RS63121B1

RS63121B1 - Kombinovana terapija sa anti-cd19 antitelom i analogom purina

Info

Publication number: RS63121B1
Application number: RS20220314A
Authority: RS
Inventors: Jutta Amersdorffer; Stefan Steidl; Mark Winderlich; Susanne Krohn; Lisa Rojkjaer
Original assignee: Morphosys Ag
Priority date: 2011-08-16
Filing date: 2012-08-14
Publication date: 2022-05-31
Also published as: PT2744826T; NZ617771A; CA2841738A1; RU2664462C2; MX353589B; JP6114273B2; EP4083071A3; HUE058855T2; KR20140071368A; CN103703027A; ZA201401835B; US20140227277A1; ES2909720T3; BR112013033916B1; LT2744826T; RU2014103490A; CN103703027B; IL230295B; EP2744826A1; MX2013014935A

Description

Opis pronalaska

Polje pronalaska

[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na farmaceutsku kombinaciju anti-CD19 antitela i analoga purina za lečenje Ne-Hočkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije i/ili akutne limfoblastne leukemije.

Pozadina pronalaska

[0002] B ćelije su limfociti koji igraju veliku ulogu u humoralnom imunološkom odgovoru. Proizvode se u koštanoj srži većine sisara i predstavljaju 5-15% cirkulišućeg limfoidnog rezervoara. Osnovna funkcija B ćelija je stvaranje antitela protiv različitih antigena i suštinska su komponenta adaptivnog imunog sistema.

[0003] Zbog njihove ključne uloge u regulisanju imunog sistema, disregulacija B ćelija je povezana sa raznim poremećajima, kao što su limfomi i leukemije. To uključuje Ne-Hočkinov limfom (NHL), hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL) i akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL).

[0004] NHL je heterogeni malignitet koji potiče od limfocita. U Sjedinjenim Državama (SAD), incidenca se procenjuje na 65.000 godišnje sa smrtnošću od približno 20.000 (”American Cancer Society, 2006; i SEER Cancer Statistics Review”). Bolest se može javiti u svim uzrastima, uobičajeno počinje kod odraslih starijih od 40 godina, a incidenca raste sa godinama. NHL se karakteriše klonskom proliferacijom limfocita koji se akumuliraju u limfnim čvorovima, krvi, koštanoj srži i slezini, iako može biti zahvaćen bilo koji glavni organ. Trenutni sistem klasifikacije koji koriste patolozi i kliničari je klasifikacija tumora Svetske zdravstvene organizacije (SZO), koja svrstava NHL u prekursorske i zrele neoplazme B-ćelija ili T-ćelija. PDQ trenutno deli NHL na indolentnu ili agresivnu grupu za ulazak u klinička ispitivanja. Indolentnu NHL grupu čine prvenstveno folikularni podtipovi, mali limfocitni limfom, MALT (limfoidno tkivo povezano sa sluznicom) i marginalna zona; indolentni obuhvata približno 50% novodijagnostikovanih NHL pacijenata sa B-ćelijama. Agresivni NHL uključuje pacijente sa histološkom dijagnozom prvenstveno limfom difuznih velikih B ćelija (DLBL, DLBCL ili DLCL) (40% svih novodijagnostikovanih pacijenata ima difuzne velike ćelije), Burkitov limfom I limfom ćelija omotača. Klinički tok NHL-a je veoma promenljiv. Glavna determinanta kliničkog toka je histološki podtip. Većina indolentnih tipova NHL-a smatra se neizlečivom bolešću. Pacijenti u početku reaguju ili na hemoterapiju ili na terapiju antitelima, a kod većine se tumor vrati. Dosadašnje studije nisu pokazale poboljšanje preživljavanja sa ranom intervencijom. Kod asimptomatskih pacijenata, prihvatljivo je „gledati i čekati“ dok pacijent ne postane simptomatski ili se čini da se tempo bolesti ubrzava. Vremenom se bolest može transformisati u agresivniju histologiju. Srednji period preživljavanja je 8 do 10 godina, a indolentni pacijenti često primaju 3 ili više tretmana tokom faze lečenja svoje bolesti. Početni tretman kod simptomatskog indolentnog NHL pacijenta je istorijski gledano bio kombinovana hemoterapija. Najčešće korišćeni agensi uključuju: ciklofosfamid, vinkristin i prednizon (CVP); ili ciklofosfamid, adriamicin, vinkristin, prednizon (CHOP). Otprilike 70% do 80% pacijenata će reagovati na početnu hemoterapiju, a trajanje remisije traje 2-3 godine. Na kraju, većina pacijenata ima recidiv bolesti. Pronalazak i klinička upotreba anti-CD20 antitela, rituksimaba, obezbedili su značajna poboljšanja u odgovoru i stopi preživljavanja. Trenutni standard nege za većinu pacijenata je rituksimab CHOP (R-CHOP) ili rituksimab CVP (R-CVP). Interferon je odobren za početni tretman NHL-a u kombinaciji sa alkilirajućim agensima, ali ima ograničenu upotrebu u SAD. Rituksimab se pokazao efikasnim kod nekoliko tipova NHL-a i trenutno je odobren kao tretman prve linije i za indolentni NHL (folikularni limfom) i agresivni NHL (difuzni limfom velikih B ćelija). WO2011/018225 otkriva terapiju antitelima za lečenje maligniteta B-ćelija koja sadrži kombinaciju anti-CD20 antitela sa fludarabinom. Međutim, postoje značajna ograničenja anti-CD20 monoklonskih antitela (mAb), uključujući primarnu rezistenciju (50% odgovora kod pacijenata sa relapsom indolentnih pacijenata), stečenu rezistenciju (50% stope odgovora nakon ponovnog lečenja), retki potpuni odgovor (2% potpune reakcije stopa u populaciji sa relapsom) i kontinuirani obrazac relapsa. Konačno, mnoge B ćelije ne eksprimiraju CD20, i stoga se mnogi poremećaji B-ćelija ne mogu lečiti upotrebom terapije anti-CD20 antitelima.

[0005] Pored NHL-a postoji nekoliko tipova leukemija koje su rezultat disregulacije B ćelija. Hronična limfocitna leukemija (takođe poznata kao "hronična limfoidna leukemija" ili "CLL"), je vrsta leukemije kod odraslih uzrokovana abnormalnom akumulacijom B limfocita. Kod CLL-a, maligni limfociti mogu izgledati normalno i zrelo, ali nisu u stanju da se efikasno nose sa infekcijom. CLL je najčešći oblik leukemije kod odraslih. Muškarci imaju dvostruko veće šanse da razviju CLL nego žene. Međutim, ključni faktor rizika je starost. Preko 75% novih slučajeva dijagnostikuje se kod pacijenata starijih od 50 godina. Više od 10.000 slučajeva se dijagnostikuje svake godine, a mortalitet je skoro 5.000 godišnje (”American Cancer Society, 2006; i SEER Cancer Statistics Review”). CLL je neizlečiva bolest, ali u većini slučajeva sporo napreduje. Mnogi ljudi sa CLL vode normalan i aktivan život dugi niz godina. Zbog sporog početka, rani stadijum CLL se generalno ne leči jer se veruje da rana intervencija CLL ne poboljšava period preživljavanja ili kvalitet života. Umesto toga, stanje se prati tokom vremena. Početni tretmani HLL variraju u zavisnosti od tačne dijagnoze i progresije bolesti. Postoje desetine agenasa koji se koriste za terapiju CLL. Kombinovani režimi hemoterapije kao što su FCR (fludarabin, ciklofosfamid i rituksimab) i BR (bendamustin i rituksimab) su efikasni i kod novodijagnostikovane i kod relapsirane CLL. Alogena transplantacija koštane srži (matične ćelije) se retko koristi kao tretman prve linije za CLL zbog rizika koji nosi.

