KR101858881B1

KR101858881B1 - 4-｛4-[(1e)-4-(2,9-디아자스피로[5.5]운데스-2-일)부트-1-엔-1-일]-2-메틸벤질｝-5-(프로판-2-일)-1h-피라졸-3-일 베타-d-글루코피라노시드 아세테이트

Info

Publication number: KR101858881B1
Application number: KR1020167011764A
Authority: KR
Inventors: 수잔 마리 뤼첼-에덴스
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 2013-11-08
Filing date: 2014-10-30
Publication date: 2018-05-16
Also published as: US20160215011A1; LT3066108T; MX2016005999A; IL244899B; AU2014347065B2; AR098670A1; CN105705509B; AU2014347065A1; JP6197113B2; MY192242A; DOP2016000067A; JP2016539099A; TWI655198B; PT3066108T; EP3066108A1; MX368174B; ES2703944T3; US9573970B2; PH12016500851A1; RS58050B1

Abstract

본 발명은 당뇨병의 치료에 유용한 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물을 제공한다.
<화학식 I>

Description

4-｛4-[(1E)-4-(2,9-디아자스피로[5.5]운데스-2-일)부트-1-엔-1-일]-2-메틸벤질｝-5-(프로판-2-일)-1H-피라졸-3-일 베타-D-글루코피라노시드 아세테이트 {4-｛4-[(1E)-4-(2,9-DIAZASPIRO[5.5]UNDEC-2-YL)BUT-1-EN-1-YL]-2-METHYLBENZYL｝-5-(PROPAN-2-YL)-1H-PYRAZOL-3-YL BETA-D-GLUCOPYRANOSIDE ACETATE}

본 발명은 피라졸 화합물의 아세테이트 염인 신규 SGLT1 억제제, 상기 화합물을 포함하는 제약 조성물, 생리학적 장애를 치료하기 위한 상기 화합물의 사용 방법, 및 상기 화합물의 합성에 유용한 중간체 및 방법에 관한 것이다.

본 발명은 당뇨병, 및 고혈당증과 연관된 다른 질환 및 장애의 치료 분야 내에 있다. 당뇨병은 높은 수준의 혈액 글루코스를 특징으로 하는 질환 군이다. 이는 미국 내에서 대략 2천5백만명의 사람들에 침범하고 있으며, 또한 문헌 [2011 National Diabetes Fact Sheet (U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention)]에 따르면 미국 내 7번째 주요 사망 원인이다. 나트륨-커플링된 글루코스 공동수송체 (SGLT)는 글루코스와 같은 탄수화물의 흡수를 담당하는 것으로 공지된 수송체 중 하나이다. 보다 구체적으로, SGLT1은 소장의 솔가장자리 막을 횡단하는 글루코스의 수송을 담당한다. SGLT1의 억제는 소장에서의 글루코스의 감소된 흡수를 유발함으로써, 당뇨병을 치료하는데 유용한 접근법을 제공할 수 있다.

미국 특허 번호 7,655,632는, 인간 SGLT1 억제 활성을 가지며, 당뇨병과 같은 고혈당증과 연관된 질환의 예방 또는 치료에 유용한 것으로 추가로 개시되는 특정 피라졸 유도체를 개시하고 있다. 또한, WO 2011/039338은, SGLT1/SGLT2 억제제 활성을 가지며, 골다공증과 같은 골 질환의 치료에 유용한 것으로 추가로 개시되는 특정 피라졸 유도체를 개시하고 있다.

당뇨병을 위한 대안적 약물 및 치료에 대한 필요가 존재한다. 본 발명은, SGLT1 억제제이고, 그 자체로 특정 장애, 예컨대 당뇨병의 치료에 적합할 수 있는 피라졸 화합물의 아세테이트 염을 제공한다.

따라서, 본 발명은 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물을 제공한다.

<화학식 I>

본 발명은 또한 수화된 화학식 I의 화합물의 결정질 형태를 제공한다.

