RS63238B1 - Kombinovana terapija sa anti-cd19 antitelom i azotnim senfom - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Ovo otkrić e se odnosi na farmaceutsku kombinaciju anti-CD19 antitela i azotnog tzv. senfa za lečenje ne-Hodžkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije i/ili akutne limfoblastne leukemije.

Pozadina pronalaska

[0002] B ć elije su limfociti koji igraju veliku ulogu u humoralnom imunološkom odgovoru. Proizvode se u koštanoj srži ve ć ine sisara i predstavljaju 5-15% cirkulišuć eg limfoidnog bazena. Osnovna funkcija B ć elija je stvaranje antitela protiv različitih antigena i u suštini su komponenta adaptivnog imunog sistema.

[0003] Zbog njihove kritične uloge u regulisanju imunog sistema, a disregulacija B ć elija je povezana sa raznim poreme ć ajima, kao što su limfomi i leukemije. To uključuje ne-Hodžkinov limfom (NHL), hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL) i akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL).

[0004] NHL je heterogeni malignitet koji potiče od limfocita. U Sjedinjenim Državama (SAD), incidencija se procenjuje na 65.000 godišnje, a sa smrtnošć u od približno 20.000 ( American Cancer Societi, 2006; i SEER Cancer Statistics Reviev). Bolest se može javiti u svim uzrastima, a uobičajeno počinje kod odraslih starijih od 40 godina, a incidencija raste sa godinama starosti. NHL se karakteriše klonskom proliferacijom limfocita koji se akumuliraju u limfnim čvorovima, krvi, koštanoj srži i slezini, iako može biti zahvać en bilo koji važan ljudski organ. Trenutni sistem klasifikacije koji koriste patolozi i kliničari je klasifikacija tumora Svetske zdravstvene organizacije (SZO), koja organizuje NHL u prekursorske i zrele neoplazme B-ć elija ili T- ć elija. PDK trenutno deli NHL kao indolentnu ili agresivnu za ulazak u klinička ispitivanja. Indolentnu NHL grupu čine prvenstveno folikularni podtipovi, mali limfocitni limfom, MALT (limfoidno tkivo povezano sa sluznicom) i marginalna zona; indolentni obuhvata približno 50% novodijagnostikovanih NHL pacijenata sa B-ć elijama. Agresivni NHL uključuje pacijente sa histološkom dijagnozom prvenstveno difuznih velikih B ć elija (DLBL, DLBCL ili DLCL) (40% svih novodijagnostikovanih pacijenata ima difuzne velike ć elije), Burkitove i ć elije plašta. Klinički tok NHL-a je veoma promenljiv. Glavna determinanta kliničkog toka je histološki podtip. Već ina indolentnih tipova NHL-a smatra se neizlečivom boleš ć u. Pacijenti u početku reaguju ili na hemoterapiju ili na terapiju antitelima i već ina ć e se vratiti. Dosadašnje studije nisu pokazale poboljšanje preživljavanja sa ranom intervencijom. Kod asimptomatskih pacijenata, prihvatljivo je „gledati i čekati“ dok pacijent ne postane simptomatski ili izgleda da se tempo bolesti ubrzava. Vremenom se bolest može transformisati u agresivniju histologiju. The medijan preživljavanja je 8 do 10 godina, a indolentni pacijenti često primaju 3 ili više tretmana tokom faze lečenja njihove bolesti. Početni tretman simptomatskog indolentnog NHL pacijenata je istorijski bio kombinovana hemoterapija. Najčešć e koriš ć eni agensi uključuju: ciklofosfamid, vinkristin i prednizon (CVP); ili ciklofosfamid, adriamicin, vinkristin, prednizon (CHOP). Otprilike 70% do 80% pacijenata ć e odgovoriti na njihovu početnu hemoterapiju, trajanje remisije traje 2-3 godine. Na kraju krajeva, ve ć ina pacijenata ima recidiv. Otkrić e i klinička upotreba anti-CD20 antitela, rituksimaba, obezbedila je značajna poboljšanja u odgovoru i preživljavanju stopa. Trenutni standard nege za već inu pacijenata je rituksimab CHOP (R-CHOP) ili rituksimab CVP (R-CVP). Interferon je odobren za početni tretman NHL-a u kombinaciji sa agensima za alkilovanje, ali ima ograničenu upotrebu u SAD. Terapija rituksimabom se pokazala efikasnom u nekoliko tipova NHL-a i trenutno je odobrena kao prva linija tretman za indolentni (folikularni limfom) i agresivni NHL (difuzni limfom velikih B ć elija). Međutim, tamo su značajna ograničenja anti-CD20 monoklonskih antitela (mAb), uključujuć i primarnu rezistenciju (50% odgovora na indolentni pacijenti sa recidivom), stečena rezistencija (50% stopa odgovora nakon ponovnog lečenja), retko potpuni odgovor (2% potpuna stopa relapsa u populaciji sa relapsom) i kontinuirani obrazac relapsa. Konačno, mnoge B ć elije se ne eksprimiraju CD20, a samim tim i mnogi poremeć aji B- ć elija ne mogu se lečiti upotrebom terapije anti-CD20 antitelima. U VO2010/083365 prijavljena je terapeutska kombinacija anti-CD20 antitela i bendamustina.

[0005] Pored NHL-a postoji nekoliko tipova leukemija koje su rezultat disregulacije B ć elija. Hronična limfocitna leukemija (takođe poznata kao "hronična limfoidna leukemija" ili "CLL"), je vrsta leukemije odraslih uzrokovana abnormalnom akumulacijom B limfocita. Kod CLL-a, maligni limfociti mogu izgledati normalno i zrelo, ali oni nisu u stanju da se efikasno nose sa infekcijom. CLL je najčešć i oblik leukemije kod odraslih. Muškarci su sa duplo više verovatnoće da ć e razviti CLL nego žene. Međutim, ključni faktor rizika je starost. Preko 75% novih slučajeva dijagnostikuje se kod pacijenata preko 50 godina. Više od 10.000 slučajeva dijagnostikuje se svake godine, a smrtnost je skoro 5.000 godišnje (američki Cancer Societi, 2006; i pregled statistike raka SEER). CLL je neizlečiva bolest, ali u već ini slučajeva napreduje sporo slučajevima. Mnogi ljudi sa CLL vode normalan i aktivan život dugi niz godina. Zbog sporog početka, CLL u ranoj fazi se generalno ne leči jer se veruje da rana intervencija CLL ne poboljšava vreme preživljavanja ili kvalitet života. Umesto toga, stanje se prati tokom vremena. Inicijalni tretmani CLL variraju u zavisnosti od tačne dijagnoze I progresija bolesti. Postoje desetine agenasa koji se koriste za terapiju CLL. Kombinovani režimi hemoterapije kao što su FCR (fludarabin, ciklofosfamid i rituksimab) i BR (bendamustin i rituksimab) su efikasni u i novodijagnostikovane i relapsirane CLL. Alogena transplantacija koštane srži (matične ć elije) se retko koristi kao prvi linijski tretman za CLL zbog njegovog rizika.

[0006] Drugi tip leukemije je akutna limfoblastna leukemija (ALL), takođe poznata kao akutna limfocitna leukemija. ALL karakteriše prekomerna proizvodnja i kontinuirano umnožavanje malignih i nezrelih belih krvnih zrnaca (takođe poznati kao limfoblasti) u koštanoj srži. „Akutno“ se odnosi na nediferencirano, nezrelo stanje cirkulisanja limfociti („blasti“), i da bolest brzo napreduje sa očekivanim životnim vekom od nedelja do meseci ako se ne leči. ALL je najčešć i u detinjstvu sa vrhunskom incidencom od 4-5 godina. Deca od 12-16 godina lakše umiru od nego drugi. Trenutno se najmanje 80% ALL u detinjstvu smatra izlečivim. Svakog se dijagnostikuje manje od 4.000 slučajeva godine, a mortalitet je skoro 1.500 godišnje (American Cancer Societi, 2006; i SEER Cancer Statistics Reviev).

