RS55107B1

RS55107B1 - Jedinjenja pirazola kao inhibitori sglt1

Info

Publication number: RS55107B1
Application number: RS20160626A
Authority: RS
Inventors: Fucheng Qu; Nathan Bryan Mantlo
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 2012-05-10
Filing date: 2013-05-02
Publication date: 2016-12-30
Also published as: CL2014002845A1; MA37501A1; IN2014DN07996A; PE20142399A1; HK1202542A1; JP6148725B2; ECSP14026088A; WO2013169546A1; KR101685779B1; EP2850084B1; CN104284894B; CR20140473A; MA37501B1; HRP20160804T1; MX2014013615A; MX357058B; JO3136B1; TWI579295B; AU2013259946A1; TW201406773A

Description

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na nova jedinjenja pirazola. na farmaceutske kompozicije koje uklujučuju ova jedinjenja, na jedinjenja za upotrebu u lečenju fizioloških poremećaja i na međuproizvode i procese korisne u sintezama jedinjenja.

[0002] Polje ovog pronalaska je tretman dijabetesa i drugih bolesti i poremećaja povezanih sa hiperglikemijom. Dijabetes je grupa oboljenja koje karakteriše visoka vrednost glukoze u krvi. Javlja se kod aproksimativno 25 miliona ljudi u Sjedinjenim Državama a takođe predstavlja sedmi vodeći uzrok smrti u U.S. po podacima National Diabetes Fact Sheet (U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Pre-vention) iz 2011. godine. Natrijum-udvojeni glukoza kotransporteri (SGLT'i) su jedni od transportera za koje se zna da su odgovorni za apsorpciju ugljovodonika, kao što je glukoza. Još preciznije, SGLT1 je odgovoran za transport glukoze kroz graničnu membranu treplji tankog creva. Inhibicija SGLT1 može da dovede do smanjene apsorpcije glukoze u tankom crevu i na taj način obezbedi svrsishodan pristup lečenju dijabetesa.

[0003] U.S. Patent broj 7,655,632 otkriva izvesne derivate pirazola sa inhibitornim delovanjem na humani SGLT1, a dalje je otkriveno da su korisni za prevenciju ili tretman bolesti povezanih sa hiperglikemijom, kao sto je dijabetes. Pored toga, WO 2011/039338 otkriva izvesne derivate pirazola koji imaju inhibitorno delovanje na SGLT1/SGLT2 a za koje je dalje otkriveno da su korisni za tretman bolesti kostiju, kao Što je osteoporoza.

[0004] Postoji potreba za alternativnim lekovima i tretman dijabetesa. Ovaj pronalazak obezbeđuje izvesne nove inhibitore SGLT 1 koji mogu da budu prikladni za tretman dijabetesa.

[0005] U skladu sa tim. ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje Formule II: pri čemu X predstavlja sledeće:

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0006] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje jedinjenje Formule I:

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0007] Osim toga, ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje Formula I ili II, ili njihovu farmaceutski prihvatljivu so, za primenu u terapiji, posebno za primenu u tretmanu dijabetesa. Pored toga, pronalazak obezbeđuje jedinjenje Formula I ili II, ili njihovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u tretmanu dijabetesa tip 1. Pored toga, ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje Formula I ili II, ili njihovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u tretmanu dijabetesa tip 2. Ovaj pronalazak takode obezbeđuje upotrebu jedinjenja Formula I ili U, ili njihove farmaceutski prihvatljive soli za proizvodnju medikamenta za tretman dijabetesa. Isto tako, ovaj pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu jedinjenja Formula I ili II. ili njihove farmaceutski prihvatljive soli za proizvodnju medikamenta za tretman dijabetesa 1. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu jedinjenja Formula I ili II. ili njihove farmaceutski prihvatljive soli za proizvodnju medikamenta za tretman dijabetesa tip 2. Pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu jedinjenja Formula I ili II, ili njihove farmaceutski prihvatljive soli za proizvodnju medikamenta za tretman IGT. IFG ili metaboličkog sindroma.

[0008] Pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja uključuje jedinjenje Formula I ili II. ili njihove farmaceutski prihvatlji ve soli, u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača ili ekscipijenata. U posebnom aspektu, kompozicija dalje uključuje jedno ili više drugih terapetuskih sredstava. Ovaj pronalazak takođe obuhvata nove međuproizvode i procese za sintezu jedinjenja Formula I ili II.

[0009] Kako se ovde koristi, nazivi "lečenje" ili "lečiti" obuhvataju sprečavanje, ograničavanje, usporavanje, zaustavljanje ili poboljšanje progresije ili ozbiljnosti postojećih simptoma ili poremećaja.

[0010] Kako se ovde koristi, naziv "pacijent" se odnosi na sisare. kao što su zamorci, pacovi, psi ili ljudi. Jasno je da su preferirani pacijenti ljudi.

[0011] Kako se ovde koristi, naziv "efektivna količina" se odnosi na količinu ili dozu jedinjenja iz pronalaska ili njegove farmaceutski prihvatljive soli koja, nakon primene jedne ili više doza na pacijentu ispoljava željeni efekat kod pacijenta u smislu dijagnoze ili tretmana.

[0012] Kao stručnjak sa iskustvom u tehnici, lekar koji postavlja dijagnozu može lako da odredi efektivnu količinu korišćenjem poznatih tehnika i pregledom rezultata dobijenih pod sličnim okolnostima. Za određivanje efektivne količine za pacijenta, lekar koji postavlja dijagnozu uzima u obzir brojne faktore, uključujući ali bez ograničenja na. vrstu sisara, njegovu veličinu; godine starosti i opšte zdravstveno stanje, prisutne specifične bolesti ili poremećaji; stepen ili prisustvo ili ozbiljnost bolesti ili poremećaja; odgovor pojedinačnog pacijenta; određeno jedinjenje koje se primenjuje; način primene; karakteristike bioraspoloživosti preparata koji se primenjuje; izabran režim doziranja; upotrebu prateće medikacije; i relevantne okolnosti.

[0013] Jedinjenja Formula I i II su generalno efikasna u velikom opsegu doze. Na primer. dnevne doze su normalno u rasponu od približno 0.01 do približno 30 mg/kg telesne težine. U nekim slučajevima, vrednosti doze ispod donje granice prethodno pomenutog opsega mogu da budu više nego adekvatne, dok u drugim slučajevima čak i veće doze mogu da se primene bez izazivanja bilo kakvog neželjenog sporednog efekta, pa stoga prethodni opseg doza ne treba da ograniči okvir pronalaska na bilo koji način.

[0014] Jedinjenja iz pronalaska su preferirano formulisana kao farmaceutske kompozicije koje se primenjuju na bilo koji način koji čini jedinjenje bioraspoloživim. Najpoželjnije, ovakve kompozicije su za oralnu primenu. Ovakve farmaceutske kompozicije i procesi za njihovu izradu su dobro poznati u tehnici. (Videti. na primer, Remington: The Science and Practice of Pharmacv (D.B. Troy, Editor, 21 st Edition.. Lippincott, Williams & Wilkins, 2006).

[0015] U daljem aspektu pronalaska, jedinjenja iz ovog pronalaska se primenjuju u kombinaciji sa jednim ili više terapeutskih sredstava, kao što su antidijabetična sredstva. Primena u kombinaciji uključuje istovremenu ili primenu jedno za drugim. Pored toga, istovremena primena kombinacije može da bude kao kombinacija u jednoj dozi ili odvojenim dozama svakog terapeutskog sredstva. U primere antidijabetičnih sredstava spadaju metformin; DPPIV inhibitor, kao što je sitagliptin ili linagliptin: sufonil urea, kao što je glimepirid; tiazolidindion, kao Što je pioglitazon; bazni insulin, kao što je glargin; brzo delujući insulin, kao što su HUMALOG ili NOVOLOG; GLP-1 agonist, kao što su eksenatid ili liraglutid; SGLT2 inhibitor, kao što su dapagliflozin ili empagliflozin; antagonist glukagon receptora, kao stoje LY2409021; i slično.