[0006] Drugi tip leukemije je akutna limfoblastna leukemija (ALL), takođe poznata kao akutna limfocitna leukemija. ALL karakteriše prekomerna proizvodnja i kontinuirano umnožavanje malignih i nezrelih belih krvnih zrnaca (takođe poznatih kao limfoblasti) u koštanoj srži. „Akutna“ se odnosi na nediferencirano, nezrelo stanje cirkulirajućih limfocita („blasti“) i da bolest brzo napreduje sa očekivanim životnim vekom od par nedelja do par meseci ako se ne leči. ALL je najčešći u detinjstvu sa vrhuncem incidencije od 4-5 godina. Deca od 12 do 16 godina od toga verovatnije umiru od drugih. Trenutno se najmanje 80% ALL u detinjstvu smatra izlečivim. Svake godine se dijagnostikuje manje od 4.000 slučajeva, a smrtnost je skoro 1.500 godišnje (American Cancer Society, 2006; i SEER Cancer Statistics Review).

[0007] Humani CD 19 molekul je strukturno različit receptor ćelijske površine eksprimiran na površini ljudskih B ćelija, uključujući, ali ne ograničavajući se na, pre-B ćelije, B ćelije u ranom razvoju (tj., nezrele B ćelije), zrele B ćelije kroz terminalnu diferencijaciju postaju plazma ćelije i maligne B ćelije. CD 19 je eksprimiran kod većine pre-B akutnih limfoblastnih leukemija (ALL), Ne-Hočkinovog limfoma, B ćelijskih hroničnih limfocitnih leukemija (CLL), pro-limfocitnih leukemija, leukemija vlašastih ćelija, uobičajenih akutnih limfocitnih leukemija, i nekih Nullćelijskih akutnih limfoblastnih leukemija (Nadler i dr, J. Immunol., 131:244-250 (1983), Loken i dr, Blood, 70:1316-1324 (1987), Uckun i dr, Blood, 71:13-29 (1988), Anderson i dr, 1984. Blood, 63:1424-1433 (1984), Scheuermann, Leuk. Lymphoma, 18:385-397 (1995)). Ekspresija CD 19 na plazma ćelijama dalje sugeriše da se može eksprimirati na diferenciranim tumorima B ćelija kao što su multipli mijelom, plazmacitomi, Valdenstromovi tumori (Grossbard i dr., Br. J. Haematol, 102:509-15(1998); Treon i dr, Semin. Oncol, 30:248-52 (2003)).

[0008] Prema tome, CD 19 antigen je target za imunoterapiju u lečenju Non-Hodgkinovog limfoma (uključujući svaki od podtipova opisanih ovde), hronične limfocitne leukemije i/ili akutne limfoblastne leukemije. CD19 je takođe predložen kao target za imunoterapiju u lečenju autoimunih poremećaja u WO2000074718.

[0009] Prikazane su određene CD19 terapije. T ćelije koje eksprimiraju anti-CD19 himerni antigen receptor (CAR) uključujući i CD3-4 i CD28 molekule date su pacijentu sa folikularnim limfomom. Kochenderfer i dr., Iskorenjivanje ćelija B loze i regresija limfoma kod pacijenta lečenog autolognim T ćelijama genetski modifikovanim da prepoznaju CD19, Blood, vol. 116, br: 20 (novembar 2010) koristili su anti-CD19 CART-ove zasnovane na FMC63 monoklonskom antitelu. Sadelain i dr., Potencijal i moguće zamke himernih antigenskih receptora, Current Opinion in Immunology, Elsevier, vol. 21, br.2, 2. april 2009. takođe opisuje anti-CD19 himerne antigen receptore (CAR). Rosenberg i dr, Tretman maligniteta B ćelija sa T ćelijama koje eksprimiraju anti-CD19 himerni receptor: Procena uticaja deplecije limfocita pre transfera T ćelija, (septembar 2008), www.gemcris.od.nih.gov/ Abstracts/ 940_s.pdf (preuzeto 13. januara 2012) opisuje anti-CD19 himerne antigen receptore (CAR) koji se koriste sa fludarabinom. Videti takođe Eshhar i dr., Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, National Academy of Science, Washington, D.C.:, vol. 90, br.2 (15. januar 1993). Međutim, ni Kochenderfer i dr., Sadelain i dr., Rosenberg i dr., ni Eshhar i dr., ne opisuju antitelo specifično za CD19 u kombinaciji sa fludrabinom kao što je ovde prikazano.

[0010] Fludarabin kao terapija u lečenju CLL je opisan u Montserrat i dr., Lečenje hronične limfocitne leukemije, Blood Review, Churchill Livingstone, vol. 7, br. 3 (1. septembar 1993), ali ne ukazuje na antitelo specifično za CD19 u kombinaciji sa fludrabinom kao što je ovde prikazano.

[0011] Upotreba CD19 antitela kod poremećaja B ćelija je diskutovana u US 201104150, zajedno sa površnim pominjanjem fludarabina u okviru dugačke liste potencijalnih kombinacionih stavki, ali nije objašnjeno samo antitelo niti su sugerisani sinergistički efekti kombinacija u lečenju Ne-Hočkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije i/ili akutne limfoblastne leukemije kao što je ovde prikazano.

[0012] Upotreba CD19 antitela u nespecifičnim B ćelijskim limfomima je diskutovana u WO 2007076950 zajedno sa površnim pominjanjem fludarabina u okviru dugačke liste potencijalnih kombinacionih stavki, ali nije objašnjeno samo antitelo niti su sugerisani sinergistički efekti kombinacija u lečenju Ne-Hočkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije i/ili akutne limfoblastne leukemije kao što je ovde prikazano.

[0013] Upotreba CD19 antitela kod leukemije i limfoma je diskutovana u WO2005012493, zajedno sa površnim pominjanjem fludarabina u okviru dugačke liste potencijalnih kombinacionih stavki, ali nije objašnjeno samo antitelo niti su sugerisani sinergistički efekti kombinacija u lečenju Ne-Hočkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije i/ili akutne limfoblastne leukemije kao što je ovde prikazano.

[0014] Upotreba CD19 antitela u CLL, NHL i ALL opisana je u Scheuermann i dr., CD19 antigen u dijagnostici leukemije i limfoma i imunoterapiji, Leukemia and Lymphoma, Vol. 18, 385-397 (1995), ali ne ukazuje na kombinaciju prikazanu ovde.

[0015] Dodatna antitela specifična za CD19 su opisana u WO2005012493 (US7109304), WO2010053716 (US12/266,999) (Imunomedics); WO2007002223 (US US8097703) (Medarex); WO2008022152 (12/377,251) i WO2008150494 (Xencor), WO2008031056 (US11/852,106) (Medimmune); WO 2007076950 (US 11/648,505) (Merck Patent GmbH); WO 2009/052431 (US12/253,895) (Seattle Genetics); i WO2010095031 (12/710,442) (Glenmark Pharmaceuticals).

[0016] Kombinacije antitela specifičnih za CD19 i drugih agenasa opisane su u WO2010151341 (US 13/377,514) (The Feinstein Institute); US5686072 (University of Texas) i WO2002022212 (PCT/US01/29026) (IDEC Pharmaceuticals).

[0017] Jasno je da uprkos nedavnom napretku u otkrivanju i razvoju sredstava protiv raka, mnogi oblici raka koji uključuju tumore koji eksprimiraju CD19 i dalje imaju lošu prognozu. Dakle, postoji potreba za poboljšanim kompozicijama i metodama za lečenje takvih oblika raka.

Rezime

[0018] Stanje tehnike ne ukazuje na sinergističke efekte kombinacije datog primera antitela i fludarabina u lečenju Ne-Hočkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije i/ili akutne limfoblastne leukemije, niti samih niti u kombinaciji.

[0019] U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na sinergističku kombinaciju antitela specifičnog za CD19 i fludarabina za upotrebu u lečenju Non-Hodgkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije ili akutne limfoblastne leukemije, pri čemu se varijabilni teški lanac antitela sastoji od niza EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFQGRVTISSDK SISTAYMELSSLRSEDTAMYYCARGTYYYGTRVFDYWG QGTLVTVSS (SEK ID BR: 10) i varijabilni laki lanac sekvence

DIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRSSKSLQNVNGNTYLYWFQQKPGQSPQLLIYRMSNLNSGVPDRFSGSGSGT EFTLTISSLEPEDFAVYYCMQHLEYPITFGAGTKLEIK (SEK ID BR: 11) i konstantni domen teškog lanca sekvence

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKTK GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFL YSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK (SEK ID BR: 12).

