7-1 i B7-2 korišćeni za interakciju sa imobilisanim CTLA4 (49). Pošto B7-1 i B7-2 funkcionišu kao kostimulativni molekuli na površini ćelije, procenili smo sposobnost anti-CTLA4 antitela da blokiraju interakciju B7-CTLA4 korišćenjem imobilizovanih B7-1 i B7-2. Koristeći kompetitivni format ELISA testa, sposobnosti L3D10 i 10D1 da blokiraju vezivanje CTLA4 fuzionog proteina, CTLA4-lg, za B7.1 i B7.2 imobilisanu na ploči i na ćelijsku membranu. Za ove eksperimente korišćeno je himerno anti-humano CTLA4-mAb sa afinitetom (2,3 nM) koji je sličan 10D1 (4 nM) (49). Za testove sa imobilizacijom ploče, B7.1Fc ili B7.2Fc su obloženi na ELISA ploču sa 1 ug/ml preko noći na 4°C ili 2 sata na 37°C. Biotinilovani CTLA4-Fc su pomešani sa datim koncentracijama bilo B7.1-Fc, 10D1 ili himernog L3D10. Količina CTLA4-Fc vezanog za B7.1 na ploči je određena korišćenjem streptavidina konjugovanog s peroksidazom rena. Kao što je prikazano na Sl. 4, dok su himerni L3D10, B7.1Fc i CTLA4-Fc efikasno blokirali interakciju CTLA4-Fc:B7.1, dve odvojene serije materijala 10D1 nisu uspele da blokiraju interakciju. L3D10 pokazuje značajno blokiranje vezivanja B7.1 imobilisanog na ploči pri koncentracijama od čak 0,2 µg/ml, postižući inhibiciju od 50% (IC50) na oko 3 µg/ml. Slično, L3D10 je blokirao vezivanje CTLA4-Fc vezivanja za ploču imobilizovanu B7.2 sa IC50od 0,03 µg/ml, dok je 10D1 iz dve različite serije materijala pokazao minimalno blokiranje sa IC50od približno 200 µg/ml (Slika 5). Međutim, u skladu sa prethodnim nalazom (49), antitelo 10D1 snažno inhibira interakciju B7-1-CTLA4 u obrnutom eksperimentu kada se CTLA4 imobilisan na ploči koristi za interakciju sa rastvorljivim B7-1 (Slika 6). ;[0066] Za eksperimente vezivanja proteina ćelijske membrane, kada je B7.1 eksprimiran na površini CHO ćelija, L3D10 blokira vezivanje CTLA4-Fc, ali 10D1 iz dve različite serije materijala nije, čak i kada se koristi pri 512 µg/ml (Slika 7 ). Iako su mnogo manje potentne od L3D10, visoke doze 10D1 su postigle približno 25% blokiranja između humanog CTLA4 i mišjeg B7-1 (Slika 8). Za B7.2 eksprimiran na površini CHO ćelije, L3D10 je ponovo blokirao, dok je 10D1 bio samo delimično blokiran, sa manje od 50% inhibicije primećeno čak i kada je 10D1 korišćen pri 512 µg/ml (Slika 9). ;[0067] Potencijalno upozorenje je da je biotinilacija možda uticala na vezivanje 10D1 za CTLA4-Fc. Da bismo rešili ovaj problem, uporedili smo vezivanje L3D10 i 10D1 za biotinilovani CTLA4-Fc koji se koristi u studijama blokiranja. Kao što je prikazano na Sl. 10, 10D1 je efikasniji od L3D10 u vezivanju biotinilovanog CTLA4-Fc. Stoga, neuspeh u blokadi od strane 10D1 nije bio posledica nedovoljnog vezivanja za biotinilovani CTLA4-Fc. Sličan obrazac je primećen kada je CTLA4 označen polihistidinom korišćen za interakciju sa humanim B7-1 transfektovanim CHO ćelijama (Slika 11). Uzeti zajedno, naši podaci sugerišu da je sposobnost antitela 10D1 da blokira interakciju B7-CTLA4 u velikoj meri zavisna od primenjenog testa, sa minimalnom ili nikakvom uočljivom aktivnošću blokiranja ako su B7-1 i B7-2 imobilizovani, dok je antitelo L3D10 snažan blokator za interakciju B7-CTLA4 bez obzira da li je protein B7 imobilizovan. ;;Primer 4. Himerno L3D10 antitelo je više efikasano nego nemodifikovani L3D10 u izazivanju odbacivanja tumora ;;[0068] Ranije je objavljeno da miš L3D10 nije uspeo da izazove potpunu remisiju MC38 tumora, iako su primećena značajna kašnjenja (19, 20). Da bi se utvrdilo da li himerni L3D10 može izazvati potpunu remisiju kod singenih miševa, 1×10<6>MC38 tumorske ćelije su transplantirane u singene C57BL/6 miševe. Nedelju dana kasnije, kada tumor dostigne oko 5 mm u prečniku, miševi su tretirani ili kontrolnim IgG ili himernim L3D10 mAb u dozi koja je samo polovina one koja je korišćena u prethodnim studijama sa L3D10 miša. Kao što je prikazano na Sl. 12, uprkos mogućoj imunogenosti humane Ig sekvence, otkriveno je da je himerni L3D10 izazvao potpunu remisiju kod svih testiranih miševa. Pošto je lečenje započeto kada su ustanovljena velika tumorska opterećenja, što je mnogo teže nego kada tumori nisu bili opipljivi (19), ovi eksperimenti pokazuju da je himerni L3D10 efikasniji od nemodifikovanog L3D10. ;;Primer 5. Himerno L3D10 antitelo ima ekvivalentnu aktivnost kao 10D1 u izazivanju odbacivanja tumora ;;[0069] Dostupnost humanih CTLA4 gena knock in miševa (20) pružila je priliku bez presedana da se testira biološka aktivnost himernog anti-humanog CTLA-4 antitela sa klinički korišćenim anti-CTLA-4 mAb, 10D1. U ovom modelu humanizovanog miša, CTLA4 gen koji kodira proizvod sa 100% identitetom sa humanim CTLA-4 proteinom je eksprimiran pod kontrolom endogenog Ctla4 lokusa miša. Kada se antitumorska aktivnost himernih L3D10 i 10D1 direktno uporedi u modelu tumora MC38 kod humanih CTLA4-knock in miševa, jasno je da su oba antitela bila uporediva u izazivanju odbacivanja tumora, dok su tumori progresivno rasli u IgG kontrolnoj grupi. SL. 13 prikazuje rezultate tretmana antitelima na veličinu tumora iz duplih eksperimenata. ;[0070] Interesantno pitanje je da li anti-CTLA-4 mAbs treba da stupe u interakciju sa svim CTLA-4 (tj. da postignu ciljno zasićenje) da bi ispoljile imunoterapeutski efekat. F1 miševi iz CTLA4<h/h>i CTLA4<m/m>miševi eksprimiraju i mišji i humani CTLA-4 protein na ko-dominantni način. Zanimljivo, kao što je prikazano na Sl.14, i himerni L3D10 i 10D1 su efikasno izazvali odbacivanje tumora, iako približno 50% proteina CTLA-4 (tj. mišja verzija proteina) ne može biti vezano anti-humanim CTLA-4 mAbs. Važno je da je L3D10 terapeutski efikasniji od 10D1 u ovom okruženju, tj. kada su doze gena ograničene (P<0,05). ;[0071] Prethodne studije su pokazale da anti-mišja Ctla-4 mAbs ne mogu da izazovu odbacivanje ćelijske linije melanoma B16-F1 bez kombinacije sa drugim terapijskim modalitetima. Zbog toga je antitumorski efekat himernih L3D10 i 10D1 antitela takođe testiran korišćenjem ovog izazovnijeg modela tumora B16 kod humanih CTLA4 knock in miševa. Kao što je prikazano na Sl. 15, dok ni L3D10 ni Ipilimumab nisu bili sposobni da izazovu odbacivanje ustanovljenih tumora, oba uzrokuju statistički značajno usporavanje rasta tumora, dok razlike između različitih antitela nisu statistički značajne. ;;Primer 6: CTLA4 blokiranje in vivo ;;[0072] CTLA4 se pretežno eksprimira među Treg gde potiskuje autoimune bolesti tako što smanjuje ekspresiju B7-1 i B7-2 na dendritskim ćelijama (50). Od ciljane mutacije Ctla4 (50) i tretman sa blokirajućim anti-CTLA4 mAb (51) povećava ekspresiju B7-1 i B7-2 na dendritskim ćelijama, sugerisano je da je fiziološka funkcija CTLA4 na Treg da smanji B7 na DC. Stoga je regulacija B7 korišćena kao očitavanje za in vivo blokadu B7-CTLA4 interakcija i razvijen je test koristeći T ćelije iz Ctla4<h/h>miševa koji su imali homozigotni knock in humani CTLA4 gen. ;[0073] Kao što je prikazano na Sl.16, površinski eksprimirani B7.1 ili B7.2 vezuje CTLA4 na površini T ćelija, što dovodi do smanjenja ekspresije B7.1 i B7.2. Međutim, vezivanje blokirajućih anti-CTLA4 antitela sprečava vezivanje B7.1/B7.2, što sprečava smanjenje regulacije B7.1 i B7.2, što dovodi do neto povećanja ekspresije B7.1/B7.2. Međutim, sa himernim T ćelijama koje eksprimiraju i humani i mišji CTLA4, antitela koja vezuju humani CTLA4 ne sprečavaju vezivanje B7.1/B7.2 za mišji CTLA4, što obnavlja inhibiciju B7.1/B7.2. ;[0074] CTLA4 humanizovani miševi koji eksprimiraju CTLA4 gen sa 100% identifikuju se sa humanim CTLA4 proteinom pod kontrolom endogenog miša Ctla4 opisan je lokus (20). Homozigotni knock-in miševi (CTLA4<h/h>) su ponovo ukršteni na pozadinu C57BL/6 tokom najmanje 10 generacija. Heterozigotni miševi (CTLA4<h/m>) proizvedeni su ukrštanjem CTLA4<h/h>miševi sa WT BALB/c miševima. ;[0075] Da bismo testirali klinički dokazano terapeutsko anti-CTLA4 mAb, 10D1, ubrizgali smo veoma visoke doze anti-CTLA4 mAb (500 µg/mišu, što je otprilike 25 mg/kg ili 8 puta veća doza koja se koristi u klinici) u Ctla4<h/h>ili Ctla4<m/h>miševi i sakupljene ćelije slezine za merenje nivoa B7-1 i B7-2 na Cd11c<hi>DC 24 sata nakon injekcije (Slike 17A-B). Kao što je prikazano na Sl. 17C-E, u poređenju sa Ctla4<h/h>miševi koji su primili humani IgG1-Fc, DC od miševa tretiranih himernim L3D10 imali su statistički značajno povećanje ekspresije B7.1 u T ćelijama koje eksprimiraju humani CTLA4, ali ne i u T ćelijama koje eksprimiraju i humani i mišji CTLA4. Slični rezultati su viđeni za B7.2 kao što je prikazano na Sl.17C-E. ;[0076] Magnituda regulacije u B7-2 je uporediva sa onim što je postignuto korišćenjem blokirajućeg anti-CTLA4 mAb u humanoj Treg-DC ko-kulturi (66). ;[0077] Da bi se dodatno potvrdila specifičnost in vivo testom, testirali smo da li L3D10 može da reguliše B7 kod Ctla4<m/h>miševa kod kojih su mišji i humani CTLA4 eksprimirani kodominantno. Pošto se najmanje 50% CTLA4 ne vezuje za anti-humana CTLA4 antitela, očekuje se da će ona biti manje moćna u blokiranju interakcije B7-CTLA4. Zaista, nijedno antitelo nije izazvalo povećanje regulacije B7-1 i B7-2 na DC od Ctla4<m/h>miševa (Slika 17C, D, F). Potpuni nedostatak blokade od strane L3D10 u Ctla4<m/h>miševima sugeriše da je CTLA4 kodiran mišjim alelom, koji se ne vezuje za L3D10 (slika 18), dovoljan da smanji ekspresiju B7. Tako su naši podaci pokazali da pri dozama koje su najmanje 8 puta veće od najveće doze korišćene u klinici, 10D1 ne blokira interakciju B7-CTLA4 kada je B7 ili imobilizovan na ploči ili usidren na ćelijskoj membrani, oba in vivo i in vitro. ;[0078] Potpuni nedostatak blokade od strane L3D10 u Ctla4<m/h>miševima sugerišu da je CTLA4 kodiran mišjim alelom, koji se ne vezuje za L3D10 (slika 18), dovoljan da smanji ekspresiju B7. Nasuprot tome, 10D1 nije povećao ekspresiju B7.1 ili B7.2. Prema modelu, ovo sugeriše da L3D10 blokira aktivnost CTLA4 in vivo dok 10D1 ne. ;[0079] Međutim, uprkos ovim očiglednim razlikama u aktivnosti blokiranja, i L3D10 i 10D1 pokazuju snažnu antitumorsku aktivnost protiv MC38 modela u himernom CTLA4<m/h>miševima, kao što je prikazano na Sl. 19. Dok je tumor progresivno rastao kod kontrolnih miševa tretiranih Ig, potpuno odbacivanje je postignuto bilo kojim anti-CTLA4 mAb. U više eksperimenata, dva antitela su uporediva u izazivanju odbacivanja tumora. U drugom modelu tumora, B16 melanomu, oba antitela su izazvala slično usporavanje rasta tumora, iako nije postignuto potpuno odbacivanje ni jednim antitelom (Slika 20). ;;Primer 7: Antitumorski efekti su povezani sa intratumorskim smanjenjem Treg ;;[0080] Imunološka regulacija in vivo rezultat je ravnoteže između aktivacije imunih ćelija i imunoloških kontrolnih tačaka. Konkretno, regulatorne T ćelije (Treg) su subpopulacija T ćelija koje regulišu imuni sistem, održavaju toleranciju na auto-antigene i poništavaju autoimunu bolest. Nedavne studije su pokazale da na terapeutsku efikasnost antimišjeg CTLA4 mAb utiče Fc podklasa i Fc receptor domaćina, koji zauzvrat utiču na citotoksičnost Treg zavisnu od antitela selektivno unutar tumorskog mikrookruženja (52, 53). Kao diferencijalna aktivnost blokiranja CTLA4 in vivo izgleda da se ne prevede na razlike u antitumorskoj aktivnosti, pokušali smo da ustanovimo mehanizam delovanja pomoću kojih se javlja antitumor i pogledali smo Treg u mikrookruženju tumora. Da bismo to uradili, žrtvovali smo miševe sa tumorom MC38 pre nego što su odbacivanja završena (slika 21) i analizirali učestalost Treg u Ctla4<h/h>knock in miševima koji su primili kontrolni Ig, 10D1 ili L3D10. Dok nijedno antitelo ne smanjuje Treg u slezini (Slika 22C), oba su smanjila Treg u mikrookruženju tumora (Slika 22E,). Zanimljivo je da je 10D1, ali ne i L3D10, izvršio ekspanziju Treg u slezini. Ekspanzija Treg u slezini pomoću 10D1 rekapitulira klinički nalaz da je ipilimumab povećao ekspresiju FOKSP3 u leukocitima periferne krvi (54). Pošto su blokirajuća i neblokirajuća antitela uporediva u smanjenju Treg u mikrookruženju tumora, blokada interakcije B7-CTLA4 ne doprinosi smanjenju Treg. Pošto 10D1 ne blokira interakciju B7-CTLA4 in vivo a ipak daju terapeutski efekat u Ctla4<h/h>miševima i kod pacijenata sa melanomom, blokada ove interakcije nije potrebna za njen terapeutski efekat. Dodatno, pošto dva mAb sa drastično različitim efektom blokiranja imaju uporediv terapeutski efekat i selektivno smanjenje Treg u mikrookruženju tumora, blokiranje interakcije CTLA4-B7 ne pojačava terapeutski efekat antitela. ;[0081] Da bismo podržali ovo zapažanje, testirali smo terapeutski efekat dva anti-CTLA4 mAbs u Ctla4<m/h>miševima kod kojih se anti-humana CTLA4 mAbs mogu vezati za maksimalno 50% CTLA4 molekula i kod kojih nijedno antitelo ne može blokirati interakciju B7-CTLA4 da bi se postigla regulacija B7 na dendritskim ćelijama (Slika 16). Opet, oba antitela izazivaju brzo odbacivanje tumora MC38, iako je L3D10 nešto efikasniji od 10D1 (Slika 22B). Shodno tome, oba antitela su selektivno osiromašila Treg u mikrookruženju tumora (Slike 22D i 21F). Ovi genetski podaci su dalje demonstrirali irelevantnost blokade CTLA4 u odbacivanju tumora i lokalnom smanjenju Treg i na taj način opovrgavali preovlađujuću hipotezu da anti-CTLA4 mAb indukuje imunitet protiv raka blokiranjem interakcije B7-CTLA4 (10). ;;Primer 8. Procena aktivnosti blokiranja najčešće korišćenih antimišjih CTLA4 mAbs 9H10 i 9D9 ;;[0082] Koncept da je CTLA4 ćelijski intrinzični negativni regulator za regulaciju T ćelija predložen je na osnovu stimulativnog efekta intaktnih i Fab dva antimišja CTLA4 mAbs (30, 31), 4F10 i 9H10, iako nisu predstavljeni nikakvi podaci koji bi pokazali da ova antitela blokiraju interakciju B7-CTLA4. Nedavno je objavljeno da treće anti-mišje CTLA4 mAb, 9D9, ima terapeutski efekat kod miševa koji nose tumor i izaziva lokalno smanjenje Treg u mikrookruženju tumora (52). Stoga smo krenuli da testiramo sva tri komercijalno dostupna antimišja CTLA4 mAbs za koja se pokazalo da izazivaju odbacivanje tumora zbog njihove sposobnosti da blokiraju interakciju B7-CTLA4 pod fiziološki relevantnim konfiguracijama. Kao prvi test, koristili smo sve veće količine anti-CTLA4 mAbs (do 2.000 puta molarni višak u odnosu na CTLA4-Fc) da blokiramo vezivanje biotinilovanog CTLA4-Fc za B7-1 i B7-2 imobilisane na ploči. Kao što je prikazano na Sl. 23A, anti-mišje CTLA4 mAb 9H10 nije blokiralo interakciju B7-1-CTLA4 čak ni pri najvišoj testiranoj koncentraciji, iako je uočeno skromno blokiranje kada je 9D9 korišćen u veoma visokim koncentracijama. Dok je mAb 9D9 efikasno blokirao interakciju B7-2-CTLA4, 9H10 to nije uspeo (Slika 23B). Zanimljivo, dok 9D9 pokazuje snažno vezivanje za rastvorljivi CTLA4-Fc, 9H10 je pokazao slabo vezivanje (Slika 23c), iako je snažniji od 9D9 u vezivanju imobilisanog CTLA4-Fc miša (Slika 23D). Pošto nedostatak bilo kakve blokirajuće aktivnosti od strane 9H10 u ovom testu može jednostavno odražavati njegovo slabo vezivanje za rastvorljivi CTLA4-Fc, ponovo smo koristili regulaciju B7-1 i B7-2 na dendritskim ćelijama kod WT miševa (CTLA4<m/m>) za merenje in vivo blokiranje interakcije B7-CTLA4. Kao što je prikazano na sl. 23E i F, 9H10 nije pojačao ekspresiju B7-1 na DC, dok je 9D9 povećao nivo B7-1 za 15% (P<0,05). Zanimljivo, dok je 9D9 jasno povećao B7-2 na DC, 9H10 to nije uspeo. Stoga, 9H10, prvo i najopsežnije proučavano tumorsko imunoterapeutsko anti-CTLA4 mAb, ne blokira interakciju B7-CTLA4. Stoga, blokiranje interakcije B7-CTLA4 ne doprinosi indukciji antitumorskog imuniteta antimišjim CTLA4 mAbs. Pošto oba mAb pokazuju uporedivi imunoterapeutski efekat i uporedivo brisanje Treg u mikrookruženju tumora (52), lokalna delecija Treg, umesto blokada interakcije B7-CTLA4, pruža jedinstveno objašnjenje za terapeutski efekat antimišjih CTLA4 mAbs. Zanimljivo, dok je 4F10 blokirao interakciju B7-CTLA4 in vitro, nije uspeo da izazove regulaciju B7 na DC in vivo (Slika 24). ;[0083] Uzeti zajedno, pokazali smo da klinički dokazano terapeutsko anti-humano CTLA4 mAb (10D1) i dva anti-mišja CTLA4 mAb (9H10 i 4F10) daju imunoterapeutski efekat bez blokiranja interakcije B7-CTLA4 u fiziološki relevantnim uslovima. Dodatno, takva blokada nije bila neophodna za odbacivanje tumora čak ni za mAb (L3D10) koje može snažno blokirati interakciju B7-CTLA4. Pošto je terapeutski efekat suštinski isti za antitela sa 1000-strukim razlikama u blokiranju interakcije B7-CTLA4, takva blokada ne doprinosi terapijskom efektu kancera anti-CTLA4 mAbs. Ovi podaci pobijaju hipotezu da anti-CTLA4 mAb daje imunoterapeutski efekat kroz blokadu kontrolne tačke (55). Pobijanjem preovlađujuće hipoteze, naši podaci sugerišu da se terapeutski efekat anti-CTLA4 mAb ne može optimizovati poboljšanjem aktivnosti blokiranja anti-CTLA4 mAb. U ovom kontekstu, posebno je interesantno primetiti da tremelimumab, koji je bolji u blokiranju interakcije B7-CTLA4 (56), nije dostigao kliničku krajnju tačku u kliničkom ispitivanju faze III (57). U međuvremenu, pokazujući snažnu korelaciju između tumorskog odbacivanja lokalnog smanjenja Treg i pobijanja uključenosti blokade interakcije B7-CTLA4 u imunitetu tumora, naš rad podržava hipotezu da je lokalna delecija Treg-a unutar tumorskog okruženja glavni mehanizam za terapijsko anti-CTLA4 mAb, i stoga predlaže nove pristupe za razvoj sledeće generacije anti-CTLA4 mAb za imunoterapiju raka. ;[0084] Konačno, gomilanje genetskih podataka kod miševa sugeriše da će prvobitni koncept (30, 31) da CTLA4 negativno reguliše aktivaciju T ćelija i da je takva regulacija postignuta putem SHP-2 (58, 59) možda morati da se revidira (60). Dakle, dok su teške autoimune bolesti u Ctla4<-/->miševima korišćene da podrže ideju CTLA4 kao ćelijski intrinzičnog negativnog regulatora za aktivaciju T ćelija (61, 62), od tada su se pojavile najmanje tri linije genetskih podataka koji nisu u skladu sa ovim stavom. Prvo, delecija gena Ctla4 specifična za lozu u Treg, ali ne i u efektorskim T ćelijama, dovoljna je da se rekapitulira autoimuni fenotip uočen kod miševa sa delecijom gena Ctla4 klicine linije (50). Ovi podaci sugerišu da autoimunost u Ctla4<-/->miševima nije bilo zbog nedostatka ćelijskog negativnog regulatora CTLA4 u efektorskim T ćelijama. Drugo, kod himera miševa koji se sastoje od WT i Ctla4<-/->T ćelijama, autoimuni fenotip je sprečen koegzistencijom WT T ćelija (63). Ovi podaci ponovo snažno tvrde da autoimune bolesti nisu uzrokovane nedostatkom negativnog regulatora unutrašnjeg ćelija. Nedostatak negativnog regulatornog efekta unutrašnjeg ćelija takođe se pokazuje činjenicom da kod himera miševa nema preferencijalne ekspanzije Ctla4<-/->T ćelije su primećene tokom virusne infekcije (64). Treće, pokazalo se da delecija Shp2 specifična za T-ćelije, za koju je predloženo da posreduje u negativnoj regulaciji CTLA4 (58, 59), pre smanjuje nego pojačava aktivaciju T ćelija (65). U kontekstu ovih genetskih podataka prijavljenih od predloga CTLA4 kao negativnog regulatora za aktivaciju T ćelija, naši podaci prijavljeni ovde pozivaju na ponovnu procenu blokade CTLA4 kontrolne tačke u imunoterapiji raka. ;;Primer 9. Himerni L3D10 pokazuje smanjene neželjene efekte na imunitet kada se koristi u kombinaciji sa drugim imunoterapijskim antitelima ;;[0085] Nedavne kliničke studije su otkrile da kombinovana terapija između anti-PD-1 i anti-CTLA4 mAb dodatno povećava preživljavanje pacijenata sa melanomom u završnoj fazi. Međutim, 55% pacijenata koji su primali kombinovanu terapiju razvilo je neželjene efekte 3 i 4 stepena imunosti (irAEs). Stoga je ključno razviti antitela sa manje toksičnosti. Razvili smo in vivo model koji rekapitulira irAE povezane sa kombinovanom terapijom anti-CTLA-4 i anti-PD-1 mAbs uočenih na klinici. U ovom modelu smo lečili humani CTLA4 gen miševe (CTLA4<h/h>) tokom perinatalnog perioda sa visokim dozama anti-PD-1 i anti-CTLA-4 mAbs. Otkrili smo da dok mladi miševi tolerišu tretman pojedinačnih mAbs, kombinovana terapija sa anti-PD-1 i 10D1 izaziva tešku irAE sa zapaljenjem više organa, anemijom i, kao što je prikazano na Sl. 25, ozbiljno