[0007] Ljudski CD19 molekul je strukturno različit receptor ć elijske površine, eksprimiran na površini humane B ć elije, uključujuć i, ali ne ograničavaju ć i se na, pre-B ć elije, B ć elije u ranom razvoju (tj., nezrele B ć elije), zrele B ć elije kroz terminalnu diferencijaciju u plazma ć elije i maligne B ć elije. CD 19 je izražen kod ve ć ine pre-B akutne limfoblastne leukemije (ALL), ne-Hodžkinovi limfomi, B ć elijske hronične limfocitne leukemije (CLL), pro-limfocitne leukemije, leukemije tzv. dlakavih ć elija, uobičajene akutne limfocitne leukemije i neke nul-akutne limfoblastne leukemije ( Nadler et al, J. Immunol., 131:244-250 (1983), Loken et al, Blood, 70:1316-1324 (1987), Uckun et al, Blood, 71:1329 (1988), Anderson et al, 1984. Blood, 63:1424-1433 (1984), Scheuermann, Leuk. Limphoma, 18:385-397 (1995)). Ekspresija CD 19 na plazma ć elijama dalje sugeriše da se može eksprimirati na diferenciranim tumorima B ć elija kao što su multipli mijelom, plazmacitomi, Valdenstromovi tumori (Grossbard et al., Br. J. Haematol, 102:509-15 (1998); Treon et al, Semin. Oncol, 30:248-52 (2003)).

[0008] Prema tome, CD 19 antigen je cilj za imunoterapiju u lečenju ne-Hodžkinovog limfoma (uključujuć i svaki od podtipova koji su opisani u ovom pronalasku), hronične limfocitne leukemije i/ili akutne limfoblastne leukemije.

[0009] Prikazane su određene CD19 terapije. T ć elije koje eksprimiraju anti-CD19 himerni antigen receptor (CAR)uključuju ć i i CD3-S i 4-BB kostimulatorni domen davali su tri pacijenta sa uznapredovalom CLL. Kalos et al., T ć elije sa himernim antigenskim receptorima imaju moć ne antitumorske efekte i mogu uspostaviti pam ć enje kod pacijenata koji su sa uznapredovalom leukemijom, Science Translational Medicine, vol. 3, br. 95 (10. avgust 2011), lečenih pacijenata sa CART-ovima koji imaju specifičnost za CD19 nedelju dana nakon što su pacijenti primili terapiju bendamustinom. S toga, do vremena kada su primenjeni CART-ovi, bendamustin je ve ć očiš ć en iz ljudskog tela, a sinergistički efekat treba isključiti Sadelain et al., očekujući i potencijalne zamke himeričnih antigenskih receptora, Current Opinion in Immunologi, Elsevier, vol. 21, br.2, 2. april 2009. takođe opisuje se anti-CD19 himernog antigen receptora (CAR). Ni Kalos et al. ni Sadelain et al. Međutim, opisuju se antitelo specifično za CD19 u kombinaciji sa bendamustinom kao što je prikazano naprimer ovde.

[0010] Bendamustin kao terapija u lečenju ne-Hodžkinovog limfoma opisan je u Bremer et al., Visoke stope dugotrajne remisije nakon 5-dnevnih ciklusa hemoterapije bendamustinom kod prethodno lečenih ne-Hodgkinovih bolesti niskog stepena limphomas, Journal of Cancer Research and Clinical Oncologi, Springer International, Berlin, DE, vol. 128, br. 11, 1 novembar 2002. i WO2006065392, ali ni jedno ni drugo rešenje ne sugeriše antitelo specifično za CD19 u kombinaciji sa bendamustinom kao što je prikazano u ovom pronalasku.

[0011] Upotreba CD19 antitela u nespecifičnim B ć elijskim limfomima je razmarana u spisima WO2007076950 (US2007154473), a uz površno pominjanje bendamustina na dugačkoj listi potencijalnih kombinacija, ali i ne uspevajući da se postigne antitelo koje je ovde prikazano ili da sugeriše sinergističke efekte kombinacije u lečenju ne-Hodžkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije i/ili akutne limfoblastne leukemije kao što je ovde prikazano.

[0012] Upotreba CD19 antitela u CLL, NHL i ALL opisana je u Scheuermann et al., CD19 antigen kod leukemije i Limphoma Diagnosis and Immunotherapi, Leukemia and Limphoma, Vol.18, 385-397 (1995), ali ne sugeriše kombinacija prikazana ovde.

[0013] Dodatna antitela specifična za CD19 su opisana u WO2005012493 (US7109304), WO2010053716 (US12/266,999) (imunomedici); VO2007002223 (US US8097703) (Medarek); VO2008022152 (12/377,251) I VO2008150494 (Ksencor), WO2008031056 (US11/852,106) (Medimmune); WO 2007076950 (US 11/648,505) (Merck Patent GmbH); WO 2009/052431 (US12/253,895) (Seattle Genetics); i WO2010095031 (12/710,442) (Glenmark Pharmaceuticals).

[0014] Kombinacije antitela specifičnih za CD19 i drugih agenasa opisane su u WO2010151341 (SAD 13/377,514) (The Feinstein Institut); US5686072 (University of Texas) i WO2002022212 (PCT/US01/29026) (IDEC Pharmaceuticals).

[0015] Jasno je da uprkos nedavnom napretku u otkrivanju i razvoju sredstava usmerenih protiv raka, mnogi oblici raka koji uključuju tumore koji eksprimiraju CD19 i dalje imaju lošu prognozu. Dakle, postoji potreba za poboljšanjem metoda za lečenje takvih oblika raka.

Rezime

[0016] Ni sam, niti kombinovano sa stanjem tehnike, ne sugeriše se sinergistički efekat kombinacije primera antitela i bendamustina u lečenju ne-Hodžkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije i/ili akutne limfoblastne leukemije.

[0017] Ovo otkrić e se odnosi na sinergističku kombinaciju antitela specifičnog za CD19 i bendamustina, za upotrebu u lečenju ne-Hodžkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije ili akutne limfoblastne leukemije, pri čemu antitelo sadrži varijabilni teški lanac sekvence EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFQGRVTISSDKSISTAYMELSSLRSEDTAMYYCARGTY YYGTRVFDYWGQGTLVTV SS (SEK ID BR: 10)

i varijabilni laki lanac sekvence DIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRSSKSLQNVNGNTYLYWFQQKPGQSPQLLIYRMSNLNSGVPDRFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCMQHLEYPITF GAGTKLEIK

(SEK ID BR: 11)

i teški lanac konstantnog domena sekvence ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKTKGQPR EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

(SEK ID BR: 12).

[0018] U jednom aspektu, ovo otkrić e se odnosi na sinergističku kombinaciju antitela specifičnog za CD19 I azotni senf. Takve kombinacije su korisne u lečenju maligniteta B ć elija, kao što je ne-Hodžkinov limfom, hronična limfocitna leukemija ili akutna limfoblastna leukemija.

[0019] In vitro i in vivo modeli se smatraju se indikativnim za to kako se određeno jedinjenje ili kombinacija jedinjenja ponaša kod ljudi. Pored toga, kada se jedinjenja kombinuju bilo in vitro ili in vivo, a očekuje se dać e kombinacija imati samo dodatne efekte. Iznenađujuć e, pronalazači su otkrili da kombinacija određenog antitela specifično za CD19 i bendamustin posredovali su na sinergističkom nivou specifičnog ubijanja ć elija u ć eliji hronične B- ć elije leukemije liniju (MEC-1) u poređenju sa samim antitelom i bendamustinom. Ovaj in vitro model ukazuje na to kako je kombinacija ć e raditi u lečenju hronične limfoidne leukemije (CLL) kod ljudi. Pored toga, i takođe neočekivano, pronalazači su otkrili da kombinacija određenog antitela specifičnog za CD19 i bendamustina inhibira tumor rast i sinergistički poveć ava medijan dana preživljavanja i srednje pove ć anje životnog veka, oba kod Burkitovog limfoma SCID mišje modela, a u poređenju sa samim antitelom i bendamustinom. Ovi in vivo modeli su indikativni za to kakoć e kombinacija funkcionisati u lečenju ne-Hodžkinovog limfoma kod ljudi. Ukratko, kombinacija od prikazanog anti-CD19 antitela i bendamustin se ponaša sinergistički u modelima relevantnim za NHL i CLL. Kao i NHL i CLL su poremeć aji povezani sa B ć elijama i CD19 je visoko eksprimiran na B- ć elijama, a kombinacija koja je prikazana kao primer bi imala isti mehanizam delovanja i takođe bi trebalo da se ponaša sinergistički i u lečenju drugih B ć elija povezanih poreme ć aja, npr. ALL.