[0020] U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na sinergističku kombinaciju antitela specifičnog za CD19 i analoga purina. Takve kombinacije su korisne u lečenju maligniteta B ćelija, kao što su Ne-Hočkinov limfom, hronična limfocitna leukemija i/ili akutna limfoblastna leukemija.

[0021] In vitro i in vivo modeli se smatraju indikativnim za to kako bi se određeno jedinjenje ili kombinacija jedinjenja ponašala kod ljudi. Pored toga, kada se jedinjenja kombinuju bilo in vitro ili in vivo, očekuje se da kombinacija ima samo aditivne efekte. Iznenađujuće, pronalazači su otkrili da je kombinacija određenog antitela specifičnog za CD19 i fludarabina posredovala na sinergističkom nivou specifičnog ubijanja ćelija u ćelijskoj liniji hronične B-ćelijske leukemije (MEC-1) u poređenju sa samim antitelom i fludarabinom. Ovaj in vitro model ukazuje na to kako će kombinacija funkcionisati u lečenju hronične limfoidne leukemije (CLL) kod ljudi. Pored toga, i takođe neočekivano, pronalazači su otkrili da kombinacija određenog antitela specifičnog za CD19 i fludarabina sinergistički inhibira rast tumora i sinergistički povećava prosečan period preživljavanja, kako na modelima miša sa SCID-om kod Burkitovog limfoma, u poređenju sa antitelom i samim fludarabinom. Ovi in vivo modeli ukazuju na to kako će kombinacija funkcionisati u lečenju Non-Hodgkinovog limfoma kod ljudi. Ukratko, kombinacija prikazanog antitela na CD19 i fludarabina se ponašala sinergistički u modelima relevantnim za NHL i CLL. Pošto su i NHL i CLL poremećaji povezani sa B ćelijama i CD19 je visoko eksprimiran na B-ćelijama, prikazana kombinacija bi imala isti mehanizam delovanja i takođe bi trebalo da se ponaša sinergistički u lečenju drugih poremećaja povezanih sa B ćelijama, npr. ALL.

[0022] Prema tome, kombinacija datog primera antitela specifičnog za CD19 i fludarabina će biti efikasna u lečenju ljudi kod Ne-Hočkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije i/ili akutne limfoblastne leukemije. Pored toga, antitelo specifično za CD19 prikazano kao primer u ovoj specifikaciji je već ušlo u klinička ispitivanja, gde se takve kombinacije mogu potvrditi kod ljudi.

[0023] Pošto je mehanizam delovanja fludarabina i drugih analoga purina sličan, pošto analozi purina ometaju sintezu nukleinskih kiselina, veruje se da bi sinergija takođe trebalo da se vidi kada se leče ljudi koji imaju Ne-Hočkinov limfom, hroničnu limfocitnu leukemiju i/ili akutnu limfoblastnu leukemiju sa kombinacijom primera antitela na CD19 i analoga purina osim fludarabina.

[0024] Kako se anti-CD19 antitelo i druga anti-CD19 antitela vezuju za CD19, veruje se da bi sinergija trebalo da se uoči i kada se leče ljudi koji imaju Ne-Hočkinov limfom, hroničnu limfocitnu leukemiju i/ili akutnu limfoblastnu leukemiju u kombinaciji sa bilo kojim anti-CD19 antitelom i analogom purina, npr. Fludarabinom.

[0025] Pošto primer anti-CD19 antitela vezuje specifični epitop CD19, veruje se da antitela koja se ukrštaju sa navedenim antitelom ili se vezuju za isti epitop kao antitelo iz primera treba da se ponašaju sinergistički kada se leče ljudi koji imaju Ne-Hočkinov limfom, hroničnu limfocitnu leukemiju i/ili akutnu limfoblastnu leukemiju u kombinaciji sa analogom purina, npr. fludarabinom.

[0026] Aspekt predstavljenog pronalaska obuhvata sinergističku kombinaciju u kojoj antitelo specifično za CD19 obuhvata HCDR1 region sekvence SYVMH (SEK ID BR: 1), HCDR2 region sekvence NPYNDG (SEK ID BR: 2), HCDR3 region sekvence GTYYYGTRVFDY (SEK ID BR: 3 ), LCDR1 region sekvence RSSKSLQNVNGNTYLY (SEK ID BR: 4), LCDR2 region sekvence RMSNLNS (SEK ID BR: 5) i LCDR3 region sekvence MQHLEYPIT (SEK ID BR: 6) i fludarabin. U poželjnim aspektima, kombinacija se koristi za lečenje Ne-Hočkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije i/ili akutne limfoblastne leukemije.

Opis crteža/slika

[0027]

Slika 1 prikazuje efekte citotoksičnosti MOR208 i fludarabina samih i u kombinaciji na MEC-1 ćelije.

Slika 2 prikazuje ADCC krive doza-odgovor kombinacije MOR208 i fludarabina u MEC-1 ćelijama.

Slika 3 prikazuje sekvencu aminokiselina varijabilnih domena MOR208.

Slika 4 prikazuje sekvencu aminokiselina Fc regiona MOR208.

Slika 5 prikazuje normalizovano specifično ubijanje ciljnih ćelija MEC-1 prethodno tretiranih fludarabinom (Flu) tokom 72 h. Podaci predstavljaju skup od 3 nezavisna eksperimenta sa 3 različita donatora efektorskih ćelija.

Slika 6 prikazuje srednji rast tumora MOR208, FLU i kombinovanih (MOR208/FLU) grupa SCID mišjeg modela opisanog u Primeru 2.

Slika 7 prikazuje prosečan period preživljavanja MOR208, FLU i kombinovanih (MOR208/FLU) grupa SCID mišjeg modela opisanog u Primeru 3.

Detaljan opis pronalaska

[0028] "Sinergija", "sinergizam" ili "sinergistički" znače više od očekivanog aditivnog efekta kombinacije. "Sinergija", "sinergizam" ili "sinergistički" efekat kombinacije se ovde određuje metodama Chou i dr., Clarke i dr., i/ili Webb i dr. Videti Ting-Chao Chou, Theoretical Basis, Experimental Design, and Computerized Simulation of Synergism and Antagonism in Drug Combination Studies, Pharmacol Rev 58:621-681 (2006). Videti takođe Clarke i dr., Issues in experimental design and endpoint analysis in the study of experimental cytotoxic agents in vivo in breast cancer and other models, Breast Cancer Research and Treatment 46:255-278 (1997). Videti takođe Webb, J. L. (1963) Enzyme and Metabolic Inhibitors, Academic Press, New York.

[0029] Termin "antitelo" označava monoklonsko antitelo, uključujući bilo koji izotip, kao što su IgG, IgM, IgA, IgD i IgE. IgG antitelo se sastoji od dva identična teška lanca i dva identična laka lanca koji su spojeni disulfidnim vezama. Svaki teški i laki lanac sadrži konstantni region i varijabilni region. Svaki varijabilni region sadrži tri segmenta naziva "regioni koji određuju komplementarnost" ("CDR") ili "hipervarijabilni regioni", koji su primarno odgovorni za vezivanje epitopa antigena. Oni se nazivaju CDR1, CDR2 i CDR3, numerisani uzastopno od N-terminusa. Više očuvani delovi varijabilnih regiona izvan CDR-ova nazivaju se „regioni okvira“. „Fragment antitela“ označava Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab’ F(ab’)2 fragment ili drugi fragment, koji sadrži najmanje jedan varijabilni teški ili varijabilni laki lanac, od kojih svaki sadrži CDR i regione okvira.

[0030] Analog purina je antimetabolit, koji oponaša strukturu metaboličkih purina, čime ometa sintezu nukleinskih kiselina. Fludarabin, na primer, može da se inkorporira u RNK i DNK supstitucijom purinskih nukleotida, adenina i gvanina. Analozi purina inhibiraju rast brzo proliferirajućih ćelija pojedinca, npr. ćelije raka, ćelije koštane srži ili ćelije prisutne u gastrointestinalnom traktu. Analozi purina uključuju merkaptopurin, azatioprin, tioguanin i fludarabin.