usporen rast. Nasuprot tome, kada se kombinuje sa anti-PD-1, himerni L3D10 pokazuje samo blagu irAE kao što je prikazano normalnim povećanjem telesne težine. ;[0086] Da bismo dalje ispitali relativnu toksičnost himernog L3D10 u poređenju sa 10D1 kada se primenjuje u kombinaciji sa anti-PD-1, pogledali smo patološke efekte u CTLA4<h/h>knock in miševa 42 dana nakon primene. Kao što je prikazano na Sl.26, terminalna telesna težina (42. dan) kod miševa tretiranih sa L3D10 anti-PD-1 bila je slična miševima tretiranim antitelom hlgG negativne kontrole. Međutim, za poređenje, težina miševa tretiranih sa 10D1 anti-PD-1 bila je mnogo manja. Shodno tome, kada smo pogledali grubu anatomiju ovih miševa, materica/jajnik/bešika i timus su bili primetno manji kod miševa tretiranih sa 10D1 PD-1 (Slika 27). Opet, organi kod miševa tretiranih sa L3D10 anti-PD-1 bili su uporedivi sa hlgG kontrolom. Nasuprot tome, srca secirana od miševa tretiranih sa 10D1 izgledala su nešto veća po veličini sa primetno beljim izgledom. Kao rezultat toga, odlučili smo da pogledamo eritropoezu kod miševa i uočili jasne razlike kod miševa tretiranih sa 10D1 anti-PD-1 u odnosu na grupe tretirane sa L3D10 anti-PD-1 ili kontrolnim antitelom, koje su bile prilično slične. Kao što je prikazano na Slici 27A, koštana srž miševa tretiranih sa 10D1 anti-PD-1 imala je primetno belju boju, a izolovana krv je bila skoro potpuno bele boje (Slika 28b). U skladu sa tim, kada smo bliže pogledali ćelije koje prolaze kroz različite faze razvoja krvi koristeći CD71 i CD119 markere. Reprezentativni FACS profili su prikazani na Sl. 28C, dok su zbirni podaci predstavljeni na Sl.28D. Ovi podaci su otkrili statistički značajno smanjenje broja ćelija koje prolaze kroz fazu IV razvoja kod miševa tretiranih sa 10D1 anti-PD-1 (Slika 28D). ;[0087] Da bismo istražili potencijalni mehanizam anemije kod miševa tretiranih sa 10D1, testirali smo da li tretman 10D1+PD-1 indukuje antitela protiv crvenih krvnih zrnaca. Kao što je prikazano na Sl.29, nisu otkrivena antitela protiv crvenih krvnih zrnaca. Dakle, razvoj autoantitela specifičnih za crvene krvne ćelije nije odgovoran za anemiju kod miševa tretiranih anti-PD-1+10D1. ;[0088] Da bismo dalje odredili toksikologiju L3D10 naspram 10D1 u kombinaciji sa anti-PD-1, uradili smo histološku analizu srca (slika 30), pluća (slika 31), pljuvačne žlezde (slika 32) i bubrega i jetre. (Slika 33) nakon fiksacije u 10% formalina u trajanju od najmanje 24 sata. U svakom od proučavanih tkiva, miševi tretirani sa 10D1 anti-PD-1 pokazali su visok nivo infiltracije T ćelija. Ocene toksičnosti, zasnovane na ozbiljnosti upale, sumirane su na Sl. 34, koja pokazuje rezultate visoke toksičnosti miševa tretiranih sa 10D1 anti-PD-1 u odnosu na L3D10 anti-PD-1 koji ima rezultate samo neznatno više od hlgG kontrolne grupe miševa. ;;Primer 10: L3D10 ima smanjeno vezivanje za rastvorljivi CTLA4. ;;[0089] L3D10 i 10D1 pokazuju slične obrasce vezivanja za CTLA4 imobilisan na ploči (slika 36). Kao moguće objašnjenje za smanjenu toksičnost L3D10 u odnosu na 10D1, posebno povećanu infiltraciju/aktivnost T ćelija povezanu sa 10D1, odlučili smo da pogledamo vezivanje za rastvorljivi CTLA4. Odlučili smo da pogledamo ovo jer se povezanost između polimorfizma CTLA4 i višestrukih autoimunih bolesti odnosi na defektnu proizvodnju rastvorljivog CTLA4 (priroda 2003, 423: 506-511) i gensko utišavanje sCTLA4 izoforme povećalo je pojavu dijabetesa tipa I kod miševa (Diabetes 2011, 60:1955-1963). Dodatno, rastvorljivi CTLA4 (abatacept i belatacept) je lek koji se široko koristi za supresiju imuniteta. U skladu sa ovom idejom, kada smo pogledali relativno vezivanje za rastvorljivi CTLA4, primetili smo značajno smanjenje vezivanja L3D10 (Slika 37). ;[0090] Pokazali smo da anti-CTLA-4 mAb indukuje robusnu injekciju tumora u heterozigotnom Ctla4<h/m>miševima kod kojih se samo 50% CTLA-4 molekula može vezati za anti-humane CTLA-4 mAbs. Da bismo utvrdili da li je angažovanje 50% CTLA-4 dovoljno da izazove irAE, tretirali smo Ctla4<h/m>miševe sa anti-PD-1+10D1. Kao što je prikazano na Sl.35, anti-PD-1+10D1 nije uspeo da izazove gubitak težine u Ctla4<h/m>miševima. Prema tome, imunitet na irAE i rak se može genetski odvojiti. ;[0091] In vivo aktivnost pokazuje da L3D10 antitelo zadržava svoju antitumorsku aktivnost, ali pokazuje smanjeni autoimuni neželjeni efekat primećen kod drugih imunoterapijskih antitela kao što je 10D1, što ukazuje da je moguće povećati antitumorsko delovanje bez pogoršanja autoimunih neželjenih događaja. Shodno tome, autoimune nuspojave nisu neophodna cena za imunitet protiv raka i da je moguće razdvojiti ove dve aktivnosti. Karakterizacija L3D10 je pokazala da je njegova sposobnost da blokira interakciju CTLA4 sa B7.1 i B7.2 efikasnija nego kod 10D1 i da se to odnosi na razliku u mestu vezivanja CTLA4 između antitela. Dodatno, L3D10 je fuzionisan sa modifikovanim humanim IgG1 Fc domenom koji ima mutacije koje daju jaku ADCC aktivnost koja pojačava terapeutski efekat antitela. Dalja karakterizacija pokazuje da se L3D10 i 10D1 vezuju za imobilisani CTLA4 sa sličnim profilom vezivanja. Međutim, L3D10 pokazuje mnogo manji afinitet vezivanja za rastvorljivi CTLA4 od 10D1. Uzeti zajedno, naši podaci pokazuju da antitelo L3D10 ima veliki potencijal za kliničku upotrebu u lečenju pacijenata sa rakom sa manje ozbiljnim neželjenim događajima. ;;Primer 11. Humanizacija L3D10 ;;[0092] Proces humanizacije počinje generisanjem homologno modelovane 3D strukture antitela i kreiranjem profila roditeljskog antitela na osnovu modeliranja strukture. Akceptorski okviri za korišćenje identifikovani su na osnovu celokupnog identiteta sekvence u okviru, odgovarajuće pozicije interfejsa, slično klasifikovanih CDR kanonskih pozicija i prisustva mesta N-glikozilacije koja bi morala biti uklonjena. Jedan okvir lakog lanca (LC) i jedan okvir teškog lanca (HC) su odabrani za dizajn humanizacije. ;[0093] Humanizovana antitela su dizajnirana stvaranjem više hibridnih sekvenci koje spajaju odabrane delove sekvence roditeljskog antitela sa sekvencama humanog okvira, uključujući kalemljenje CDR sekvenci u akceptorske okvire. Predviđene CDR sekvence referentnog roditeljskog antitela L3D10 date su kao SEQ ID NOS: 21-26 kao što je naznačeno u Tabeli 1A ispod: ;Tabela 1A: Predviđene CDR sekvence referentnog roditeljskog antitela L3D10 ;;; ;;; [0094] Koristeći 3D model, ove humanizovane sekvence su metodički analizirane posmatranjem i kompjuterskim modeliranjem da bi se izolovale sekvence koje bi najverovatnije zadržale vezivanje antigena. Cilj je bio da se maksimizira količina humane sekvence u konačnim humanizovanim antitelima uz zadržavanje originalne specifičnosti antitela. ;[0095] Tri humanizovana laka lanca (LC1, LC2 i LC3) i tri humanizovana teška lanca (HC1, HC2 i HC3) su dizajnirana na osnovu odabranih akceptorskih okvira. ;[0096] Prema pronalasku, humanizovani laki lanac je LC2, a humanizovani teški lanac je HC3. Svaka od tri HC ili tri LC sekvence bila je iz iste klicine linije, sa različitim povratnim mutacijama na roditeljsku sekvencu miša, kao što je prikazano na Sl. 38. Sekvence aminokiselina humanizovanog varijabilnog regiona i njihova optimizovana kodirajuća nukleotidna sekvenca su navedene u SEQ ID NOS: 9-20. CDR2 sekvence i humanizovanih teških i lakih lanaca sadrže promene aminokiselina u odnosu na referentnu roditeljsku sekvencu L3D10 antitela i navedene su u SEQ ID NOS 33-38 kao što je navedeno u Tabeli 1B ispod. Tabela 1B: CDR2 sekvence varijabilnih regiona humanizovanog antitela. ;;; ; ;;; [0097] Laki i teški humanizovani lanci sada mogu da se kombinuju da bi se stvorila varijanta potpuno humanizovanih antitela. Sve moguće kombinacije humanizovanih lakih i teških lanaca su testirane na njihov nivo ekspresije i afinitet vezivanja za antigen da bi se identifikovala antitela koja imaju sličan učinak kao roditeljsko antitelo. ;[0098] Korišćen je novi alat za izračunavanje rezultata humanosti za monoklonska antitela (24). Ovaj rezultat predstavlja kako izgleda sekvenca varijabilnog regiona antitela nalik humanoj, što je važan faktor kada se humanizuju antitela. Rezultati humanosti za roditeljska i humanizovana antitela su prikazani u tabelama 2 i 3 ispod. Na osnovu našeg postupka, za teške lance rezultat od 79 ili više ukazuje na to da izgledaju kao humane; za lake lance rezultat od 86 ili više ukazuje na to da izgledaju kao humane. ;;Tabela 2: Humanizovane informacije o lakom lancu i rezultati humanosti. ;;; ;;; Tabela 3: Informacije o humanizovanom teškom lancu i rezultati humanosti. ;;; ; ;; [0099] Geni za antitela pune dužine su konstruisani tako što su se prvo sintetizovale sekvence varijabilnog regiona. Sekvence su optimizovane za ekspresiju u ćelijama sisara. Ove sekvence varijabilnog regiona su zatim klonirane u ekspresione vektore koji već sadrže humane Fc domene; za teški lanac, korišćena je kičma hlgG1 (M252I, S254T, T256E, S298A, E333A, K334A). Pored toga, za poređenje, varijabilni region himernih roditeljskih teških i lakih lanaca konstruisan je kao himerni lanac pune dužine korišćenjem istih Fc sekvenci okosnice. ;[0100] Svih 9 humanizovanih antitela je podvrgnuto maloj proizvodnji od 0,01 litara. Himerno roditeljsko antitelo je takođe uvećano za direktno poređenje. Plazmidi za naznačene teške i lake lance su transfektovani u ćelije HEK293 suspenzije korišćenjem hemijski definisanog medijuma u odsustvu seruma da bi se napravila antitela. Cela antitela u kondicioniranom medijumu su prečišćena korišćenjem medijuma MabSelect SuRe Protein A (GE Healthcare). ;10 testiranih antitela prikazano je u tabeli 4 ispod, gde su PP # 4639-4636 i 4638 referentna antitela, a PP # 4637 je antitelo u skladu sa pronalaskom. ;;Tabela 4: Deset antitela prolazno proizvedenih u ćelijama HEK293 ;; ;;; [0101] Sistemom Octet je procenjen afinitet 9 kombinacija humanizovanih antitela i himernog roditeljskog antitela na antigen (huCTLA4). Kinetički eksperimenti sa više koncentracija izvedeni su na sistemu Octet Red96 (ForteBio). Anti-hlgG Fc biosenzori (ForteBio, #18-5064) su hidrirani u razblaživaču uzorka (0.1% BSA u PBS i 0.02% Tveen 20) i prethodno kondicionirani u pH 1.7 glicinu. Antigen je razblažen korišćenjem 7 tačaka, 2-strukog serijskog razblaženja počevši od 600 nM sa razblaživačem uzorka. Sva antitela su razblažena do 10 µg/mL sa razblaživačem uzorka i zatim imobilizovana na anti-hlgG Fc biosenzore tokom 120 sekundi. Nakon što su uspostavljene osnovne linije tokom 60 sekundi u razblaživaču uzorka, biosenzori su premešteni u bunarčiće koji sadrže antigen u nizu koncentracija da bi se izmerila povezanost. Asocijacija je posmatrana tokom 120 sekundi, a disocijacija je primećena tokom 180 sekundi za svaki protein od interesa u razblaživaču uzorka. Afiniteti vezivanja su okarakterisani prilagođavanjem kinetičkih senzorgrama na model monovalentnog vezivanja (1:1 vezivanje). Kompletna kinetička merenja su sažeta u tabeli 5 ispod. ;;Tabela 5: Kinetička merenja humanizovanih antitela i roditeljskog antitela ;; ;;; Primer 12. Anti-tumorska aktivnost humanizovanih anti-CTLA4 antitela ;;[0102] Na osnovu relativnog afiniteta vezivanja i rezultata humanosti, izabrali smo 3 antitela za dalju evaluaciju: ;Referenca PP4631 - visok afinitet i dobra ekspresija ;PP4637 - visok afinitet i dobra ekspresija ;Referenca PP4638 - nešto niži afinitet, ali najviši rezultat humanizacije ;[0103] Materijal za svako od ovih antitela proizveden je prolaznom proizvodnjom u ćelijama HEK293 na skali od 0.1 litra nakon čega je usledilo prečišćavanje proteina A. Afinitet vezivanja prečišćenih antitela je potvrđen Octet analizom kao što je prikazano u Tabeli 6 ispod. ;;Tabela 6. Kinetička merenja humanizovanih antitela i roditeljskog antitela ;; ;;; [0104] Procenjivali smo antitumorsku aktivnost ova tri humanizovana antitela u poređenju sa 10D1 i himernim L3D10 antitelom koristeći singeni MC38 model mišjeg tumora kod humanih CTLA4-knock in miševa opisanih u Primeru 5 iznad. SL.39A prikazuje raspored tretmana in vivo eksperimenta; miševima su date ukupno 4 doze antitela svaka 3 dana počevši od 7. dana nakon inokulacije. Kao što je prikazano na Sl. 39B, sva humanizovana antitela su potpuno eliminisala tumor i bila su uporediva sa 10D1. ;[0105] U drugom eksperimentu procenjivali smo antitumorsku aktivnost humanizovanih antitela PP4631 i PP4637 u poređenju sa 10D1 i himernim L3D10 antitelom korišćenjem singenog MC38 modela tumora miša u heterozigotnom Ctla4<h/m>miševi opisani u Primeru 5 (Slika 14) u dve različite doze. Kao što je prikazano na Sl. 40, dok se sva mAbs ne razlikuju kada se koriste u dozi od 30 mcg/miš/injekcija (1.5 mg/kg), PP4637 je bio efikasniji pri 10 mcg/miš/injekcija (0.5 mg/kg), dok su PP4631 i 10D1 pokazali uporedivu aktivnost. ;[0106] Anti-tumorska aktivnost humanizovanih antitela u poređenju sa 10D1 i himernim L3D10 antitelom je takođe demonstrirana korišćenjem singenog B16-F1 modela mišjeg tumora melanoma kod humanih CTLA4-knock in miševa, kao što je prikazano na Sl.41. Miševima su date ukupno 3 doze antitela svaka 3 dana počevši od 2. dana nakon inokulacije. Kao što je prikazano na Sl.41, L3D10 i humanizovana antitela odložili su rast tumora i bili su uporedivi sa 10D1. ;Primer 13. Humanizovani klonovi L3D10 održavaju superiorne bezbednosne profile u odnosu na 10D1. ;;[0107] Da bismo testirali da li se superiorni bezbednosni profili L3D10 mogu održati nakon humanizacije, uporedili smo PP4631 i PP4637 sa 10D1 zbog njihovih štetnih efekata kada se koriste u kombinaciji sa anti-PD-1. Kao što je prikazano na Sl.42, i PP4631 i PP4637 su manje toksični od 10D1 kada se koriste u kombinaciji sa anti-PD-1. ;[0108] U skladu sa defektnom eritropoezom opisanom na Sl.28, miševi tretirani sa 10D1 plus anti-PD-1 su anemični na osnovu kompletne krvne slike (CBC), dok oni koji su primili anti-PD-1+ PP4631 i anti-PD-1+ PP4637 imaju uglavnom normalne CBC profile kao što je prikazano na Sl.43. Dodatno, analiza profila T ćelija u PBL otkriva snažnu sistemsku aktivaciju i CD4 i CD8 T ćelija kod miševa koji su primili 10D1+anti-PD-1, ali ne i onih koji su primili anti-PD-1+ PP4631 ili anti-PD-1+ PP4637 (slika 44), što dalje podržava ideju da anti-CTLA-4 mAbs zasnovana na L3D10 ne izazivaju sistemsku aktivaciju T ćelija. ;;Primer 14. Karakteristike vezivanja humanizovanih anti-CTLA4 antitela ;;[0109] Da bismo potvrdili da su humanizovana antitela zadržala svoje karakteristike vezivanja za CTLA4, pogledali smo vezivanje za imobilizovani CTLA4 vezan za ploču. Kao što je prikazano na Sl. 45, humanizacija ne utiče na vezivanje za imobilizovani CTLA4 i sva 3 humanizovana antitela su pokazala slično vezivanje sa roditeljskim himernim L3D10 antitelom. Međutim, humanizacija dalje smanjuje vezivanje L3D10 za rastvorljivi CTLA4 kao što je prikazano na Sl. 46. Na osnovu smanjenog vezivanja za rastvorljivi CTLA4, očekuje se da će 3 humanizovana antitela izazvati jednako odbacivanje tumora sa još manje autoimunih neželjenih efekata nego L3D10. ;[0110] Pokazali smo da himerni L3D10 ima 1000 puta veću aktivnost blokiranja od 10D1. Ovo je pokrenulo zanimljivu mogućnost da blokiranje interakcija B7-CTLA-4 može objasniti nedostatak irAE. Kao što je prikazano na sl. 47 i 48, ni PP4631 ni PP4637 ne blokiraju B7-CTL-A4 interakcije in vitro i in vivo. Činjenica da PP4631 i PP4637 pokazuju smanjeni irAE dodatno podržava ideju da blokiranje interakcije B7-CTLA-4 nije odgovorno za poboljšanu bezbednost L3D10. ;[0111] S obzirom na predloženu ulogu CTLA-4 u zaštiti od autoimunih bolesti, predložili smo smanjeno vezivanje za rastvorljivi CTLA-4 kao osnovni mehanizam za poboljšane bezbednosne profile. Da bismo testirali ovu hipotezu, koristili smo povećanje telesne težine kod ženki miševa koje su primile anti-PD-1 anti-CTLA-4 mAbs tokom perinatalnog perioda kao osnovni indikator za irAE. Kao što je prikazano na Sl. 42, uočeno je ozbiljno smanjenje povećanja telesne težine kod miševa koji su primali i 10D1 i anti-PD-1, dok su oni koji su primali PP4637 anti-PD-1 imali najniži irAE, praćeni PP4631, a zatim L3D10. Stroga inverzna korelacija sa smanjenim vezivanjem za sCTLA-4 je u skladu sa centralnom hipotezom. ;;Primer 15. Procena mogućnosti obrade humanizovanih anti-CTLA4 antitela ;;[0112] Da bi se procenio razvojni i proizvodni potencijal tri različita humanizovana antitela, sproveden je niz analitičkih metoda da bi se okarakterisala različita antitela. ;; ;;; [0113] Kao inicijalna procena, predviđene molekulske težine i izoelektrična tačka tri vodeća kandidat antitela su izračunate na osnovu sekvenci aminokiselina. Kao što je prikazano u tabeli 7, sva antitela su bila prilično slična, iako je antitelo imalo nešto niži PI. ;;Tabela 7: Teorijski parametri tri humanizovana antitela ;;; ; Procena prinosa proizvoda ;;[0114] Da bi se procenila produktivnost različitih antitela, ćelije HEK293 su prolazno transfektovane vektorima koji eksprimiraju teške i lake lance različitih antitela. Ove ćelije su zatim kultivisane u posudama za mućkanje tokom 6 dana koristeći medijum bez seruma. Posle 6 dana, supernatant je sakupljen i antitela su prečišćena hromatografijom na proteinu A u jednom koraku. Kao što bi trebalo u tabeli 8 u nastavku, antitela PP4631 i PP4637 su pokazala slične prinose proteina, dok je antitelo PP4638 proizvedeno sa mnogo nižim relativnim prinosom. ;;Tabela 8: Procena prinosa proizvodnje humanizovanih antitela. ;;; ;;; [0115] Da bi se procenila čistoća prolazno eksprimiranih antitela, uzorci su analizirani redukujućim i neredukcionim SDS-PAGE. Kao što je prikazano na Sl. 50, uzorci iz sva 3 antitela proizveli su gel trake koje ukazuju na molekul antitela i da su uzorci bili relativno čisti nakon prečišćavanja proteina A. ;;Ekskluziona hromatografija ;;[0116] Da bismo dalje ispitali čistoću i agregaciju različitih antitela nakon prolazne ekspresije, izvršili smo ekskluzionu hromatografiju prečišćenih proteina. Ukratko, 50 µg filtriranog (koristeći filter od 0.22 µm) uzorka je korišćeno za SE-HPLC odvajanje korišćenjem TOSOH G3000 SWxl 5µm kolone. PBS pH 7.4 je korišćen kao mobilna faza. Kao što je prikazano u tabeli 9 ispod, sva humanizovana antitela pokazuju čistoću >90% nakon prečišćavanja proteina A. Antitela PP4631 i PP4637 su pokazala slične niske nivoe agregata veće molekulske težine (MW) i degradacije prisutne sa uzorcima antitela sa većinom proteina unutar glavnog pika. Nasuprot tome, antitelo PP4638 je imalo više nivoe agregacije i izvesnu degradaciju. SE-HPLC hromatogrami su prikazani na Sl.51. ;Tabela 9: Ekskluzivna hromatografija po veličini ;;; ;;; Kapilarna elektroforeza (CE) ;;[0117] Kapilarna elektroforeza je korišćena da se kvantifikuje količina proteina unutar traka pikova i pod smanjenim i u neredukujućim uslovima, kao i količina neglikoziliranog proteina teškog lanca. Ukratko, 100 µg uzorka je razblaženo u CE-SDS puferu za uzorke zajedno sa jodoacetamidom (neredukujući uslovi) ili β-merkaptoetanolom (redukujući uslovi), zajedno sa 2 µL standardnog proteina od 10 kDa. Uzorci su zatim tretirani 10 minuta na 70°C. Za odvajanje, PA-800, 50µm I.D. korišćena je kapilara od silicijum dioksida; tekuća dužina 20.2 cm; razdelni napon 15kV; OD220za detekciju. Kao što je prikazano u tabeli 10 ispod, sva tri proteina su pokazala visoke nivoe čistoće, u skladu sa SDS-PAGE, i svi su bili visoko glikozilovani. CE-SDS hromatogrami su prikazani na Sl.52. ;;Tabela 10: Kapilarna elektroforeza ;;; ;;; Deamidacija: kapilarno izoelektrično fokusiranje (clEF) i tečna hromatografija-masena spektrometrija (LC-MS) ;;[0118] Nivo deamidacije proteina pod visokim pH stresom određen je poređenjem antitela sa i bez tretmana visokim pH tokom dva različita vremenska perioda (5 sati i 12.5 sati), nakon čega je usledila clEF i LC-MS analiza. ;[0119] Profil izoforme naelektrisanja i izoelektrične tačke različitih antitela određivani su kapilarnim izoelektričnim fokusiranjem (clEF). Ukratko, uzorci su podvrgnuti razmeni pufera u 20 mM Tris pH 8.0, a