RS59611B1 - Novi poc sistem testiranja i metod - Google Patents

Description

Predmetni pronalazak se odnosi na sistem testiranja ili sistem analize (sistem detekcije) i metod testiranja poželjno za primenu u oblasti Point-of Care (PoC).

U istraživanju i in-vitro dijagnostici kod ljudi, veterini, hrani ili u velikom broju drugih oblasti primene, analitički testovi se koriste za kvalitativno i/ili kvantitativno odreÿivanje molekula, analita i/ili aktivnosti ili njihovih kompozicija. Rezultati testiranja obezbeÿuju različite informacije, kao što su dijagnostički parametri za identifikaciju oboljenja, porekla hrane, ili efikasnosti leka.

Danas poznate metode analiza DNK i proteina dominiraju u dostupnim testovima. Konkretno, imuno-analize su metode u kojima se koriste antitela za specifično vezivanje izabranih, dovoljno velikih ciljnih molekula gotovo bilo koje vrste, kao što su biomarkeri.

Brzi testovi omoguüavaju očitavanje vrednosti u roku od nekoliko minuta ili sati od početka testiranja, i blizu tačke uzorkovanja i bez potrebe da se uzorak pošalje (Point-of-Care (PoC)).

Poznate standardizovane metode testranja obuhvataju testiranje bočnog protok (LFT), tesiranje protok kroz (FTT), testiranje aglutinacije (AT) ili testiranje u čvrstoj fazi (SPT). Sve ove metode direktno i vizuelno detektuju analite. Za takve testove postoje dodatni kompaktni ureÿaji za Rčitavanje, koji takoÿe daju kvantitativne rezultate.

Poznate metode ispitivanja in-vitro dijagnostike su imunotestiranja (IA), posebno imuno testiranje povezano sa enzimom (EIA), ili "testiranje vezivanja" ("sendvič") (videti, na primer, EP 0171150B1, EP 0063810B1). Pored toga, trebalo bi navesti literaturu Rogera P. Ekinsa (npr., WO 8401031 i slično).

Testovi vezivanja zasnovani na membrani, naročito IgE iz krvnih alergena, poznati su od kraja 1980-ih, na primer, iz HEMIJSKIH ABSTRAKTA, vol.101, broj 25, 17. decembar 1984., strana 578, apstrakt broj 228190b, Columbus, Ohio, US; B. J. VALSH et al .: "Allergen discs prepared from nitrocellulose: detection of IgE binding to soluble and insoluble allergens", & J. IMMUNOL. METHODS 1984, 73(1), 139-45. Neki testirani sistemi zasnovani na principu bočnog protoka komercijalno su dostupni kao brzi testovi za alergiju.

Za PoC oblast komercijalno dostupan Fast-check PoC podnosioca je opisan nizom primera (videti EP 1718970), koji se može koristiti na osnovu membranskog testa vezivanja za otkrivanje alergija iz cele krvi.

Dalje, opisan je brzi test podnosioca u WO 2011/000959, u kome se membrana selektivno vlaži izmeÿu detekcijskih mesta u cilju da bi se posebno efikasno i paralelno uvelo testiranje reagenasa u odreÿenim oblastima membrane prethodno napunjene celokupnom krvlju koja se analizira.

Sledeüi brzi test podnosioca je opisan u WO 2013026808A1 od 28.02.2013., pri čemu se tečnost ispira preko membrane sa obe strane. U tu svrhu, membrana se fiksira na uzdužnim stranama u ureÿaju, tako da se na vrhu i na dnu membrane stvara slobodna zapremina, kroz koju teþnost slobodne zapremine može da teþe prlazeüi kroz membranu. WO 2006074350A2 takoÿe otkriva generiþki sistem testiranja, ali sa formiranjem U-turn na nosaþu.

Postoji velika potreba, meÿutim, za poboljšanim brzim testovima. Konkretno, može se poboljšati uniformno punjenje pojedinaþnih detekcijskih mesta sa uzorkovanom teþnošüu (analit), kao i efikasno ispiranje svih detekcijskih mesta, kao i obnovljiva linija protoka teþnosti, koja toleriše promene svojstava membrane izazvane promenama proizvodnje. Meÿutim, sva ova svojstva su preduslov za reproducirane i kvalitetne rezultate.

Stoga je cilj ovog pronalaska da za PoC sistem testiranja obezbedi poboljšani i reproduktivniji metodu za punjenje nosaþa sa uzorkom teþnosti za detekciju analita uz pomoüu molekula receptora.

Iznenaÿujuüe je da se ovaj cilj postiže zahtevom 1. Prema pronalasku, predviÿen je in vitro metod testiranja za detekciju najmanje jednog analita iz uzorka teþnosti pomoüu ureÿaja koji se sastoji od dve komore za uzorke razdvojene nosaþem koji ima najmanje dve površine, gde je prednja strana nosaþa okrenuta prema prvoj komori za uzorak, a zadnja strana nosaþ je okrenuta prema drugoj komori za uzorak, i

a) najmanje jedan molekul receptora je fiksiran na prednjoj strani nosaþa,

b) najmanje jedna slobodna zapremina je formirana preko prednje i zadnje strane nosaþa, koji je ograniþen sa zidom komore,

c) prva komora za uzorke ima najmanje dva otvora, pri þemu uzorkovana teþnost teþe kroz prvi otvor duž gradijenta protoka preko prednje strane nosaþa do drugog otvora razmaknutog od nosaþa,

d) druga komora za uzorke ima najmanje dva otvora, gde uzorkovana teþnost teþe kroz prvu komoru za uzorke duž gradijenta protoka preko zadnje strane nosaþa i teþe u suprotnom smeru od protoka na prednjem delu nosaþa do drugog otvora,

e) drugo otvaranje prve komore za uzorak i prvo otvaranje druge komore za uzorak meÿusobno su povezani kanalom, þiji je kanal manjeg preþnika od preþnika komore za uzorak ili slobodne zapremine, i pri þemu ceo uzorak teþnosti izmeÿu dve komore uzorka prolazi kroz kanal izmeÿu prolazi komore za uzorke,

f) drugo otvaranje druge komore za uzorke omoguüava odliv teþnosti,

g) slobodne zapremine iz b.) su barem delimiþno formirane sa teþnom kolonom,

h) pri þemu se gradijent protoka duž prednjeg i zadnjeg dela nosaþa odvija pomoüu pritiska i uvlaþi kolonu teþnosti iz g.), pri þemu bar jedan receptorski molekul veže bar jedan analit iz uzorka teþnosti.

Ovo üe se odnositi ovde kao ’’metod prema pronalasku’’.

Postupak prema pronalasku naroþito pogodno omoguüava ponovljivo punjenje i ispiranje nosaþa uzorkom teþnosti za detekciju analita. U ovom sluþaju, kvalitativno poboljšanje se postiže privremenim formiranjem teþne kolone duž gradijenta protoka preko nosaþa i relevantnih detekcijskih mesta sa molekulima receptora.

Prema pronalasku, nosaþ razdvaja dve komore za uzorke, tako da celokupni protok teþnosti uzorka prolazi izmeÿu dve komore uzorka kroz kanal izmeÿu komora za uzorke, ali po moguünosti ne preko ivica nosaþa. Ovim se obezbeÿuje da se þak i nosaþi razliþitih dimenzija preplave u jednakom obimu na vrhu i na dnu teþnosti za uzorke. Takoÿe je poželjno da se bilo koja cilindriþna zakrivljenost nosaþa u popreþnom smeru, koja postoji ili nastane od poþetka ili tek nakon vlaženja sa teþnošüu uzorka, smanji ili þak kompenzuje priþvršüivanjem nosaþa izmeÿu komora uzoraka. Ovaj aspekt pronalaska takoÿe dovodi do željenog uniformnog i ponovljivog protoka preko nosaþa.