[0020] Prema tome, kombinacija antitela sa primerom specifičnog za CD19 i bendamustina ć e biti efikasna u lečenju ljudi kod ne-Hodgkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije ili akutne limfoblastne leukemije. Pored toga, antitelo specifično za CD19 prikazano u ovoj specifikaciji je već ušlo u klinička ispitivanja, gde se takve kombinacije mogu potvrditi kod ljudi.

[0021] Kako je mehanizam delovanja bendamustina i drugih azotnih iperita sličan, jer alkiluje agense koji formiraju međulančane unakrsne veze (ICL) između baza DNK, blokirajuć i tako fundamentalne procese kao što su replikacija i transkripcija, veruje se da bi sinergija takođe trebalo da se vidi kada se leče ljudi koji imaju ne-Hodžkinov limfom, hroničnu limfocitnu leukemiju ili akutnu limfoblastnu leukemiju sa kombinacijom anti CD19 antitelom i azotnim senfom, osim bendamustina.

[0022] Kako se anti-CD19 antitelo i druga anti-CD19 antitela vezuju za CD19, veruje se da sinergiju takođe treba posmatrati kada se leče ljudi koji imaju ne-Hodžkinov limfom, hroničnu limfocitnu leukemiju ili akutnu limfoblastnu leukemiju sa kombinacijom bilo kog anti-CD19 antitela i azotnog senfa, na primer, bendamustina.

[0023] Budući da de anti-CD19 antitelo primerom vezuje za specifični epitop CD19, veruje se da antitela prevazilaze konkurenciju sa navedenim antitelom ili se vezuju za isti epitop, kao što bi antitelo trebalo da se ponaša sinergistički kada se leče ljudi koji imaju ne-Hodžkinov limfom, hroničnu limfocitnu leukemiju ili akutnu limfoblastnu leukemiju kada se koristi u kombinaciji sa azotnim senfom, na primer, bendamustinom.

[0024] Aspekt sadašnjeg otkrić a obuhvata sinergističku kombinaciju u kojoj antitelo specifično za CD19 obuhvata HCDR1 region sekvence SYVMH (SEK ID BR: 1), HCDR2 region sekvence NPYNDG (SEQ ID BR: 2), HCDR3 region sekvence GTYYYGTRVFDY (SEK ID BR: 3), an LCDR1 region sekvence RSSKSLQNVNGNTYLY (SEK ID BR: 4), LCDR2 region sekvence RMSNLNS (SEK ID BR: 5), LCDR3 region sekvence MQHLEYPIT (SEK ID BR: 6) ibendamustin. U poželjnim aspektima, kombinacija se koristi za lečenje ne-Hodžkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije ili akutne limfoblastne leukemije.

Opis Slika

[0025]

Slika 1 pokazuje citotoksične efekte MOR00208 i bendamustina, samih i u kombinaciji na MEC-1ć elijama.

Slika 2 prikazuje ADCC krive koja odgovora dozi kombinacije MOR00208 i bendamustina u MEC-1ć elijama.

Slika 3 prikazuje sekvencu aminokiselina varijabilnih domena MOR00208.

Slika 4 prikazuje sekvencu aminokiselina Fc regiona MOR00208.

Slika 5 prikazuje normalizovane specifične podatke o ubijanju iz tabele 2.

Slika 6 prikazuje rezultate modela preživljavanja humanog Ramos Burkittovog B-ć elijskog limfoma kod SCID miševa kako je opisano u Primeru 3. Slika predstavlja podatke prikazane u tabeli 6, ali isključuje smrtne slučajeve povezane sa lečenjem.

Slika 7 prikazuje statističku analizu rezultata subkutano (SC) implantiranog humanog Ramos Burkittovog Modela rasta tumora B-ć elijskog limfoma kod SCID miševa, kao što je opisano u Primeru 2.

Slika 8 prikazuje rezultate subkutano (SC) implantiranog humanog tumora B-ć elijskog limfoma Ramos Burkittovog modela rasta kod SCID miševa, kao što je opisano u Primeru 2.

Slika 9 prikazuje rezultate subkutano (SC) implantiranog humanog tumora B-ć elijskog limfoma Ramos Burkittovog modela rasta kod SCID miševa, kao što je opisano u Primeru 2. Na ovoj slici doza BEN je 13 mg/kg.

Slika 10 prikazuje rezultate subkutano (SC) implantiranog humanog tumora B-ć elijskog limfoma Ramos Burkittovog modela rasta kod SCID miševa, kao što je opisano u Primeru 2. Na ovoj slici doza BEN je 16 mg/kg.

Detaljan opis pronalaska

[0026] "Sinergija", "sinergizam" ili "sinergizmi" znače više od očekivanog aditivnog efekta kombinacije. Izraz "sinergija", "sinergizam" ili "sinergistički" efekat kombinacije se ovde određuju metodama Chou et al., Clarke et al. i/ili Vebb et al. Videti Ting-Chao Chou, Teorijske osnove, Eksperimentalni dizajn i Kompjuterizovana simulacija sinergizma i antagonizma u studijama kombinacije lekova, Pharmacol Rev 58:621-681 (2006). Vidi takođe Clarke et al., Problemi u dizajnu eksperimenta i analiza krajnjih tačaka u proučavanju eksperimentalnih citotoksičnih agenasa in vivo kod raka dojke i drugi modeli, Istraživanje i lečenje raka dojke 46:255-278 (1997). Vidi takođe Vebb, J.L. (1963) Enzime i Metabolic Inhibitors, Academic Press, Nev York.

[0027] Termin "antitelo" označava monoklonska antitela, uključujuć i bilo koji izotip, kao što su IgG, IgM, IgA, IgD i IgE. IgG antitelo se sastoji od dva identična teška lanca i dva identična laka lanca koji su spojeni disulfidom obveznice. Svaki teški i laki lanac sadrži konstantni region i varijabilni region. Svaki varijabilni region sadrži tri segmenta koji se nazivaju „regioni koji određuju komplementarnost“ („CDRs“) ili „hipervarijabilni regioni“, koji su prvenstveno odgovorni za vezivanje epitopa antigena. Oni se nazivaju CDR1, CDR2 i CDR3, numerisani uzastopno sa N-kraja. Visoko očuvani delovi varijabilnih regiona izvan CDR-ova nazivaju se „okvirne regije“. „Fragment antitela“ označava Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab’ F(ab’)2 fragment ili drugi fragment, koji sadrži najmanje jedan varijabilni teški ili varijabilni laki lanac, od kojih svaki sadrži CDR i okvirne regione.

[0028] "Azotni senf" je nespecifično sredstvo za alkilovanje DNK koja se koriste kao hemoterapija. Alkilaciona sredstva dodaju an alkil grupa (CnH2n+1) u baze nukleinske kiseline, npr. dodavanjem alkil grupe gvaninskoj bazi DNK na broju 7 atom azota imidazolnog prstena. Koraci alkilacije rezultiraju formiranjem međulančanih unakrsnih veza (ICL). Ove ICL su visoko citotoksične, jer blokiraju osnovne metaboličke procese kao što su replikacija i transkripcija. Azotni senfovi uključuju ciklofosfamid, hlorambucil, uramustin, ifosfamid, melfalan i bendamustin.