zatim je 100 µg proteina uzorka pomešano sa amfoternim elektrolitom, metil celulozom, zajedno sa markerima PI 7,05 i PI 9,77. iCE3<™>je korišćen za analizu, sa 100 µm I.D. kapilarni; 1.5kV plus 3kV; OD280za detekciju. Za tretman deamidacionim stresom, uzorci su tretirani sa 500 mM NaHCOs tokom 5 sati ili 12.5 sati, a zatim ispitani sa clEF i LC-MS. Rezultati analize su prikazani u Tabeli 11 ispod, a LC-MS grafovi su prikazani na Sl. 53. Sva tri antitela pokazuju predviđeno povećanje količine deamidiranih vrsta sa uslovima stresa i odgovarajući pad glavnog pika. Kao što je predviđeno iz aminokiselinske sekvence, pI antitela PP4637 je malo niži nego za PP4631 i PP4638 (Tabela 7) i viši uočeni pI u poređenju sa predviđenim pI verovatno ukazuje na glikozilaciju. ;;Tabela 11: Izoelektrično fokusiranje i deamidacija ;;; ;;; Termička analiza diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC). ;;[0120] Da bi se odredila termička stabilnost i temperature topljenja različitih antitela, oni su podvrgnuti termalnoj analizi diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC). Ukratko, uzorci od 2 mg/mL u PBS pH 7.4 podvrgnuti su povećanju temperature od 15°C do 105°C brzinom od 1°C/min. Promena Cp sa temperaturom je praćena i za uzorke i za pufer (kao referentnu vrednost). Krive Cp u odnosu na temperaturu su dobijene oduzimanjem referentne vrednosti, a pikovi su ukazivali na Tm analita. Kao što je prikazano u tabeli 12 u nastavku, sva tri antitela su pokazala slično visoku temperaturu topljenja. DSC krive za tri antitela su prikazane na Sl. ;54. ;Tabela 12: Ekskluziona hromatografija ;;; ;;; Oksidacija: mapiranje peptida ;;[0121] Oksidativna modifikacija humanizovanih antitela je procenjena mapiranjem peptida korišćenjem LC-MS sa ili bez oksidativnog stresa. Uzorci su denaturisani na 65°C u prisustvu 6M GnCl i 5mM β-ME, a zatim acetilovani jodacetamidom. Obrađeni uzorci se zatim digestiraju sa tripsinom (Promega, kvalitet sekvenciranja) na 55°C i svarena smeša je odvojena na C18 koloni LC reverzne faze (ACQUITI UPLC BEH130 C18, 2,1 × 100 mm, 1,7 µm) i analizirana masenom spektrometrijom (Waters XEVO-G2S QTOF) koristeći alate za analizu Masslynx i Biophatmlynx. Za analizu oksidacionog stresa, uzorci tretirani sa 0,05% ili 0,1% H2O2tokom 1 sata, zatim ispitan sa LC-MS. Rezultati su prikazani u tabelama 13 - 16 ispod. ;nel: ;i paonj;;7. D ;463 ;PP ;;telo nti ael: ;pan njired ;1.S ;463 ;PP ;otelantitnoren efer el: ;panji orn ;. G ;nina ioet m atimes m nalatite an ;anih zovanim 38. hu 64 cija ;PP ;ida lo ksite O ant3. ;1tnoela ; ab eren Tref ; Tabela 14. Oksidacija humanizovanog referentnog antitela PP4631 na mestima triptofana. Crveni brojevi ukazuju na dokaze pronađene fragmentacije; „—“ označava da nijedan nije detektovan; „0“ označava da su detektovani u ekstremno niskim nivoima. ;; ;;; Tabela 15. Oksidacija humanizovanog referentnog antitela PP4637 na mestima triptofana. Crveni brojevi ukazuju na dokaze pronađene fragmentacije; „—“ označava da nijedan nije detektovan; „0“ označava da su detektovani u ekstremno niskim nivoima. ;;; ; Tabela 16. Oksidacija humanizovanog referentnog antitela PP4638 na mestima triptofana. Crveni brojevi ukazuju na dokaze pronađene fragmentacije; „—“ označava da nijedan nije detektovan; „0“ označava da su detektovani u ekstremno niskim nivoima. ;; ;;; Specifičnost vezivanja ;;[0122] Specifičnost vezivanja različitih antitela je određena procenom sposobnosti detekcije nespecifičnog vezivanja za dve različite ćelijske linije koje ne eksprimiraju CTLA4 (CHO i HEK293) u odnosu na 10D1 u dve različite koncentracije. Ukratko, uzorci od 100 µg/mL ili 20 µg/mL (ili referentni mAb) u PBS su inkubirani sa 3×10e<6>ćelije/ml (CHO ili HEK293). FITC obeleženo zečje anti-humano-IgG antitelo (Boster, Wuhuan, Kina) je korišćeno za detekciju i vezivanje ciljnog mAb za ćelije je mereno pomoću FACS. Kao što je prikazano u tabeli 17 ispod, antitela PP4631 i PP4637 pokazuju veoma nisko vezivanje i dobru specifičnost, dok antitelo PP4638 pokazuje nespecifičnu aktivnost vezivanja za kontrolne ćelijske linije. ;;Tabela 17: Specifičnost vezivanja za ćelijske linije CHO i HEK293 ;;; ; ;; Primer 16. Mapiranje epitopa L3D10 i humanizovanih antitela ;;[0123] Da bismo mapirali epitop koji se vezuje za CTLA-4 roditeljskog antitela L3D10 i humanizovanih varijanti, PP4631 i PP4637, iskoristili smo činjenicu da su mišji i humani CTLA4 proteini unakrsno reaktivni na B7-1, ali ne i na anti-CTLA-4 antitela. Shodno tome, dizajnirali smo određeni broj mutanata humanog CTLA-4Fc proteina u kojima su klasteri aminokiselina iz humanog CTLA-4 proteina zamenjeni aminokiselinama iz mišjeg Ctla-4 proteina. Pošto se anti-CTLA-4 antitela korišćena u ovoj studiji ne vezuju za mišji Ctla-4, vezivanje anti-humanih CTLA-4 antitela treba da se ukine kada se ključni ostaci epitopa koji vezuju antitela zamene mišjim aminokiselinama. ;[0124] DNK vektori koji kodiraju 11 mutantnih proteina CTLA-4Fc (M1-M11) (SEQ ID NOS: 40-50) su konstruisani na osnovu divljeg tipa humane CTLA-4Fc sekvence, a proteini su proizvedeni prolaznom transfekcijom u HEK293 na skali od 0,01 mL. nakon čega sledi jednostepeno prečišćavanje hromatografijom proteinom A. ;[0125] Vezivanje anti-CTLA4 antitela za CTLA4Fc proteine izvedeno je pomoću ELISA. Ploče su obložene CTLA-4Fc proteinima u količini od 1 µg/mL i biotinilovana antitela ili fuzioni protein B7-1Fc su zatim korišćeni u rastvorljivoj fazi u testu vezivanja, pri čemu su količine vezanog proteina merene korišćenjem peroksidaze rena (HRP) konjugovane streptavidinom. ;[0126] Anti-humana CTLA-4 antitela ne reaguju unakrsno sa mišjim Ctla-4, što verovatno odražava razlike u sekvenci aminokiselina između humanog i mišjeg CTLA-4 u ekstracelularnom domenu. SL. 55 pokazuje poravnanje humanih, makaki i mišjih CTLA-4 vanćelijskih domena i naglašava očuvanje sekvence između čoveka i makaki, dok pokazuje brojne razlike između sekvenci miša i primata. Zbog očuvanja MIPPPI motiva vezivanja, mišji i humani CTLA4 proteini su unakrsno reaktivni na B7-1 (72). ;[0127] Da bismo mapirali epitop vezivanja anti-humanih CTLA-4 antitela, generisali smo niz mutantnih proteina CTLA-4Fc koji se ne preklapaju koji inkorporiraju klastere aminokiselina specifičnih za miševe u humanu sekvencu CTLA-4. Amino kiseline ugrađene u svaki od 11 mutanata prikazane su na Sl.55, a sekvence aminokiselina WT i mutantnih CTLA-4Fc proteina su prikazane na Sl. 56. Ovi proteini su proizvedeni prolaznom transfekcijom u ćelijama HEK293 i prinos je dat u Tabeli 18. Čini se da mnoge od mutacija utiču na ekspresiju proteina kao što je naznačeno njihovim prinosima u odnosu na WT humani CTLA-4Fc protein. ;;Tabela 18: WT i mutantni CTLA-4Fc proteini koji se prolazno proizvode u ćelijama HEK293. ;;; ;;; [0128] Kapacitet himernog L3D10 i humanizovanih antitela PP4631 i PP4637 da vežu imobilisane mutantne konstrukte CTLA-4Fc je zatim određen ELISA testom u kojem su ploče obložene mutantnim konstruktima CTLA-4 i biotinilovanim anti-CTLA-4 antitelima, ili B7-1 Ig kontrolni protein i mereno je vezivanje korišćenjem streptavidina konjugovanog sa HRP. Rezultati testova vezivanja su prikazani u tabelama 19 - 22. Kao što se očekivalo, sva 4 vezujuća proteina su pokazala dobro vezivanje u zavisnosti od doze za WT CTLA-4Fc protein. Međutim, čini se da mutacije koje su uvedene u proteine M9 i M10 menjaju ukupnu strukturu i ovi mutanti nisu uspeli da vežu B7-1Fc. Mutacije uvedene u M2 i M4 takođe su delimično izmenile konformaciju CTLA-4 na šta ukazuje smanjeno vezivanje u odnosu na WT protein. U skladu sa ovim nalayom, sva 4 ova mutanta (M2, M4, M9 i M10) su bila eksprimirana sa mnogo nižim prinosom (Tabela 18). Nasuprot tome, koristeći vezivanje za WT CTLA-4Fc protein i vezivanje B7-1Fc proteina kao reference, M11 se jasno ističe kao protein koji se dobro eksprimira, efikasno vezuje B7-1Fc, ali nije uspeo da veže dva humanizovana anti-CTLA- 4 antitela. Njegovo vezivanje za originalni L3D10 je takođe smanjeno za približno 100 puta (Tabela 20). Kao što se očekivalo, mutacije koje utiču na ukupnu potvrdu takođe su uticale na vezivanje za anti-CTLA-4 antitela. ;noaneaz ik vede;Pr iz . e P) in R ;prote ;a(H ren 4Fc ;mo ;TLA ;daz C isza okje peran ;iv saezim ;.in.V ;ovante ug -4Fc ro nj;LA ;nip ko T m ;fuzio ;noiniC di te Igrotavi;7-1 ;ep B tr tnip an za ut jeenes;maneriv m su a 11 vezin ote - M ;1 hov pro ;g nji . M e Fcujvano ;-4az lo ;niLA uk T a bioti ;C ;p našt ;ogti vlji nata ;vezan ;diuta e = m in Tlič;4Ig ;ko 0.W LA su 45 T u D C O ;tet čem ;njaegririte,per m ; :In m ;stosu 19te ti la osbeSA ;dnaLIT E vre suja u ;eren čem ;m i ;isu ,pr;om nost test;ed vr;LISA ;ane E ;ikaz jer;P ;eno ;P). ;ved Riz(H ;ine ;rena ote ;prmoza4Fc ;sid LA ok T ;C per za sa manje ;anic -4Feziv ;gov ;LA ;. Vju Tla kon Cinitite an ominte 10id pro ;;L3D ;ptav ;ntnire uta ogsttn m sueren ;erene ;11 ref m M g a -1 noteiner M m proc. hig -4F ;opa ;vano ;LA ;lo T epit ;C ;ni;tip nje ;bioti ;ljiira;ap og div M = ;T ; 20: vezan e la n 0.We liči b 45aD T ko Ojčem ;eren m ,pri ;u om ;stistest;no SA ;vred LI;Eane je ;o kaz den Pri ;P). ;izve;R ;ine(H ;a prote ;ren cF4 om LA idaz T ;C oksza per e saanj;meziv ;vani1.V ;go -4Fc LA ;nju ;463 ;ko T PP ;m iCtela ;dinotein anti ;avipro ogtnireptntnst ;e utanerem f u re eren ;s g m ;a 11ano ;- M zovtein ;1 proani;c. M hum nog ;-4F ovaLA ;opa l t ni ti T C ;epi;ipje bio ;og jit iran ;anap divlz = M ve;e T ; 21: ;činli 0.Wela ;45ab ko D ;Tsu O ne Tliči ;0.W ko ;45 su D u O ;ja čem ;eren ,pri ;m u om ;stistest;no d ;LISA ;vre E ne je ;o kaza;;eden ;Priizv P). ;e Rin(H ;prote ;rena ;;4Fc ;om LA daz T ;C ksi za o ;per nje ;saa;;eziv ;anim .V ov ;jug 637 4 n ko PP ;;ela m noi;antit;vid g pta ;vano ;streizo ;eneaner m m hu ;ina ;opa ;ote prepitje og vaniran pa ilo Mtin ; C ;22: bio ;ip a ;el nog ;ljit adiv Tab ;vez ;= Tabela 23. Sirovi podaci iz ponovljene studije koji pokazuju specifičan gubitak antigenog epitopa samo kod M11. Kao u tabelama 2-5, izuzev što su dodatne kontrole uključene da bi se pokazala specifičnost vezivanja. ;; ;; [0129] Pošto je L3D10 zadržao značajno vezivanje za M11, testirali smo da li je vezivanje specifično. Obložili smo ploču sa humanim CTLA4-Fc (hCTLA4Fc), mišjim CTLA4-Fc (mCTLA4-Fc), kontrolnim IgG1-Fc ili svim mutantnim hCTLA4-Fc i izmerili njihovo vezivanje za B7-1Fc zajedno sa L3D10, PP4631 i PP4637. Najveći deo podataka je predstavljen u tabeli 23. Kao što je prikazano na Sl. 57, biotinilovani B7-1 vezuje hCTLA-4, mCTLA-4 i M11, podjednako dobro. Specifičnost testa je prikazana nedostatkom vezivanja za IgG1-Fc. Zanimljivo, dok je L3D10-vezivanje za M11 jače od onih za IgG1-Fc i mCTLA4-Fc, značajno vezivanje za IgG1-Fc sugeriše da je vezivanje himernog antitela za M11 možda nespecifično. Nasuprot tome, nijedno od humanizovanih antitela se ne vezuje za kontrolu M11, mCTLA-4 i IgG1-Fc. Ovi podaci pokazuju da su mutacije uvedene u M11 selektivno ablacije L3D10, PP4631 i PP4637 vezivanja za CTLA-4. ;[0130] Koristeći poznatu kompleksnu strukturu 133, mapirali smo CTLA-4 epitop u 3-D strukturu. Kao što je prikazano na Sl. 58, epitop prepoznat od ovih mAbs lokalizovan unutar oblasti pokrivene B7-1. Kao takvi, vezivanje L3D10, PP4631 i PP4637 za CTLA-4 bi se međusobno isključivalo za B7-1. Loše blokiranje PP4631 i PP4637 je posledica niže avidnosti, a ne karakterističnih domena vezivanja. ;[0131] Koristeći činjenicu da su mišji i humani CTLA4 proteini unakrsno reaktivni na B7-1, ali da anti-humana CTLA-4 antitela ne reaguju unakrsno sa mišjim Ctla-4 proteinom, uspeli smo da mapiramo epitop vezivanja L3D10 izvedena antitela pomoću ELISA. Korišćenjem većeg broja mutanata humanog CTLA-4Fc proteina u kojima su klasteri aminokiselina iz humanog CTLA-4 proteina zamenjeni aminokiselinama iz mišjeg Ctla-4 proteina, jasno se pokazuje da kada zamenimo 4 aminokiseline koje odmah prate poznati B7-1 vezujući domen CTLA-4, dozno-zavisno vezivanje antitela je u velikoj meri ukinuto. Činjenica da vezujući epitop mapira direktno pored B7-1 vezujućeg domena dobro korelira sa demonstriranom sposobnošću L3D10 antitela da blokira B7-CTLA-4 interakcije i in vitro i in vivo. Pošto se rastvorljivi CTLA4 proizvodi fuzijom C-terminalnih aminokiselina ekstracelularnog IgV domena sa intracelularnim domenom, primamljivo je spekulisati da je antitelo koje se vezuje za polimorfne ostatke C-terminalnog domena (samo 18 amino kiselina sa C-terminusa) veća je verovatnoća da će izgubiti reaktivnost na rastvorljivi CTLA-4, u kome je veliki intracelularni domen fuzionisan sa C-terminusom ekstracelularnog domena. ;[0132] Da bi se dalje istražio domen vezivanja anti-CTLA4 antitela, dizajnirano je 6 dodatnih mutantnih CTLA4-Fc fuzionih proteina, označenih kao M12-M17 (SEQ ID NOS: 51-56) (Slika 59) i korišćeno za poređenje vezivanja anti-CTLA4 antitela 10D1 (slika 60A), PP4631 (slika 60B) i PP4637 (slika 60C). Kao što je prikazano na Sl. 60, mutacije u M11, koje su na pozicijama I<103>L<104>I<106>, poništile su vezivanje za 10D1, PP4631 i PP4637, pokazujući da mesta vezivanja za 10D1, PP4631 i PP4637 uključuju ostatke I<103>L<104>I<106>. Važno je da je dodatna mutacija u A29>I obnovila vezivanje CTLA-4 sa mutacijama u I<103>L<104>I<106>do PP4631 i PP4637. Ovi podaci pokazuju da je pozicija A<29>u CTLA4 važna za vezivanje antitela PP4631 i PP4637, ali ne i 10D1. ;;Primer 17. Anti-CTLA-4 mAb sinergizuje sa anti-4-1BB u izazivanju odbacivanja tumora ;;[0133] Studije na životinjskim modelima su pokazale da je anti-tumorski odgovor izazvan monoklonskim antitelom (mAb) anti-CTLA-4, barem delimično, posledica antigen-specifičnog T-ćelijskog odgovora na normalne antigene "samo" diferencijacije (73, 74. Sklonost anti-CTLA-4 antitela da pogoršavaju autoimune bolesti dobro je dokumentovana kod miševa (75-78). Ovo je dodatno pokazano i potvrđeno kao glavno ograničenje u skorijim humasnim studijama u kojima su pacijenti razvili teške autoimune manifestacije koje su zahtevale prekid lečenja (79). Sa druge strane, pokazalo se da terapijska anti-4-1BB mAbs poništavaju razvoj autoimunih bolesti kod miševa sklonih lupusu (24, 25). ;[0134] Činjenica da anti-4-1BB mAb mogu i stimulisati antitumorske odgovore i smanjiti autoimune manifestacije podiže intrigantnu mogućnost da kombinacija ovog antitela sa antiCTLA-4 mAb može dovesti do odbacivanja raka bez autoimunosti. U ovoj studiji anti-CTLA-4 i anti-4-1BB su kombinovani da bi se izazvalo odbacivanje velikih ustanovljenih tumora. ;[0135] Kombinovani efekat anti-mišjih-CTLA-4 i anti-mišjih-4-1BB antitela u indukciji odbacivanja tumora posredovanog CD8 T ćelijama. ;[0136] Dva modela, jedan sa minimalnim oboljenjem i jedan sa velikim utvrđenim tumorima, korišćena su za testiranje antitumorskog efekta kombinovanja tretmana anti-mišjeg-4-1BB i anti-mišjeg-CTLA-4 mAb tretmana. C57BL/6 miševi su podvrgnuti subkutanoj inokulaciji ćelija raka debelog creva MC38, a u različito vreme nakon inokulacije tumorskih ćelija, antitela su ubrizgana miševima izazvanim tumorom, a veličina i učestalost tumora su praćeni fizičkim pregledom. ;[0137] U modelu minimalne bolesti, miševi su tretirani IgG hrčka plus IgG pacova, anti-4-1BB plus IgG hrčka (samo anti-4-1BB grupa), anti-CTLA-4 plus IgG pacova (samo anti-CTLA-4 grupa), ili anti-4-1BB u kombinaciji sa anti-CTLA-4 počevši od 48 sati nakon inokulacije tumorskih ćelija. Antitela su davana intraperitonealno (i.p.) 2., 9. i 16. dana. Tretman samo sa anti-4-1BB ili anti-CTLA-4 mAb doveo je do kašnjenja u rastu tumora pri čemu je 1 od 5 miševa u svakoj grupi odbacio tumore, dok su 4 od 5 miševa lečenih i anti-CTLA-4 i anti-4-1BB mAbs bila bez tumora na kraju eksperimenta. SL.61A prikazuje merenja rasta tumora za svakog miša. Da bi se uporedile stope rasta između grupa, na podatke je primenjen linearni model slučajnih efekata. Kombinovana terapija značajno je smanjila dnevni rast veličine tumora za 4.6 mm<2>/dan u odnosu na sam anti-CTLA-4 (p = 0,0094). Dodatno, kombinovana terapija značajno je smanjila rast za 8.4 mm<2>dnevno preko samo anti-4-1BB (p = 0.0006). Pored stope rasta, stvarne veličine tumora su upoređene između grupa za lečenje šest nedelja nakon početnog izazivanja tumora. Prosečna veličina tumora u šest nedelja bila je značajno manja za miševe koji su davali kombinovanu terapiju (27.5 mm<2>) u poređenju sa miševima koji su dobili ili anti-CTLA-4 (137.8 mm<2>, p = 0.0251) ili anti-4-1BB odvojeno (287.6, p = 0.0006). Dakle, u uslovima minimalnog opterećenja tumorom, kombinacija anti-4-1BB i anti-CTLA-4 mAbs dovodi do značajnog kašnjenja u rastu tumora u odnosu na anti-4-1BB ili anti-CTLA-4 date odvojeno. ;[0138] Da bi se utvrdilo da li se antitumorski efekti kombinovanog tretmana mAb protiv malog tumorskog opterećenja mogu proširiti na terapijske primene protiv većih tumorskih opterećenja, miševi sa utvrđenim tumorima lečeni su antitelima. Miševi divljeg tipa C57BL/6 su izazvani potkožnom inokulacijom MC38 ćelija raka debelog creva. Tumori su ostavljeni da rastu 14 dana, nakon čega su odabrani miševi sa utvrđenim tumorima (obično > 7 mm u prečniku) i podeljeni nasumično u četiri grupe za tretman: IgG hrčka plus IgG pacova, anti-4-1BB plus IgG hrčka, anti -CTLA-4 plus IgG pacova i anti-4-1BB mAb u kombinaciji sa anti-CTLA-4 mAb. Antitela su davana i.p.14., 21. i 28. dana nakon izazivanja tumora. Kao što je prikazano na Sl. ;61B, tretman sa anti-CTLA-4 mAb nije ometao rast tumora u poređenju sa kontrolnim IgG tretmanom, iako je odbacivanje primećeno kod jednog od osam miševa u grupi. Tretman anti-4-1BB mAb donekle je usporio rast tumora, ali je samo jedan od osam miševa odbio tumor. Nasuprot tome, kombinovana terapija sa anti-CTLA-4 i anti-4-1BB mAbs dovela je do eradikacije tumora kod 7 od 8 miševa i prevencije daljeg rasta tumora kod preostalog miša. Kao što je gore navedeno, stope rasta između grupa su upoređene primenom modela linearnih slučajnih efekata na podatke. Kombinovana terapija značajno je smanjila dnevni rast veličine tumora za 10.6 mm<2>/dan u odnosu na sam anti-CTLA-4 (p < 0.0001). Dodatno, kombinovana terapija značajno je smanjila rast za 6.2 mm<2>dnevno preko samo anti-4-1BB (p = 0.0002). Pored brzine rasta, stvarne veličine tumora su upoređene između grupa za lečenje osam nedelja nakon inicijalnog izazivanja tumora. Procenjena prosečna veličina tumora u osam nedelja bila je značajno manja za miševe koji su uzimali kombinovanu terapiju (-1.7 mm<2>, 95% CI: -10.8, 7.5 mm<2>) u poređenju sa miševima koji su dobili ili anti-CTLA-4 (404.9 mm<2>, 95% CI: 285.4, 524.4 mm<2>; p < 0.0001) ili anti-4-1BB odvojeno (228.4 mm<2>, 95% CI: 200.4, 689.9 mm<2>;p = 0.0004). Stoga se čini da kombinovano mAb takođe značajno odlaže rast tumora u odnosu na anti-CTLA-4 ili anti-4-1BB odvojeno i kod većih tumorskih opterećenja. ;[0139] Poznato je da MC38 formira metastaze u jetri.<80>Da bi se procenio efekat terapeutskih antitela na metastaze u jetri, svi miševi uključeni u eksperimente su analizirani na metastaze u jetri histološkim putem. Kao što je prikazano u tabeli 24, približno 60% kontrolnih miševa tretiranih Ig imalo je mikrometastaze u jetri. Samo tretmani sa anti-CTLA-4 ili anti-4-1BB antitelima su donekle smanjili stopu metastaza, iako smanjenje nije dostiglo statistički značaj. Zanimljivo je da je samo 1/22 miševa u grupi tretiranoj sa oba antitela imalo metastaze u jetri. Koristeći model logističke regresije, otkrili smo da su šanse za metastaze u jetri kod miševa kojima je dat samo anti-4-1BB bile približno 4.7 puta veće od šansi za miševe kojima su davani i anti-4-1BB i anti-CTLA-4 (95% CI : 1.6, 13.7; p = 0.0050). Slično tome, šanse za metastaze u jetri bile su 3.6 puta veće za miševe koji su primali samo anti-CTLA-4 u poređenju sa miševima koji su primali oba tretmana (95% CI: 1.3, 10.2; p = 0.0174). Dakle, kombinovana terapija značajno smanjuje metastaze u jetri od strane MC38 u poređenju sa tretmanom sa bilo kojim antitelom samim. ;;Tabela 24: Kombinovana terapija značajno smanjuje metastaze na jetri*