[0016] Jedinjenja Formula I i II se izrađuju kako je ilustrovano u niže datim primerima i šemama. Za stručnjaka sa uobičajenim iskustvom u tehnici, reagensi i početni materijali su lako raspoložvi. Svi supstituenti, ukoliko nije drugačije navedeno, su prethodno definisani. Podrazumeva se da date Šeme, izrade i primeri ne treba da ograniče okvir pronalaska na bilo koji način.

[0017] U primere rezolucija spadaju tehnike selektivne kristalizacije ili asimetrična hromatografija. (Videti, na primer J. Jacques, i saradnici, "Enantiomers, Racemates i Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981 i E.L, Eliel and S.H. Wilen," Stereochemistrv of Organic Compounds", Wiley-Interscience, 1994). Stručnjak sa uobičajenim iskustvom u tehnici će dalje jasno da razume da razdvajanje i izdvajanje, hromatografijom, asimetričnom hromatografijom ili selektivnom kristalizacijom pojedinačnih diastereomera ili geometrijskih izomera Formule I ili II, može da se izvede u bilo kojoj pogodnoj tački procesa sinteze.

[0018] Kako se ovde koristi, " 8" se odnosi na deo po milion opadajući iz tetrametilsilana; "min" se odnosi na minut ili minute; "THF" se odnosi na tetrahidrofuran; "MeOH" se odnosi na metanol ili metil alkohol; "HPLC" se odnosi na visoko efikasnu tečnu hromatografiju; naziv "Ac" se odnosi na acetil supstituent sledeće strukture:

Naziv "Bz" se odnosi na benzoil supstituent sledeće strukture:

Naziv "BOC" se odnosi na t-butiloksikarbonil zaštitnu grupu.

[0019] Farmaceutski prihvatljive soli i uobičajena metodologija za njihovu izradu su dobro poznati u tehnici. Videti, na primer, Gould, P.L., "Salt selection for basic drugs," International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986); Bastin i saradnici "Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities," Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000); i S.M. Berge, i saradnici, "Phannaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, Januarv 1977. Stručnjak sa iskustvom u tehnici sinteze će da razume da su jedinjenja Formula I i II, kao amini, organske baze i kao takve se jednostavno konvertuju u i izdvajaju kao farmceutski prihvatljive soli kao što su tartaratne ili HC1 soli, koristeći tehnike i uslove koji su dobro poznati stručnjaku sa uobičajenim iskustvom u tehnici.

Sinteza (4-bromo-2-metil-fenil)metanola.

[0020]

[0021] Šema 1, faza A: Add bor-tetrahidrofuran kompleks (0.2 mol, 200 mL, 1.0 M rastvor) u rastvor 4- bromo-2-metilbenzoeve kiseline (39 g, 0.18 mol) u tetrahidrofuranu (200 mL) se doda bor-tetrahidrofuran kompleks (0.2 mol, 200 mL. 1.0 M rastvor). Nakon 18 sati na sobnoj temperaturi, rastvarač se ukloni pod sniženim pritiskom da se dobije čvrsta supstanca. Prečišćavanjem gasnom hromatografijom se dobije naslovljeno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca (32.9 g, 0.16 mol). 'H NMR (CDCh): 5 1.55 (s. IH), 2.28 (s. 3H), 4.61 (s, 2H), 7.18-7.29 (m, 3H).

Alternativna sinteza ( 4- bromo- 2- metil- feniDmetanola.

[0022] Bor-dimetil sulfid kompleks (2M rastvor u THF; 116 mL, 0.232 mol) se na 3 °C polako dodaje u rastvor 4-bromo-2-metilbenzoeve kiseline (24.3 g, 0.113 mol) u

anhidrovanom tetrahidrofuranu (THF, 146 mL). Nakon 10 min mešanja uz hlađenje, kupatilo za hlađenje se ukloni i reakcija se ostavi da se polako zagreje na temperaturu sredine. Nakon 1 sat, rastvor se ohladi na 5°C i polako se dodaje voda (100 mL). Doda se etil acetat (100 mL) i faze se razdvoje. Organski sloj se ispere sa zasićenim vodenim rastvorom NaHCO_i (200 mL) i suši preko Na2S04. Filtriranjem i koncentrisanjem pod sniženim pritiskom dobija se ostatak koji se prečisti filtriranjem kroz tanku ploču silika gela uz eluiranje sa 15% etil acetat/izo-heksan da se dobije naslovljeno jedinjenje (20.7 g, 91.2% prinos). MS (m/z): 183/185 (M+l-18).

Izrada 2

Sinteza 4-bromo-l -hlormetil-2-metil-benzena.

[0023]

[0024] Šema 1, faza B: u rastvor (4-bromo-2-metil-fenil)metanola (32.9 g, 0.16 mol) u dihlormetanu (200 mL) i dimetilformamidu (0.025 mol. 2.0 mL) se na 0°C doda tionil hlorid (14.31 mL, 0.2 mol). Nakon 1 sat se na sobnoj temperaturi smeša sipa u ledenu vodu (100 g). ekstrahuje sa dihlormetanom (300 mL), ekstrakt ispere sa 5% vodenim rastvorom natrij um bikarbonata (30 mL) i slanim rastvorom (200 mL). suši preko natrijum sulfata i koncentruje pod sniženim pritiskom da se dobije sirovo naslovljeno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca (35.0 g, 0.16 mol). Materijal se koristi u sledećoj fazi reakcije bez naknadnog prečišćavanja.

'H NMR (CDCb): 5 2.38 (s, 3H), 4.52 (s, 2H). 7.13-7.35 (m, 3H).

Alternativna sinteza 4- bromo- l- hlormetil- 2- metil- benzena.

[0025] U rastvor (4-bromo-2-metil-fenil)metanola (16.14 g, 80.27 mmol) i irietilamina (16.78 mL; 120.4 mmol) u dihlormetanu (80.7 mL), ohlađenom u ledenoj vodi, se polako dodaje metansulfonil hlorid (6.83 mL, 88.3 mmol). Smeša se ostavi da se polako zagreje na temperaturu sredine i meša 16 sati. Doda se još metansulfonil hlorida (1.24 mL; 16.1 mmol) i smeša se meša 2 sata na temperaturi sredine. Doda se voda (80mL) i faze se razdvoje. Organski sloj se ispere sa hlorovodoničnom kiselinom (1N; 80 mL), nakon toga sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum hidrogen karbonata (80 mL). nakon toga sa vodom (80 mL) i suši preko NaiSO-i. Filtriranjem i koncentrovanjem pod sniženim pritiskom dobija se ostatak koji se prečisti gasnom hromatografijom (uz eluiranje sa heksanom) da se dobije naslovljeno jedinjenje (14.2 g; 80.5% prinos). 'H NMR (300.11 MHz. CDCb): 5 7.36-7.3 (m, 2H), 7.18 (d, J= 8.1 Hz, IH), 4.55 (s, 2H). 2.41 (s. 3H).

Izrada 3

Sinteza 4-[(4-bromo-2-metil-fenil)metiI]-5-tzopropil-lH-pirazol-3-ola.

[0026]

[0027] Šema 1, faza C: u rastvor metil 4-metil-3-oksova!erata (27.1 mL. 0.19 mol) u tetrahidrofuranu se na 0°C doda natrijum hidrid (8.29 g, 0.21 mol. 60% disperzija u ulju). Nakon 30 min na sobnoj temperaturi, doda se rastvor 4-bromo-l-hlormetil-metil-benzena (35.0 g, 0.16 mol) u tetrahidrofuranu (50 mL). Dobijena smeša se zagreva na 70 °C u toku noći (18 sati). Doda se 1.0 M rastvor HC1 (20 mL) da se neutrališe reakcija. Smeša se ekstrahuje sa etil acetatom (200 mL), ekstrakt se ispere sa vodom (200 mL) i slanim rastvorom (200 mL), suši preko Na2S04, filtrira i koncentruje pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak se rastvori u toluenu (200 mL) i doda se hidrazin monohidral (23.3 mL, 0.48 mol). Smeša se zagreva na 120 °C u toku 2 sata pomoću Dean-Stark aparature da se ukloni voda. Smeša se ohladi a rastvarač ukloni pod sniženim pritiskom, ostatak se rastvori sa dihlormetanom (50 mL) i metanolom (50 mL). Ovaj rastvor se polako sipa u menzuru sa vodom (250 mL). Dobijeni precipitirani produkt se sakupi filtracijom pod vakuumom. Suši se pod vakuumom u pećnici u toku noći na 40 °C da se dobije naslovljeno jedinjenje kao čvrsta supstanca (48.0 g, 0.16 mol). MS (m/z): 311.0 (M+l), 309.0 (M-l).