[0031] Merkaptopurin se koristi u lečenju akutnih leukemija, limfoma, reumatoidnog artritisa i inflamatorne bolesti creva, kao što su Kronova bolest i ulcerozni kolitis, ovim redom. Merkatopurin ima sledeću strukturu:

[0032] Azatioprin je glavna imunosupresivna citotoksična supstanca. Široko se koristi u transplantaciji za kontrolu reakcija odbacivanja. Neenzimski se cepa na 6-merkaptopurin koji deluje kao analog purina i inhibitor sinteze DNK. Sprečavanjem klonske ekspanzije limfocita u fazi indukcije imunog odgovora utiče i na ćelijski i na humoralni imunitet. Takođe uspešno potiskuje autoimunost. Azatioprin ima sledeću strukturu:

[0033] Tioguanin se koristi tokom rane i/ili kasne intenzivirajuće terapije akutne limfoblastne leukemije u detinjstvu (ALL), dok se 6-merkaptopurin uglavnom koristi u različitim vremenskim tačkama terapije, naime tokom tretmana održavanja ALL. Tioguanin ima sledeću strukturu:

[0034] Fludarabin ili fludarabin fosfat (Fludara®) je lek za hemoterapiju koji se koristi u lečenju hronične limfocitne leukemije i indolentnih Ne-Hočkinovih limfoma. Fludarabin je analog purina. Fludarabin inhibira sintezu DNK interferirajući sa ribonukleotid reduktazom i DNK polimerazom i specifičan je za S fazu (pošto su ovi enzimi veoma aktivni tokom replikacije DNK). Fludarabin ima sledeću strukturu:

[0035] "FLU" kako se ovde koristi znači fludarabin.

[0036] "VH" se odnosi na varijabilni region teškog lanca imunoglobulina antitela ili fragmenta antitela. "VL" se odnosi na varijabilni region lakog lanca imunoglobulina antitela ili fragmenta antitela.

[0037] Termin "CD19" se odnosi na protein poznat kao CD19, koji ima sledeće sinonime: B4, antigen B-limfocita CD19, površinski antigen B-limfocita B4, CVID3, diferencijacijski antigen CD19, MGC12802 i površinski antigen T-ćelija Leu-12.

[0038] Humani CD19 ima sekvencu aminokiselina:

[0039] "MOR208" je anti-CD19 antitelo. Aminokiselinska sekvenca varijabilnih domena je data na slici 3. Aminokiselinska sekvenca teškog i lakog lanca Fc regiona MOR208 je data na slici 4. „MOR208“ i „XmAb 5574“ se koriste kao sinonimi za opisivanje antitela prikazanih na slikama 3 i 4. MOR208 antitelo je opisano u US application serial no. 12/377,251.

[0040] Dodatna antitela specifična za CD19 su opisana u US patent br. 7,109,304 (Imunomedics); US application serial no. 11/917,750 (Medarek); US application serial no. 11/852,106 (Medimmune); US application serial no. 11/648,505 (Merck Patent GmbH); US patent no. 7,968,687 (Seattle Genetics); i US application serial no. 12/710,442 (Glenmark Pharmaceuticals).

[0041] "Fc region" označava konstantni region antitela, koji kod ljudi može biti iz lgG1, 2, 3, 4 podklase ili drugih klasa. Sekvence humanih Fc regiona dostupne su na IMGT, Human IGH C-REGIONs,http://www.imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/protein/human/IGH/IGHC/Hu_IGHCallgenes.html (preuzeto 16. maja 2011).

[0042] "RefmAb33" je antitelo čija je sekvenca amino kiseline sledeća:

[0043] Teški lanac uključujući Fc region:

[0044] Laki lanac uključujući Fc region:

[0045] RefmAb33 je specifičan za RSV, i koristi se kao kontrola izotipa, pošto deli isti Fc region kao MOR208.

[0046] "Kombinacija" znači više od jedne stavke, npr. jedinjenje kao što je antitelo i fludarabin.

[0047] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na kombinacije, farmaceutike i farmaceutske kompozicije koje sadrže opisane kombinacije. Dve komponente sinergističke kombinacije ovog pronalaska, npr. antitelo specifično za CD19 i fludarabin, mogu se davati zajedno, istovremeno ili odvojeno. Kada se daju zajedno, dve komponente se mogu formulisati zajedno u jednoj farmaceutskoj kompoziciji, koja može uključivati farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijent. Alternativno, dve komponente mogu takođe biti formulisane u različitim farmaceutskim kompozicijama. U ovom slučaju, dve komponente se mogu primeniti istovremeno ili jedna za drugom. U jednom izvođenju, fludarabin se primenjuje pre i/ili odvojeno od primene antitela specifičnog za CD19, npr. MOR208.

[0048] Farmaceutska kompozicija uključuje aktivni agens, npr. antitelo za terapeutsku upotrebu kod ljudi. Farmaceutska kompozicija može uključivati prihvatljive nosače ili ekscipijente.

[0049] „Primena“ ili „davanje“ uključuje, ali nije ograničeno na isporuku u obliku injekcije, kao što je, na primer, intravenski, intramuskularni, intradermalni ili subkutani put ili mukozni put, na primer, kao sprej za nos ili aerosol za inhalaciju ili kao rastvor za gutanje, kapsula ili tableta.

[0050] "Terapeutski efikasna količina" jedinjenja ili kombinacije odnosi se na količinu dovoljnu da izleči, ublaži ili delimično zaustavi kliničke manifestacije date bolesti ili poremećaja i njegovih komplikacija. Količina koja je efikasna za određenu terapeutsku svrhu zavisiće od težine bolesti ili povrede, kao i od težine i opšteg stanja subjekta. Podrazumeva se da se određivanje odgovarajuće doze može postići korišćenjem rutinskog eksperimentisanja, konstruisanjem matrice vrednosti i testiranjem različitih tačaka u matrici, što sve spada u okvir uobičajenih veština obučenog lekara ili kliničkog naučnika.

[0051] "CDR-ove" ovde definišu ili Chothia i dr ili Kabat i dr. Videti Chothia C, Lesk AM. (1987) Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J Mol Biol., 196(4):901-17. Videti Kabat E.A, Wu T.T., Perry H.M., Gottesman K.S. and Foeller C. (1991). Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th edit., NIH Publication no. 91-3242, US Dept. of Health and Human Services, Washington, DC.

[0052] „Unakrsna konkurencija“ označava sposobnost antitela ili drugog vezivnog agensa da ometa vezivanje drugih antitela ili vezivnih agenasa za CD19 u standardnom testu kompetativnog vezivanja. Sposobnost ili stepen u kojem je antitelo ili drugi vezivni agens u stanju da ometa vezivanje drugog antitela ili vezujućeg molekula za CD19, i, prema tome, da li se može reći da se unakrsno takmiči prema predstavljenom pronalasku, može se odrediti korišćenjem standardnih testova kompetativnog vezivanja. Jedan pogodan test uključuje upotrebu Biacore tehnologije (npr. korišćenjem instrumenta BIAcore 3000 (Biacore, Uppsala, Sweden)), koji može da meri stepen interakcije korišćenjem tehnologije površinske plazmonske rezonancije. Drugi test za merenje unakrsne konkurencije koristi pristup zasnovan na ELISA-i. Proces visoke propusnosti za "epitope binning" antitela zasnovan na njihovoj unakrsnoj konkurenciji je opisan u Međunarodnoj prijavi patenta br. WO 2003/48731

[0053] Izraz "epitop" uključuje bilo koju proteinsku determinantu sposobnu da se specifično veže za antitelo ili na drugi način stupa u interakciju sa molekulom. Epitopske determinante se generalno sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupa molekula kao što su aminokiseline ili bočni lanci ugljenih hidrata ili šećera i mogu imati specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Epitop može biti "linearan" ili "konformacioni". Izraz "linearni epitop" se odnosi na epitop sa svim tačkama interakcije između proteina i molekula u interakciji (kao što je antitelo) linearno duž primarne aminokiselinske sekvence proteina (kontinuirano). Izraz "konformacioni epitop" se odnosi na epitop u kome se diskontinuirane aminokiseline spajaju u trodimenzionalnu konformaciju. U konformacionom epitopu, tačke interakcije se javljaju preko aminokiselinskih ostataka na proteinu koji su odvojeni jedan od drugog.