Prema pronalasku, kanal vodi od drugog otvora prve komore za uzorke do prvog otvora druge komore za uzorke. Ovaj kanal prvo omoguüava odvajanje komora za uzorke uz pomoü nosaþa, a da ipak usmeri protok teþnosti iz prve u drugu komoru za uzorak, tako da prednji i zadnji deo nosaþa mogu da se podjednako prelivaju. Iznenaÿujuüe je da kanal ne utiþe na efekat ispiranja, iako deluje na protok sliþno ventilu za dovod.

Sledeüa prednost ovog primera izvoÿenja prema pronalasku leži u þinjenici da je povratak uzorkovane teþnosti kroz kanal spreþen u situacijama u kojima je pritisak koji se primenjuje na komore za uzorke smanjen.

U poželjnom primeru izvoÿenja ovaj kanal ima preþnik od drugog otvora prve komore za uzorke do prvog otvora druge komore za uzorak, što približno odgovara probnom doziranju uzorka i kanalu za otpad. Štaviše, ovaj kanal je manjeg preþnika od preþnika komore za uzorke ili slobodne zapremine. Dalje, poželjno je da kanal okružuje priþvrsni element, posebno popreþni potporni nosaþ, nosaþa i ima okrugli otvor.

Kao rezultat ovih aspekata obezbeÿeno je da se, uprkos proizvodnim tolerancijama nosaþa, može stvoriti dovoljan gradijent protoka u odnosu na obe površine nosaþa. Prednje i zadnje strane se pojavljuju, pri þemu se može postiüi transport znaþajnog dela, ali najmanje polovine uzorka teþnosti izvan nosaþa. Ovo se naroþito odnosi na onu oblast nosaþa do koje se prvi put doseže ili vlaži kada teþnost uzorka uÿe i na kojoj se na mestu detekcije nalazi bar jedan molekul receptora. Ostali rastvori, kao što je rastvor za ispiranje, poželjno se takoÿe transportuju u osnovi izvan nosaþa.

Prema pronalasku, kolona teþnosti je formirana od prednje ili zadnje strane nosaþa do suprotnog zida komore odgovarajuüe komore za uzorke (poklopac komore ili dno komore). U sledeüem poželjnom primeru izvoÿenja, udaljenost prve ili druge površine nosaþa od zida komore je 10 mm ili više, pri þemu je kolona teþnosti obezbeÿena u slobodnoj zapremini iznad prednjeg i/ili zadnjeg dela, þim nastane gradijent protoka.

Meÿutim, razdaljina od 10 do 1500 µm (1,5 mm) je poželjno izmeÿu prednjeg i zadnjeg dela i zida komore, pri þemu gradijent protoka ne može da se odredi, dalje je poželjno rastojanje od 80 µm do 350 µm, a naroþito je poželjna udaljenost od 120 µm do 200 µm.

Dalje, može se preferirati da se obe udaljenosti prednje ili zadnje strane nosaþa razlikuju, a naroþito da bude, na primer, 170 µm do poklopca komore (vrh zida komore) i, na primer, 150 µm do dna komore (dno zida komore). Varijacija zavisi od željenog gradijenta protoka na uzorku teþnosti.

Dalje je poželjno da se nosaþ preseþe uzdužno i da se fiksno priþvrsti na komoru za uzorke sa svih strana. Poželjno je da se uzdužne strane stežu izmeÿu dve ivice polu-oklopa, koja obrazuje komoru za uzorke i slobodni prostor ili slobodnu zapreminu iznad i ispod membrane. Takoÿe je poželjno da se jedna ili obe krajnje strane nosaþa nalaze u pozitivnom vodiþu, na primer umetak, kako bi se izbeglo proklizavanje nosaþa tokom sastavljanja kasete za testiranje i u cilju da se pojednostavi proizvodnja. Nosaþ se takoÿe može zalepiti na uzdužne boþne ili krajnje strane. Moguüa je i kombinacija stezanja i vezivanja. Ostale moguüe metode za uþvršüivanje nosaþa ukljuþuju oblikovanje ivica u polimernoj matrici, lepljenje rastvaraþa, ultrazvuþno i lasersko i termiþko zavarivanje, lasersko zavarivanje maskom, mehaniþko fiksiranje poput stezanja ili (plastiþnog) zakovica ili 3D tehnike štampanja koje ukljuþuju fiksaciju nosaþ se postiže oblikovanjem.

U sledeüem poželjnom primeru izvoÿenja ovog pronalaska, ureÿaj za testiranje sadrži, pored dve komore za uzorkovanje, treüu komoru, koja je fluidno povezana sa drugim otvorom druge komore za uzorke, i u koju se dodaju teþnosti (uzorkovana teþnost, teþnost za ispiranje, rastvori, itd.), jednom kada su protekle kroz dve komore za uzorke. Ova treüa (pomoüna) komora može biti snabdevena apsorbujuüim materijalom, na primer pamukom, pulpom, poliakrilatima ili funkcionalizovanim poliakrilatima na poznat naþin (videti na primer Sliku 3). Zapremina komore od najmanje 1,0 ml, posebno 5-10 ml, je poželjna.

U sledeüem poželjnom primeru izvoÿenja, treüa komora je povezana najmanje jednim otvorom ili ventilacijom sa spoljne strane kasete za testiranje, tako da se pod pritiskom kasete za testiranje može izjednaþiti pritisak. Naroþito je korisno obezbediti dodatnu þetvrtu komoru izmeÿu treüe komore i spoljašnje strane kasete za testiranje, tako da teþnost koja izlazi iz treüe komore i nastaje, na primer, kao rezultat punjenja kasete za testiranje prekomerno sa velikim koliþinama teþnosti ili sa velikim brzim punjenjem, se može sakupljati u dodatnu komoru i ne preüi spolja, gde bi nepoželjno, na primer, mogao da doÿe u kontakt sa korisnikom.

Prema tome, pronalazak se takoÿe odnosi na primer izvoÿenja, pri þemu je odliv iz druge komore za uzorke povezan kanalom u drugu komoru, pri þemu ova treüa komora

a) delimiþno sadrži upijajuüi materijal i

b) sadrži ventil, koji je poželjno obrazovan kao kanal i naroþito poželjno kao kanal sa najmanje jednim nagibom ili bar jednom drugom komorom.

Propuštanje testirane teþnosti može se takoÿe spreþiti sa odgovarajuüim polupropusnim membranama u drugoj komori, meÿutim ovo izvoÿenje je znatno skuplje za proizvodnju.

U sledeüem poželjnom primeru izvoÿenja, treüa komora - kontejner za otpad - je povezana kanalom za drugu komoru za uzorke. Kao rezultat, materijal koji se nalazi u kontejneru za otpad efikasno se izbegava izvlaþenjem kapilara.

Poželjni postupak za proizvodnju kasete za testiranje je lasersko zavarivanje komponenata brizganjem, pomoüu kojih se može ponoviti dovoljna preciznost. Iznenaÿujuüe, otkriveno je da je najprikladnija metoda u kojoj se koriste 3 sloja strukturiranih elemenata za injekciono oblikovanje - gornja polovina školjke, srednji deo, donja polovina školjke - izmeÿu kojih se pre svakog zavarivanja, delimiþno osiguranih udubljenja ili filma za rupe. Složenost proizvodnje se u poþetku þini veüa zbog dva filma i postupak je prema tome manje povoljan. Iznenaÿujuüe, meÿutim, složenost i preciznost injekcionih delova mogu se smanjiti ovom metodom. Naroþito je poželjna varijanta u kojoj su folije opremljene udubljenjima ili umetcima, koji olakšavaju fiksiranje nosaþa pre zavarivanja, ili rupama za omoguüavanje vertikalnih kanala.

Druga metoda za proizvodnju kasete za testiranje je 3D štampanje, koje je posebno pogodno za proizvodnju malih koliþina.