또한, 본 발명은 수화되고, 다음 중 적어도 하나를 특징으로 하는 화학식 I의 화합물의 결정질 형태를 제공한다:

a. 5.2°의 회절각 2-세타에서의 강한 피크를 7.8°, 8.0° 및 10.7° (각각 ± 0.2°)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 강한 피크와 조합하여 갖는, CuKα 방사선을 사용한 X선 분말 회절 패턴; 및

b. 아다만탄의 고자장 공명 (δ=29.5 ppm)을 기준으로 181.8, 161.2, 160.0, 147.6 및 137.4 ppm (각각 ±0.2 ppm)에서의 피크를 포함하는 ¹³C 고체 상태 NMR 스펙트럼.

본 발명은 주위 온도에서의 물 함량이 약 9 중량% 내지 약 12 중량% 범위인 수화된 화학식 I의 결정질 형태를 추가로 제공한다.

또한, 본 발명은 당뇨병의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 제1형 당뇨병의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 제1형 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 제2형 당뇨병의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 제2형 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 글루코스 내성 장애 (IGT), 공복 글루코스 장애 (IFG) 또는 대사 증후군의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 글루코스 내성 장애 (IGT), 공복 글루코스 장애 (IFG) 또는 대사 증후군을 치료하는 방법을 제공한다.

게다가, 본 발명은 특히 당뇨병의 치료를 위한, 요법에 사용하기 위한 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물을 제공한다. 또한, 본 발명은 제1형 당뇨병의 치료에 사용하기 위한 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물을 제공한다. 또한, 본 발명은 제2형 당뇨병의 치료에 사용하기 위한 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물을 제공한다. 본 발명은 추가로 IGT, IFG 또는 대사 증후군의 치료에 사용하기 위한 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물을 제공한다. 본 발명은 또한 당뇨병 치료용 의약의 제조를 위한 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물의 용도를 제공한다. 게다가, 본 발명은 제1형 당뇨병 치료용 의약의 제조를 위한 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 제2형 당뇨병 치료용 의약의 제조를 위한 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 IGT, IFG 또는 대사 증후군 치료용 의약의 제조를 위한 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물의 용도를 제공한다.

본 발명은 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물을 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물을 추가로 제공한다. 특정한 실시양태에서, 조성물은 1종 이상의 다른 치료제를 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물의 합성을 위한 신규 중간체 및 방법을 포괄한다.

또한, 본 발명은 4-{4-[(1E)-4-(2,9-디아자스피로[5.5]운데스-2-일)부트-1-엔-1-일]-2-메틸벤질}-5-(프로판-2-일)-1H-피라졸-3-일 베타-D-글루코피라노시드와 습윤 에틸 아세테이트를 혼합하는 것을 포함하는, 결정질 SGLT1 억제제의 제조 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 4-{4-[(1E)-4-(2,9-디아자스피로[5.5]운데스-2-일)부트-1-엔-1-일]-2-메틸벤질}-5-(프로판-2-일)-1H-피라졸-3-일 베타-D-글루코피라노시드와 습윤 에틸 아세테이트를 혼합한 후, 생성된 고체를 수집하는 것을 포함하는, 결정질 SGLT 억제제의 제조 방법을 제공한다.

무정형 고체인 4-{4-[(1E)-4-(2,9-디아자스피로[5.5]운데스-2-일)부트-1-엔-1-일]-2-메틸벤질}-5-(프로판-2-일)-1H-피라졸-3-일 베타-D-글루코피라노시드 (유리 염기)의 단리 및 정제는 자원 집중적일 수 있는 크로마토그래피의 사용을 필요로 한다. 화학식 I의 화합물은 크로마토그래피의 제거를 통해 단리 및 정제의 개선을 허용하고, 특히 제약 조성물의 상업적 제조 및 저장에 있어서, 제약 제제에 대한 형태 안정성 및 취급 특성이 개선된 결정질 형태를 제공한다.

본원에 사용된 용어 "강한 피크"는 관련 스펙트럼 또는 분말 패턴에서 가장 강한 피크의 적어도 5%인 강도를 갖는 피크를 의미한다.

본원에 사용된 용어 "치료하는" 또는 "치료하는 것"은 기존 증상 또는 장애의 진행 또는 중증도를 저지, 둔화, 정지 또는 역전시키는 것을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "환자"는 포유동물, 예컨대 마우스, 기니 피그, 래트, 개 또는 인간을 지칭한다. 바람직한 환자는 인간인 것으로 이해된다.