[0054] „Vezuje isti epitop kao“ označava sposobnost antitela ili drugog vezujućeg agensa da se veže za CD19 i ima isti epitop kao antitelo navedeno u primerima. Epitopi datog primera antitela i drugih antitela vezanih za CD19 mogu se odrediti korišćenjem standardnih tehnika mapiranja epitopa. Tehnike mapiranja epitopa, dobro poznate u struci, uključuju Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E.Morris, ur., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Na primer, linearni epitopi se mogu odrediti istovremenom sintezom velikog broja peptida na čvrstim nosačima, peptida koji odgovaraju delovima proteinskog molekula, i reakcijom peptida sa antitelima dok su peptidi još uvek vezani za nosače. Takve tehnike su poznate u ovoj oblasti i opisane u, npr. U.S. patent No. 4,708,871; Geysen i dr, (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:3998-4002; Geysen i dr, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 82:78-182; Geysen i dr, (1986) Mol. Immunol. 23:709-715. Slično, konformacioni epitopi se lako identifikuju određivanjem prostorne konformacije aminokiselina kao što je, na primer, zamena vodonika/deuterijumom, rendgenska kristalografija i dvodimenzionalna nuklearna magnetna rezonanca. Videti, npr. Epitope Mapping Protocols, supra. Antigenski regioni proteina se takođe mogu identifikovati korišćenjem standardnih dijagrama antigenosti i hidropatije, kao što su oni izračunati korišćenjem, na primer, softverskog programa Omiga verzija 1.0 dostupnog od Oxford Molecular Group. Ovaj računarski program koristi Hopp/Woods metod, Hopp i dr, (1981) Proc. Natl. Acad. Sci

[0055] USA 78:3824-3828; za određivanje profila antigenosti, i Kyte-Doolittle tehnika, Kyte i dr, (1982) J.Mol. Biol. 157: 105-132; za grafike hidrofilnosti.

[0056] Aspekt predstavljenog pronalaska obuhvata kombinaciju antitela specifičnog za CD19 i analoga purina za upotrebu u lečenju Ne-Hočkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije i/ili akutne limfoblastne leukemije. U izvođenjima, kombinacija je sinergistička.

[0057] Ovde se kombinacija prikazanog antitela anti-CD19 i fludarabina ponašala sinergistički u in vitro i in vivo modelima relevantnim za NHL i CLL. Pošto su i NHL i CLL poremećaji povezani sa B ćelijama i CD19 je visoko eksprimiran na B-ćelijama, prikazana kombinacija treba da ima isti mehanizam delovanja i takođe treba da se ponaša sinergistički u lečenju drugih poremećaja povezanih sa B ćelijama, npr. ALL. Zbog toga će kombinacija prikazanog antitela specifičnog za CD19 i fludarabina biti efikasna u lečenju ljudi kod Ne-Hočkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije i/ili akutne limfoblastne leukemije.

[0058] Pošto je mehanizam delovanja fludarabina i drugih analoga purina sličan, u tome što analozi purina ometaju sintezu nukleinskih kiselina, veruje se da sinergija takođe treba da se zabeleži i kada se leče ljudi koji imaju Non-Hodgkinov limfom, hroničnu limfocitnu leukemiju i/ ili akutnu limfoblastnu leukemiju sa kombinacijom anti-CD19 antitela i analoga purina koji nije fludarabin, npr. merkaptopurin, azatioprin i tioguanin.

[0059] Kao što je prikazano da se anti-CD19 antitelo i druga anti-CD19 antitela vezuju za CD19 antigen, veruje se da se sinergija takođe treba videti kada se leče ljudi koji imaju Ne-Hočkinov limfom, hroničnu limfocitnu leukemiju i/ili akutnu limfoblastnu leukemiju u kombinaciji bilo kog anti-CD19 antitela i analoga purina, gde je anti-CD19 antitelo, na primer, US patent application serial number 12/377,251 (Xencor), WO2005012493, WO2010053716 (Immunomedics); WO2007002223 (Medarex); WO2008022152 (Xencor); WO2008031056 (Medimmune); WO 2007/076950 (Merck Patent GmbH); WO 2009/052431 (Seattle Genetics); i WO2010095031 (Glenmark Pharmaceuticals)

[0060] Kao što je predstavljeno ovim pronalaskom, kod tzv. ”hi” izvođenja, antitelo specifično za CD19 sadrži antitelo koje se unakrsno takmiči sa antitelom koje sadrži HCDR1 region sekvence SYVMH (SEK ID BR: 1), HCDR2 region sekvence NPYNDG (SEK ID BR: 2), HCDR3 region sekvence GTYYYGTRVFDY (SEK ID BR: 3), LCDR1 region sekvence RSSKSLQNVNGNTYLY(SEK ID BR: 4), LCDR2 region sekvence RMSNLNS (SEK BRNO: 5) i LCDR3 region sekvence MQHLEYPIT (SEK ID BR: 6).

[0061] Kao što je predstavljeno ovim pronalaskom, antitelo specifično za CD19 sadrži antitelo koje se vezuje za isti epitop kao antitelo koje sadrži HCDR1 region sekvence SYVMH (SEK ID BR: 1), HCDR2 region sekvence NPYNDG (SEK ID BR: 2), HCDR3 region sekvence GTYYYGTRVFDY (SEK ID BR: 3), LCDR1 region sekvence RSSKSLQNVNGNTYLY I (SEK ID BR: 4), LCDR2 region sekvence RMSNLNS (SEK ID BR: 5) i LCDR3 region sekvence MQHLEYPIT (SEK ID BR: 6).

[0062] Kao što je predstavljeno ovim pronalaskom, antitelo specifično za CD19 obuhvata HCDR1 region sekvence SYVMH (SEK ID BR: 1), HCDR2 region sekvence NPYNDG (SEK ID BR: 2), HCDR3 region sekvence GTYYYGTRVFDY (SEK ID BR: 3), LCDR1 region sekvence RSSKSLQNVNGNTYLY (SEK ID BR: 4), LCDR2 region sekvence RMSNLNS (SEK ID BR: 5) i LCDR3 region sekvence MQHLEYPIT (SEK ID BR: 6).

antitelo specifično za CD19 sadrži varijabilni teški lanac sekvence i varijabilni laki lanac sekvence

[0063] U izvođenjima, antitelo specifično za CD19 sadrži varijabilni teški lanac sekvence EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFQGRVTISSDKSISTAYMELS SLRSEDTAMYYCARGTYYYGTRVFDYWG QGTLVTVSS (SEK ID BR:10) i varijabilni laki lanac sekvence DIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRSSKSLQNVNGNTYLYWFQQKPGQSPQLLIYRMSNLNSGVPDRFSGSGSGTEFTLTISSLEP EDFAVYYCMQHLEYPITFGAGTKLEIK (SEK ID BR: 11).

[0064] U izvođenjima, antitelo specifično za CD19 sadrži konstantan domen teškog lanca sekvence ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPGK. (SEK ID BR: 12)

[0065] U izvođenjima, antitelo specifično za CD19 obuhvata konstantni domen lakog lanca sekvence RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEK ID BR: 13).

[0066] U izvođenjima, analog purina je fludarabin.

[0067] U izvođenjima, komponente kombinacije, antitelo specifično za CD19 i fludarabin, daju se odvojeno. U jednom izvođenju, fludarabin se primenjuje pre primene antitela specifičnog za CD19.

[0068] Kao što je predstavljeno ovim pronalaskom, kombinacija je farmaceutska kompozicija. Kao što je predstavljeno ovim pronalaskom, kompozicija sadrži prihvatljiv nosač. Kao što je predstavljeno ovim pronalaskom, kombinacija se primenjuje u efektivnoj količini.