U sledeüem poželjnom primeru izvoÿenja ovog pronalaska, teþnost uzoraka se ne nanosi direktno na nosaþ, veü se stavlja u komoru za uzorkovanje pod primenom pritiska preko (uzorka) kanala u ureÿaju za testiranje ili je usisan pod vakuumom. U poželjnom primeru izvoÿenja, (uzorak) kanal je poravnat paralelno sa nosaþem ili u smeru gradijenta protoka koji se formira. Prema tome, pronalazak se takoÿe odnosi na postupak gde se uzorak teþnost unosi putem (uzorka) kanala u ureÿaju za ispitivanje u komori za uzorak sa pritiskom ili se usisava pod vakuumom, pri þemu se kanal za uzorak otvara u prvi otvor prve komore za uzorak (videti, na primer, Sliku 3) uzorak teþnost teþe kroz ovaj prvi otvor duž gradijenta protoka preko prednjeg dela nosaþa do drugog otvora udaljenog od nosaþa.

U poželjnom primeru izvoÿenja, na ulazu prve slobodne zapremine nalazi se difuzor, zbog þega nosaþ bolje teþe preko ivica.

U sledeüem poželjnom primeru izvoÿenja, nosaþ je priþvršüen na zid komore na takav naþin da zakrivljenost postoji ili nakon vlaženja teþnim taþkama prema gornjoj strani (videti Sliku 5).

Nadalje se daje prednost korišüenju zapremine ili zapremina rastvora koja je veüa od zapremine teþnosti koju nosaþ može da preuzme ili je veüa od ukupne zapremine nosaþa u vlažnom stanju (videti primere).

Gradijent protoka može da se stvori pomoüu pritiska, pri þemu se uzorkovana teþnost izlaže pritisku u komori za uzorke. Pogodni pritisak može se generisati ruþno, naroþito špricom, ampulom, ili mašinom, naroþito pumpom ili duvalicama.

Primerni gradijent protoka može se postiüi na sledeüi naþin:

Dovoljan pritisak je, na primer, 150 hPa preko komore, sa tipiþnom zapreminom uzorka od 95 µl ako je visina slobodne zapremine 320 µm, širina 3,5 mm, dužina 50,5 mm, a željeno vreme punjenja je 5s. Sa desetim vremenom punjenja, odn.0,5 s, potreban pritisak je oko 10 puta, odn.1500 hPa, pod inaþe identiþnim uslovima. Ako se na izlazni otvor pritisne vakuumom, vreme punjenja je najmanje 0,75 s pod inaþe identiþnim uslovima.

Sledeüa poželjna proseþna brzina protoka uzorkovane teþnosti u komori je 0,1 m/s, što se na primer može postiüi ruþno jednim špricom za jednokratnu upotrebu od 1000 µl sa 4 kanala i odgovara vremenu punjenja od 5 s (vidi primer).

Dalje, poželjno je da, na primer, u sluþaju da uzorkovana teþnost ima zapreminu od 95 µl, slobodna zapremina iznad nosaþa ima dužinu nosaþa od 50 mm i širinu od 3,5 mm, sa ukupnom visinom od 320 µm (dno komore do plafona komore), pri þemu je udaljenost od prve površine od plafona komore 170 µm, a udaljenost od druge površine do dna komore 150 µm.

Maksimalni nadpritisak ili negativni pritisak (vakuum) i protok komore za uzorke takoÿe treba da se dimenzioniše sa drugim dimenzijama komore za uzorke i nosaþa, tako da uzorkovana teþnosti doÿe do otvora za izlaz prema metodi pronalaska za manje od 5 sekundi, poželjno za manje od 2 sekunde.

Takoÿe je poželjno da je preþnik ulaznog otvora pri zadatoj zapremini uzorkovane teþnosti, npr.

95 µl je 0,3 mm, a otvor na izlazu je 1,2 mm, pri þemu je udaljenost na nosaþu pri zadatom protoku poželjno 50,5 mm. Ostale dimenzije mogu biti ekstrapolirati na osnovu sledeüih poželjnih primera izvoÿenja.

Stoga se u poželjnom primeru izvoÿenja pronalazak odnosi na optimizovanu komoru za uzorke sa ulazom uzorkovane teþnosti od 80-120 µl, pri þemu dužina nosaþa je 40-60 mm, širina nosaþa 2,0-5 mm, a preþnik dotoka 0,15 mm do 0,45, preþnik otvora 1 mm do 1,5 mm, ukupna visina komore za uzorke je od 260 µm do 450 µm.

Prema pronalasku, gradijent protoka se vodi antiparalelno na prvoj i drugoj površini nosaþa (videti Sl.1a (za poreÿenje) i 1b).

Prema pronalasku, metoda ispitivanja u kojoj se protok prvo vodi duž prednje strane nosaþa, vodi se drugim kanalom od prednje strane nosaþa do njegove zadnje strane i poslediþno se usmerava u suprotnom smeru do daljeg otvaranja druge slobodne zapremine (Slika 1b). Ovde protok nije podeljen, veü je tok usmeren duž obe strane nosaþa. Postoji mali rizik od nehomogenosti protoka pri bifurkaciji. Pored toga, pri istoj zapremini komore za uzorak, protok rastvora je dvostruko veüi nego u primeru sa istim protokom smera. Uz istu zapreminu teþnosti koja se koristi, postiže se i bolji efekat ispiranja zbog veüeg protoka. Obezbeÿen je metod testiranja za detekciju najmanje jednog analita dobijenog iz uzorkovane teþnosti, koja se sastoji od dve komore za uzorke, koje su po moguünosti razdvojene nosaþem koji je delimiþno providan za uzorkovanu teþnost i koji se sastoji od najmanje dve površine, gde je prednji deo nosaþa okrenut prema prvoj komori za uzorke, a zadnja strana nosaþ je okrenuta prema drugoj komori za uzorke, i

a) najmanje jedan molekul receptora je fiksiran na prednjoj strani nosaþa,

b) najmanje jedna slobodna zapremina formirana je iznad prednje i zadnje strane nosaþa, koja je ograniþena zidom komore,

c) uzorkovana teþnost je podeljena u komoru za uzorke preko kanala koji se grana u dva kanala, pri þemu svaki vodi u jednu od dve komore za uzorke, pri þemu teþnost uzoraka teþe kroz odgovarajuüi prvi otvor duž odgovarajuüeg gradijenta protoka preko prednje i zadnje strane nosaþa u drugi otvor udaljen od nosaþa,

d) odgovarajuüe drugo otvaranje komora za uzorke spaja se u najmanje jedan kanal, što omoguüava odliv iz komora za uzorke,

e) slobodne zapremine iz b.) su barem delimiþno formirane sa teþnom kolonom,

f) gde se gradijent protoka odvija duž prednjeg i zadnjeg dela nosaþa pomoüu pritiska i uvlaþi teþnu kolonu iz e.).

U još jednom poželjnom primeru izvoÿenja, više komora za uzorke (npr.1 do 10) može se povezati paralelno i napajati se iz uzorka kanala (vidi Sliku 2).

Stoga se pronalazak odnosi na metod gde se više komora za uzorke snabdeva paralelno iz kanala uzorka sa najmanje jednom uzorkovanom teþnošüu.

U obimu ovog pronalaska, termin "molekul receptora" oznaþava supstance kao što su peptidi, proteini, nukleinske kiseline, enzimi, ligandi, receptori, antitela ili antigeni, DNK, RNA, PNA, takoÿe molekuli ne-biohemijskog porekla, poput sintetskih molekula. Reagensi za testiranje mogu da sadrže kombinacije ovih vrsta molekula ili njihove fragmente, konjugate, modifikovane, kao što su glikovani ili fosforilirani oblici. Prema pronalasku su takoÿe ukljuþeni lipidi i šeüeri. Dalje, prirodni proizvodi i prirodni ekstrakti mogu biti prisutni u reagensima za testiranje, kao što je þesto sluþaj u alergijskim testovima ili testovima intolerancije na hranu. Najmanje jedan molekul receptora veže se sa najmanje jednim analitom iz uzorkovane teþnosti. Prema tome, pronalazak se takoÿe odnosi na ispitivanje vezivanja, pri þemu se naroþito ponovljivi rezultati mogu dobiti uz pomoü metode prema pronalasku.