Alternativna sinteza 4-|( 4- bromo- 2- metil- fenil) metil]- 5- izopropil- l H- pirazol- 3- ola.

[0028] Izradi se rastvor 4-bromo-l-hlormetiI-2-metil-benzena (13.16 g, 59.95 mmola) u acetonitrilu (65.8 mL). Dodaju se kalijum karbonat (24.86 g, 179.9 mmol), kalijum jodid

(11.94 g, 71.94 mmol) i metil 4-metil-3-oksovalerat (8.96 mL; 62.95 mmol). Dobijena smeša se meša 20 sati na temperaturi sredine. Doda se hlorovodonična kiselina (2N) da se dobije pH 3. Rastvor se ekstrahuje sa etil acetatom (100 ml), organska faza se ispere sa slanim rastvorom (100 ml) i suši preko Na2S04. Smeša se filtrira i koncentruje pod sniženim pritiskom. Ostatak se rastvori u toluenu (65.8 mL) i doda se hidrazin monohidrat (13.7 mL, 0.180 mol). Dobijena smeša se zagreva pod refluksom a voda se ukloni koristeći Dean-Stark aparaturu. Nakon 3 sata. smeša se ohladi na 90 °C, doda se još hidrazin monohidrata (13.7 mL; 0.180 mol) i smeša se zagreva 1 sat pod refluksom. Smeša se ohladi i koncentruje pod sniženim pritiskom. Dobijena čvrsta supstanca se triturira sa vodom (200 mL), filtrira i suši u vakuum sušnici preko P2O5na 60°C. Čvrsta supstanca se triturira u izo-heksanu (200 mL) i filtrira da se

dobije naslovljeno jedinjenje (14.3 g; 77.1% prinos). MS (m/z): 309/311 (M+l).

Izrada 4

Sinteza 4-(4-bromo-2-metilbenzil)-5-(propan-2-il)-lH-pirazol-3-il 2,3.4,6-tetra-O-benzoil-beta-D-glukopiranozida.

[0029]

[0030] Šema 1, faza D: u bocu zapremine 1L se sipaju 4-[(4-bromo-2-melil-fenil)metii]-5-izopropil-lH-pirazol-3-ol (20 g, 64.7 mmol), alfa-D-glukopiranozil bromid tetrabenzoat (50 g, 76 mmol), benziltributilamonijum hlorid (6 g, 19.4 mmol). dihlormetan (500 mL), kalijum karbonat (44.7 g, 323 mmol) i voda (100 mL). Reaktivna smeša se meša u toku noći na sobnoj temperaturi. Smeša se ekstrahuje sa dihlonnetanom (500mL). Ekstrakt se ispere sa vodom (300 mL) i slanim rastvorom (500 mL). Organska faza se suši preko natrijum sulfata, filtrira i koncentruje pod sniženim pritiskom. Ostatak se prečisti gasnom hromatografijom da se dobije naslovljeno jedinjenje (37 g, 64 mmol). MS (m/z): 889.2 (M+l), 887.2 (M-l).

Izrada 5

Sinteza 4-{4-[(lE)-4-hidroksibut-l-en-l-il]-2-metilbenziI}-5-(propan-2-iI)-lH-pirazol-3-il 2,3,4,6-tetra-O-benzoil-beta-D-glukopiranozida.

[0031]

[0032] Šema 1, fazaE: u rastvor 4-(4-bromo-2-metiIbenzil)-5-(propan-2-il)-lH-pirazol-3-il 2,3.4,6-tetra-O-benzoil-beta-D-gIukopiranozida (3 g. 3.4 mmol) u acetonitrilu (30 mL) i trietil-aminu (20 mL) se doda 3-buten-l-oI (0.58 mL, 6.8 mmol). Rastvor se degasira sa azotom u toku 10 minuta. Dodaju se tri-o-tolilfosfin (205 mg, 0.67 mmol) i paladijum acetat (76 mg, 0.34 mmol). Refluksuje se u toku 2 sata na 90 °C. Ohladi na sobnu temperaturu i koncentruje da se ukloni rastvarač pod sniženim pritiskom. Ostatak se prečisti gasnom hromatografijom da se dobije naslovljeno jedinjenje (2.1 g, 2.4 mmol). MS (m/z): 878.4 (M+l).

Izrada 6

Sinteza 4-{4-[(lE)-4-oksibut-l-en-l-ilJ-2-metilbenzil}-5-(propan-2-il)-lH-pirazol-3-il 2,3,4,6-tetra-O-benzoil- beta-D-glukopiranozida.

[0033]

[0034] Šema 1, fazaF: u rastvor 4-{4-[(lE)-4-hidroksibut-l-en-l-il]-2-metilbenzil}-5-

(propan-2-il)-l H-pirazol-3-il-2,3,4,6-tetra-0-benzoil-beta-D-glukopiranozida (280 mg, 0.32 mmol) i natrijum bikarbonata (133.8 mg. 1.6 mmol) u dihlormetanu (20 mL) se na 0 °C doda 3,3,3-triacetoksi-3-jodftalid (134 mg, 0.96 mmol). Nakon 15 minuta na sobnoj temperaturi, reakcija se neutrališe sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum tiosulfata (10 mL). Ekstrahuje se sa dihlormetanom (30 mL). Ekstrakt se ispere sa vodom (30 mL) i slanim rastvorom (40 mL). Organska faza se suši preko natrijum sulfata, filtrira i koncentruje pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak se prečisti gasnom hromatografijom da se dobije naslovljeno jedinjenje (270 mg, 0.31 mmol). MS (m/z): 876.5 (M+l). 874.5 (M-l).

Izrada 7

Sinteza terc-butil 2-{(3E)-4-[3-metil-4-({5-(propan-2-il)-3-[(2,3,4,6-tetra-0-benzoil-beta-D-glukopiranozil)oksi]-lH-pirazol-4-il{metil)fenil]but-3-en-l-il{-2,9-diazaspiro[5.5]undekan-9-karboksilata.

[0035]

[0036] Šema 1, faza G: u rastvor 4-{4-[(lE)-4-oksibut-l-en-1 -il]-2-metilbenzil}-5-(propan-2-il)-lH-pirazol-3-ii 2,3,4,6-tetra-O-benzoil-bela-D-glukopiranoziđa (270 mg, 30 0.31 mmol) i terc-butil 2,9-diazaspiro[5.5]undekan-9-karboksilat hidrohlorida (179 mg, 0.62 mmol) u 1,2-dihloretanu (5 mL) se doda natrijum triacetoksiborohidrid (98 mg, 0.46 mmol). Nakon 30 minuta na sobnoj temperaturi, reakcija se neutrališe sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata (10 mL). Ekstrahuje se sa dihlormetanom (30 mL). Ekstrakt se ispere sa vođom (30 mL) i slanini rastvorom (40 mL), organska faza se suši preko natrijum sulfata, filtrira i koncentruje pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak se prečisti gasnom hromatografijom da

se dobije naslovljeno jedinjenje (275 mg, 0.25 mmol).

MS(m/z): 1115.6 (M+ 1).

Izrada 8

Sinteza 4-{4-[(lE)-4-(2,9-diazaspiro[5.5]undek-2-il)bi]t-l-en-l-il]-2-metilbenzil}-5-(propan-2-il)-lH-pirazol-3-il-2,3.4,6-tetra-0-benzoil-beta-D-glukopiranozid dihidrohlorida.