[0069] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obuhvata sinergističku kombinaciju antitela specifičnog za CD19 koje sadrži HCDR1 region sekvence SYVMH (SEK ID BR: 1), HCDR2 region sekvence NPYNDG (SEK ID BR: 2), HCDR3 region sekvence GTYYYGTRVFDY (SEK ID BR: 3), LCDR1 region sekvence RSSKSLQNVNGNTYLY (SEK ID BR: 4), LCDR2 region sekvence RMSNLNS (SEK ID BR: 5) i LCDR3 region sekvence MQHLEYPIT (SEK ID BR: 6) i fludarabin je u stanju da posreduje u ubijanju MEC-1 ́ ćelija od strane ADCC-a u prisustvu izolovanih humanih PBMC sa najmanje dvostruko, trostruko, četvorostruko ili petostruko boljom efikasnošću nego sam fludarabin.

[0070] Aspekt predstavljenog pronalaska obuhvata sinergističku kombinaciju antitela specifičnog za CD19 koje sadrži HCDR1 region sekvence SIVMH (SEK ID BR: 1), HCDR2 region sekvence NPYNDG (SEK ID BR: 2), HCDR3 region sekvence GTYYYGTRVFDY (SEK ID BR: 3), LCDR1 region sekvence RSSKSLQNVNGNTYLY (SEK ID BR: 4), LCDR2 region sekvence RMSNLNS (SEK ID BR: 5) i LCDR3 region sekvence MQHLEYPIT (SEK ID BR: 6) i fludarabin za lečenje Non-Hodgkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije i/ili akutne limfoblastne leukemije. U izvođenjima, Ne-Hočkinov limfom je izabran iz grupe koju čine folikularni limfom, mali limfocitni limfom, limfoidno tkivo povezano sa sluzokožom, marginalna zona, difuzna velika B ćelija, Burkitov limfom i ćelije omotača.

[0071] Drugi aspekt predstavljenog pronalaska obuhvata metod lečenja Non-Hodgkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije i/ili akutne limfoblastne leukemije kod pojedinca kome je to potrebno, pri čemu postupak obuhvata davanje antitela specifičnog za CD19 i analoga purina. U aspektu predstavljenog pronalaska, antitelo specifično za CD19 obuhvata HCDR1 region sekvence SIVMH (SEK ID BR: 1), HCDR2 region sekvence NPYNDG (SEK ID BR: 2), HCDR3 region sekvence GTYYYGTRVFDY (SEK ID BR: 2). ID BR: 3), LCDR1 region sekvence RSSKSLQNVNGNTYLY (SEK ID BR: 4), LCDR2 region sekvence RMSNLNS (SEK ID BR: 5) i LCDR3 region sekvence MQHLEYPIT (SEK ID BR: 6). U izvođenjima postupka, analog purina je fludarabin.

Primeri

[0072] Primer 1: Inhibicija proliferacije MEC-1 ćelija korišćenjem MOR208 i fludarabina, samog i u kombinaciji

Materijali

[0073] MEC-1 ćelije: ćelijska linija hronične b-ćelijske leukemije DSMZ# ACC497; Ćelijski medijum: Iscove-ov modifikovani Dulbekov medijum (IMDM) sa GlutaMAX™, Invitrogen, Kat. br: 31980-048, 20% FCS; PBMC: RPMI1640, sa stabilnim glutaminom, PAN Biotech GmbH, Kat. br: P04-13500 dopunjen sa 10% FCS; Biocoll: Biochrome AG KAT. br.: L6115 LOT br.: 1050T; Fludarabin: Baier, 25 mg/ml u ddH2O, LOT br: 91 00ST; i RefmAb33 (anti-RSV) sa istim Fc regionom kao MOR208.

[0074] Citotoksičnost MOR208 i fludarabina samostalno i u kombinaciji je testirana u MEC-1 ćelijama. FLU je analog purina, stoga funkcioniše preko direktne citoksičnosti u MEC-1 ćelijama. MOR208 cilja na CD19 i dodatno funkcioniše preko ADCC-a u ubijanju MEC-1 ćelija. Za sledeće grupe mereno je ubijanje MEC-1 ćelija: FLU na 18 µg/ml; MOR208 u 18:00 i kombinacija MOR208 u 18:00 i FLU od 18 µg/ml. Ove koncentracije su odabrane jer su blizu ili na EC50 za MOR208 i FLU.

[0075] U FLU grupi i kombinovanoj grupi MOR208+FLU, ćelije MEC-1 su prethodno inkubirane sa FLU tokom 72 sata pre merenja ADCC testa. MEC-1 ćelije su obojene upotrebom 1 mg/ml Calcein AM, a zatim su prebrojane i podešene na 2x10<5>/ml. PBMC su izbrojani i podešeni na 6x10<6>/ml. ADCC testovi su urađeni na sledeći način: Koristeći ploče sa 96 bunarića, dodato je 100 µl ćelijske suspenzije MEC-1 ćelija po bunariću, zatim je 100 µl ćelijske suspenzije PBMCs dodato u svaki bunarić, što je rezultiralo E:T odnosom od 30:1. Antitela su razblažena do 1 pg/ml u medijumu. Ćelije su centrifugirane i ponovo suspendovane. U talog smeše target:efektorska ćelije dodato je 100 µl rastvora antitela ili kontrolnog rastvora. Smeša je inkubirana 4 h u CO2inkubatoru na 37°C. ADCC merenja su obavljena na sledeći način: inkubirani rastvor ćelija (∼ 100µl) je prebačen u FACS epruvete i 200µl FACS pufera (DPBS 3%FCS) i 0,5 µl PI osnovni rastvor je dodat u svaku epruvetu. Korišćen je FACS-Calibur. Mrtve MEC-1 ćelije su obojene propidijum jodidom.

[0076] Tabela 1 i Slika 1 prikazuju sirove podatke.

T l 1

[0077] Vrednosti predstavljaju % mrtvih ćelija. Svaki eksperiment predstavlja PBMC od različitih donatora. Kontrola korišćena za Eksperimente 1 i 2 bila je RefMab33. Kontrola korišćena za Eksperiment 3 su samo PBMC.

[0078] Tabela 2 prikazuje sirove podatke iz Tabele 1 normalizovane za specifično ubijanje i rezultate Chou proračuna urađenih u određivanju sinergizma.

T l 2

[0079] Vrednosti prikazane u Tabeli 2 su izračunate na sledeći način: 1) od sirovih podataka (% mrtvih ćelija) prikazanih u Tabeli 1, oduzet je bekgraund (kontorole), što je rezultiralo specifičnim ubijanjem za svaku tretiranu grupu; zatim 2) specifične vrednosti ubijanja su normalizovane postavljanjem kombinacije MOR208 FLU na 1. Proseci Tabele 2 su prikazani na slici 5. Prikazani su primeri ADCC krive doza-odgovor korišćenih u proračunima faktora Chou kombinacije MOR208 FLU na slici 2.

[0080] Proračuni Chou indeksa (CI) su završeni da bi se odredila sinergija kombinacije datog primera anti-CD19 antitela i fludarabina u poređenju sa samo MOR208 i FLU. Proračuni su opisani u TingChao Chou, Theoretical Basis, Experimental Design, and Computerized Simulation of Synergism and Antagonism in Drug Combination Studies, Pharmacol Rev 58:621-681 (2006)and Chou TC, Talalay P, Quantitative analysis of doseeffect relationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors. Adv Enzyme Regul 22: 27-55 (1984). Metode Chou-Talalai se sprovode metodom Cl-izobol.

1

Jednačina srednjeg efekta

[0081] Modeli jednačine srednjeg efekta efekta inhibitora (kao što je lek) kao Fa/Fu=(D/D50)^m, gde je D doza, Fai Fudeo sistema na koji utiče i na njega ne utiče doza D (Fa+ Fu= 1); D50 je doza koja proizvodi srednji efekat (npr. IC50, ED50, LD50). Konstanta m određuje oblik krive doza-efekat. Korišćen je softver Excel Fit da bi se izvršio proračun linearne regresije da bismo procenili parametre m i D50.