U cilju ovog pronalaska, nosaþ se sastoji od þvrstog materijala, koji ima prvu i drugu površinu, u celini ili delimiþno od gelaste, porozne, sliþno situ, propusne ili polupropusne membrane, dijalizne membrane, naroþito obložene ili neprevuþene membranu. Na primer, kao što su nitroceluloza, PVDF, zeolit, sinterisani materijali, posebno polietilen oksid, i materijali naknadno snabdeveni sa mikrokanalima, kao što je silicijum, staklo ili plastika, koji su napravljeni propusnim sa laserskim bušenjem, bombardovanjem jona ili gravura. Nosaþ može biti obložen, na primer proteinima, posebno antitelima, šeüerima kao što je dekstran, ili sa metalima, staklom ili plastikom, ili derivatima ugljenika kao što su ugljene nanocevke.

U cilju ovog pronalaska izraz "nosaþ je delimiþno propusan za uzorkovanu teþnost" oznaþava da uzorkovana teþnost bar vlaži nosaþ, a uzorkovana teþnost je delimiþno adsorbovana najmanje u nosaþu. Moguþnost da mala koliþina uzorkovane teþnosti proÿe kroz takoÿe nije iskljuþen. Zbog toga su u ovom pronalasku membrane poželjne i komercijalno su dostupne.

Nosaþ može naroþito da ima dve ravni-paralene ili približno ravne paralelne površine, koje prema pronalasku formiraju prednju i zadnju stranu. Naroþito, nosaþ može biti u obliku membrane ili ravne šipke. Nosaþi mogu formirati detekciona mesta i mogu biti obezbeÿeni sa molekulima receptora (test reagensi).

Jedan ili više molekula receptora su fiksirani na prvoj površini nosaþa. Pored toga, najmanje jedan molekul receptora može biti fiksiran na drugoj površini nosaþa. Kao što je opisano, molekuli receptora se takoÿe mogu fiksirati u sloju ispod prve ili druge površine. Na primer, molekuli receptora mogu se sušiti na ili u blizini površine, bilo sami ili u stabilizujuüem matriksu, ili se mogu naneti kao liofilizat i rastvaraüe se sa površine rokom vlaženja. Fiksacija se može dalje izvršiti upotrebom nekovalentnih interakcija, kao što su izmeÿu antitela i proteina A, izmeÿu biotina i streptavidina, izmeÿu heksa-histidina i nikla-NTA ili u baznom uparivanju DNK. Dalje, element molekula receptora može biti kovalentno vezan na prvu površinu. U poželjnom primeru izvoÿenja, molekul receptora ostaje fiksiran pri vlaženju na prvoj površini, naroþito više od 50%.

Uzorkovana teþnost u cilju ovog pronalaska može biti bilo koja supstanca ili smeša supstanci, ako je pogodno, ukljuþujuüi rastvaraþ, bilo kog porekla, ali po moguünosti biološka teþnost. Konkretno, teþnost u uzorku može da potiþe od biljke ili životinje, posebno od sisara, naroþito od þoveka. Na primer, uzorkovana teþnost može biti neizrecivo: krv, polu krv, serum, pljuvaþka,

1

suza, mokraüa, sekrecija, cerebralna teþnost ili preraÿeni oblici takvih teþnosti ili teþnosti koji sadrže ove gore pomenute teþnosti. Uzorkovana teþnost se takoÿe može razblažiti.

Uzorkovana teþnost sadrži najmanje jedan analit koji je adresiran na najmanje jedan molekul receptora ili izaziva detekciju koja se može detektirati.

Uzorkovana teþnost može dalje da sadrži reagense kao što su ligandi, konkurenti, antitela, posebno antitela konjugovana na digokigenin, na koja se do 100 anti-digoksigenin antitela mogu vezati kao sekundarna antitela da bi pojaþali signal, ili obeležena antitela, enzimi ili enzimski supstrati , naroþito one koje izazivaju promenu boje ili luminescenciju, i mogu sadržati drugu organsku teþnost uzorka koja sadrži, na primer, drugo antitelo i izaziva promenu boje u drugoj boji.

Dalje, uzorkovana teþnost može da sadrži stabilizatore ili antikoagulante kao što su EDTA, heparin ili citrat.

Dalje rastvor može dalje da sadrži deterdžente, hvatajuüe molekule za vezivanje slobodnih supstanci koje se ne vezuju za molekul receptora, ili inhibitore enzima, tako da je rastvor pogodan za ispiranje ili zaustavljanje reakcije.

Rastvor može da sadrži dvostruko destilovanu, destilovanu ili vodu iz slavine sa ili bez dodatnih supstanci, a voda može da se dodatno propusti kroz jonski izmenjivaþ. Dalje, rastvor može da sadrži uobiþajene puferne komponente za stabilizaciju pH vrednosti ili za stabilizovanje komponenata uzorkovane teþnosti.

Komora za uzorak je šupljina u kojoj se nalazi nosaþ, i sadrži oba otvora (ulaz, izlaz). Komora za uzorke može imati optimizovan oblik za ruþno rukovanje, na primer u obliku ravnog kuboida, koji se može držati u jednoj ruci. Poželjno, kuboid je debljine manje od 1 cm. Teþnosti se mogu uzastopno ubrizgati u komoru za uzorke pomoüu šprica sa drugom rukom. Gornja strana komore za uzorke može sadržati providan poklopac, koji oslobaÿa pogled barem na delove nosaþa i omoguüava brzu vizuelnu procenu testa u skladu sa metodom prema pronalasku. Dalje, komora za uzorke može biti dizajnirana tako da se može postaviti u ureÿaj za þitanje koji sadrži ureÿaje za punjenje komore za uzorke ili za þitanje testova. Ureÿaji ove vrste, posebno u minijaturizovanom obliku, mogu se integrisati u dodatno kuüište ili sliþno.

Pritisak sa kojim uzorkovana teþnost teþe kroz otvor u komori za uzorke može pogodno da se generiše ruþno pomoüu špriceva, pri þemu špric poželjno ima zapreminu koja nije manja od jedne desetine i nije viša od deset puta veüe od zapremine komore za uzorke. Pored toga, poželjno je da špric ima Luer vezu. Pomoüu šprica, teþnosti se najpre mogu izvuüi a potom ubrizgati u komoru za uzorke.

Špricom za generisanje pritiska takoÿe se može upravljati sa pumpom za špriceve. Ovde je povoljno da se pritisak može graditi uniformno i na reprodukovan naþin. U ovom primeru izvoÿenja, pogodan je spojnik creva izmeÿu pumpe za šprice i komore za uzorak, þiji se kraj kasete može oblikovati kao Luer spoj. Pored toga, može biti poželjno da se ventil obezbedi na najmanje dva naþina, tako da se reagensi/uzorkovana teþnost mogu izvuüi iz jednog ili više kontejnera za skladištenje i potom dostaviti u komoru za uzorke.

Pritisak se takoÿe može generisati ruþno ili mehaniþki na neki drugi naþin, na primer, skladištenjem reagensa/uzorkovane teþnosti u kompresovanoj i zatvorenoj posudi za skladištenje. Otvor može biti povoljan sa Luer adapterom. Ruþnim pritiskom na spremnik testirani rastvor prolazi iz rezervoara u komoru za uzorke. Pritisak na rezervoaru se može stvoriti i mašinom, na primer pritiskom na klip, polugu ili ureÿaj za utiskivanje na skladištu, koji se zauzvrat može pokretati motorom, pneumatski ili hidrauliþno. U svim metodama i ureÿajima, pritisak može da se pojavi kao nadpritisak preko ulaznog otvora ili kao negativan pritisak na izlaznom otvoru.

Kontejner za skladištenje može biti dizajniran za jednokratnu upotrebu u vidu mehura ili blistera, posebno u unapred ispunjenom i zatvorenom obliku. Mehurovi ili blisteri napravljeni od plastike ili folije, naroþito pojedinaþne ampule, su povoljni. Poželjno je da se u kasetu za testiranje ugraÿuju blisteri ili ampule za jednokratnu upotrebu tako da se zajedno prave u istom proizvodnom ciklusu i rezervoari se prethodno napune u drugom koraku.