[0037]

[0038] Šema 1, faza H: u rastvor terc-butil 2-{(3E)-4-[3-metil-4-({5-(propan-2-il)-3-[(2,3,4,6-tetra-0-benzoil-beta-D-glukopiranozil)oksi]-lH-pirazoI-4-il{metii)fenil]but-3-en-l-il{-2,9-diazaspiro[5.5]undekan-9-karboksilata (275 mg, 0.25 mmol) u dihlormetanu (5 mL) se doda vodonik hlorid (4.0 M rastvor u 1,4-dioksanu. 0.6 mL, 2.4 mmol). Nakon noći (18 sati) na sobnoj temperaturi, rastvor se koncentruje a rastvarač se ukloni pod sniženim pritiskom da se dobije naslovljeno jedinjenje kao čvrsta supstanca (258 mg, 0.24 mmol). MS (m/z): 1015.6 (M+l).

Primer 1

Sinteza 4-{4-[(lE)-4-(2,9-diazaspiro[5.5]undek-2-il)but-I-en-l-il]-2-metilbenziI}-5-(propan-2-il)-l H-pirazol-3-il beta-D-glukopiranozida.

[0039]

[0040] Šema 1, faza I: u rastvor 4-{4-[(lE)-4-(2,9- diazaspiro[5.5]undek-2-il)but-l-en-l-il]-2-metiIbenzil}-5-(propan-2-il)-lH-pirazoI-3-il 2,3,4,6-tetra-O-benzoii-beta-D-glukopiranoziđ dihidrohlorida (258 mg, 0.24 mmol) u metanolu (2 mL) se doda natrijum hidroksid (0.5 mL, 0.5 mmol, 1.0 M rastvor). Nakon 2 sata na 40 °C, rastvor se koncentruje i rastvarač se ukloni pod sniženim pritiskom da se dobije ostatak koji se prečisti postupkom preparativne HPLC: visoki pH, 25% B u toku 4 min, 25-40 B % u toku 4 min @ 85 mL/min koristeći 30 x 75 mm, 5 um C18XBridge ODB kolonu, rastvarač A - H20 m NH4HCO3@ pH 10, rastvarač B - MeCN da se dobije naslovljeno jedinjenje kao čvrsta supstanca (46 mg, 0.08 mmol). MS (m/z): 598.8

(M+l), 596.8 (M-l).

Izrada 9

Sinteza 4-(4-bromo-2-metilbenzil)-5-(propan-2-il)-lH-pirazol-3-i] 2,3,4,6-tetra-O-acetil-beta-D-glukopiranozida.

[0041]

[0042] Šema 2, faza A: u bocu zapremine 1 L se dodaju 4-[(4-bromo-2-meti]-feniI)metil]-5-izopropil-lH-pirazoI-3-ol (24 g, 77.6 mmol), 2,3,4,6-tetra-O-acetil-alfa-D-glukopiranoziI bromid (50.4 g, 116 mmol), benzihributilamonijum hlorid (5 g. 15.5 mmol), dihlormetan (250 mL), kalijum karbonat (32 g, 323 mmol) i voda (120 mL). Reaktivna smeša se meša u toku noći na sobnoj temperaturi. Ekstrahuje se sa dihlormetanom (450 mL). Ekstrakt se ispere sa vodom (300 mL) i slanim rastvorom (500 mL). Organska faza se suši preko natrijum sulfata, filtrira i koncentruje pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak se prečisti gasnom hromatografijom da se dobije naslovljeno jedinjenje (36.5 g, 57 mmol). MS (m/z): 638.5 (M+l), 636.5 (M-l).

Alternativna sinteza 4-( 4- bromo- 2- metilbenziiy5-( propan- 2- il)- lH- pirazol- 3- il 2. 3. 4. 6- tetra-O- acetil- beta- D- glukopiranozida.

[0043] Reagensi 4-[(4-bromo-2-metil-fenil)metil]-5-izopropil-l H-pirazol-3-ol (24.0 g, 77.6 mmol), 2,3,4,6-tetra-O-acetil-alfa-D-glukopiranozil bromid (50.4 g, 116 mmol), benzihributilamonijum hlorid (4.94 g, 15.52 mmol), kalijum karbonat (32.18 g, 232.9 mmol), dihlormetan (250 mL) i voda (120 mL) se kombinuju i smeša se meša 18 sati na temperaturi sredine. Smeša se podeli između dihlormetana (250 mL) i vode (250 mL). Organska faza se ispere sa slanim rastvorom (250 mL), suši preko Na2S04. filtrira i koncentruje pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak se prečisti gasnom hromatografijom (uz eluiranje sa 10% etil acetat u dihlormetanu do 70% etil acetat u dihlormetanu) da se dobije naslovljeno jedinjenje (36.5 g, 74% prinos). MS (m/z): 639/641 (M+l).

Izrada 10

Sinteza 4-{4-[( 1 E)-4-hidroksibut-1 -en-1 -il]-2-metilbenziI} -5-(propan-2-il)-1 H-pirazol-3-il 2,3,4.6-tetra-O-acetil- beta-D-glukopiranozida.

[0044]

[0045] Šema 2, faza B: u rastvor 4-(4-bromo-2-metilbenzil)-5-(propan- 2-il)-l H-pirazol-3-il 2,3,4,6-tetra-O-acetil-beta-D-glukopiranozida (15 g, 23.5 mmol) u acetonitrilu (200 mL) i trietilaminu (50 mL) se doda 3-buten-I -ol (6.1 mL. 70 mmol). Rastvor se degasira sa azotom u toku 10 minuta. Dodaju se tri-o-tolilfosfm (1.43 g, 4.7 mmol) i palađijum acetat (526 mg, 2.35 mmol). Nakon refluksovanja 2 sata na 90 °C, rastvor se ohladi i koncentruje da se rastvarač ukloni pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak se prečisti gasnom hromatografijom da se dobije naslovljeno jedinjenje (7.5 g, 11.9 mmol). MS (m/z): 631.2 (M+l), 629.2 (M-l).

Izrada 11

Sinteza 4-{4-[(lE)-4-oksibut-l-en-l-il]-2-metilbenzil}-5-(propan-2-il)-lH-pirazol-3-iI 2,3,4,6-letra-O-acetil-beta-D-glukopiranozida.

[0046]

[0047] Šema 2, faza C: u rastvor4-{4-[(lE)-4-hidroksi-bul-l-en-l-il]-2-metilbenziI}-5-(propan-2-il)-lH-pirazo]-3-i]-2,3.4,6-tetra-0-acetil-beta-D-g]ukopiranozida (1.5 g, 2.38 mmol) i natrijum bikarbonata (2 g, 23.8 mmol) u dihlormetanu (50 mL) se na 0 °C doda 3,3,3-triacetoksi-3-jodftalid (2,]g, 4.76 mmol). Nakon 15 minuta na sobnoj temperaturi, reakcija se neutrališe sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum tiosulfata (10 mL). Ekstrahuje se sa dihlormetanom (30 mL), a ekstrakt se ispere sa vodom (30 mL) i slanim rastvorom (40 mL). Organska faza se suši preko natrijum sulfata, filtrira i koncentruje pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak se prečisti gasnom hromatografijom da se dobije naslovljeno jedinjenje (0.95 g, 1.51 mmol). MS (m/z): 628.8(M+1), 626.8 (M-l).

Izrada 12

Sinteza terc-butil 2-l(3E)-4-[3-metil-4-({5-(propan-2-il)-3-[(2,3,4,6-tetra-0-acetil-beta-D-glukopiranozil)oksi]-lH-pirazol-4-il}metil)fenil]but-3-en-l-il)-2,9-diazaspiro[5.5]undekan-9-karboksilata.

[0048]

[0049] Šema 2, Faza D: u rastvor 4-{4-[(l E)-4-oksibut-l-en-l-iI]-2-metilbenziI}-5-(propan-2-il)-l H-pirazol-3-il 2,3,4,6-tetra-O-acetil-bcta-D-glukopiranozida (600 mg, 0.95 mmol) i terc-butil 2,9-diazaspiro[5.5]undekan-9-karboksilat hidrohlorida (333 mg, 1.2 mmol) u 1.2-dihloretanu (30 mL) se doda natrijum triacetoksiborohidrid (303 mg, 1.4 mmol). Nakon 30 minuta na sobnoj temperaturi, reakcija se neutrališe sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata (15 mL). Ekstrahuje se sa dihlormetanom (60 mL). Ekstrakt se ispere sa vodom (30 mL) i slanim rastvorom (60 mL). Organska faza se suši preko natrijum sulfata, filtrira i koncentruje pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak se prečisti gasnom hromatografijom da

se dobije naslovljeno jedinjenje (500 mg, 0.58 mmol).