[0082] Efekti kombinacije na MEC-1 ćelije se mere % mrtvih ćelija kao što je gore opisano. Mi definišemo frakciju Fukao odnos % mrtvih ćelija tretirane ćelijske linije prema % mrtvih ćelija ćelijske linije izložene kontroli. To je:

Fu = % mrtvih ćelija (tretirana ćelijska linija) / % mrtvih ćelija (ne-tretirana ćelijska linija)

[0083] Tada je % mrtvih ćelija ćelijske linije konstantan D50 u jednačini srednjeg efekta, koja se može proceniti linearnom regresijom opisanom iznad.

Cl-izobol metoda

[0084] Metoda Cl-izobol obezbeđuje kvantitativnu procenu sinergizma između lekova. Kombinovani indeks (CI) se procenjuje na osnovu podataka o dozi i efektu pojedinačnih i kombinovanih tretmana lekovima. Vrednost Cl manja od 1 ukazuje na sinergizam; Cl = 1 ukazuje na aditivni efekat; a Cl > 1 ukazuje na antagonizam. Interakcija sa lekovima (sinergizam ili antagonizam) je izraženija što je vrednost Cl dalje od 1.

[0085] Formalno, kombinovani indeks (CI) kombinovanog tretmana lekovima je definisan kao Cl =D1/Dx1+ D2/DX2. Ovde su D1 i D2 doze leka 1 i leka 2 date kombinacije, ovim redom; i Dx1, i Dx2 je doza tretmana samo sa lekom 1 i lekom 2 koji bi dao isti efekat kao i kombinacija. Doze Dx1 i Dx2 treba proceniti na osnovu podataka o dozi i efektu tretmana pojedinačnim lekovima. U suštini, jednačina srednjeg efekta se uklapa u podatke za svaki lek. Iz jednačine srednjeg efekta leka možemo proceniti dozu (tj. D) neophodnu da bi se proizveo efekat (tj. Fa, Fu). Što je tačka dalje od aditivne linije, veća je razlika između 1 i njegovog Cl, pa je jači (sinergistički ili antagonistički) efekat.

Rezultati

[0086] Kao što je prikazano u Tabeli 2, vrednosti Chou indeksa ukazuju na jasan sinergizam kombinacije MOR208 i fludarabina u specifičnom ubijanju ćelija MEC-1 u poređenju sa MOR208 i samim fludarabinom. Ovaj zaključak je zasnovan na Chou proračunima od 0,03, 0,3 i 0,3 u svakom od tri eksperimenta, ovim redom, sa prosekom od 0,21, gde Cl <1 ukazuje na sinergizam. Prema tome, kombinacija MOR208 i fludarabina će se takođe ponašati sinergistički u lečenju Ne-Hočkinovog limfoma (NHL), hronične limfoidne leukemije (CLL) i/ili akutne limfoblastne leukemije (ALL) kod ljudi.

[0087] Da bi se potvrdili rezultati gore predstavljenih Chou proračuna, normalizovani podaci u Tabeli 2 su procenjeni na statističku značajnost korišćenjem Bonferronijevog testa višestrukog poređenja. Videti ”James, et al, Antibody-mediated B-cell depletion before adoptive immunotherapy with T cells expressing CD20-specific chimeric T-cell receptors facilitates eradication of leukemia in immunocompetent mice, Blood, 114(27):5454-63 (Epub 2009 Oct 30)”. Rezultati su prikazani u Tabeli 3.

T l

Rezultati

[0088] Kao što je prikazano u Tabeli 3, Bonferonijev test višestrukog poređenja pokazuje da je kombinovani tretman FLU MOR208 statistički efikasniji u specifičnom ubijanju ćelija MEC-1 nego tretman samo FLU i MOR208.

[0089] Primer 2: MOR208 i FLU sami i u kombinaciji u subkutano (SC) implantiranom modelu rasta tumora tumora β-ćelijskog limfoma Ramosa Burkita kod ljudi.

Materijali

[0090] RAMOS ćelije humanog Burkitovog limfoma (ATCC broj CRL-1596, lot# br. 3953138); Kontrola sredstva: 0,9% natrijum hlorida, 25mg/ml manitola, pH 7,0;; SCID miševi (University of Adelaide, Waite Campus, Urrbaraie, SA, Australia, Strain C.B.-17-lgh-1<b>-Prkdc<scid>).

Metode

[0091] Ženkama C.B-17 SCID miševa starim šest do sedam nedelja su subkutano implantirane RAMOS ćelijae (∼ 5 x 10<6>ćelija/mišu). 14 dana nakon inokulacije, miševi su podeljeni u deset grupa od po osam, gde je svaka grupa imala zapremine tumora relativno iste veličine. Lečenje je počelo 14. dana. Režimi lečenja su dati u Tabeli 4. Trajanje studije je bilo 63 dana.

T l 4

[0092] MOR208, fludarabin i sredstvo su davani u zapremini od 0,1 mL/10 g telesne težine. Početno očitavanje je bio rast tumora, konkretno zapremina tumora na dan 38. Težine tumora su izračunate korišćenjem jednačine (I x w2)/2, gde se I i w odnose na veće i manje dimenzije prikupljene pri svakom merenju.

[0093] Rezultati su prikazani u Tabeli 5, a proseci su prikazani na slici 6.

T l

[0094] Pored krajnje tačke zapremine tumora 38. dana studije, procenjeni su parametri 1) smanjenog rasta tumora [%] 38. dana i 2) produženog vremena do 4000 mg tumora [%]. Rezultati su prikazani u Tabeli 6.

T l

[0095] Obe krajnje tačke prikazane u Tabeli 6 su procenjene korišćenjem koncepta frakcionog proizvoda (FPC) da bi se utvrdilo da li postoji sinergizam sa tretmanom kombinacije tretmana MOR208 i FLU u poređenju sa samim MOR208 i fludarabinom. Kada je kombinovana grupa tretmana efikasnija od izračunavanja FPC, onda postoji sinergizam. Koncept frakcionog proizvoda je izračunat korišćenjem formule 1-[(1-A)*(1-B)] = fpc(%), kako je to opisao Webb, J. L. (1963) Enzyme and Metabolic Inhibitors, Academic Press, New York. Nakon što su FPC proračuni završeni, rezultujuća FPC vrednost i vrednosti iz Tabele 6 su normalizovane postavljanjem FPC vrednosti na 1. Rezultati ovih proračuna prikazani su u Tabeli 7.

T l

Rezultati

[0096] Obe krajnje tačke su mera inhibicije rasta tumora i u obe krajnje tačke, smanjeni rast tumora (%) 38. dana studije i produženo vreme (%) do 4000 mg, kombinacija MOR208 FLU125 pokazala je jasan sinergizam u poređenju sa samim MOR208 i FLU.

[0097] Da bi se potvrdili rezultati gore predstavljenih FPC kalkulacija, podaci o prosečnoj zapremini tumora [mm^3] 38. dana studije (prikazani u Tabeli 5) su procenjeni na statističku značajnost korišćenjem Bonferonijevog testa višestrukog poređenja. Rezultati su prikazani u Tabeli 8.

T l

Rezultati

[0098] Kao što je prikazano u Tabelama 5 i 6, u svim parametrima, kombinacija MOR208 i fludarabina 125 mg/kg bila je efikasnija u inhibiciji rasta tumora in vivo nego MOR208 ili sam fludarabin. Potvrđeno je da je ovo povećanje efikasnosti kombinacije MOR208 i fludarabina 125 mg/kg u inhibiciji rasta tumora in vivo u poređenju sa samim MOR208 i fludarabinom statistički značajno, kao što je prikazano u Tabeli 8. Pored toga, koncept frakcionog proizvoda pokazuje jasan sinergizam kombinacije MOR208 i fludarabina 125 mg/kg u inhibiciji rasta tumora in vivo u poređenju sa samim MOR208 ili fludarabinom, kao što je prikazano u Tabeli 7. Stoga će se kombinacija MOR208 i fludarabina takođe ponašati sinergistički u lečenju Ne-Hočkinovog limfoma (NHL), hronične limfoidne leukemije (CLL) i akutne limfoblastne leukemije (ALL) kod ljudi.