[0029] Ciklofosfamid se prodaje kao Endoxan, Citoxan, Neosar, Procytox i Revimmune, a takođe je poznat kao citofosfan. Ciklofosfamid ili kombinacije uključujuć i ciklofosfamid se koriste u lečenju limfoma, leukemija i nekih čvrstih tumora. Ciklofosfamid ima sledeć u strukturu:

[0030] GlakoSmithKline prodaje Hlorambucil kao Leukeran. Koristi se uglavnom u lečenju hroničnih limfocita leukemija. Hlorambucil ima sledeć u strukturu:

[0031] Uramustin se koristi u lečenju ne-Hodgkinovog limfoma. Uramustin ima sledeć u strukturu:

[0032] Ifosfamid se prodaje kao Mitoxana i Ifex. Ifosfamid ima sledeć u strukturu:

[0033] Melfalan se prodaje kao Alkeran. Melfalan ima sledeć u strukturu:

[0034] Bendamustin se prodaje pod nazivima Ribomustin® i Treanda®, a poznat je i kao SDKS-105, od strane Mundipharma International Corporation Limited (imalac licence je Astellas Pharma GmbH) i Cephalona, za lečenje hronične limfocitne leukemije (CLL), indolentnog B-ć elijskog ne-Hodžkinovog limfoma (NHL) i drugih limfoma. Bendamustine ima slede ć u strukturu:

[0035] "BEN" kada se ovde koristi znači bendamustin.

[0036] "VH" se odnosi na varijabilni region teškog lanca imunoglobulina antitela ili fragmenta antitela. "VL" Naziv "promenljivi region" imunoglobulinskog lakog lanca antitela ili fragmenta antitela.

[0037] Termin "CD19" se odnosi na protein poznat kao CD19, koji ima sledeć e sinonime: B4, B-limfocit antigen CD19, površinski antigen B-limfocita B4, CVID3, diferencijacijski antigen CD19, MGC12802 i površinski T-ć elije antigen, Leu-12.

[0038] Humani CD19 ima sekvencu aminokiselina:

(SEK ID BR: 7)

[0039] "MOR00208" je anti-CD19 antitelo. Aminokiselinska sekvenca varijabilnih domena je data na slici 3. Aminokiselinska sekvenca teškog i lakog lanca Fc regiona MOR00208 je data na slici 4. "MOR00208" i "KsmAb 5574" se koriste kao sinonimi za opis antitela prikazanog na slikama 3 i 4. MOR00208 antitelo je opisan u US patentnoj prijavi serijski broj 12/377,251.

[0040] Dodatna antitela specifična za CD19 su opisana su u US patentu br. 7,109,304 (Imunomedici); US prijava broj.

11/917,750 (Medarek); US prijava serijski br. 11/852,106 (Medimmune); US Prijava serijski br.11/648,505 (Merck Patent GmbH); US patent br.7,968,687 (Seattle Genetics); i US prijava br.12/710,442(Glenmark Pharmaceuticals).

[0041] „Fc region“ označava konstantni region antitela, koji kod ljudi može biti IgG1, 2, 3, 4 podklase ili drugi. Sekvence ljudskih Fc regiona dostupne su na IMGT, Human IGH C-REGIONs, http://vvv.imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/protein/human/IGH/IGHC/Hu_IGHCallgenes.html (preuzeto 16. maja 2011).

[0042] "RefmAb33" je antitelo čija je sekvenca amino kiselina sledeć a:

Teški lanac uključujuć i Fc region:

(SEK ID BR: 8)

Laki lanac uključujuć i Fc region:

( SEK ID BR: 9)

[0043] RefmAb33 je specifičan za RSV, i koristi se kao kontrola izotipa, pošto deli isti Fc region kao MOR00208.

[0044] "Kombinacija" znači više od jedne stavke, npr. jedinjenje kao što je antitelo i bendamustin.

[0045] Ovo otkrić e se takođe odnosi na kombinacije, farmaceutike i tj. farmaceutske kompozicije koje sadrže opisane kombinacije. Dve komponente sinergističke kombinacije ovog pronalaska, npr. antitelo specifično za CD19 i bendamustin, mogu se davati zajedno, istovremeno ili odvojeno. Kada su primenjene zajedno, dve komponente mogu biti formulisane zajedno u jednoj farmaceutskoj kompoziciji, koja može uključiti farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijent. Alternativno, dve komponente se takođe mogu formulisati u različite farmaceutske kompozicije. U ovom slučaju, dve komponente se mogu primeniti istovremeno ili naknadno. U jednom rešenju, bendamustin se primenjuje pre i/ili odvojeno od primene leka antitela specifičnog za CD19, npr. MOR00208.

[0046] Farmaceutska kompozicija uključuje aktivni agens, npr. antitelo za terapeutsku upotrebu kod ljudi. A farmaceutska kompozicija može uključivati prihvatljive nosače ili ekscipijente.

[0047] „Administriranje“ ili „administriranje“ uključuje, ali nije ograničeno na isporuku u obliku injekcije, kao što je, za na primer, intravenski, intramuskularni, intradermalni ili potkožni put ili mukozni put, na primer, kao nazalni sprej ili aerosol za inhalaciju ili kao rastvor za gutanje, kapsula ili tableta.

[0048] "Terapeutski efikasna količina" jedinjenja ili kombinacije se odnosi se na količinu dovoljnu za izlečenje, ublažavanje ili delimično zaustavljanje kliničke manifestacije date bolesti ili poremeć aja i njegovih/njihovih komplikacija. Količina koja je efikasna za određenu terapeutsku svrhu zavisić e od težine bolesti ili povrede, kao i od težinu i opšteg stanja pacijenta. Podrazumeva se da određivanje odgovarajuć e doze može biti postignuto, koriš ć enjem rutinskog eksperimentisanja, konstruisanjem matrice vrednosti i testiranjem različitih tačaka u matrici, sve od kojih je u okviru uobičajenih veština za obučenog lekara ili kliničkog naučnika.

[0049] "CDR-ove" ovde definišu ili Chothia et al ili Kabat et al. Videti Chothia C, Lesk AM. (1987) Canonical strukture za hipervarijabilne regione imunoglobulina. J Mol Biol., 196(4):901-17. Videti Kabat E.A, Vu T.T., Perri H.M., Gottesman K.S. i Foeller C. (1991). Sekvence proteina od imunološkog značaja, 5. izdanje, publikacija NIH ne. 91-3242, Ministarstvo zdravlja i ljudskih službi SAD, Vašington, DC.

[0050] „Unakrsna konkurencija“ označava sposobnost antitela ili drugog vezivnog agensa da ometa vezivanje drugih antitela ili vezivna sredstva za CD19 u standardnom testu konkurentskog vezivanja. Sposobnost ili stepen u kojem antitelo ili drugi vezivni agens može da ometa vezivanje drugog antitela ili vezujuć eg molekula za CD19, te da li s toga može re ć i da se unakrsno konkurisanje prema pronalasku i da li se može odrediti korišć enjem standardne konkurencije u testovima vezivanja. Jedan odgovarajuć i test uključuje upotrebu Biacor tehnologije (npr. koriš ć enjem BIAcore 3000 instrumenta (Biacore, Upsala, Švedska)), koji može da meri obim interakcija korišć enjem tehnologije površinske plazmonske rezonance. Drugi test za merenje unakrsne konkurencije koristi pristup zasnovan na ELISA testu. Proces visoke propusnosti za "epitop binning" antitela zasnovano na njihovoj unakrsnoj konkurenciji opisana su u Međunarodnoj patentnoj prijavi, ovjava br. WO 2003/48731