U sledeüem poželjnom primeru izvoÿenja ovog pronalaska koristi se pumpa koja pumpa rastvore/uzorkovane teþnosti i na taj naþin ih dovodi u komoru za uzorke. Pumpa može biti postavljena izmeÿu rezervoara i komore za uzorke, i može direktno pumpati rastvore/uzorkovane teþnosti, ili može ispumpati vazduh ili teþnosti u kontejner za skladištenje sa dva otvora, tako da se teþnost iz njega premešta i pumpa u komoru za uzorke. Dalje, može se predvideti upotreba pumpe koja može pumpati napred-nazad, te koristiti ventil koji ima najmanje dve putanje, tako da reagensi za testiranje mogu biti ispumpani iz jednog ili više rezervoara i nakon toga isporuþeni u komoru za uzorke. Pumpa se takoÿe može nalaziti iza komore za uzorke i može stvarati negativan pritisak u komori za uzorke, tako da se teþnost iz kompresovanog kontejnera za skladištenje, koji se nalazi ispred komore za uzorak, usisava vakuumom u komoru za uzorke i po potrebi dalje usisava u kontejner za otpad. Posebna prednost u ovom primeru izvoÿenja je ta što pumpa nije kontaminirana ni jednim rastvorom/ uzorakovanom teþnosti i zbog toga se može koristiti bez daljeg preþišüavanja. Posebno su pogodne mikropumpe poput O-run 100 ili O-run 200 kompanije PARItec GmbH, Grafelfing, Nemaþka. Pored toga, posebno su pogodne dijafragmne pumpe i mikromembranske pumpe, peristaltiþke pumpe i gerotorne pumpe.

Teþnost, koja može biti uzorkovana teþnost ili rastvor, teþe u komoru za uzorke sa komponentom protoka paralelno sa prvom i drugom površinom nosaþa. Ako je u teþnosti prisutan analit koji se može vezati za bar jedan molekul receptora, to je moguüe þim se teþnost dovede u kontakt sa receptorskim molekulom. U ovom sluþaju, može biti poželjnije da se pritisak nakon ubrizgavanja teþnosti otpusti do približno atmosferskog pritiska, tako da teþnosti koje su locirane na nosaþu, više ne mogu ili teško teku i mogu da inkubiraju i vezuju receptorske molekule i analiziraju bez dodavanja nove teþnosti. Dalje, može biti poželjno da se odnos pritiska neko vreme obrne, tako da se teþnost kreüe u obrnutom smeru, ili da izmeni uslove pritiska neko vreme, tako da se teþnost pomera napred-nazad preko nosaþa. Dakle, u poreÿenju sa teþnošüu koja ne teþe, bolji prenos mase izmeÿu teþnosti i nosaþa je moguü bez potrebe za više teþnosti.

Za ispiranje nosaþa može se koristiti druga teþnost/rastvor. Takoÿe, kada se ispira, može biti poželjno da se teþnost ostavi nepomiþna ili blago pomerena preko nosaþa neko vreme kako bi se upravljalo sa manjim koliþinama teþnosti. Takoÿe tokom ispiranja, pritisak se može naizmeniþno primenjivati.

Iznenaÿujuüe je da testni protokol, kakav je opisan u Primeru 1, može dati rezultate koji se mogu oþitati lako golim okom, kao što su, na primer, testovi boþnog protoka koji su poznati iz stanja tehnike. Iako u testu boþnog protoka, teþnosti teku kroz kapilarne sile kroz nosaþ i paralelno sa njenim površinama, i tako preko molekula receptora ili þak kroz polja testiranja/ detekcije.

Prednost metode prema pronalasku je i u tome što ne pati od unakrsnog razgovora, što se može javiti tokom ispitivanja boþnog protoka, kada su dva molekula receptora smeštena na razliþitim testnim poljima vezani za isti analit.

U metodi prema pronalasku, protok teþnosti preko nosaþa se odvija dovoljno brzo, tako da se ne dovodi do iscrpljivanja vrednosti analita iz teþnosti nakon dodira sa prvim reagensom za testiranje i nema uticaja na interakciju sa drugim molekulom receptora.

1

Još jedna prednost metode prema pronalasku je ta što se nekoliko teþnosti može uzastopno dodavati jednostavno, u proizvoljnim vremenskim intervalima i gotovo bez mešanja. S druge strane, u testu boþnog protoka postoji moguünost samo sa ograniþenjima, jer se teþnost negativno pomera samo kapilarnim delovanjem trake za testiranje ili štapiüa. Jednom kada se nanese, teþnost se neprekidno kreüe u pravcu još ne mokrog nosaþa ili šipki. Takoÿe je karakteristiþno za kapilarno dejstvo da teþnosti koje se primenjuju na nosaþ u isto vreme ili sukcesivno teku jedna u drugu i mešaju se zajedno. Kao rezultat toga, vrlo osetljive metode enzimskog testiranja, gde se želi poboljšati signal, na primer, putem peroksidaze hrena ili alkalne fosfataze, mogu se ograniþiti, na primer, sušenjem. U stvari, komercijalno dostupni testovi lateralnog protoka zasnivaju se iskljuþivo na protokolima ispitivanja koji ne ukljuþuju enzimski korak i u koji se ne dodaje više od jednog teþnog reagensa u uzorak.

Takoÿe postoje prednosti u odnosu na otvorene testove u kojima se rastvori za testiranje nalaze u supernatantu preko membrane. U ovim testovima, slobodna ili fiksirana membrana se ruþno trese u posudu, kao što je sluþaj u EP 1718970 od strane podnosioca zahteva, ili se tava neprekidno meša mehaniþkom tresilicom ili elektriþnom tresilicom. Trešenjem, pokret supernatanta se indukuje u odnosu na membranu i na taj naþin se dobija poboljšani prenos mase za reakciju vezivanja - kao i za reakciju ispiranja, što dovodi do sliþnih rezultata kao i oni dobijeni sa metodom iz pronalaska. Prednosti zatvorene strukture su spreþavanje kontaminacije uzorka, zaštita korisnika od prskanja i kontakta sa uzorkovanom teþnošüu i nezavisnost radnih parametara kao što su frekvencija tresenja tresalice. Stoga se obnovljivost poboljšava metodama prema pronalasku.

Takoÿe je iznenaÿujuüe da su rezultati znatno bolji kada obe površine nosaþa doÿu u dodir sa teþnostima. To je iznenaÿujuüe jer u oba sluþaja druga površina dolazi u dodir sa proporcionalno sliþnim protocima, koliþinama supstanci i koncentracijama teþnosti za testiranje, reagensa i teþnosti za ispiranje. Meÿutim, kod eksperimentalnog poreÿenja, opaža se znatno lošiji efekat ispiranja kada je druga ili zadnja strana nosaþa priþvršüena za dno šupljine.

Rezultat testa se može oþitati pomoüu kasete sa prozirnim poklopcem pomoüu koje se mogu uoþiti reagensi za testiranje i vizuelno oþitati vrednost boje ili promene sive boje. Ovaj raspored takoÿe omoguüava fotometrijsko oþitavanje metode ispitivanja, naroþito kada se koristi optika koja mapira rezultat testa na senzor slike. Poželjno, ovaj slikovni senzor je CCD ili CMOS senzor. Posebno ekonomiþna, ipak efikasna su i optiþki sistemi od strane potrošaþe, poput onih koja se koriste u fotoaparatima, web kamerama i mobilnim telefonima. U testu promene boje ili promene fluorescencije može biti poželjnije da se koristiti filter boja ili senzor u boji sa fotosenzorima osetljivim na boju. Kada se koristiti fluorescencija, pobuÿivanje fluorescencije može se izvršiti pomoüu lampe, lasera ili LED.