[0099] Pored toga, kombinacija MOR208 i fludarabina 125 mg/kg bila je efikasnija u inhibiciji rasta tumora in vivo nego sama veća doza fludarabina od 250 mg/kg. Pošto je fludarabin pokazao značajne neželjene efekte pri većim dozama, ovaj rezultat pokazuje da je bezbednija, efikasnija alternativa visokoj dozi fludarabina, kombinacija MOR208 i fludarabina.

Primer 3 MOR208 i fludarabin sami i u kombinaciji u humanom Ne-Hočkinovom RAMOS tumoru kod SCID miševa, model preživljavanja

1

Materijali

[0100] Ciklofosfamid (Fluka, Buchs Switzerland, Lot. No. 07551661) Kontrola sredstva: 0,9% natrijum hlorida, 25 mg/ml manitola, pH 7,0; SCID miševi (University of Adelaide, Waite Campus, Urrbaraie, SA, Australia, soj C.B.-17-Igh-1<b>-Prkdcscid); RAMOS ćelije humanog limfoma (ATCC broj CRL-2638).

Metode

[0101] SCID miševi su prethodno tretirani ciklofosfamidom (18 mg/kg, i.p., dva puta dnevno) dva dana pre inokulacije RAMOS ćelija (dan -5 i -4). Na dan inokulacije (dan -3), miševi su podeljeni u deset grupa od po osam miševa i inokulisani sa 1 x 10<6>RAMOS ćelija svaka intravenozno u repnu venu. Režim doziranja za svaku grupu je prikazan u Tabeli 9 i počeo je nultog dana. Trajanje studije je bilo tri nedelje.

Tabela 9: Režimi doziranja

Grupa Jedinjenje Tretman Planirani raspored

A Fludarabin 125 mg/kg, i.p, in 10 mL/kg Jednom dnevno (dan 0-5) B MOR208 3 mg/kg, i.v., in 10 mL/kg Dva puta nedeljno tri nedelje C Sredstvo kontrole i.p., 10 mL/kg Jednom dnevno (dan 0-5) AB Fludarabin/MOR208 125 mg/kg, i.p; 3 mg/kg, i.v. in 10 Jednom dnevno (dan 0-5)/ Dva mL/kg; puta nedeljno tri nedelje E Fludarabin 250 mg/kg, i.p, in 10 mL/kg Jednom dnevno (dan 0-5)

[0102] Očitano je bilo srednje vreme preživljavanja u danima. Da bi se procenilo da li je efekat kombinacije u poređenju sa pojedinačnim grupama tretmana bio sinergistički, korišćene su metode Clark i dr.

Tzv. ”Clarke” i dr. sinergizam

[0103] Metoda je opisana u ”Issues in experimental design and endpoint analysis in the study of experimental cytotoxic agents in vivo in breast cancer and other models, Breast Cancer Research and Treatment 46:255-278 (1997)”.

[0104] Podaci se analiziraju na sledeći način:

Antagonistički (AB)/C < (A/C) x (B/C)

Aditivno (AB)/C = (A/C) x (B/C)

Sinergistički (AB)/C > (A/C) x (B/C)

Pri čemu je A tretman sa MOR208; B je samo tretman FLU; C je odgovor na sredstvo za tretman; AB je kombinacija tretmana A i B. Srednje vreme preživljavanja u danima za svaku studijsku grupu i Clarke i dr. analize su prikazane u Tabeli 10.

T l 1

Rezultati

[0105] Kombinacija MOR208 i FLU je pokazala jasan sinergizam u srednjem vremenu preživljavanja u poređenju sa samim MOR208 i FLU.

[0106] Da bi se potvrdili rezultati gornjih proračuna sinergizma, srednje vreme preživljavanja u danima kombinacije MOR208 i fluradabina 125 mg/kg upoređeno je sa MOR208 i samo fluradabinom koristeći ”MantelHaenszel” test [P vrednost] i ”Gehan-Wilcoxon” test [P vrednost]. Rezultati prikazani u Tabeli 11.

T l 11

Rezultati

[0107] Tabela 10 pokazuje da je kombinacija MOR208 i fludarabina 125 mg/kg sinergistički povećala srednje vreme preživljavanja u SCID mišjem modelu Burkitovog limfoma u poređenju sa MOR208 i samim fludarabinom. Potvrđeno je da je ovo povećanje srednjeg vremena preživljavanja kombinacije MOR208 i fludarabina 125 mg/kg in vivo statistički značajno u poređenju sa samim MOR208 i fludarabinom, kao što je prikazano u Tabeli 11. Stoga, kombinacija MOR208 i fludarabina se takođe ponaša se sinergistički u lečenju Ne-Hočkinovog limfoma (NHL), hronične limfoidne leukemije (CLL) i akutne limfoblastne leukemije (ALL) kod ljudi.

[0108] Pored toga, kombinacija MOR208 i fludarabina 125 mg/kg bila je efikasnija u povećanju srednjeg vremena preživljavanja in vivo od veće doze samog fludarabina od 250 mg/kg. Kako je fludarabin pokazao značajne neželjene efekte pri većim dozama, uprkos njegovoj efikasnosti, ovaj rezultat pokazuje da je bezbednija, efikasnija alternativa visokoj dozi fludarabina kombinacija MOR208 i fludarabina.

1

�

1

2

�

Claims

Patentni zahtevi:

1. Sinergistička kombinacija antitela specifičnog za CD19 i fludarabina za upotrebu u lečenju Ne-Hočkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije ili akutne limfoblastne leukemije, pri čemu antitelo sadrži varijabilni teški lanac sekvence EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFQGRVTISSDKSISTAYMELS SLRSEDTAMYYCARGTYYYGTRVFDYWGQGTLVTVSS (SEK ID BR: 10) i varijabilni laki lanac sekvence DIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRSSKSLQNVNGNTYLYWFQQKPGQSPQLLIYRMSNLNSGVPDRFSGSGSGT EFTLTISSLEPEDFAVYYCMQHLEYPITFGAGTKLEIK (SEK ID BR: 11) i konstantni domen teškog lanca sekvence ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEE KTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEK ID BR: 12).

2. Kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu antitelo sadrži konstantni domen lakog lanca sekvence RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEK ID BR: 13).

3. Kombinacija prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva za upotrebu u lečenju Ne-Hočkinovog limfoma, opciono pri čemu je Ne-Hočkinov limfom izabran iz grupe koju čine folikularni limfom, mali limfocitni limfom, limfom povezan sa mukoznim tkivom, limfom marginalne zone, difuzni limfom velikih B ćelija, Burkitov limfom i limfom ćelija omotača.

4. Kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, pri čemu je Ne-Hočkinov limfom folikularni limfom.

5. Kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, pri čemu je Ne-Hočkinov limfom mali limfocitni limfom.

6. Kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, pri čemu je Ne-Hočkinov limfom limfom limfoidnog tkiva povezan sa mukozom.

7. Kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, pri čemu je Ne-Hočkinov limfom limfom marginalne zone.

8. Kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, pri čemu je Ne-Hočkinov limfom difuzni limfom velikih B ćelija.

9. Kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, pri čemu je Ne-Hočkinov limfom Burkitov limfom.

10. Kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, pri čemu je Ne-Hočkinov limfom limfom ćelija omotača.

11. Kombinacija prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2 za upotrebu u lečenju hronične limfocitne leukemije.

12. Kombinacija prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2 za upotrebu u lečenju akutne limfoblastne leukemije.

13. Kombinacija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu su antitelo specifično za CD19 i fludarabin:

(a) formulisani zajedno u jednoj farmaceutskoj kompoziciji; ili

(b) formulisani u različitim farmaceutskim kompozicijama.

14. Kombinacija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 13, pri čemu se pomenuto antitelo specifično za CD19 i fludarabin daju istovremeno.

15. Kombinacija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 12 ili patentnom zahtevu 13(b), pri čemu se pomenuto antitelo specifično za CD19 i fludarabin daju odvojeno.

16. Kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 15, pri čemu se fludarabin primenjuje pre primene navedenog antitela specifičnog za CD19.