[0050] „Unakrsna konkurencija“ označavaju sposobnost antitela ili drugog vezivnog agensa da ometa vezivanje drugih antitela ili vezivna sredstva za CD19 u standardnom testu konkurentnog vezivanja. Moguć nost ili stepen u kojem antitelo ili drugi vezivni agens može da ometa vezivanje drugog antitela ili vezujuć eg molekula za CD19, i da li se može re ć i da se stoga unakrsno takmiči prema pronalasku, može se odrediti korišć enjem standardnog takmičenja testovi vezivanja. Jedan odgovaraju ć i test uključuje upotrebu Biacore tehnologije (npr. korišć enjem BIAcore 3000 instrumenta (Biacore, Upsala, Švedska)), koji može da meri obim interakcija korišć enjem tehnologije površinske plazmonske rezonancije. Drugi test za merenje unakrsnog nadmetanja koristi pristup zasnovan na ELISA-i. Proces visoke propusnosti za "epitop binning" antitela zasnovan na njihovoj unakrsnoj konkurenciji opisana su u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO 2003/48731

[0051] Termin "epitop" uključuje bilo koju proteinsku determinantu sposobnu da se specifično veže za antitelo ili na drugi način u interakciji sa molekulom. Epitopske determinante se generalno sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupa molekula kao što su aminokiseline ili bočni lanci ugljenih hidrata ili šeć era i mogu imati specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Epitop može biti "linearan" ili "konformacioni". Termin „linearni epitop" se odnosi na epitop sa svim tačkama interakcije između proteina i molekula u interakciji (npr. kao antitelo) se javljaju linearno duž primarne aminokiselinske sekvence proteina (kontinuirano). Termin „konformacioni epitop" se odnosi na epitop u kome se diskontinuirane aminokiseline koje se spajaju u trodimenzionalnu konformaciju. U konformacionom epitopu, tačke interakcije se javljaju preko aminokiselinskih ostataka na proteinu koji su odvojeni su jedan od drugog.

[0052] Termin „Veže isti epitop kao“ označava sposobnost antitela ili drugog vezujuć eg agensa da se veže za CD19 i ima isti epitop kao primer antitela. Epitopi datog primera antitela i drugih antitela na CD19 može se odrediti korišć enjem standardnih tehnika mapiranja epitopa. Tehnike mapiranja epitopa, dobro poznate u tehnici uključuju Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biologi, Vol. 66 (Glenn E.Morris, ur., 1996) Humana Press, Totova, Nju Džersi. Na primer, linearni epitopi se mogu odrediti npr. istovremenom sintetizacijom velikih brojeva peptida na čvrstim nosačima, peptida koji odgovaraju delovima proteinskog molekula, i reagujuć i na peptide sa antitelima dok su peptidi još uvek vezani za nosače. Takve tehnike su poznate u tehnici i opisane u, npr., američkom patentu br. 4,708,871; Geisen et al, (1984) Proc. Natl. Akad. Sci. USA 8:3998-4002; Geisen et al, (1985) Proc. Natl. Akad. Sci. SAD 82:78-182; Geisen et al, (1986) Mol. Immunol.23:709-715. Slično, konformacioni epitopi se lako identifikuju određivanjem prostorne konformacije aminokiselina kao što je npr. razmena vodonik/deuterijum, rendgenska kristalografija i dvodimenzionalna nuklearna magnetna rezonanca. Videti, npr., Epitope Mapping Protocols, supra. Antigeni regioni proteina se takođe mogu identifikovati korišć enjem standardnih dijagrama antigenosti i hidropatije, kao što su izračunato koriš ć enjem, na primer, softverskog programa Omiga verzije 1.0 dostupnog od Okford Molecular Group. Ovaj računar program koristi Hopp/Voods metod, Hopp et al, (1981) Proc. Natl. Akad. Sci USA 78:3824-3828; za utvrđivanje profila antigenosti, i Kite-Doolittle tehnika, Kite et al, (1982) J.Mol. Biol.157: 105-132; za delove hidropatije.

Primene

[0053] Jedan spekt ovog pronalaska obuhvata kombinaciju antitela specifičnog za CD19 i azotnog senf za upotrebu u lečenju ne-Hodžkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije i/ili akutne limfoblastne leukemija. U realizacijama prema pronalasku, kombinacija je sinergistička.

[0054] Ovde se kombinacija prikazanog antitela na CD19 i bendamustina ponašala sinergistički u in vitro i in vivo modelima relevantnim za NHL i CLL. Kako su i NHL i CLL poremeć aji povezani sa B ć elijama, a CD19 jeste visoko izražen na B- ć elijama, to prikazana kombinacija treba da ima isti mehanizam delovanja, a takođe se ponašaju sinergistički u lečenju drugih poremeć aja povezanih sa B ć elijama, npr. ALL. Dakle, kombinacija od naprimer antitela specifičnog za CD19 i bendamustina ć e biti efikasna u lečenju ljudi kod ne-Hodžkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije i/ili akutne limfoblastne leukemije.

[0055] Kako je mehanizam delovanja bendamustina i drugih azotnih iperita sličan, jer se alkiluju agensi koji formiraju međulančane unakrsne veze (ICL) između baza DNK, blokirajuć i tako fundamentalne procese kao što su replikacija i transkripcija, to se veruje da bi sinergija trebalo da se vidi kada se leče ljudi koji imaju ne-Hodžkinov limfom, hroničnu limfocitnu leukemiju i/ili akutnu limfoblastnu leukemiju sa kombinacijom npr. anti-CD19 antitela i azotnog senfa, npr. ciklofosfamida, hlorambucila, uramustina, ifosfamid i melfalan, osim bendamustina

[0056] Kako anti-CD19 antitelo i druga anti-CD19 antitela vezuju CD19, veruje se da sinergija takođe treba posmatrati kada se leče ljudi koji imaju ne-Hodžkinov limfom, hroničnu limfocitnu leukemiju i/ili akutnu limfoblastnu leukemiju sa kombinacijom bilo kog anti-CD19 antitela i azotnog senfa, gde je anti-CD19 antitelo j na primer, opisano u US patentnoj prijavi serijski broj 12/377,251 (Ksencor), WO2005012493, WO2010053716 (Imunomedici); WO2007002223 (Medarek); WO2008022152 (Ksencor); WO2008031056 (Medimmune); WO 2007/076950 (Merck Patent GmbH); WO 2009/052431 (Seattle Genetics); i VO2010095031 (Glenmark Farmaceutika).

[0057] Kako je prikazano u ovom pronalasku, antitelo specifično za CD19 obuhvata antitelo koje je u unakrsnoj konkurenciji sa sa antitelom koje obuhvata HCDR1 region sekvence SYVMH (SEK ID BR: 1), HCDR2 region sekvence NPYNDG (SEK ID BR: 2), HCDR3 region sekvence GTYYYGTRVFDY (SEK ID BR: 3), LCDR1 region sekvence RSSKSLQNVNGNTYLY (SEK ID BR: 4), LCDR2 region sekvence RMSNLNS (SEK ID BR: 5), i LCDR3 region sekvence MQHLEYPIT (SEK ID BR: 6).

[0058] Kako je prikazano u ovom pronalasku, antitelo specifično za CD19 obuhvata antitelo koje vezuje epitope antitela, obuhvatajući HCDR1 region sekvence SYVMH (SEK ID BR: 1), HCDR2 region sekvence NPYNDG (SEK ID BR: 2), an HCDR3 region sekvence GTYYYGTRVFDY (SEK ID BR: 3), LCDR1 region sekvence RSSKSLQNVNGNTYLY (SEK ID BR:: 4), LCDR2 region sekvence RMSNLNS (SEK ID BR:: 5), i LCDR3 region sekvence MQHLEYPIT (SEK ID BR: 6).

[0059] Kako je prikazano u ovom pronalasku, antitelo specifično za CD19 obuhvata HCDR1 region sekvence SYVMH (SEK ID BR: 1), HCDR2 region sekvence NPYNDG (SEK ID BR: 2), HCDR3 region sekvence GTYYYGTRVFDY (SEK ID BR: 3), LCDR1 region sekvence RSSKSLQNVNGNTYLY (SEK ID BR: 4), LCDR2 region sekvence RMSNLNS (SEK ID BR:: 5), i LCDR3 region sekvence MQHLEYPIT (SEK ID BR:: 6).