본원에 사용된 용어 "유효량"은 환자에게 단일 또는 다중 용량 투여 시 진단 또는 치료 중인 환자에서 목적하는 효과를 제공하는, 본 발명의 화합물의 양 또는 용량을 지칭한다.

유효량은 관련 기술분야의 통상의 기술자로서 담당 진단자에 의해, 공지된 기술의 사용에 의해 및 유사한 상황 하에 얻어진 결과를 관찰함으로써 용이하게 결정될 수 있다. 환자에 대한 유효량을 결정하는데 있어서, 포유동물의 종; 그의 크기, 연령, 및 전반적 건강; 침범된 구체적 질환 또는 장애; 질환 또는 장애의 침범 정도 또는 중증도; 개별 환자의 반응; 투여된 특정한 화합물; 투여 방식; 투여된 제제의 생체이용률 특징; 선택된 투여 요법; 병용 의약의 사용; 및 다른 관련 상황을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 인자가 담당 진단자에 의해 고려된다.

화학식 I의 화합물은 일반적으로 넓은 투여량 범위에 걸쳐 유효하다. 예를 들어, 1일 투여량은 정상적으로 약 0.01 내지 약 30 mg/kg 체중 범위 내에 있다. 일부 경우에, 상기 범위의 하한치 미만의 투여량 수준이 보다 적절할 수 있고, 반면에 다른 경우에는 더 많은 용량이 임의의 유해한 부작용을 유발하지 않으면서 사용될 수 있고, 따라서 상기 투여량 범위는 어떤 방식으로도 본 발명 범위를 제한하고자 하지는 않는다.

본 발명의 화합물은 바람직하게는 화합물을 생체이용가능하게 하는 임의의 경로에 의해 투여되는 제약 조성물로서 제제화된다. 가장 바람직하게는, 이러한 조성물은 경구 투여를 위한 것이다. 이러한 제약 조성물 및 그의 제조 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. (예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, Editor, 21st Edition., Lippincott, Williams & Wilkins, 2006] 참조).

본 발명의 추가 측면에서, 본 발명의 화합물은 1종 이상의 치료제, 예컨대 항당뇨병제와 조합으로 투여될 수 있다. 조합 투여는 동시 또는 순차적 투여를 포함한다. 또한, 조합의 동시 투여는 각 치료제의 단일 조합 용량 또는 별개의 용량과 같을 수 있다. 항당뇨병제의 예는 메트포르민; DPPIV 억제제, 예컨대 시타글립틴 또는 리나글립틴; 술포닐우레아, 예컨대 글리메피리드; 티아졸리딘디온, 예컨대 피오글리타존; 기저 인슐린, 예컨대 글라진; 신속 작용 인슐린, 예컨대 휴마로그(HUMALOG) 또는 노보로그(NOVOLOG); GLP-1 효능제, 예컨대 엑세나티드 또는 리라글루티드; SGLT2 억제제, 예컨대 다파글리플로진 또는 엠파글리플로진; 글루카곤 수용체 길항제, 예컨대 LY2409021 등을 포함한다.

화학식 I의 화합물은 하기 제시된 제조예, 실시예 및 반응식에 예시된 바와 같이 제조될 수 있다. 시약 및 출발 물질은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 입수가능하다. 달리 명시되지 않는 한, 모든 치환기는 이전에 정의된 바와 같다. 이들 반응식, 제조예 및 실시예는 어떤 방식으로도 본 발명의 범주를 제한하고자 하지는 않는 것으로 이해된다.

분해의 예는 선택적 결정화 기술 또는 키랄 크로마토그래피를 포함한다. (예를 들어 문헌 [J. Jacques, et al., "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981, 및 E.L. Eliel and S.H. Wilen," Stereochemistry of Organic Compounds", Wiley-Interscience, 1994] 참조). 개별 부분입체이성질체 또는 기하 이성질체의, 크로마토그래피, 키랄 크로마토그래피 또는 선택적 결정화에 의해, 분리 및 단리가 합성에서 임의의 편리한 시점에 일어날 수 있다는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 또한 명백하여야 한다.