MS (m/z): 866.8, 867.8 (M+l), 864.8. 865.8 (M-1).

Izrada 13

Sinteza terc-butil 2-{(3E)-4-[3-metil-4-( {5-(propan-2-il)-3-[(2,3,4,6-tetra-0-acetiI-beta-D-gIukopiranozil)oksi]-lH-pirazol-4-il{metil)fenil]but-3-en-l-il}-2,8-diazaspiro[4.5]dekan-8-karboksilata.

[0050]

[0051] Naslovljeno jedinjenje se u suštini izrađuje po postupku za Izradu 12. MS (m/z): 852.8, 853.6 (M+l), 850.8, 851.6 (M-l).

Izrada 14

Sinteza terc-butil 9-{(3E)-4-[3-metiI-4-( {5-(propan-2-il)-3-[(2,3,4,6-tetra-0-acetil-beta-D-glukopiranozil)oksi]-lH-pirazol-4-il}metil)fenil]but-3-en-l-il}-3,9-diazaspiro[5.5]undekan-3-karboksilata.

[0052]

[0053] Naslovljeno jedinjenje se u suštini izrađuje po postupku za Izradu 12. MS (m/z): 866.8. 867.6 (M+l), 864.8, 865.6 (M-l).

Izrada 15

Sinteza 4-{4-[(lE)-4-(2,9-diazas<p>iro[5.5]undek-2-il)but-l-en-l-il|-2-metilbenzil}-5-(propan-2-il)-l H-pirazol-3-il 2,3,4,6-tetra-O-acetil-beta-D-glukopiranozid dihidrohlorida.

[0054]

[0055] Šema 2, faza E: u rastvor terc-butil 2-{(3E)-4-[3-metil-4-({5-(propan-2-iI)-3-[(2,3,4,6-tetra-0-acetil-beta-D-gIukopiranozil)oksi]-1 H-pirazol-4-il}metil)fenil]but-3-en-l -il }-2,9-diazaspiro[5.5]undekan-9-karboksilata (500 mg, 0.58 mmol) u dihlormetanu (20 mL) se doda vodonik hlorid (4.0 M rastvor u 1,4-dioksanu, 1.5 mL, 5.8 mmol). Nakon 2 sata na sobnoj temperaturi, rastvor se koncentruje i rastvarač ukloni pod sniženim pritiskom da se dobije naslovljeno jedinjenje kao čvrsta supstanca (480 mg, 0.57 mmol).

MS (m/z): 767.4 (M+l).

Izrada 16

Sinteza 4-{4-[( 1 E)-4-(2,8-diazaspiro[4.5]dec-2-il)but-1 -en-1 -il]-2-metilbenzil} -5-(propan-2-il)-lH-pirazol-3-il 2.3,4,6-tetra-O-acetil-beta-D-glukopiranozid dihidrohlorida.

[0056]

[0057] Naslovljeno jedinjenje se u suštini izrađuje po postupku za Izradu 15. MS (m/z): 752.8, 753.8 (M+l), 750.8 (M-l).

Prva alternativna sinteza za Primer 1

Prva alternativna sinteza 4-{4-[(lE)-4-(2,9-diazaspiro[5.5]undek-2-il)but-l-en-l-il]-2-metilbenzil}-5-(propan-2-il)-l H-pirazol-3-il beta-D-glukopiranozida.

[0058]

[0059] Šema 2, faza F: u 4-{4-[(lE)-4-(2,9-diaza- spiro[5.5]unđek-2-il)but-l-en-l-il]-2-metilbenzil}-5-(propan-2-il)-lH pirazol-3-il 2,3,4,6-tetra-O-acetil-beta-D-glukopiranozid dihidrohlorid (480 mg, 0.24 mmol) se dodaju metanol (5 mL). trietilamin (3 mL) i voda (3 mL). Nakon 18 sati (u toku noći) na sobnoj temperaturi, rastvor se koncentruje do sušenja pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak se prečisti postupkom preparativne HPLC: visoki pH. 25% B u toku 4 min, 25-40 B % u toku 4 min @ 85 mL/min koristeći 30 x 75 mm, 5 um Cl 8XBridge ODB kolonu, rastvarač A - H20 m NH4HCO3@ pH 10, rastvarač B - MeCN da se dobije naslovljeno jedinjenje kao čvrsta supstanca (50 mg, 0.08 mmol). MS(m/z):598.8 (M+l), 596.8 (M-l). 'H NMR (400.31 MHz, CD3OD): 5 7.11 (đ, J=1.3 Hz, IH), 7.04 (dd, J=1.3,8.0 Hz, IH), 6.87 (đ, J= 8.0 Hz, IH), 6.36 (d, J= 15.8 Hz, IH), 6.16 (dt, J= 15.8, 6.3 Hz, IH), 5.02 (m, IH), 3.81 (d, J= 11.7 Hz, 111). 3.72 (d, J= 16.8 Hz, IH), 3.68 (d, J= 16.8 Hz, IH), 3.64 (m, IH), 3.37-3.29 (m, 4H), 2.79 (m, IH). 2.72 (t, J= 5.8 Hz, 4H), 2.44-2.33 (m. 6H), 2.30 (s, 3H), 2.26 ( široko s, 2H), 1.59 (m, 2H). 1.50 (m, 2H), 1.43 (m, 2H), 1.36 (m, 2H), 1.11 (d, J= 7.0 Hz, 3H), 1.10 (đ, J= 7.0 Hz, 3H).

Primer 2

Sinteza 4-{4-[(lE)-4-(2,8-diazaspiro[4.5]dec-2-il)but-l-en-l-il]-2-metiibenzil}-5-(propan-2-il)-l H-pirazol-3-il beta-D-glukopiranozida.

[0060]

[0061] Naslovljeno jedinjenje se u suštini izrađuje po postupku prve alternativne sinteze za Primer 1. MS (m/z): 584.7 (M+l). 582.8 (M-l).

Primer 3

Sinteza 4-{4-[(lE)-4-(3,9-diazaspiro[5.5]undek-3-iI)but-l-en-l-il]-2-metilbenzil)-5-(propan-2-il)-lH-pirazol-3-il beta-D-glukopiranozida.

[0062]

[0063] Naslovljeno jedinjenje se u suštini izrađuje po prvom tretiranju jedinjenja iz Izrade 14 sa HC1 kako je diskutovano za Izradu 15 a nakon toga tretiranjem dobijene hidrohloridne soli sa trietil aminom, kako je diskutovano u prvoj alternativnoj sintezi za Primer 1. MS (m/z): 598.8, 599.8 (M+l), 596.8, 597.8 (M-l ).

Izrada 17

Sinteza terc-butil 4-but-3-inil-4,9-điazaspiro[5.5]undekan-9-karboksilata.

[0064]

[0065] Šema 3, faza A: cezijum karbonat (46.66 g. 143.21 mmol) se doda u suspenziju terc-butil 4,9- diazaspiro[5.5]undekan-9-karboksilat hidrohlorida (16.66 g, 57.28 mola) u acetonitrilu (167 mL). Smeša se meša 10 minuta na temperaturi sredine a nakon toga se doda 4-bromobutin (6.45 mL, 68.74 mmol). Reakcija se zagreva pod refluksom i meša 18 sati. Smeša se ohladi i koncentruje pod sniženim pritiskom. Ostatak se podeli između vode (200 mL) i etil acetata (150 mL). Faze se razdvoje i vodeni sloj se ekstrahuje sa etil acetatom (100 mL). Kombinovani organski slojevi se isperu sa vodom (200 mL), nakon toga sa slanim rastvorom (150 mL), suše preko MgS04, filtriraju i koncentruju pod sniženim pritiskom da se dobije naslovljeno jedinjenje (17.2 g, 98% prinos). 'H NMR (300.11 MHz, CDCb): 5 3.43-3.31 (m, 4H), 2.53-2.48 (m, 2H), 2.37-2.29 (m, 4H), 2.20 (s, 2H), 1.94 (t, J= 2.6 Hz, IH). 1.44 (s, 17H).