[0060] U izvodjenju prema pronalasku, antitelo specifično za CD19 obuhvata varijabilni teški lanac sekvence EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWIGYINPY NDGTKYNEKFQGRVTISSDKSISTAYMELSSLRSEDTAMYYCARGTYYYGTRVFDYWG QGTLVTVSS (SEK ID BR: 10)

i varijabilni laki lanac sekvence DIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRSSKSLQNVNGNTYLYWFQQKPGQSPQLLIYRMSNLNSGVPDRFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCMQHLEYPITF GAGTKLEIK (SEK ID BR:11).

[0061] U realizacijama, antitelo specifično za CD19 obuhvata konstantni domen teškog lanca sekvence

(SEK ID BR: 12)

[0062] U realizacijama, antitelo specifično za CD19 obuhvata konstantni domen lakog lanca sekvence.

(SEK ID BR. 13)

[0063] U realizacijama, azotni senf je bendamustin.

[0064] U realizacijama, komponente kombinacije, antitelo specifično za CD19 i bendamustin, su administrirani odvojeno. U jednom aspektu, bendamustin se primenjuje pre primene specifičnog antitela za CD19.

[0065] Kao što je ovde prikazano, kombinacija je farmaceutska kompozicija. Kao što je ovde prikazano, kompozicija sadrži prihvatljiv nosač. Kao što je ovde otkriveno, kombinacija se primenjuje u efektivnoj količini.

[0066] U drugom aspektu, sinergistička kombinacija antitela specifičnog za CD19 koja sadrži HCDR1 region sekvence SYVMH (SEK ID BR: 1), HCDR2 region sekvence NPYNDG (SEK ID BR: 2), HCDR3 region sekvence GTYYYGTRVFDY (SEK ID BR: 3), LCDR1 region sekvence RSSKSLQNVNGNTYLY (SEK ID BR: 4), LCDR2 region sekvence.

[0067] RMSNLNS (SEK ID BR: 5), i LCDR3 region sekvence MQHLEYPIT (SEK ID BR: 6) i bundestamin su sposobni za ubijanje MEC-1 ćelilja od strana ADCC, a u prisustvu izolovanog humanog PBMCs sa u najmanjem dva "folda" (savijutka), tri-folda, četiri-folda, ili pet-folda, a efikasnije nego u slučaju samog bendamustina.

[0068] Jedan aspekt prema pronalasku obuhvata sinergičku kombinaciju antitela specifičnog za CD19 obuhvatajući HCDR1 region sekvence SYVMH (SEK ID BR: 1), HCDR2 region sekvence NPYNDG (SEQ ID NO: 2), HCDR3 region sekvence GTYYYGTRVFDY (SEK ID BR: 3), LCDR1 region sekvence RSSKSLQNVNGNTYLY (SEK ID BR: 4), LCDR2 region sekvence RMSNLNS (SEK ID BR: 5), i LCDR3 region sekvence MQHLEYPIT (SEK ID BR: 6) i bendamustin za lečenje ne-Hodgkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije i/ili akutne limfoblastne leukemije. U realizacijama, ne-Hodžkinovog limfoma je izabran iz grupe koju čine folikularni limfom, mali limfocitni limfom, limfoidno tkivo povezano sa .mukozom marginalne zone, difuznom velikom B ćelijom, Burkitovim sindromom, a mantl ćelijom.

[0069] Drugi aspekt obuhvata metod lečenja ne-Hodžkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije i/ili akutne limfoblastne leukemije kod pojedinca kome je to potrebno, koji metod obuhvata davanje antitela specifičnog za CD19 i azotnog senfa. U realizacijama, antitelo specifično za CD19 obuhvata HCDR1 region sekvence SYVMH (SEK ID BR: 1), HCDR2 region sekvence NPYNDG (SEK ID BR: 2), HCDR3 region sekvence GTYYYGTRVFDY (SEK ID BR: 3), LCDR1 region sekvence RSSKSLQNVNGNTYLY (SEK ID BR: 4), LCDR2 region sekvence RMSNLNS (SEK ID BR: 5), i LCDR3 region sekvence MQHLEYPIT (SEK ID BR: 6). U realizacijama postupka, antitelo sadrži primer antitela specifičnog za CD19. U realizacijama postupka azotni senf je bendamustin.

Primeri

Primer 1: Inhibicija proliferacije MEC-1 ć elija koriš ć enjem MOR00208 i bendamustina samostalno iu kombinaciji

Materijali

[0070] MEC-1 ć elije: ć elijska linija hronične B- ć elijske leukemije DSMZ# ACC497; Ć elijski medijum: Iscoveov modifikovani Dulbekov medijum (IMDM) sa GlutaMAKS™, Invitrogen, Kat. br.: 31980-048, 20% FCS; PBMC: RPM11640, sa stabilnim glutaminom, PAN Biotech GmbH, Kat. br.: P04-13500 dopunjen sa 10% FCS; Biocoll: Biochrome AG KAT. br.: L6115 LOT br.: 1050T; Bendamustin: Mundipharma LOT br.: 88018; FCS: PAN KAT. br.: 3302-P282403 LOTA br.: P282403; i RefmAb33 (anti-RSV) sa istim Fc regionom kao MOR00208.

Metode

[0071] Citotoksičnost MOR00208 i bendamustina samostalno i u kombinaciji je testirana u MEC-1 ć elijama. BEN je alkiliraju ć i agens, stoga funkcioniše preko direktne citoksičnosti u MEC-1 ć elijama. MOR00208 cilja na CD19 i dodatno funkcioniše preko ADCC-a u ubijanju MEC-1 ć elija. Za slede ć e grupe mereno je ubijanje ć elija MEC-1: BEN na 100 mg/ml; MOR00208 u 18,6 sati i kombinacija MOR00208 u 18,6 sati i BEN u dozi od 100 mg/ml. Ove koncentracije su izabrane jer su blizu ili na EC50 za MOR00208 i BEN. Za kontrole je korišćeno: RefmAb33, ili sami PBMC. Kako u BEN grupi tako i u kombinovanoj grupi MOR00208+BEN,ć elije MEC-1 su prethodno inkubirane sa BEN za period 48 sati pre merenja ADCC testa. MEC-1 ć elije su obojene upotrebom 1 mg/ml Calcein AM, a zatim su prebrojane i podešene na 2Ks105/ml. PBMC su izbrojani i podešeni na 6Ks106/ml. Testovi ubijanja ć elija su rađeni na slede ć i način: koriš ć enjem ploča sa 96 bunarči ć a, 100 ml ć elijske suspenzije MEC-1 ć elija je dodato po bunarčić u, zatim je dodato 100 ml ć elijske suspenzije PBMC u svaki bunarčić, što je rezultiralo E:T odnosom od 30:1 . Antitela su razblažena do 1 mg/ml u medijumu. Ć elije su centrifugirane i ponovo suspendovane. Postupak do cilja je bio da je dodata peleta efektorskih ć elija, 100 ml rastvora antitela ili odgovaraju ć i kontrolni rastvor. Smeša je inkubirana 4 h u CO2 inkubatoru na 37°C. Merenja ubijanja ć elija su vršena na slede ć i način: inkubirani rastvor ć elija (~100 ml) je prebačen u FACS epruvete i u svaku epruvetu je dodato 200 ml FACS pufera (DPBS 3% FCS) i 0,5 ml osnovnog rastvora PI. Korišć en je FACS-Calibur. Mrtve MEC-1 ć elije su obojene propidijum jodidom. Tabela 1 i Slika 1 prikazuju neobrađene podatke.

Tabela 1

[0072] Vrednosti predstavljaju % (procenat) mrtvih ć elija. Svaki eksperiment predstavlja PBMC od različitih donora. Kontrola korišć ena za svaki eksperiment je bila RefMab33.

[0073] Tabela 2 prikazuje neobrađene podatke tabele 1 normalizovane za specifično ubijanje i rezultate Chou proračuna a uradjeno kod utvrđivanja sinergizma.