본원에 사용된 "δ"는 테트라메틸실란으로부터의 백만분율 다운-필드를 지칭하고; "min"은 분을 지칭하고; "THF"는 테트라히드로푸란을 지칭하고; "MeOH"는 메탄올 또는 메틸 알콜을 지칭하고; "HPLC"는 고성능 액체 크로마토그래피를 지칭한다.

용어 "Ac"는 하기 구조의 아세틸 치환기를 지칭한다:

용어 "Bz"는 하기 구조의 벤조일 치환기를 지칭한다:

용어 "BOC"는 t-부틸옥시카르보닐 보호기를 지칭한다.

<반응식 1>

제조예 1

(4-브로모-2-메틸-페닐)메탄올

반응식 1, 단계 A: 보란-테트라히드로푸란 복합체 (0.2 mol, 200 mL, 1.0 M 용액)를 테트라히드로푸란 (200 mL) 중 4-브로모-2-메틸벤조산 (39 g, 0.18 mol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 18시간 후, 감압 하에 용매를 제거하여 고체를 수득하였다. 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 백색 고체 (32.9 g, 0.16 mol)로서 수득하였다.

¹H NMR (CDCl₃): δ 1.55 (s, 1H), 2.28 (s, 3H), 4.61 (s, 2H), 7.18-7.29 (m, 3H).

(4-브로모-2-메틸-페닐)메탄올의 대안적 합성.

보란-디메틸 술피드 복합체 (THF 중 2M; 116 mL, 0.232 mol)를 3℃에서 무수 테트라히드로푸란 (THF, 146 mL) 중 4-브로모-2-메틸벤조산 (24.3 g, 0.113 mol)의 용액에 천천히 첨가하였다. 10분 동안 차갑게 교반한 후, 냉각 조를 제거하고, 반응물을 주위 온도로 천천히 가온되도록 하였다. 1시간 후, 용액을 5℃로 냉각시키고, 물 (100 mL)을 천천히 첨가하였다. 에틸 아세테이트 (100 mL)를 첨가하고, 상을 분리하였다. 유기 층을 포화 수성 NaHCO₃ 용액 (200 mL)으로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 여과하고 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였으며, 이를 실리카의 짧은 패드를 통해 15% 에틸 아세테이트/이소-헥산을 사용하여 용리하면서 여과함으로써 정제하여 표제 화합물 (20.7 g, 91.2% 수율)을 수득하였다.

MS (m/z): 183/185 (M+1-18).

제조예 2

4-브로모-1-클로로메틸-2-메틸-벤젠

반응식 1, 단계 B: 티오닐 클로라이드 (14.31 mL, 0.2 mol)를 0℃에서 디클로로메탄 (200 mL) 및 디메틸포름아미드 (0.025 mol, 2.0 mL) 중 (4-브로모-2-메틸-페닐)메탄올 (32.9 g, 0.16 mol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 1시간 후, 혼합물을 빙수 (100 g)에 붓고, 디클로로메탄 (300 mL)으로 추출하고, 추출물을 5% 수성 중탄산나트륨 (30 mL) 및 염수 (200 mL)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켜 조 표제 화합물을 백색 고체 (35.0 g, 0.16 mol)로서 수득하였다. 물질을 반응의 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.

¹H NMR (CDCl₃): δ 2.38 (s, 3H), 4.52 (s, 2H), 7.13-7.35 (m, 3H).

4-브로모-1-클로로메틸-2-메틸-벤젠의 대안적 합성.