Izrada 18

Sinteza terc-butil 4-[(E)-4-(4,4,5,5-tetrametil-l ,3,2-dioksaborolan-2-il)but-3-enil]-4,9-di azaspiro [5.5] undekan-9- karboksilata.

[0066]

[0067] Šema 3, faza B: Trietilamin (5.62 mola; 0.783 mL), 4,4,5,5-tetrametil-l,3,2-dioksaborolan (8.56 mL, 59.0 mmol) i cirkonocen hlorid (1.45 g, 5.62 mola) se dodaju u terc-butil 4-but-3-inil-4,9-diazaspiro[5.5]un-dekan-9-karboksilat (17.21 g. 56.16 mola). Dobijena smeša se zagreva 3.5 sata na 65 °C. Smeša se ohladi i rastvori u dihlormetanu (150 mL). Dobijeni rastvor se propusti kroz~4cm debelu ploču silika gela, uz eluiranje sa dihlormetanom (2 x 200 mL). Filtrat se koncentruje pod sniženim pritiskom da se dobije naslovljeno jedinjenje (21.2 g, 87% prinos). 'H NMR (300.11 MHz, CDCb): 5 6.65-6.55 (m, IH), 5.49-5.43 (m, IH), 3.42-3.29 (m, 4H), 2.40-2.27 (m. 6H), 2.25-2.08 (m, 2H), 1.70-1.13 (m, 29H).

Izrada 19

Sinteza terc-butil 2-{(3E)-4-[3-metil-4-({5-(propan-2-il)-3-beta-D-glukopiranozil)oksi]-l H-pirazol-4-il{metil)fenil]but-3-en-l -il}-2,9-diazaspiro[5.5]undekan-9-karboksilata.

[0068]

[0069] Šema 3, faza C: rastvor 4-(4-bromo-2-metilbenzil)-5-(propan-2-il)-lH-pirazol-3-il 2,3.4,6-tetra-O- acetil-beta-D-glukopiranoziđa (20 g, 31.3 mmol), terc-butil 4-[(E)-4-(4,4,5,5-tetrametil-l,3,2-dioksaborolan-2-il)but-3- enil]-4,9-diazaspiro[5.5]undekan-9-karboksilata (16.3 g, 37.5 mmol) i kalijum karbonata (12.97 g, 93.82 mmol) u tetrahidrofuranu (200 mL) i vodi (40 mL) se degasira u toku 15 min propuštanjem mehurića gasa azota. Dodaju se Pd(OAc)2(140 mg, 625 mmol) i 2-dicikloheksillWino-2\4',6,-tri-i-propil-l,r-bifenil (0.596 g, 1.25 mmol) i reakcija se zagreva pod refluksom u toku 16 h. Rastvor se ohladi na temperaturu sredine i doda se metanol (200 mL). Nakon 30 minuta, rastvarač se ukloni pod sniženim pritiskom. Smeša se podeli između etil acetala (500 mL) i slanog rastvora (500 ml) i doda se vodeni rastvor MgSCM(IM: 500 ml) da se pomogne razdvajanje faza. Slojevi se razdvoje a organski sloj se suši preko MgSCUt filtrira kroz 10 cm ploču silika gela, uz eluiranje sa etil acetatom (-1.5 L). Filtrat se odbaci a silika gel ploča se ispere sa 5% rastvorom MeOH u THF (2 L). Metanol ni filtrat se koncentruje pod sniženim pritiskom da se dobije naslovljeno jedinjenje (20. lg, 92%).

MS (m/z): 699 (M+l).

Druga alternativna sinteza Primera 1

Druga alternativna sinteza 4-{4-[(lE)-4-(2.9-diazaspiro[5.5]undek-2-il)but-l-en-l-il]-2-metilbenzil}-5-(propan-2-il)-lFI-pirazol-3-il beta-D-glukopiranozida.

[0070]

[0071] Šema 3. faza D: u rastvor terc-butil 2-{(3E)-4-[3- metil-4-( {5-(propan-2-il)-3-beta-D-glukopiranozil)oksi]-lH-pirazol-4-illmetil)fenil]but-3-en-l-il}-2,9-diaza-spiro[5.5]undekan-9-karboksilata (14.87 g; 21.28 mmol) u dihlormetanu (149 mL) ohlađenom u ledenoj vodi se doda trifluorosirćetna kiselina (32.2 mL; 0.426 mol). Rastvor se ostavi da se zagreje na sobnu temperaturu. Nakon 30 minuta, smeša se polako dodaje u rastvor aminijaka u MeOH (2M; 300 mL), uz hlađenje neophodno da se održava konstantna temperatura. Rastvor se meša na sobnoj temperaturi u toku 15 min. Smeša se koncentruje pod sniženim pritiskom a ostatak se prečisti koristeći SCX-2 smolu. Bazni filtrat se koncentruje pod sniženim pritiskom a ostatak se triturira/sonicira u etil acetata, filtrira i suši. Dobijena Čvrsta supstanca se rastvori u MeOH (200ml) i koncentruje pod vakuumom. Ovo se ponovi nekoliko puta da se dobije naslovljeno jedinjenje (12.22 g. prinos 96%). MS (m/z): 599 (M+l). [a]D<20>= -12 ° (C=0.2, MeOH).

Izrada 20

Sinteza (3E)-4-[3-metil-4-({5-(propan-2-il)-3-E(2,3,4,6-tetra-0-acetiI-beta-D-glukopiranozil)oksi]-lH-pirazol-4-H}metil)fenil]but-3-en-l -il metansulfonata.

[0072]

[0073] Šema 4. faza A. U rastvor 4- {4-[(lE)-4-hidroksibut-l-en-l-il]-2-metilbenzil}-5-(propan-2-il)-l H-pirazol-3-il 2,3,4,6-tetra-O-acetil-beta-D-glukopiranoziđa (3.7, 5.87 mmol) u dihlormetanu (15 mL) i trietilaminu (4 mL, 29 mmol) se na 0 °C doda metansulfoil hlorid (0.54 mL, 7 mmol). Nakon refluksovanja na sobnoj temperaturi u toku 30 min, rastvor se koncentruje i rastvarač ukloni pod sniženim pritiskom. Ostatak se prečisti gasnom hromatografijom da se dobije naslovljeno jedinjenje (2.9 g, 4.1 mmol).

MS (m/z): 708.5 (M+I), 706.5 (M-l).

Izrada 21

Sinteza terc-butil 2-{(3E)-4-[3-metil-4-({5-(propan-2-il)-3-[(2,3,4,6-tetra-0-acetil-beta-D-glukopiranozil)oksi]-lH-pirazoI-4-il{metiI)fenil]but-3-en-l-il}-2,6-diazaspiro[3.5]nonan-6-karboksilata.

[0074]

[0075] Šema 4, faza B. U rastvor (3E)-4-|3-metil-4-({5-(propan- 2-il)-3-[(2,3,4,6-tetra-O-acetil-beta-D-glukopiranozil)oksi]-lH-pirazol-4-il}metil)fenil]but-3-en-]-il metansulfonata (200 mg, 0.28 mmol) i terc-butil 2,6-diazaspiro[3.5]nonan-6-karboksilata (77 mg, 0.34 mmol) u acetonitrilu (3 mL) se doda diizopropiletilamin (0.2 mL, 1.1 mmol). Smeša se zagreva na 80°C u toku noći. Smeša se koncentruje pod sniženim pritiskom a ostatak se prečisti gasnom hromatografijom da se dobije naslovljeno jedinjenje (127 mg, 0.15 mmol).

MS (m/z): 838.8, 839.6 (M+l), 836.8, 837.6 (M-l).

Izrada 22

Sinteza terc-butil 2-{(3E)-4-[3-metil-4-({5-(propan-2-il)-3-[(2,3,4,6-tetra-0-acetil-beta-D-glukopiranozil)oksi]-lH-pirazol-4-il}metil)fenil]but-3-en-l-il}-2.7-diazaspiro[3.5]nonan-7-karboksilata.

[0076]

[0077] Naslovljeno jedinjenje se u suštini izrađuje po postupku za Izradu 21. MS (m/z): 838.8, 839.6 (M+l), 836.8, 837.6 (M-l).