[0140] Da bi se utvrdilo koja podgrupa imunih ćelija doprinosi antitumorskom efektu izazvanom kombinovanim tretmanom mAb, glavne podgrupe limfocita su osiromašene monoklonskim antitelima. MC38 tumorske ćelije su ubrizgane subkutano. Kada su tumori bili opipljivi, miševi koji su nosili tumor su podeljeni u četiri grupe. Svaka grupa je imala seriju intraperitonealnih injekcija antitela za iscrpljivanje različitih podgrupa imunih ćelija, uključujući bez deplecije sa normalnim IgG pacova, smanjenje CD4 T ćelija sa anti-CD4 mAb (GK 1.5), smanjenje CD8 T ćelija sa anti-CD8 mAb (2.4.3), i iscrpljivanje NK ćelija sa anti-NK1.1 mAb (PK136). Pored toga, svi miševi u svim grupama su tretirani anti-CTLA-4 plus anti-4-1BB mAbs jednom nedeljno tokom tri nedelje. Adekvatna iscrpljenost podgrupa imunih ćelija je procenjena protočnom citometrijom periferne krvi uzete od miševa neposredno pre završetka eksperimenta (podaci nisu prikazani). Kao što se očekivalo, miševi bez osiromašenja imunih ćelija su reagovali na tretman sa anti-CTLA-4 kombinovanim sa anti-4-1BB mAb (slika 62). Slično tome, iscrpljivanje NK ćelija i CD4 T ćelija nije uticalo na antitumorsko delovanje kombinovane terapije anti-CTLA-4 plus anti-4-1BB mAb. Smanjenje CD8 T ćelija je, međutim, poništilo antitumorsko delovanje kombinovane terapije antitelima. Na dan 28, procenjena prosečna veličina tumora za miševe sa osiromašenim CD8 T ćelijama (92.3 mm<2>, 95% CI: 64.5, 12.1 mm<2>) je bila značajno veća od prosečne veličine tumora za miševe bez iscrpljivanja imunih ćelija (28.7 mm<2>, 95% CI: -17.1, 74.4 mm<2>), miševi sa osiromašenim CD4 T ćelijama (16.7 mm<2>, 95% CI: 1.0, 32.4 mm<2>), i miševi sa osiromašenim NK ćelijama (9.3 mm<2>, 95% CI: -8.3, 26.9 mm<2>). Ovi podaci pokazuju da je efekat iskorenjivanja tumora tretmana anti-CTLA-4 i anti-4-1BB mAb zavisan od CD8 T ćelija.