메탄술포닐 클로라이드 (6.83 mL, 88.3 mmol)를 얼음/물에서 냉각시킨 디클로로메탄 (80.7 mL) 중 (4-브로모-2-메틸-페닐)메탄올 (16.14 g, 80.27 mmol) 및 트리에틸아민 (16.78 mL; 120.4 mmol)의 용액에 천천히 첨가하였다. 혼합물을 주위 온도로 천천히 가온되도록 하고, 16시간 동안 교반하였다. 추가의 메탄술포닐 클로라이드 (1.24 mL; 16.1 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 주위 온도에서 2시간 동안 교반하였다. 물 (80mL)을 첨가하고, 상을 분리하였다. 유기 층을 염산 (1N; 80 mL), 이어서 포화 수성 탄산수소나트륨 용액 (80 mL), 이어서 물 (80 mL)로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 여과하고 감압 하에 농축시켜 잔류물을 수득하였으며, 이를 플래쉬 크로마토그래피 (헥산을 사용하여 용리함)에 의해 정제하여 표제 화합물 (14.2 g; 80.5% 수율)을 수득하였다.

¹H NMR (300.11 MHz, CDCl₃): δ 7.36-7.30 (m, 2H), 7.18 (d, J= 8.1 Hz, 1H), 4.55 (s, 2H), 2.41 (s, 3H).

제조예 3

4-[(4-브로모-2-메틸-페닐)메틸]-5-이소프로필-1H-피라졸-3-올

반응식 1, 단계 C: 수소화나트륨 (8.29 g, 0.21 mol, 오일 중 60% 분산액)을 0℃에서 테트라히드로푸란 중 메틸 4-메틸-3-옥소발레레이트 (27.1 mL, 0.19 mol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 30분 후, 테트라히드로푸란 (50 mL) 중 4-브로모-1-클로로메틸-2-메틸-벤젠 (35.0 g, 0.16 mol)의 용액을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 70℃에서 밤새 (18시간) 가열하였다. 1.0 M HCl (20 mL)을 첨가하여 반응물을 켄칭하였다. 에틸 아세테이트 (200 mL)로 추출하고, 추출물을 물 (200 mL) 및 염수 (200 mL)로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 톨루엔 (200 mL) 중에 용해시키고, 히드라진 1수화물 (23.3 mL, 0.48 mol)을 첨가하였다. 혼합물을 120℃에서 2시간 동안 딘-스타크(Dean-Stark) 장치를 사용하여 가열하여 물을 제거하였다. 냉각시키고, 감압 하에 용매를 제거하고, 잔류물을 디클로로메탄 (50 mL) 및 메탄올 (50 mL) 중에 용해시켰다. 이 용액을 물 (250 mL)을 함유하는 비커에 천천히 붓는다. 생성된 침전된 생성물을 진공 여과에 의해 수집하였다. 진공 하에 오븐에서 40℃에서 밤새 건조시켜 표제 화합물을 고체 (48.0 g, 0.16 mol)로서 수득하였다.

MS (m/z): 311.0 (M+1), 309.0 (M-1).

4-[(4-브로모-2-메틸-페닐)메틸]-5-이소프로필-1H-피라졸-3-올의 대안적 합성.

아세토니트릴 (65.8 mL) 중 4-브로모-1-클로로메틸-2-메틸-벤젠 (13.16 g, 59.95 mmol)의 용액을 제조하였다. 탄산칼륨 (24.86 g, 179.9 mmol), 아이오딘화칼륨 (11.94 g, 71.94 mmol) 및 메틸 4-메틸-3-옥소발레레이트 (8.96 mL; 62.95 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 주위 온도에서 20시간 동안 교반하였다. 염산 (2N)을 첨가하여 pH 3을 수득하였다. 용액을 에틸 아세테이트 (100 ml)로 추출하고, 유기 상을 염수 (100 ml)로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 혼합물을 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 톨루엔 (65.8 mL) 중에 용해시키고, 히드라진 1수화물 (13.7 mL, 0.180 mol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 환류 하에 가열하고, 딘 앤 스타크 장치를 사용하여 물을 제거하였다. 3시간 후, 혼합물을 90℃로 냉각시키고, 추가의 히드라진 1수화물 (13.7 mL; 0.180 mol)을 첨가하고, 혼합물을 환류 하에 1시간 동안 가열하였다. 혼합물을 냉각시키고, 감압 하에 농축시켰다. 생성된 고체를 물 (200 mL)로 연화처리하고, 여과하고, 진공 오븐에서 P₂O₅ 상에서 60℃에서 건조시켰다. 고체를 이소-헥산 (200 mL)으로 연화처리하고, 여과하여 표제 화합물 (14.3 g; 77.1% 수율)을 수득하였다.