U sledeüem primeru izvoÿenja koriste se oþitane metode elektrohemijske detekcije, poput onih koje su uglavnom razvijene poslednjih godina za dijagnostiþke metode, kao što je Dionex ED 40 Uputstvo za upotrebu elektriþnog detektora, http://www.dionex.com/en-us/webdocs/4529-34855-03.pdf, Gau, V. et al. ""Oral Fluid Nanosensor Test (OFNASET)with Advanced Electrochemical-Based Molecular Analysis Platform", Ann. N.Y. Acad. Sci.1098: 401-410 (2007) doi: 10.1196/annals.1384.005. Wood, M. et al. "eSensor®: An Electrochemical Detection Based DNA Microarray Technology for Multiplexed Molecular Diagnostics" Abstracts of the 219th meeting of the Electrochemical Society (ECS) May 1, 2011 - May 6, 2011, Montreal, QC, Kanada.

Takoÿe je otkrivena upotreba kompleta koji se sastoji od sistema za testiranje koji ima dve komore za uzorke razdvojene nosaþem koji ima najmanje dve površine, koji sadrži komoru za uzorke koja sadrži nosaþ zajedno sa fiksnim molekulima receptora za obavljanje testa vezivanja sa ulazom i izlazom. Vrh komore i dno komore obrazuju slobodan prostor, ako je potrebno. Druga sekundarna komora, koja je fluidno povezana sa komorom za uzorke, ukljuþujuüi sredstvo za pritisak i druge pomoüne i aditive, kao što je rastvor za zaustavljanje, rastvor za pranje itd. Dalja rešenja se mogu obezbediti kao u gornjem sistemu testiranja/metodi.

Pronalazak se, naroþito, odnosi na upotrebu takvog generiþkog kompleta za otkrivanje najmanje jednog analita iz uzorkovane teþnosti in vitro metodom testiranja iz pronalaska, koji sadrži ureÿaj koji sadrži dve komore za uzorke odvojene nosaþem koji ima najmanje dve površine, pri þemu je prednja strana nosaþa okrenuta prema prvoj komori za uzorke a zadnja strana nosaþa je okrenuta prema drugoj komori za uzorak, i

a) najmanje jedan molekul receptora je fiksiran na prednjoj strani nosaþa,

b) najmanje jedna slobodna zapremina formirana je iznad prednje i zadnje strane nosaþa, koja je ograniþena zidom komore,

c) prva komora za uzorke ima najmanje dva otvora, pri þemu teþnost za uzorak teþe kroz prvi otvor duž gradijenta protoka preko prednje strane nosaþa do drugog otvora udaljenog od nosaþa,

d) druga komora za uzorke ima najmanje dva otvora, pri þemu teþnost za uzorak iz prve komore za uzorke teþe kroz prvi otvor duž gradijenta protoka preko zadnjeg dela nosaþa i u suprotnom smeru od toka na prednjem delu nosaþa do drugog otvora,

e) drugo otvaranje prve komore za uzorak i prvo otvaranje druge komore za uzorak meÿusobno su povezani kanalom, þiji je kanal manjeg preþnika od preþnika komore za uzorak ili slobodnog

1

zapremine, i pri þemu cela uzorkovana teþnost izmeÿu dve komore za uzorak prolazi kroz kanal izmeÿu zida komore za uzorke,

f) drugo otvaranje druge komore za uzorak omoguüava odliv teþnosti,

g) da su slobodne zapremine iz b.) formirane barem delimiþno sa kolonom teþnosti,

h) gde se gradijent protoka odvija duž prednjeg i zadnjeg dela nosaþa pomoüu pritiska i na koloni teþnosti g.) pri þemu bar jedan molekul receptora veže bar jedan analit iz teþnosti uzorka.

Naroþito, pronalazak se odnosi na takav generiþki komplet za detekciju najmanje jednog analita iz uzorkovane teþnosti koji sadrži dve komore za uzorke koje su odvojene nosaþem koji ima najmanje dve površine, pri þemu prednja stranu nosaþa je usmerena prema prvoj komori za uzorak, a zadnja stranu nosaþa je usmerena prema drugoj komori za uzorke, i

a) najmanje jedan molekul receptora je fiksiran na prednjoj strani nosaþa,

b) najmanje jedna slobodna zapremina formirana je iznad prednje i zadnje strane nosaþa, koja je ograniþena zidom komore,

c) uzorkovana teþnost se distribuira u komore za uzorke preko kanala koji se razdvajaju u dva kanala, pri þemu svaki vodi u jednu od dve komore za uzorke, pri þemu uzorkovana teþnost teþe kroz odgovarajuüi prvi otvor duž odgovarajuüeg gradijenta protoka preko prednje i zadnje strane nosaþa do drugog otvora udaljenog od nosaþa,

d) odgovarajuüe drugo otvaranje komora za uzorke se stapa u najmanje jedan kanal, što omoguüava odliv iz komora za uzorke,

e) slobodne zapremine iz b.) su barem delimiþno formirane teþnom kolonom,

f) gde se gradijent protoka odvija duž prednjeg i zadnjeg dela nosaþa pomoüu pritiska i unosi kolonu teþnosti iz e.).

Drugi cilj ovog pronalaska odnosi se na upotrebu metode ili kompleta za otkrivanje najmanje jednog analita (supstanci) iz uzorkovane teþnosti kod þoveka, veterinarskoj medicini ili dijagnostici biljaka, dijagnostici hrane, dijagnostici životne sredine, forenziþka dijagnostika, farmakologija, toksikologija, alergija, autoimune ili metaboliþke bolesti, zarazne bolesti, seksualno prenosive bolesti, intolerancije na hranu, parazitske bolesti, odreÿivanje malih molekula kao što su lekovi, lekovi ili metaboliti, üelijski posrednici, tipizacija tkiva, tipizacija vrsta, tipizacija hrane, tipizacija antigenima, epitoptipiranje i otkrivanje DNK ili RNK.

Naroþito je poželjna upotreba metode ili sistema testiranja (ureÿaja) u podruþju Point-of-Care.

Primeri i Slike

1

Ovi primeri služe su samo za objašnjenje.

Primer 1

Test Protokol za Testiranje Alergije

Priprema

Dovesti kutiju za testiranje sa epruvetom i kasetom za testiranje (komplet koji sadrži komoru za uzorke) i takoÿe uzorak pacijenta na sobnu temperaturu (18-25 °C).

Pripremiti tajmer, rukavice za jednokratnu upotrebu, kantu za þvrsti otpad i olovku.

Izvaditi kasetu za testiranje i špric.

Sve inkubacije se rade na sobnoj temperaturi.

U kutiju za testiranje (komplet) ubaciti epruvete bilo unapred ili sukcesivno u toku testiranja vertikalno u odgovarajuüe obojene držeüe ureÿaja na gornjoj ivici kutije.

1.1. Unošenej Uzorka

Otvoriti epruvetu (crveni poklopac) sa prethodno uvedenim uzorkom i pomoüu šprice preneti sadržaj u kasetu za testiranje u potpunosti i bez mehuriüa. Umetnuti špric u otvor za uzorke i brzo ubrizgati sadržaj.

Postaviti kasetu za testiranje na ravnu površinu i inkubirati 4 minute.

1.2. Dodavanje Rastvora za Testiranje

Kao što je prethodno opisano (odeljak 10.1.), brzo ubrizgati sadržaj rastvora konjugata (žuti poklopac) u ulaz kasete za testiranje uz pomoüu šprica i inkubirati 8 minuta.

1.3. Ispiranje

Otvoriti prvu epruvetu sa rastvorom za pranje (plavi poklopac) i brzo ubrizgati sadržaj u otvor kasete za testiranje kao što je gore opisano. Odmah nakon toga, sadržaj druge epruvete brzo ubrizgati rastvorom za pranje (plavi poklopac). Nije potrebna inkubacija.

1.4. Razvoj

1

Otvoriti prvu epruvetu sa obojenim supstratom (beli poklopac) i brzo ubrizgati sadržaj u ulaz kasete za testiranje. Odmah nakon toga, otvoriti drugu epruvetu sa supstratom u boji (beli poklopac), ubrizgati sadržaj bez mehuriüa u dovod kasete za testiranje i inkubirati 8 minuta. Tokom razvoja su u svakom testnom polju vidljiva 2 paralelna referentna hoda razliþitog intenziteta i opciono dodatno centralni ispitni hod.