Izrada 23

Sinteza terc-butil 7-{(3E)-4-[3-metil-4-({5-(propan-2-iI)-3-[(2,3.4,6-tetra-0-acetil-beta-D-glukopiranozil)oksi]- ]H-pirazol-4-il}metii)fenil]but-3-en-l-il}-2.7-diazaspiro[3.5]nonan-2-karboksilata.

[0078]

[0079] Naslovljeno jedinjenje se u suštini izrađuje po postupku za Izradu 21. MS (m/z): 838.8, 839.6 (M+l), 836.8, 837.6 (M-l).

Izrada 24

Sinteza terc-butil l-{(3E)-4-[3-metil-4-({5-(propan-2-il)-3-[(2,3,4,6-tetra-0-acetil-beta-D-glukopiranozil)oksi]- lH-pirazol-4-iI}metil)fenil]but-3-en-l-il}-l,8-diazaspiro[4.5]dekan-8-karboksilata.

[0080]

[0081] Naslovljeno jedinjenje se u suštini izrađuje po postupku za Izradu 21. MS (m/z): 852.8, 853.6 (M+l), 850.8, 852.8 (M-l).

Izrada 25

Sinteza terc-butil 8-{(3E)-4-[3-metil-4-({5-(propan-2-il)-3-[(2.3.4,6-tetra-0-acetil-beta-d-glukopiranozil)oksi]-lH- pirazoI-4-il}metil)fenil]but-3-en-l-il}-2.8-diazaspiro[4.5]dekan-2-karboksilata.

[0082]

[0083] Naslovljeno jedinjenje se u suštini izrađuje po postupku za Izradu 21. MS (m/z): 852.8, 853.6 (M+l), 850.8. 851.6 (M-l).

Primer 4

Sinteza 4-{4-[(lE)-4-(2,6-diazaspiro[3.5]non-2-il)but-l-en-l-il]-2-metilbenzil}-5-(propan-2-i!)-l H-pirazol-3-iI beta-D-glukopiranozida.

[0084]

[0085] Šema 4, faza C. U rastvor terc-butil 2-{(3E)-4-[3-metil- 4-({5-(propan-2-il)-3-[(2,3,4,6-tetra-0-acetil-beta-D-gIukopiranozil)oksi]-lh-pirazol-4-il}metil)fenil]but-3-en-l-il}-2,6-diazaspiro[3.5]nonan-6-karboksilata u dihlormetanu (2 mL) se doda smeša 4.0 M rastvora HCl/l,4-dioksan (1.5 mL, 1.5 mmol) i meša 4.0 h na sobnoj temperaturi. Smeša se koncentruje pod sniženim pritiskom da se dobije penasta čvrsta supstanca. Čvrsta supstanca se tretira sa 2.0 M rastvorom amonijaka u MeOH (2 mL) u toku noći. Nakon ] 8 sati na sobnoj temperaturi, smeša se koncentruje i rastvarač ukloni pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak se prečisti postupkom preparativne HPLC: visoki pH, 19% B u toku 3 min, 19-34 B % u toku 5 min @ 85 mL/min koristeći 30 x 75 mm, 5 um Cl 8XBridge ODB kolonu, rastvarač - H2O m NH4HCO3@ pH 10, rastvarač B - MeCN da se dobije naslovljeno jedin jenje kao čvrsta supstanca (47 mg, 0.08 mmol). MS (m/z): 570.8, 571.8 (M+l), 568.7, 569.8 (M-l).

Primer 5

Sinteza 4-{4-[(lE)-4-(2,7-diazaspiro[3.5]non-2-il)but-t-en-l-il]-2-metilbenzil}-5-(propan-2-i 1)-1 H-pi razol -3 -i 1 beta-D-glukopiranozida.

[0086]

[0087] Naslovljeno jedinjenje se u suštini izrađuje po postupku iz Primera 4. MS (m/z): 570.8, 571.8 (M+l), 568.7, 569.8 (M-l).

Primer 6

Sinteza 4-{4-[(l E)-4-(2,7-diazaspiro[3.5]non-7-il)but-l-en-l-il]-2-metilbenzil}-5-(propan-2-il)-1 H-pirazol-3-il beta-D-glukopiranozid trifluoroacetata (1:2).

[0088]

[0089] Naslovljeno jedinjenje se u suštini izrađuje po postupku iz Primera 4 u kome se finalno jedinjenje prečisti postupkom preparativne HPLC pri niskom pH (nizak pH, 16% B u toku 3 min, 16-33 B % u toku 5 min @ 85 mL/mtn koristeći 30 x 75 mm, 5 um Cl 8XBridge ODB kolonu, rastvarač - H20 m 0.1% TFA, rastvarač B - MeCN m 0.1% TFA). MS (m/z): 570.8, 571.8 (M+l), 568.7, 569.8 (M-l).

Primer 7

Sinteza 4-{4-[(lE)-4-(l,8-diazaspiro[4.5]dec-l-il)but-l-en-l-il]-2-metilbenzil}-5-(propan-2-il)-lH-pirazol-3-il beta-D-glukopiranozida.

[0090]

[0091] Naslovljeno jedinjenje se u suštini izrađuje po postupku iz Primera 4. MS (m/z): 584.7, 585.8 (M+l), 582.8, 583.8 (M-l).

Primer 8

Sinteza 4-{4-[(lE)-4-(2,8-diazaspiro[4.5]dec-8-il)but-l-en-l-il]-2-metilbenzil}-5-(propan-2-il)-l H-pirazol-3-il beta-D-glukopiranozida.

[0092]

[0093] Naslovljeno jedinjenje se u suštini izrađuje po postupku iz Primera 4. MS (m/z): 584.7, 585.8 (M+l), 582.8, 583.8 (M-l).

Ispitivanje natrijum- zavisnog glukoza transportera 1 ( SGLT1) i SGLT2

[0094] cDNK koje enkodiraju humani SGLT1 (slc5al, NM 000343), humani SGLT2 (slc5a2, M 003041) i mišji SGLT1 (slc5al, M_0I9810.4) su nabavljene od Openbiosvstems, Invitrogen i Openbiosvstems, tim redom. cDNK je klonirana u pcDNK3.1 + za ekspresiju kod sisara i stabilno je transfektovana u ćelije (CHO)-Kl ovarijuma kineskog hrčka, koristeći standardne procedure transfekcije kod sisara. SGLT-ekspresujući sub-klon svake prekomerno ekspresujuće ćelijske linije je izabran na osnovu rezistencije na neomicin (Geneticin, Invitrogen) i aktivnosti u analizi preuzimanja 14C-cc-metil- D-glukopiranozida (14C-AMG)

(videti u daljem tekstu). Stabilnost SGLT-ekspresujuće ćelije se održava pomoću standardnih tehnika za ćelijsku kulturu.

[0095] Aktivnost SGLT se meri kao preuzimanje natrijum-zavisnog 14C-AMG u prethodnim ćelijskim linijam,a kako je opisano u daljem tekstu. Sto uL medijuma za kulturu koji sadrži 30,000 ćelija se zaseje u svaki otvor BioCoat poli- D-lizin ploče (Becton Dickson) sa 96 otvora i uzgaja u toku noći na 37°C. Medijum za kulturu se aspirira a ćelije se dva puta isperu sa po 200 uL reaktivnog pufera (140 mM NaCl, 2 mM KC1, 1 mM CaCb, MgCb i 14 mM N-2-hidroetilpiperazin-N,-2-etansulfonske kiseline (Hepes ), pH 7.5). Višak pufera se izvuče na papirnim ubrusima. U svaki otvor se doda po trideset i pet uL reaktivnog pufera. U svaki otvor se doda po pet pL 10% dimetilsulfoksida (DMSO) u reaktivnom puferu koji sadrži različite koncentracije test jedinjenja ili ne sadrži jedinjenje kao kontrola. Reakcija se inicira dodavanjem 10 uL 14C-AMG u reaktivni pufer da se izradi finalna koncentracija od 4 uM. Ploča se inkubira 125 minuta na 37°C. Reakcija se zaustavlja izvlačenjem reaktivnog pufera a nakon toga ispiranjem sa 200 uL ledeno hladnog reaktivnog pufera. Primeni se ručno izvlačenje kako bi se osiguralo potpuno uklanjanje reaktivnog pufera. U svaki otvor se doda po 10 uL 0.1 N rastvora NaOH, a nakon toga se doda po 100 uL supermiks koktela za scintilaciju (PerkinElmer). Nakon mešanja, signal scintilacije u ploči se broji u MicroBeta (PerkinElmcr). Kriva dobijena iz odgovora na deset doza se nanosi na empirijski model četiri parametra koristeći ActivitvBase (ID Business Solution) da se odredi koncentracija inhibitora za polovinu maksimalne inhibicije (IC50). Jedinjenja iz ovde datih Primera 1-8 su u osnovi testirana kako je prethodno opisano i ispoljavaju IC50 vrednost za SGLT1 na manje od približno 500 nM.