[0141] Anti-4-1BB antitelo je smanjilo odgovor antitela na ksenogena anti-CTLA-4 antitela.

[0142] Jedna od prepreka ponovljenoj terapiji antitelima je pojačanje odgovora antitela domaćina na terapijska antitela.<81>Pošto je poznato da 4-1BB smanjuje odgovor antitela na proteine, procenili smo efekat anti-4-1BB antitela na odgovor domaćina na anti-CTLA-4 antitela. Kao što je prikazano na Sl. 63, vrlo mali, ako je bilo kakav odgovor anti-antitela otkriven kod miševa tretiranih bilo kontrolnim IgG ili anti-4-1BB. U skladu sa sposobnošću anti-CTLA-4 mAb da olakša odgovor CD4 T ćelija<82>, miševi tretirani anti-CTLA-4 plus IgG pacova razvili su jake odgovore antitela domaćina protiv primenjenog 4F10 antitela i IgG pacova (Slike 63A-B). Ovaj odgovor je smanjen za više od 30 puta kada je anti-4-1BB istovremeno primenjen sa anti-CTLA-4 mAb. Ovi podaci sugerišu da anti-4-1BB antitela mogu potencijalno da produže trajanje drugih terapijskih proteina koji se istovremeno primenjuju smanjenjem odgovora domaćina na terapijske lekove.