1.5. Zaustavljanje

Otvoriti epruvetu sa rastvorom za zaustavljanje (zeleni poklopac) i ubrizgati sadržaj u ulaznu kasetu za testiranje. Napomena: Rezultati testiranja su stabilni najmanje 12 sati i mogu se þitati tokom tog vremena.

Primer 2

Komora za testiranje (Komora sa Uzorkom)

U nastavku su date dimenzije za membranu i njene udaljenosti od ostalih elemenata ureÿaja. Treba imati na umu da su date sve dimenzije za suvo stanje membrane i da se moguüi otkloni membrane ili nepravilnosti na površini ili eventualno izobliþenje injekciono oblikovanih delova ne uzimaju u obzir. U vlažnom stanju membrana može nateüi ili saviti i na taj naþin imati izmenjenu debljinu i promene udaljenosti od drugih komponenti.

(Ojaþana) nitrocelulozna membrana debljine 140 mm iseþena je na dimenziju od 50,5 mm x 6,3 mm. Rezultirajuüa membranska traka postavljena je na udubljenu foliju tako da traka u potpunosti prekriva udubljenje i steže se na krajnjim stranama ispod odgovarajuüeg jeziþka koji se nalazi na prednjim krajevima udubljenja u foliji. Film se steže membranskom trakom izmeÿu dve injekciono oblikovane polovine, koje sa filmom i membranskom trakom formiraju obe komore za uzorke prema fig.1b i 2, þija je širina 3,5 mm. Ukupna zapremina membrane je, stoga 44,5 µl, a slobodna membrana je 24,7 µl. Udaljenost membranskog vrha do suštinski ravne unutrašnje strane gornjeg zida komore je 170 pm, od dna membrane do suštinski ravnog donjeg dela komore polovine omotaþa je 150 µm. Zapremina gornje komore je 30,04 µl, a donje 26,51 µl. Popreþni presek nestegnutog dela membrane je 0,49 mm<2>, a komore je 1,62 mm<2>.

Komora je opremljena ulaznim otvorom u prvoj komori za uzorke blizu jednog kraja membrane sa presekom od 0,3 mm<2>, i izlaznim otvorom u drugoj komori za uzorke u blizini membrane sa presekom od 1,2 mm<2>.

1

U testnom ureÿaju 4 x 2 komore su projektovane paralelno, tako da je ukupna zapremina membrana 98,98 µl, u odnosu na prve komore bez ulaza i izlaza 120,19 µl, a na drugu komoru 106,05 µl punjenje sa jednim pristupom (uzorak kanala), koje se navija u 4 kanala, od kojih je svaki povezan u prvu komoru. Izlazni otvori se, zauzvrat, spajaju u jedan kanal, koji je spojen na koliþinu otpada integrisanu u test ureÿaj, u koji se nalazi upijajuüi materijal. Upijajuüi materijal je fluidno povezan bez membrane, tako da je usisavanje ograniþeno na slobodnu teþnost koja ulazi u otpad. Testni ureÿaj ima prozore kroz koje se mogu posmatrati podruþja trake za testiranje optereüene reagensom.

Na kaseti za testiranje zalepljena je neprozirna i udubljena folija. Udubljenja služe kao prozori, kroz svaki od ovih prozora merna polja se mogu videti sa svakim alergenom ili oþitati optiþkim þitaþem. Ploþe izmeÿu prozora, koje se pružaju uz nosaþ, drže se što je moguüe usko, na primer 2 mm ili manje. Mreže okomite na njih, od nosaþa do nosaþa su šire, tako da postoji dovoljno prostora za štampane informacije o pojedinim mernim poljima. Ove informacije mogu da sadrže brojeve, skraüenice slova ili ceo pojam, na primer pojam koji oznaþava alergen.

Tokom testa, sledeüe supstance i koliþine se dodaju testnom ureÿaju u skladu sa Protokolom 1:

1) Uzorak, ukljuþujuüi razblaživaþem uzorka 380 µl

2) pufer za pranje 1.000 µl

3) Rastvor supstrata po proceduri (ispiranje dva puta) 2 * 800 µl

4) rastvor antitela/konjugata 1 800 µl

5) rastvor antitela/konjugata 2 800 µl

Zapremina svake pojedinaþne test komponente je veüa od zapremine membrane (100 µl).

Opis slika:

Fig. 1a: Uzdužni presek kroz ispitnu kasetu sa dve komore za uzorke, u kojima se teþnost na obe površine nosaþa (1) - prednja i zadnja - u toku (3) vode paralelno jedna prema drugoj. Kaseta se podvrgava pritisku kroz ulazni otvor (5), tako da teþnost teþe odatle do izlaznog otvora i odatle kroz drugi kanal do otpada (4) (sekundarna komora (supra)) (uporedni primer).

Fig. 1b: Prikazuje uzdužni presek kroz komoru za uzorke, u kojoj teþnost na kraju nosaþa (1) teþe kroz dalji kanal i vodi se prema stražnjoj strani nosaþa i teþe na drugoj površini (naliþju sa suprotne strane), paralelno sa prvom površinom.

1

Fig. 2: Pogled odozgo na komoru za uzorke. Nekoliko nosaþa može biti postavljeno paralelno u kaseti. U tu svrhu se protok može podeliti ili nosaþi postaviti zajedno u šupljinu.

Fig. 3: Detaljan uzdužni presek primernog izvoÿenja, nije prikazano skaliranja. Rastvori se uvode kroz otvor (5) na ulazu i protok (3) preko prednjeg dela fiksnog nosaþa (1), na kome se nalaze reagensi za testiranje (2). Odatle, rastvori prolaze do zadnjeg dela nosaþa preko drugog kanala na drugom kraju nosaþa i teku kroz ovo prema izlaznom otvoru. Dodatni kanal usmerava teþnosti ka otpadu (4), koji poželjno sadrži upijajuüi materijal. Komora za otpad povezana je kroz ventilacioni otvor sa spoljnim svetom. Ovaj ventilacioni otvor može biti opremljen pregradama i drugim komorama da se spreþi curenje otpada.

Fig. 4: Imunološki test sa tri identiþne membrane kao þvrsta faza, izveden istovremeno u skladu sa protokolom iz Primera 1. U trakama 1 i 2, teþnost teþi preko membrana iz obe strane, a u traci 3 teþnost teþe samo preko gornje strane. U svim trakama korišüeni su identiþni reagensi i zapremine.

Fig. 5: Prikazuje uzdužni presek kao eksplodirani prikaz da bi prikazao slojevitu strukturu kasete za testiranje. Filmovi su smešteni u svakom sluþaju izmeÿu injekciono oblikovanih delova, koji je providan u nekim regijama, u obliku injekcionog premaza i istog centralnog dela u kalupu za ubrizgavanje. Laser je zavaren kroz polovinu omotaþa kroz foliju za polovinu omotaþa i srednjeg dela, i takoÿe polovinom omotaþa i srednjeg dela.

Fig. 6: Detaljan pogled odozdo na nosaþu, a ne kroz skalu. Nosaþ se steže ispod završnih jeziþaka folije i prekriva udubljenje na foliji.

Fig. 7: Uzdužni presek kroz kasetu za testiranje, a ne za skaliranje. Nosaþ je fiksiran na ivicama komora za uzorke. Moguüa zakrivljenost nosaþa u popreþnom smeru je uveliko preuveliþena. Ako zakrivljenost postoji ili nastaje nakon vlaženja, nosaþ je poželjno umetnut tako da se zakrivljenost formira prema prednjem delu.