MS (m/z): 309/311 (M+1).

제조예 4

4-(4-브로모-2-메틸벤질)-5-(프로판-2-일)-1H-피라졸-3-일 2,3,4,6-테트라-O-벤조일-베타-D-글루코피라노시드

반응식 1, 단계 D: 1L 플라스크에, 4-[(4-브로모-2-메틸-페닐)메틸]-5-이소프로필-1H-피라졸-3-올 (20 g, 64.7 mmol), 알파-D-글루코피라노실 브로마이드 테트라벤조에이트 (50 g, 76 mmol), 벤질트리부틸암모늄 클로라이드 (6 g, 19.4 mmol), 디클로로메탄 (500 mL), 탄산칼륨 (44.7 g, 323 mmol) 및 물 (100 mL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 디클로로메탄 (500mL)으로 추출하였다. 추출물을 물 (300 mL) 및 염수 (500 mL)로 세척하였다. 유기 상을 황산나트륨 상에거 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물 (37 g, 64 mmol)을 수득하였다.

MS (m/z): 889.2 (M+1), 887.2 (M-1).

제조예 5

4-{4-[(1E)-4-히드록시부트-1-엔-1-일]-2-메틸벤질}-5-(프로판-2-일)-1H-피라졸-3-일 2,3,4,6-테트라-O-벤조일-베타-D-글루코피라노시드

반응식 1, 단계 E: 3-부텐-1-올 (0.58 mL, 6.8 mmol)을 아세토니트릴 (30 mL) 및 트리에틸아민 (20 mL) 중 4-(4-브로모-2-메틸벤질)-5-(프로판-2-일)-1H-피라졸-3-일 2,3,4,6-테트라-O-벤조일-베타-D-글루코피라노시드 (3 g, 3.4 mmol)의 용액에 첨가하였다. 용액을 질소로 10분에 걸쳐 탈기하였다. 트리-o-톨릴포스핀 (205 mg, 0.67 mmol) 및 아세트산팔라듐 (76 mg, 0.34 mmol)을 첨가하였다. 90℃에서 2시간 동안 환류하였다. 실온으로 냉각시키고, 감압 하에 농축시켜 용매를 제거하였다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물 (2.1 g, 2.4 mmol)을 수득하였다.

MS (m/z): 878.4 (M+1).

제조예 6

4-{4-[(1E)-4-옥시부트-1-엔-1-일]-2-메틸벤질}-5-(프로판-2-일)-1H-피라졸-3-일 2,3,4,6-테트라-O-벤조일-베타-D-글루코피라노시드

반응식 1, 단계 F: 3,3,3-트리아세톡시-3-아이오도프탈리드 (134 mg, 0.96 mmol)를 0℃에서 디클로로메탄 (20 mL) 중 4-{4-[(1E)-4-히드록시부트-1-엔-1-일]-2-메틸벤질}-5-(프로판-2-일)-1H-피라졸-3-일 2,3,4,6-테트라-O-벤조일-베타-D-글루코피라노시드 (280 mg, 0.32 mmol) 및 중탄산나트륨 (133.8 mg, 1.6 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 15분 후, 반응물을 포화 수성 티오황산나트륨 (10 mL)으로 켄칭하였다. 디클로로메탄 (30 mL)으로 추출하였다. 추출물을 물 (30 mL) 및 염수 (40 mL)로 세척하였다. 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물 (270 mg, 0.31 mmol)을 수득하였다.

MS (m/z): 876.5 (M+1), 874.5 (M-1).