[0143] Kod humanih CTLA-4 „knock-in“ miševa, kombinacija anti-mišjih 4-1BB i antihumanih CTLA-4 antitela izazvala je odbacivanje tumora i dugotrajan imunitet protiv kancera.

[0144] Pošto anti-4-1BB smanjuje proizvodnju antitela protiv anti-CTLA-4 antitela, interesantno je pitanje da li je poboljšanje odbacivanja tumora anti-4-1BB samo zbog njegovog efekta u suzbijanju odgovora antitela. Ovaj miš koji ima „knock-in“ CTLA4 gen nam je omogućio da testiramo da li anti-tumorski efekat anti-humanih CTLA4 antitela može biti poboljšan anti-4-1BB antitelom. Kao što je prikazano na Sl.64A, dok su i anti-humano CTLA-4 (L3D10) i anti-4-1BB antitelo (2A) pojedinačno izazvali odloženi rast tumora, kombinacija dva antitela je rezultujela najznačajnijim odbacivanjem tumora. Odnosno, u grupama tretiranim anti-CTLA-4, 4-1BB ili sa dva antitela, 1/7, 2/7, 5/7 miševi nikada nisu razvili tumore, dok su svi miševi u netretiranoj grupi razvili tumore. Pošto je anti-humano CTLA-4 antitelo mišjeg porekla, uticaj 4-1BB antitela se ne može pripisati njegovoj supresiji antitela na terapeutska anti-CTLA-4 antitela. Pored toga, naši podaci su takođe pokazali da će bolji efekat kombinovane terapije verovatno biti primenljiv na imunoterapiju zasnovanu na anti-humanom CTLA-4 antitelu.