Tabela 2

[0074] Vrednosti prikazane u tabeli 2 su izračunate na sledeć i način: 1) iz neobrađenih podataka (% mrtvih ć elija) prikazanih u tabeli 1, oduzeta je pozadina (kontrole), što je rezultiralo specifičnim ubijanjem za svaku tretiranu grupu; zatim 2) specifične vrednosti ubijanja su normalizovane postavljanjem kombinacije MOR00208 BEN na slici 1. Prosečne vrednosti u tabeli 2 su prikazani na slici 5. Primer krive odgovora na dozu ADCC korišć eno u proračunima Chou faktora MOR00208 BEN kombinacija prikazana je na slici 2.

[0075] Proračuni Chou indeksa (CI) su završeni da bi se odredila sinergija kombinacije prikazane primerima anti-CD19 antitela i bendamustina u poređenju sa samim MOR00208 i BEN. Takvi proračuni su opisani u Ting-Chao Chou, Teorijska osnova, eksperimentalni dizajn i kompjuterizovana simulacija sinergizma i antagonizma u studijama kombinacije lekova, Pharmacol Rev 58:621-681 (2006) i Chou TC, Talalai P, Kvantitativna analiza doze-odnosi efekata: kombinovani efekti više lekova ili inhibitora enzima. Adv Enzime Regul 22: 27-55 (1984). Metode Chou-Talalai se sprovode pomoć u Clisobol metode.

Jednačina srednjeg efekta

[0076] Modeli jednačine srednjeg efekta inhibitora (kao što je lek) kao Fa/Fu =(D/D50)^m, gde je D doza, Fa i Fu su deo sistema na koji doza D utiče i na njega ne utiče (Fa Fu = 1); D50 je doza koja proizvodi srednji efekat (npr. IC50, ED50, LD50). Konstanta m određuje oblik krive doza-efekat.

[0077] Korišćen je Ekcel Fit softver da se izvrši proračun linearne regresije da bismo procenili parametre m i D50.

[0078] Efekti kombinacije na MEC-1ć elije se mere % ć elijske smrti kao što je gore opisano. Definisana je frakcija Fu kao odnos %ć elijske smrti tretirane ć elijske linije prema % ć elijske smrti ć elijske linije izložene kontroli. To je:

Fu= % smrtnost ćelija (tretirana ćelijska linija)/ % smrtnost ćelija (netretirana ćelijska linija)

[0079] Tada je % ć elijske smrti ć elijske linije konstanta D50 u jednačini srednjeg efekta, koja se može procenitilinearnom regresijom opisanom gore.

CI-izobol metod

[0080] CI-izobol metoda daje kvantitativnu procenu sinergizma između lekova. Kombinovani indeks (CI) se procenjuje na osnovu podataka o dozi i efektu pojedinačnih i kombinovanih tretmana lekovima. Vrednost Cl manja od 1 ukazuje na sinergizam; CI=1 označava aditivni efekat; a CI>1 ukazuje na antagonizam. Interakcija sa lekovima (sinergizam ili antagonizam) je izraženije što je vrednost CI dalje od 1.

[0081] Formalno, kombinovani indeks (CI) kombinovanog tretmana lekovima je definisan kao

[0082] Ovde D1 i D2 su doze leka 1 i leka 2 kombinacije, respektivno; i Dx1, i Dx2 je doza tretmana samo sa lekom 1 i lekom 2 koja bi dala isti efekat kao i kombinacija. Doze Dx1 i Dx2 treba proceniti na osnovu podataka o dozi i efektu tretmana pojedinačnih lekova. U suštini, srednji efekat jednačina je prilagođena podacima svakog leka. Iz jednačine srednjeg efekta leka možemo proceniti dozu (tj. D) neophodno da se proizvede efekat (tj. Fa, Fu). Što je tačka dalje od aditivne linije, već a je razlika između 1 i njegovog CI, pa je stoga jači efekat (sinergistički ili antagonistički).

Rezultati

[0083] Kao što je prikazano u tabeli 2, vrednosti Chou indeksa ukazuju na jasan sinergizam kombinacije MOR00208 i bendamustina pri specifičnom ubijanju ć elija MEC-1, a u poređenju sa MOR00208 i samim bendamustinom. Ovaj zaključak zasniva se na Chou proračunima od 0,2, 0,7 i 0,75 svakog od tri eksperimenta, respektivno, koji imaju prosek od 0,6, gde CI<1 ukazuje na sinergizam. Dakle, kombinacija MOR00208 i bendamustina ć e takođe se ponašaju sinergistički u lečenju ne-Hodžkinovog limfoma (NHL), hronične limfoidne leukemije (CLL) i akutne limfoblastne leukemije (ALL) kod ljudi. Da bi se potvrdili rezultati gornjih Chou proračuna, normalizovani podaci iz Tabele 2 su procenjeni na statističku značajnost korišć enjem Bonferonijevog testa višestrukog poređenja. Videti: James, et al, Deplecija B-ć elija posredovana antitelom pre usvajanja imunoterapije sa T ć elijama koje eksprimiraju CD20 specifične himerni T- ć elijski receptori olakšavaju eradikaciju leukemije kod imunokompetentnih miševa, Blood, 114(27):5454-63 (Epub 2009, 30. oktobar). Rezultati su prikazani u tabeli 3.

Tabela 3

Rezultati

[0084] Kao što je prikazano u tabeli 3, Bonferonijev test višestrukog poređenja pokazuje da je kombinovani tretman BEN+ MOR00208 statistički efikasniji u specifičnom ubijanju ć elija MEC-1 nego tretman BEN i samo MOR00208 sama.

Primer 2: MOR00208 i BEN sami i u kombinaciji u subkutano (SC) implantiranom modelu rasta tumora B-ć elijskog limfoma Ramosa Burkitta kod čoveka.

Materijali

[0085] RAMOS ć elije humanog Burkitovog limfoma (ATCC broj CRL-1596, partija br.3953138); Kontrola nosača: 150 mM NaCl, 25 mg/mL manitola, pH 5,5-6,0; (podešeno sa 0,01 M NaOH). Ref_mAb_33_IgG_Ksen (10 mg/mL u PBS, upuć eno kao Ref_mAb_33). Šestonedeljne ženke C.B-17 SCID miševa (CB17/Icr-Prkdcscid/IcrlcoCrl) kupljene su od Charles River Laboratories (Wilmington, MA) i aklimatizovao se u laboratorijama devet dana pre eksperimentisanja.

Metode

[0086] SCID miševi su implantirani subkutano sa RAMOS ć elijama (~5 k 106 ć elija/miš). Kada su miševi imali tumore veličine približno 150 mm3, ili ~14 dana nakon inokulacije, oni su razdvojeni u grupe, gde je svaka grupa imala zapremine tumora relativno iste veličine. Tretmani su počeli 15-og dana. Režimi lečenja su dati u tabeli 4. Trajanje studije je bilo 60 dana.

Tabela 4

[0088] Očitavanja su bila 1) Medijan dana do dostizanja veličine od 4000 mg, gde je statistička analiza urađena korišć enjem log rang testa i 2) Veličina tumora 34-og dana studije, gde je statistička analiza urađena korišć enjem One-Vai-ANOVA i Bonferonijevi post hoc testovima. (Neobrađeni podaci nisu prikazani). Težina tumora je izračunata pomoć u jednačine (I k v2)/2, gde se I i v odnose na već e i manje dimenzije prikupljene pri svakom merenju. Rezultati su prikazani na Slikama 7-10. Kombinovana terapija nije bila značajno superiornija u odnosu na odgovarajuć e monoterapije u ovom modelu, a u poređenju sa jasnom sinergijom prikazanom u ortotopskom modelu preživljavanja u nastavku. Ovo se smatra povezanim na neefikasan režim doziranja MOR00208 u ovom modelu. Međutim, ortotopski model preživljavanja opisan u nastavku jeste onaj za koji se veruje da može da predvidi koliko ć e dobro kombinovani tretman funkcionisati u lečenju CLL, NHL i ALL kod ljudi, a budući da ortotopski model bolje oponaša prirodu multifokalne bolesti, uključujuć i zahva ć enost vaskularnih sistem i u poređenju sa gornjim modelom potikožnog čvrstog tumora.