2

Claims (16)

Patentni zahtevi

1. In vitro metoda testiranja za detektovanje najmanje jednog analita uzorkovane teþnosti, pri þemu se koristi ureÿaj koji sadrži dve komore za uzorke, koje su razdvojene nosaþem koji ima najmanje dve površine, prednju stranu nosaþa usmerenu ka prvoj komori za uzorke i zadnju stranu nosaþa usmerenu ka drugoj komori za uzorke, i

a) najmanje jedan molekul receptora je fiksiran na prednjoj strani nosaþa;

b) najmanje jedna odgovarajuüa slobodna zapremina je formirana preko prednje i zadnje strane nosaþa i ograniþena je zidom komore;

c) prva komora za uzorke ima najmanje dva otvora, pri þemu uzorkovana teþnost teþe kroz prvi otvor duž gradijenta protoka preko prednje strane nosaþa do drugog otvora razmaknutog od nosaþa;

d) druga komora za uzorke ima najmanje dva otvora, pri þemu uzorkovana teþnost teþe kroz prvi otvor iz prve komore za uzorke duž gradijenta protoka preko zadnje strane nosaþa i u pravcu suprotnom od toka na prednjoj strani nosaþ do drugog otvora;

e) drugo otvaranje prve komore za uzorak i prvo otvaranje druge komore za uzorak meÿusobno su povezani kanalom, pri þemu je ovaj kanal manjeg preþnika od preþnika komore za uzorke ili slobodne zapremine, i gde je ceo uzorak protok teþnosti teþe izmeÿu dve komore za uzorak kroz kanal izmeÿu komora za uzorke;

f) drugo otvaranje druge komore za uzorke omoguüava pražnjenje teþnosti;

g) da su slobodne zapremine iz b.) formirane barem delimiþno sa kolonom teþnosti, h) pri þemu je gradijent protoka duž prednje i zadnje strane nosaþa obezbeÿen korišüenjem pritiska i uvlaþi kolonu teþnosti iz g.), pri þemu se bar jedan molekul receptora vezuje na najmanje jedan analit iz teþnosti uzorka.

2. Metod testiranja za detektovanje najmanje jednog analita iz uzorkovane teþnosti prema zahtevu 1, koji sadrži dve komore za uzorke, koje su razdvojene nosaþem koji ima najmanje dve površine, pri þemu je nosaþ delimiþno propusan za uzorkovanu teþnost.

3. Metod testiranja prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri þemu kanal okružuje priþvrsni element, naroþito popreþni potporni nosaþ, nosaþa i ima okrugli otvor.

4. Metod testiranja prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri þemu je pražnjenje iz druge komore za uzorak povezano kanalom sa drugom komoru, pri þemu ta treüa komora a) delimiþno sadrži upijajuüi materijal i

b) sadrži ventilacionotvor, koji je poželjno oblikovan kao kanal i naroþito poželjno kao kanal sa najmanje jednim zavojem ili bar jednom daljom komorom.

5. Metod testiranja prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri þemu je kaseta za testiranje sastavljena od tri komponente proizvedene injekcionim modeliranjem, a to su polovica, srednji deo i polovica, pri þemu je najmanje jedna folija smeštena izmeÿu najmanje jedna polovice i srednjeg dela i obezbeÿena je sa najmanje jednim izrezom i najmanje dva jeziþka za prijem nosaþa, pri þemu je druga folija posebno pogodno smeštena izmeÿu srednjeg dela i druge polovice, a ove komponente su meÿusobno povezane laserskim zavarivanjem, a posebno laserskim zavarivanjem sa maskom.

6. Metod testiranja prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri þemu je udaljenost izmeÿu prednje ili zadnje strane nosaþa i zida komore 10 µm ili više, posebno do 1.500 µm.

7. Metod testiranja prema zahtevu 6, pri þemu je udaljenost 80 µm do 350 µm, posebno 120 µm do 200 µm, pri þemu udaljenost prednje i zadnje strane nosaþa može biti razliþita.

8. Metod testiranja prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri þemu je nosaþ napravljen od þvrstog materijala, u potpunosti ili delimiþno napravljenog od gelaste, porozne, sitopropusne, polupropusne membrane, dijalizne membrane, naroþito obložene ili neobložene membrane.

9. Metod testiranja prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri þemu je bar jedan molekul receptora fiksiran na drugoj površini nosaþa.

10. Metod testiranja prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri þemu je uzorkovana teþnost biološka ili nebiološka teþnost, naroþito kompletna krv, polu-krv, plazma, serum, slina, suza, mokraüa, sekrecija, moždana teþnost ili preraÿeni oblici takvih teþnosti, rastvori koji sadrže bakterije, ili aktivni sastojci, naroþito EDTA-stabilizacione teþnosti.

11. Metod testiranja prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznaþen time, što se primena pritiska vrši pomoüu nadpritiska ili negativnog pritiska, naroþito uz pomoü špriceva, ampula, pumpe ili duvaljki.

12. Metod testiranja prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznaþen time, što se sa ulazom uzorkovane teþnosti, koja ukljuþuje 300 µl razblaženog uzorka, 340-540 µl, posebno 350-370 µl za plazmu i 480-520 µl za krvi kao uzorkovana teþnost, komora za uzorak je konfigurisana na sledeüi naþin: dužina nosaþa 40-60 mm, širina nosaþa 2,0-10 mm, preþnik dovoda 0,15 mm do 0,45.

13. Metod testiranja prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznaþen time, što je više komora za uzorke obezbeÿeno paralelno iz komore za uzorke sa najmanje jednom uzorkovanom teþnošüu.

14. Metod testiranja prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznaþen time, što se za detekciju analita koriste antitela.

15. Upotreba kompleta za detekciju najmanje jednog analita iz uzorkovane teþnosti in vitro iz zahteva 1, koji sadrži ureÿaj koji sadrži dve komore za uzorke, pri þemu je prednja strana nosaþa usmerena prema prvoj komori za uzorke i zadnja strana nosaþa je usmerena prema drugoj komori za uzorke, i

a) najmanje jedan molekul receptora je fiksiran na prednjoj strani nosaþa;

b) najmanje jedna odgovarajuüa slobodna zapremina je formirana preko prednje i zadnje strane nosaþa i ograniþena je zidom komore;

c) prva komora za uzorke ima najmanje dva otvora, pri þemu uzorkovana teþnost teþe kroz prvi otvor duž gradijenta protoka preko prednje strane nosaþa do drugog otvora razmaknutog od nosaþa;

d) druga komora za uzorke ima najmanje dva otvora, pri þemu uzorkovana teþnost teþe kroz prvi otvor iz prve komore za uzorke duž gradijenta protoka preko zadnje strane nosaþa i u pravcu suprotnom od toka na prednjoj strani nosaþ do drugog otvora;

e) drugo otvaranje prve komore za uzorak i prvo otvaranje druge komore za uzorak meÿusobno su povezani kanalom, pri þemu je ovaj kanal manjeg preþnika od preþnika komore za uzorke ili slobodne zapremine, i pri þemu kompletan protok uzorkovane teþnosti teþe izmeÿu dve komore za uzorak kroz kanal izmeÿu komora za uzorke;

f) drugo otvaranje druge komore za uzorke omoguüava pražnjenje teþnosti;

g) da su slobodne zapremine iz b.) formirane barem delimiþno sa kolonom teþnosti, h) gde se gradijent protoka duž prednje i zadnje strane nosaþa obezbeÿuje korišüenjem pritiska i uvlaþi kolonu teþnosti iz g.), pri þemu se bar jedan molekul receptora vezuje za najmanje jedan analit iz teþnosti uzorka.

16. Upotreba kompleta prema zahtevu 15 ili metod prema bilo koom od zahteva 1 do 14 za detekciju najmanje jednog analita (supstance) iz uzorkovane teþnosti u ljudskoj medicini, veterinarskoj medicini ili dijagnostici biljaka, dijagnostikovanju hrane, dijagnostikovanju životne sredine, forenziþkoj dijagnostici, farmakologiji, toksikologiji, kod alergija, autoimunih

2

ili metaboliþkih oboljenja, zaraznih oboljenja, genitalnih oboljenja, intolerancije na hranu, parazitskih oboljenja, odreÿivanja malih molekula kao što su lekovi, medikamenti ili metaboliþki proizvodi, üelijski posrednici, u tipizaciji tkiva, tipizaciji vrsta, tipizaciji hrane, tipizaciji antigena, tipizaciji epitopa i detekciji DNK ili RNK.