[0145] Da bismo testirali da li su miševi tretirani dvostrukim antitelima imuni na dalje izlaganje tumorskim ćelijama, izložili smo ih tumorskim ćelijama 110 dana nakon njihovog prvog izlaganja tumorskim ćelijama. Kao što je prikazano na Sl. 64B, svih pet miševa tretiranih dvostrukim antitelima koji su odbacili tumorske ćelije u prvom krugu ostali su bez tumora, dok su kontrolni naivni miševi imali progresivan rast tumora. Tako je kombinovana terapija takođe izazvala dugotrajan imunitet na ćelije kancera.

[0146] Jedna od prepreka imunoterapiji zasnovanoj na proteinima je imunitet domaćina na terapijske proteine. U slučaju antitela, domaćin može da postavi antitela na ksenotipske, alotipske i idiotipske epitope.<81>Ksenotipski odgovor se može eliminisati potpunom humanizacijom, iako drugi odgovori anti-antitela zahtevaju posebna razmatranja. Prepreka je očiglednija za anti-CTLA-4 antitelo jer je ono samo po sebi pomoćno sredstvo. Prethodni rad od Mittler et al. pokazao značajnu supresiju humoralnog imunog odgovora zavisnog od T-ćelija.<83>Naši podaci pokazuju da istovremena primena anti-4-1BB antitela smanjuje odgovore domaćina na anti-CTLA-4 antitelo, što sugeriše još jednu prednost kombinovane terapije upotrebom anti-CTLA-4 i anti-4-1BB antitela.

[0147] Uzeti zajedno, naši podaci pokazuju da kombinovana terapija sa anti-CTLA-4 i anti-4-1BB antitelima nudi tri glavne prednosti, naime, povećan efekat na imunitet protiv kancera, uzajamno suzbijanje autoimunih neželjenih efekata i poboljšanje odgovora anti-antitela.

[0148] Sve publikacije i patenti pomenuti u ovoj specifikaciji su ovde uključeni referencom u istoj meri kao da je za svaku pojedinačnu publikaciju ili patentnu prijavu posebno i pojedinačno naznačeno da bude uključena referencom u celini. Iako je pronalazak opisan u vezi sa njegovim specifičnim primerima izvođenja, biće razumljivo da se može dalje modifikovati i da je ova prijava namenjena da pokrije sve varijacije, upotrebe ili adaptacije pronalaska prema, generalno, principima pronalazska i uključujući takva odstupanja od ovog otkrića koja su u okviru poznate ili uobičajene prakse u struci na koju se pronalazak odnosi i koja se mogu primeniti na suštinske karakteristike koje su ovde prethodno izložene.

Citirane reference.

[0149]

1. Townsend ARM, Tothbard J, Gotch FM, Bahadur G, Wraith D, McMichael AJ. The epitope of influenza nucleoprotein recognized by cytotoxic lymphocytes can be defined with short synthetic peptides. Cell.1986;44:959-68.

2. Zinkernagel RM, Doherty PC. Restriction of in vitro T cell-mediated cytotoxicity in lymphocytic choriomeningitis within a syngeneic or semiallogeneic system. Nature.

1974;248:701-2.

3. Lafferty KJ, Prowse SJ, Simeonovic CJ, Warren HS. Immunobiology of tissue transplantation: a return to the passenger leukocyte concept. Annu Rev Immunol. 1983;1:143-73.

4. Liu Y, Linsley PS. Costimulation of T-cell growth. Curr Opin Immunol. 1992;4(3):265-70.

5. Schwartz RH. Costimulation of T lymphocytes: the role of CD28, CTLA4, and B7/BB1 in interleukin-2 production and immunotherapy. Cell.1992;71(7):1065-8.

6. Freeman GJ, Freedman AS, Segil JM, Lee G, Whitman JF, Nadler LM. B7, a new member of the Ig superfamily with unique expression on activated and neoplastic B cells. J Immunol.

1989;143(8):2714-22.

7. Freeman GJ, Gribben JG, Boussiotis VA, Ng JW, Restivo VA, Jr., Lombard LA, et al. Cloning of B7-2: a CTLA4 counter-receptor that costimulates human T cell proliferation [see comments]. Science. 1993;262(5135):909-11.

8. Hathcock KS, Laszlo G, Dickler HB, Bradshaw J, Linsley P, Hodes RJ. Identification of an alternative CTLA4 ligand costimulatory for T cell activation [see comments]. Science.

1993;262(5135):905-7.

9. Wu Y, Guo Y, Liu Y. A major costimulatory molecule on antigen-presenting cells, CTLA4 ligand A, is distinct from B7. J Exp Med.1993;178(5):1789-93.

10. Leach DR, Krummel MF, Allison JP. Enhancement of antitumor immunity by CTLA4 blockade [see comments]. Science.1996;271(5256):1734-6.

11. Linsley PS, Brady W, Urnes M, Grosmaire LS, Damle NK, Ledbetter JA. CTLA4 is a second receptor for the B cell activation antigen B7. J Exp Med.1991;174(3):561-9.

12. Linsley PS, Clark EA, Ledbetter JA. T-cell antigen CD28 mediates adhesion with B cells by interacting with activation antigen B7/BB-1. Proc Natl Acad Sci USA. 1990;87(13):5031-5.

13. Hodi FS, Mihm MC, Soiffer RJ, Haluska FG, Butler M, Seiden MV, et al. Biologic activity of cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 antibody blockade in previously vaccinated metastatic melanoma and ovarian carcinoma patients. Proc Natl Acad Sci U SA.

2003;100(8):4712-7. PubMed PMID: 12682289.

14. Hodi FS, O'Day SJ, McDermott DF, Weber RW, Sosman JA, Haanen JB, et al. Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med.

2010;363(8):711-23. Epub 2010/06/08. doi: 10.1056/NEJMoa1003466. PubMed PMID: 20525992; PubMed Central PMCID: PMC3549297.

15. Larkin J, Chiarion-Sileni V, Gonzalez R, Grob JJ, Cowey CL, Lao CD, et al. Combined Nivolumab and Ipilimumab or Monotherapy in Untreated Melanoma. N Engl J Med.

2015;373(1):23-34. Epub 2015/06/02. doi: 10.1056/NEJMoa1504030. PubMed PMID: 26027431.

16. Ribas A, Hodi FS, Callahan M, Konto C, Wolchok J. Hepatotoxicity with combination of vemurafenib and ipilimumab. N Engl J Med. 2013;368(14):1365-6. Epub 2013/04/05. doi: 10.1056/NEJMc1302338. PubMed PMID: 23550685.

17. Delyon J, Mateus C, Lambert T. Hemophilia A induced by ipilimumab. N Engl J Med.

2011;365(18):1747-8. Epub 2011/11/04. doi: 10.1056/NEJMc1110923. PubMed PMID: 22047582.

18. Fadel F, El Karoui K, Knebelmann B. Anti-CTLA4 antibody-induced lupus nephritis. N Engl J Med. 2009;361(2):211-2. Epub 2009/07/10. doi: 10.1056/NEJMc0904283. PubMed PMID: 19587352.

19. Kocak E, Lute K, Chang X, May KF, Jr., Exten KR, Zhang H, et al. Combination therapy with anti-CTL antigen-4 and anti-4-1BB antibodies enhances cancer immunity and reduces autoimmunity. Cancer Res. 2006;66(14):7276-84. Epub 2006/07/20. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-05-2128. PubMed PMID: 16849577.

20. Lute KD, May KF, Lu P, Zhang H, Kocak E, Mosinger B, et al. Human CTLA4-knock-in mice unravel the quantitative link between tumor immunity and autoimmunity induced by anti-CTLA4 antibodies. Blood.2005. PubMed PMID: 16037385.

21. May KF, Roychowdhury S, Bhatt D, Kocak E, Bai XF, Liu JQ, et al. Anti-human CTLA4 monoclonal antibody promotes T cell expansion and immunity in a hu-PBL-SCID model: a new method for preclinical screening of costimulatory monoclonal antibodies. Blood.

2005;105:1114-20. PubMed PMID: 15486062.

22. Shields RL, Namenuk AK, Hong K, Meng YG, Rae J, Briggs J, et al. High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma Rill, and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the Fc gamma R. J Biol Chem.

2001;276(9):6591-604. Epub 2000/11/30. doi: 10.1074/jbc.M009483200. PubMed PMID: 11096108.