Primer 3 MOR00208 i bendamustin sami i u kombinaciji kod humanog Nehodgkin RAMOS tumora u SCID miševi, model preživljavanja

Materijali

[0089] Ciklofosfamid (Bakter, Lot. No.1A548C); Kontrola vozila: 0,9% natrijum hlorid, 25 mg/ml manitola, pH 6,5-6,8 (podešeno sa 0,01 M NaOH); SCID miševi (Univerzitet Adelaide, Vaite Campus, Urrbaraie, SA, Australija, Strain C.B.-17-Igh-1b-Prkdcscid); RAMOS ć elije humanog Burkitovog limfoma (ATCC broj CRL-1596); Ref_mAb_33_IgG_Ksen (10 mg/mL u PBS-u, koji se naziva Ref_mAb_33); Bendamustin (Mundipharma, partija br.83889).

Metode

[0090] SCID miševi su prethodno tretirani ciklofosfamidom (75 mg/kg, i.p., dva puta dnevno) dva dana pre RAMOS-a ć elijska inokulacija (dan -2 i -1). Na dan inokulacije (Nulti dan), miševi su podeljeni u sedam grupa od po deset miševa i inokulisani sa 1 k 106 RAMOS ć elijom svaka intravenozno, u repnu venu. Planirani režim doziranja za svaku grupu je prikazano u tabeli 5 i počelo je 3-eg dana. Studija je trajala 60 dana.

[0091] Podaci o preživljavanju su prikazani u Tabeli 6 i na Slici 6

Tabela 7

[0094] % Prosečnog povećanja preživljavanja (ILS) je izračunat kako sledi:

Sredni % povećanja opstanka = ( Preživaljavanje<Tretman>- Srednje priživljavanje<Kontrola>)/Srednje Preživljavanje<Kontrola>*100. ;Broj preživljavanja je meren u danima nakon inokulacije. ;;Klasifikacija kombinatornih efekata ;;[0094] Klasifikacija efekata kombinovane terapije MOR000208/bendamustinom (kombo) je procenjena upoređujuć i ILS kombinacije sa dodatkom ILS odgovarajuć ih monoterapija: Sinergija/Potenciranje*: ILSCombo > ILSMOR00208 3mg/kg ILSBendamustin. Sinergijski efekti se klasifikuju kao potenciranje ako bar jedna od monoterapija nema efekta. Aditivnost: ILSKombo = ILSMOR002083mg/kg ILSBendamustin. Antagonizam: ILSKombo < ILSMOR002083mg/kg ILSBendamustin.

[0095] Pored analize podataka u svrhu identifikacije sinergije, sledeć a statistička analiza je takođe uradjena. Statističke analize su sprovedene korišć enjem srednjih vrednosti. Svaka životinja koja je neočekivano umrla ili je izdvojena pre 17og dana studije u grupama tretmana sa članom za testiranje isključena je iz izračunavanja analize preživljavanja. Smrt/uklanjanje ovih životinja se pripisuje toksičnosti jedinjenja pre nego progresiji bolesti, kako su se desile mnogo pre prvih uginuć a životinja u kontrolim nosačima. Kriva preživljavanja je napravljena korišć enjem ograničenja proizvoda Kaplana i Mejera, i krive preživljavanja upoređene korišć enjem log-rank (Mantel-Cok) testa. Značajne razlike su pronađene i izvršeno je višestruko poređenje svih parova (Holm-Sidak testom). Urađeno je poređenje između svih grupa. Pored toga, poređenje sledeć ih grupa je sažeto u odvojenim ciframa za svaki ispitni član: Kontrolni nosači/Ref_mAb (grupa 10) vs. Bendamustin grupe (Grupe 2, 3 i 4) i Kontrolni nosači/ Ref_mAb (grupa 10) protiv kombinovanih grupa (grupe 5 i 6) ili odgovarajuć e MOR00208 grupe monoterapije (grupa 1). A vrednost manja od 0,05 se smatrala značajnom. Rezultati su prikazani u tabelama 8-10.

Tabela 8:

Tabela 9:

Tabela 10:

Rezultati

[0096] Kao što je prikazano u tabelama od 7 do 10 i slici 6, kombinacija MOR00208 i bendamustina se ponašala sinergistički i bio je statistički značajan rezultat kod ne-Hodžkin RAMOS modelu preživljavanja ortotopskog tumora u poređenju sa MOR00208 i samo bendamustina.

Claims (1)

1. Patentni zahtevi 1. Sinergistička kombinacija antitela specifičnog za CD19 i bendamustina, za upotrebu u lečenju ne-Hodžkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije ili akutne limfoblastne leukemije, naznačeno time što antitelo sadrži varijabilni teški lanac sekvence EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWIGYINPYNDG TKYNEKFQGRVTISSDKSISTAYMELSSLRSEDTAMYYCARGTYYYGTRVFDYWGQG TLVTVSS (SEK ID BR: 10) i varijabilni laki lanac sekvence DIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRSSKSLQNVNGNTYLYWFQQKPGQSPQLLIYRMSN LNSGVPDRFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCMQHLEYPITFGAGTKLEIK (SEK ID BR: 11) i teški lanac konstantnog domena sekvence

   (SEK ID BR: 12) 2. Kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu antitelo sadrži konstantni domen lakog lanca sekvence

   (SEK ID BR: 13) 3. Kombinacija prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, za upotrebu u lečenju ne-Hodžkinovog limfoma, opciono pri čemu je ne-Hodžkinov limfom izabran iz grupe koju čine folikularni limfom, mali limfocitni limfom, limfom limfoidnog tkiva povezan sa sluznicom, limfom marginalne zone, difuzni veliki B ć elijski limfom, Burkittov limfom i limfom ć elija plašta. 4. Kombinacija za upotrebu, prema patentnom zahtevu 3, pri čemu je ne-Hodžkinov limfom, folikularni limfom. 5. Kombinacija za upotrebu, prema patentnom zahtevu 3, pri čemu je ne-Hodžkinov limfom, mali limfocitni limfom. 6. Kombinacija za upotrebu, prema patentnom zahtevu 3, pri čemu je ne-Hodžkinov limfom, limfoidni limfom povezan sa sluznicom limfomnog tkiva. 7. Kombinacija za upotrebu, prema patentnom zahtevu 3, pri čemu je ne-Hodžkinov limfom, limfom marginalne zone. 8. Kombinacija za upotrebu, prema patnetnom zahtevu 3, pri čemu je ne-Hodžkinov limfom, difuzni limfom velikih B limfom ć elija. 9. Kombinacija za upotrebu, prema patentnom zahtevu 3, pri čemu je ne-Hodžkinov limfom Burkitov limfom. 10. Kombinacija za upotrebu, prema patentnom zahtevu 3, pri čemu je ne-Hodžkinov limfom, limfom ć elija plašta. 11. Kombinacija prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, za upotrebu u lečenju hronične limfocitne leukemije. 12. Kombinacija prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, za upotrebu u lečenju akutne limfoblastne leukemije. 13. Kombinacija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu su antitelo specifično za CD19 i bendamustin: (a) formulisani zajedno u jednoj farmaceutskoj kompoziciji; ili (b) formulisani u različitim farmaceutskim kompozicijama. 14. Kombinacija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 13, pri čemu se navedeno antitelo specifično za CD19 i bendamustin administriraju istovremeno. 15. Kombinacija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 12 ili patentnom zahtevu 13(b), pri čemu se navedeno antitelo specifično za CD19 i bendamustin daju odvojeno. 16. Kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 15, pri čemu se bendamustin administrira pre primene pomenutog antitela specifičnog za CD19.