[0096] JoŠ preciznije, vrednosti u tabeli 1 pokazuju da jedinjenje 1 inhibira humani i mišji SGLT1in vitroi da je mnogo potentniji za humani i mišji SGLT1 nego za humani SGLT2m

vilro.

Efekti snižavanja glukoze u testu tolerancije oralne glukoze ( OGTT)

[0097] Test jedinjenje je formulisano dodavanjem vehikuluma od 1% hidroksietilceluzloze, 0.25% Tvveen® 80 m/ antipeneće sredstvo 0. 05% da se pripremi test jedinjenje za izradu rastvora koncentracije 1 mg/ml. Smeša se sonicira sondom u toku približno 30 sekukndi. Dobijeni rastvor se koristi kao osnovni rastvor od koga se razblaživanjem sa vehikulumom pripremaju rastvori sa dozom manje koncentracije.

[0098] Pojedinačno smešteni C57B1/6 miševi se ostave gladni u toku noći onemogućavanjem pristupa hrani od kasnog popodneva pre dana za ispitivanje. Narednog jutra, miševi se izmere i našte se uzme uzorak krvi iz dela repa za merenje glukoze pomoću glukometra (Roche AccuChek). Studijske grupe (n=5) se određuju na osnovu nivoa glukoze u krvi našte i uključuju preferirane životinje sa nivoom glukoze u rasponu od 80-100 mg/dl glukoze.

[0099] Nakon pođele po grupama, prvom mišu se oralno ubaci 10 ml/kg pripremljenog test jedinjenja i počne izračunavanje vremena. Svakoj narednoj životinji se doza da u razmacima od minut ipo. Tri sata nakon primene prvog jedinjenja počinje ispitivanje, uzima se osnovni uzorak krvi za merenje nivoa glukoze (od prve životinje, iz dela repa). Životinji se nakon toga odmah da oralna doza 50% dekstroze (Hospira) u količini od 3 g/kg. Uzima se uzorak krvi za nivo glukoze, tačno u razmacima od minut ipo iz vene repa, tako da se za svaku životinju uzorak uzima na 20, 40, 60 i 120 minuta nakon doze dekstroze.

[0100] Kako je prethodno pokazano u tabeli 2. jedinjenje iz primera 1 ispoljava smanjenje u pojavi glukoze nakon oralne količine 50% dekstroze (Hospira®) kod normalnih glikemičnih C57B1/6 miševa, u zavisnosti od doze. Primer 1 takođe pokazuje smanjenje oblasti glukoze usklađene sa osnovnom vrednošću ispod krive (AUC) u toku OGTT, u zavisnosti od doze. Pored toga, primer 1, u zavisnosti od doze. smanjuje prosečnu maksimalnu koncentraciju u vrednosti glukoze u plazmi (Cmax) u toku OGTT. dok povećava prosečno vreme koje je potrebno da glukoza dostigne maksimalnu koncentraciju (Tmax).

Vrednosti glukoze u testu tolerancije na mešoviti obrok kod mužjaka pacova sa dijabetesom

indukovanim streptozotocinom

[0101 ] Kod pacova na kojima je primenjen streptozotocin (STZ) je došlo do razvoja dijabetes melitusa. Veruje se da će sredstva koja regulišu vrednosti glukoze kod ovih životinja biti korisna u tretmanu dijabetesa kod ljudi.

[0102] Test jedinjenje se formuliše dodavanjem vehikuluma od 1% hidroksietilceluloze (HEC), 0.25% Tween® 80mlantipeneće sredstvo 0.05% da se pripremi test jedinjenje kao rastvor u koncentraciji od 2.5 mg/ml. Smeša se sonicira sondom u toku približno 30 sekundi. Dobijeni rastvor se koristi kao osnovni rastvor, od koga se razblaživanjeni sa vehikulumom pripremaju rastvori sa dozom manje koncentracije. STZ, 45 mg/kg, se formuliše rastvaranjem u 0.1 M citratni pufer u alikvotama od 3ml i čuva na ledu na tamnom mestu, do početka primene. Koristi se mešoviti obrok sa visokim sadržajem masti (Bio-Serv® Rodent Diet F3282 High Fat) koji sadrži kalorije masti (60%), kalorije ugljovođonika (26%) i kalorije proteina (15%). Pojedinačno smeštenim Dawley pacovima je omogućeno da se prilagode u periodu od 3 do 7 dana.

[0103] U naporima da se osigura da nisu neposredno uzeli hranu, STZ se primenjuje posle podne, približno šest sati u ciklusu dan-noć (svetio se pali u 6 ujutru, gasi u 6 posle podne). Životinje se anesteziraju sa izofluranom a STZ se ubrizga injekcijom u venu repa. Kada životinja povrati svest, vraća se u odeljak i ostavi 7 dana da se oporavi.

[0104] Dva dana neposredno pre testa tolerancije na hranu (MTT) svim pacovima je data mala količina (2-4g) F3282 hrane, tako da se prilagode na nju pre uzimanja u toku eksperimenta. Veče pre eksperimenta, pacovi se prenesu u čiste kaveze a hrana im se ukloni. U toku jutra, životinje se mere i iz dela repa se uzima uzorak krvi za merenje nivoa glukoze (Abbott AIphaTrak glukometri: kod 29). Životinje se podele u grupe n=6 na osnovu telesne težine i nivoa glukoze našte. Trideset minuta nakon oralne primene test jedinjenja, izvrše se dva merenja glukoze. Nakon toga im se da pet grama peleta Bio-Serv® hrane 3282. Nakon 20 minuta, preostala hrana se izdvoji i izmeri. Na 20. 40, 60 i 120 minuta se uzimaju uzorci krvi za merenje glukoze.

[0105] Kako je prethodno pokazano u tabeli 3, jedinjenje iz primera 1 značajno, i u zavisnosti od doze, snižava glukozu u MTT u poređenju sa kontrolnim vehikulumom. Akarboza ne smanjuje značajno glukozu u poređenju sa kontrolama u bilo kojoj vremenskoj tački. Osim toga, postoji smanjenje u AUC-ima podešenim prema osnovnoj vrednosti glukoze u zavisnosti od doze povezano sa tretmanom sa Primerom 1. Akarboza značajno smanjuje AUCe glukoze do vrednosti sličnim sa rezultatima koje postiže Primer 1 u koncentraciji od lOmg/kg. Tabela 3 pokazuje da jedinjenje iz primera 1 reguliše vrednosti glukoze kod mužjaka pacova.

Claims

1. Jedinjenje formule: naznačeno time što X predstavlja sledeće: ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

2. Jedinjenje ili so u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačeno time što je to:

3. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 2. naznačeno time što je to:

4. Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3, naznačeno time što je za upotrebu u terapiji.

5. Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3, naznačeno time sto je za upotrebu u tretmanu dijabetesa.

6. Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so u skladu sa patentnim zahtevom 5, nazačeno time što je za upotrebu u tretmanu dijabetesa tip 1.

7. Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so u skladu sa patentnim zahtevom 5, nazačeno time stoje za upotrebu u tretmanu dijabetesa tip 2.

8. Farmaceutska kompozicija koja uključuje jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva I do 3, naznačena time što je u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača ili ekscipijenata.

9. Farmaceutska kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 8, naznačena time što dalje uključuje jedno ili više drugih farmaceutskih sredstava.