23. Dall'Acqua WF, Woods RM, Ward ES, Palaszynski SR, Patel NK, Brewah YA, et al. Increasing the affinity of a human IgG1 for the neonatal Fc receptor: biological consequences. J Immunol. 2002;169(9):5171-80. Epub 2002/10/23. PubMed PMID: 12391234.

24. Gao SH, Huang K, Tu H, Adler AS. Monoclonal antibody humanness score and its applications. BMC biotechnology. 2013;13:55. Epub 2013/07/06. doi: 10.1186/1472-6750-13-55. PubMed PMID: 23826749; PubMed Central PMCID: PMC3729710.

25. Sun Y, Chen HM, Subudhi SK, et al. Costimulatory molecule-targeted antibody therapy of a spontaneous autoimmune disease. Nat Med 2002.8: 1405-13

26. Foell J, Strahotin S, O'Neil SP, et al. CD137 costimulatory T cell receptor engagement reverses acute disease in lupus-prone NZB × NZW F1 mice. J Clin Invest 2003.111: 1505-18 27. Melero I, Shuford WW, Newby SA, et al. Monoclonal antibodies against the 4-1BB T-cell activation molecule eradicate established tumors. Nat Med 1997.3: 682-5

28. May KF, Jr., Chen L, Zheng P and Liu Y Anti-4-1BB monoclonal antibody enhances rejection of large tumor burden by promoting survival but not clonal expansion of tumorspecific CD8+ T cells. Cancer Res 2002.62: 3459-65

29. Ye Z, Hellstrom I, Hayden-Ledbetter M, et al. Gene therapy for cancer using single-chain Fv fragments specific for 4-1BB. Nat Med 2002.8: 343-8

30. Walunas, T.L., et al., CTLA4 can function as a negative regulator of T cell activation. Immunity, 1994. 1(5): p.405-13.

31. Krummel, M.F. and J.P. Allison, CD28 and CTLA4 have opposing effects on the response of T cells to stimulation. J Exp Med, 1995.182(2): p.459-65.

32. Anderson, D.E., et al., Paradoxical inhibition of T-cell function in response to CTLA4 blockade; heterogeneity within the human T-cell population. Nat Med, 2000.6(2): p.211-4.

33. Coyle, A. J. et al. (2001) "The Expanding B7 Superfamily: Increasing Complexity In Costimulatory Signals Regulating T Cell Function," Nature Immunol. 2(3):203-209.

34. Sharpe, A. H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily," Nature Rev. Immunol. 2:116-126.

35. Collins, M. et al. (2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands," Genome Biol.

6:223.1-223.7.

36. Flajnik, M. F. et al. (2012) "Evolution Of The B7 Family: Co-Evolution Of B7H6 And Nkp30, Identification Of A New B7 Family Member, B7H7, And Of B7's Historical Relationship With The MHC," Immunogenetics epub doi.org/10.1007/s00251-012-0616-2. 37. Martin-Orozco, N. et al. (2007) "Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity," Semin. Cancer Biol.17(4):288-298.

38. Flies, D. B. et al. (2007) "The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity," J. Immunother. 30(3):251-260

39. Ishida, Y. et al. (1992) "Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death," EMBO J.11:3887-3895.

40. Agata, Y. et al. (1996) "Expression Of The PD-1 Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And B Lymphocytes," Int. Immunol.8(5):765-772.

41. Yamazaki, T. et al. (2002) "Expression Of Programmed Death 1 Ligands By Murine T Cells And APC," J. Immunol. 169:5538-5545.

42. Nishimura, H. et al. (2000) "Facilitation Of Beta Selection And Modification Of Positive Selection In The Thymus Of PD-1-Deficient Mice," J. Exp. Med.191:891-898.

43. Martin-Orozco, N. et al. (2007) "Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity," Semin. Cancer Biol.17(4):288-298.

44. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991).

45. Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol.196:901-917.

46. Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498.

47. Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7:805.

48. Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969

49. Keler, T. et al. Activity and safety of CTLA4 blockade combined with vaccines in cynomolgus macaques. J. Immunol.171, 6251-6259 (2003).

50. Wing, K. et al. CTLA4 control over Foxp3+ regulatory T cell function. Science 322, 271-275, doi:10.1126/science.1160062 (2008).

51. Schwartz, R. S. The new immunology--the end of immunosuppressive drug therapy? N. Engl. J. Med.340, 1754-1756, doi:10.1056/NEJM199906033402209 (1999).

52. Simpson, T. R. et al. Fc-dependent depletion of tumor-infiltrating regulatory T cells codefines the efficacy of anti-CTLA4 therapy against melanoma. J. Exp. Med.210, 1695-1710, doi:10.1084/jem.20130579 (2013).

53. Selby, M. J. et al. Anti-CTLA-4 antibodies of IgG2a isotype enhance antitumor activity through reduction of intratumoral regulatory T cells. Cancer immunology research 1, 32-42, doi:10.1158/2326-6066.CIR-13-0013 (2013).

54. Maker, A. V., Attia, P. & Rosenberg, S. A. Analysis of the cellular mechanism of antitumor responses and autoimmunity in patients treated with CTLA4 blockade. J. Immunol. 175, 7746-7754 (2005).

55. Korman, A. J., Peggs, K. S. & Allison, J. P. Checkpoint blockade in cancer immunotherapy. Adv. Immunol. 90, 297-339, doi:10.1016/S0065-2776(06)90008-X (2006).

56. Ribas, A. et al. Tremelimumab (CP-675,206), a cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4 blocking monoclonal antibody in clinical development for patients with cancer. Oncologist 12, 873-883, doi:10.1634/theoncologist.12-7-873 (2007).

57. Ribas, A. et al. Phase III randomized clinical trial comparing tremelimumab with standardof-care chemotherapy in patients with advanced melanoma. J. Clin. Oncol.31, 616-622, doi: 1 0.1200/JCO.2012.44.6112 (2013).

58. Lee, K. M. et al. Molecular basis of T cell inactivation by CTLA4 [In Process Citation]. Science 282, 2263-2266 (1998).

59. Marengere, L. E. et al. Regulation of T cell receptor signaling by tyrosine phosphatase SYP association with CTLA4 [published errata appear in Science 1996 Dec 6;274(5293)1597 and 1997 Apr 4;276(5309):21]. Science 272, 1170-1173 (1996).

60. Liu, Y. Is CTLA4 a negative regulator for T-cell activation? Immunol. Today 18, 569-572 (1997).

61. Tivol, E. A. et al. Loss of CTLA4 leads to massive lymphoproliferation and fatal multiorgan tissue destruction, revealing a critical negative regulatory role of CTLA4. Immunity 3, 541-547 (1995).

62. Waterhouse, P. et al. Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in CTLA4 [see comments]. Science 270, 985-988 (1995).

63. Bachmann, M. F., Kohler, G., Ecabert, B., Mak, T. W. & Kopf, M. Cutting edge: lymphoproliferative disease in the absence of CTLA4 is not T cell autonomous. J. Immunol.

163, 1128-1131 (1999).

64. Bachmann, M. F. et al. Normal pathogen-specific immune responses mounted by CTLA4-deficient T cells: a paradigm reconsidered. Eur. J. Immunol. 31, 450-458 (2001).

65. Nguyen, T. V., Ke, Y., Zhang, E. E. & Feng, G. S. Conditional deletion of Shp2 tyrosine phosphatase in thymocytes suppresses both pre-TCR and TCR signals. J. Immunol. 177, 5990-5996 (2006).

66. Qureshi, O. S. et al. Trans-endocytosis of CD80 and CD86: a molecular basis for the cellextrinsic function of CTLA-4. Science 332, 600-603, doi: 10.1126/science.1202947 (2011).

67. Ueda, H. et al. Association of the T-cell regulatory gene CTLA4 with susceptibility to autoimmune disease. Nature 423, 506-511 (2003).

68. Magistrelli, G. et al. A soluble form of CTLA-4 generated by alternative splicing is expressed by nonstimulated human T cells. Eur. J. Immunol. 29, 3596-3602, doi:10.1002/(SICI)1521-4141(199911)29:11<3596::AID-IMMU3596>3.0.CO;2-Y (1999).

69. Kremer, J. M. et al. Treatment of rheumatoid arthritis by selective inhibition of T-cell activation with fusion protein CTLA4Ig. N. Engl. J. Med. 349, 1907-1915, doi:10.1056/NEJMoa035075 (2003).

70. Abrams, J. R. et al. CTLA4Ig-mediated blockade of T-cell costimulation in patients with psoriasis vulgaris. J. Clin. Invest.103, 1243-1252, doi:10.1172/JCI5857 (1999).

71. Gerold, K. D. et al. The soluble CTLA-4 splice variant protects from type 1 diabetes and potentiates regulatory T-cell function. Diabetes 60, 1955-1963, doi:10.2337/db11-0130 (2011).

72. Peach RJ, Bajorath J, Brady W, Leytze G, Greene J, Naemura J, et al. Complementarity determining region 1 (CDR1)- and CDR3-analogous regions in CTLA-4 and CD28 determine the binding to B7-1. J Exp Med.1994;180(6):2049-58.

73. van Elsas, A., Hurwitz, A. A. & Allison, J. P. Combination immunotherapy of B16 melanoma using anti-cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 (CTLA-4) and granulocyte/macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)-producing vaccines induces rejection of subcutaneous and metastatic tumors accompanied by autoimmune depigmentation. J. Exp. Med.190, 355-366 (1999).

74. van Elsas, A. et al. Elucidating the autoimmune and antitumor effector mechanisms of a treatment based on cytotoxic T lymphocyte antigen-4 blockade in combination with a B16 melanoma vaccine: comparison of prophylaxis and therapy. J. Exp. Med.194, 481-489. (2001).

75. Karandikar, N. J., Vanderlugt, C. L., Walunas, T. L., Miller, S. D. & Bluestone, J. A. CTLA-4: a negative regulator of autoimmune disease. J. Exp. Med.184, 783-788 (1996).

76. Luhder, F., Chambers, C., Allison, J. P., Benoist, C. & Mathis, D. Pinpointing when T cell costimulatory receptor CTLA-4 must be engaged to dampen diabetogenic T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.97, 12204-12209 (2000).

77. Hurwitz, A. A., Sullivan, T. J., Sobel, R. A. & Allison, J. P. Cytotoxic T lymphocyte antigen-4 (CTLA-4) limits the expansion of encephalitogenic T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE)-resistant BALB/c mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.

99, 3013-3017 (2002).

78. Piganelli, J. D., Poulin, M., Martin, T., Allison, J. P. & Haskins, K. Cytotoxic T lymphocyte antigen 4 (CD152) regulates self-reactive T cells in BALB/c but not in the autoimmune NOD mouse. J. Autoimmun. 14, 123-131 (2000).

79. Phan, G. Q. et al. Cancer regression and autoimmunity induced by cytotoxic T lymphocyteassociated antigen-4 blockade in patients with metastatic melanoma. Proc Natl Acad Sci U.S.A.

100, 8372-8377 (2003).

80. Eisenthal, A. et al. Antitumor effects of recombinant interleukin-6 expressed in eukaryotic cells. Cancer Immunol. Immunother. 36, 101-107 (1993).

81. Schroff, R. W., Foon, K. A., Beatty, S. M., Oldham, R. K. & Morgan, A. C., Jr. Human anti-murine immunoglobulin responses in patients receiving monoclonal antibody therapy. Cancer Res.45, 879-885 (1985).

82. Kearney, E. R. et al. Antigen-dependent clonal expansion of a trace population of antigenspecific CD4+ T cells in vivo is dependent on CD28 costimulation and inhibited by CTLA-4. J. Immunol. 155, 1032-1036 (1995).

83. Mittler, R. S., Bailey, T. S., Klussman, K., Trailsmith, M. D. & Hoffmann, M. K. Anti-4-1BB monoclonal antibodies abrogate T cell-dependent humoral immune responses in vivo through the induction of helper T cell anergy. J. Exp. Med.190, 1535-1540 (1999).

Claims (5)

Patentni zahtevi

1. Anti-CTLA4 antitelo sposobno da veže humani CTLA4 koje sadrži: teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 64, laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 71 i IgG1 Fc region koji sadrži sekvencu datu u SEQ ID NO: 4.

2. Farmaceutska kompozicija koja sadrži terapeutski efikasnu količinu anti-CTLA4 antitela prema patentnom zahtevu 1, i fiziološki prihvatljiv nosač ili ekscipijens.

3. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 2 za upotrebu u lečenju kancera kod subjekta.

4. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, koja dalje sadrži upotrebu dodatnog agensa izabranog iz grupe koja se sastoji od anti-PD-1 i anti-4-1BB antitela.

5. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, naznačena time što su anti-PD-1 ili anti-4-1BB antitela i anti-CTLA4 antitelo kombinovani u jednom molekulu kao bispecifična antitela.