제조예 7

tert-부틸 2-{(3E)-4-[3-메틸-4-({5-(프로판-2-일)-3-[(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-베타-D-글루코피라노실)옥시]-1H-피라졸-4-일}메틸)페닐]부트-3-엔-1-일}-2,9-디아자스피로[5.5]운데칸-9-카르복실레이트

반응식 1, 단계 G: 소듐 트리아세톡시보로히드라이드 (98 mg, 0.46 mmol)를 1,2-디클로로에탄 (5 mL) 중 4-{4-[(1E)-4-옥시부트-1-엔-1-일]-2-메틸벤질}-5-(프로판-2-일)-1H-피라졸-3-일 2,3,4,6-테트라-O-벤조일-베타-D-글루코피라노시드 (270 mg, 0.31 mmol) 및 tert-부틸 2,9-디아자스피로[5.5]운데칸-9-카르복실레이트 히드로클로라이드 (179 mg, 0.62 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 30분 후, 반응물을 포화 수성 중탄산나트륨 (10 mL)으로 켄칭하였다. 디클로로메탄 (30 mL)으로 추출하였다. 추출물을 물 (30 mL) 및 염수 (40 mL)로 세척하고, 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물 (275 mg, 0.25 mmol)을 수득하였다.

MS (m/z): 1115.6 (M+1).

제조예 8

4-{4-[(1E)-4-(2,9-디아자스피로[5.5]운데스-2-일)부트-1-엔-1-일]-2-메틸벤질}-5-(프로판-2-일)-1H-피라졸-3-일 2,3,4,6-테트라-O-벤조일-베타-D-글루코피라노시드 디히드로클로라이드

반응식 1, 단계 H: 염화수소 (1,4-디옥산 중 4.0 M 용액, 0.6 mL, 2.4 mmol)를 디클로로메탄 (5 mL) 중 tert-부틸 2-{(3E)-4-[3-메틸-4-({5-(프로판-2-일)-3-[(2,3,4,6-테트라-O-벤조일-베타-D-글루코피라노실)옥시]-1H-피라졸-4-일}메틸)페닐]부트-3-엔-1-일}-2,9-디아자스피로[5.5]운데칸-9-카르복실레이트 (275 mg, 0.25 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 밤새 (18시간) 후, 감압 하에 농축시켜 용매를 제거하여 표제 화합물을 고체 (258 mg, 0.24 mmol)로서 수득하였다.

MS (m/z): 1015.6 (M+1).

반응식 2

제조예 9

4-(4-브로모-2-메틸벤질)-5-(프로판-2-일)-1H-피라졸-3-일 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-베타-D-글루코피라노시드.

반응식 2, 단계 A: 1 L 플라스크에, 4-[(4-브로모-2-메틸-페닐)메틸]-5-이소프로필-1H-피라졸-3-올 (24 g, 77.6 mmol), 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-알파-D-글루코피라노실 브로마이드 (50.4 g, 116 mmol), 벤질트리부틸암모늄 클로라이드 (5 g, 15.5 mmol), 디클로로메탄 (250 mL), 탄산칼륨 (32 g, 323 mmol) 및 물 (120 mL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 디클로로메탄 (450 mL)으로 추출하였다. 추출물을 물 (300 mL) 및 염수 (500 mL)로 세척하였다. 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물 (36.5 g, 57 mmol)을 수득하였다.

MS (m/z): 638.5 (M+1), 636.5 (M-1).

4-(4-브로모-2-메틸벤질)-5-(프로판-2-일)-1H-피라졸-3-일 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-베타-D-글루코피라노시드의 대안적 합성.

시약 4-[(4-브로모-2-메틸-페닐)메틸]-5-이소프로필-1H-피라졸-3-올 (24.0 g, 77.6 mmol), 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-알파-D-글루코피라노실 브로마이드 (50.4 g, 116 mmol), 벤질트리부틸암모늄 클로라이드 (4.94 g, 15.52 mmol), 탄산칼륨 (32.18 g, 232.9 mmol), 디클로로메탄 (250 mL) 및 물 (120 mL)을 합하고, 혼합물을 주위 온도에서 18시간 동안 교반하였다. 혼합물을 디클로로메탄 (250 mL)과 물 (250 mL) 사이에 분배하였다. 유기 상을 염수 (250 mL)로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피 (디클로로메탄 중 10% 에틸 아세테이트에서 디클로로메탄 중 70% 에틸 아세테이트를 사용하여 용리함)에 의해 정제하여 표제 화합물 (36.5 g, 74% 수율)을 수득하였다.

MS (m/z): 639/641 (M+1).

제조예 10

4-{4-[(1E)-4-히드록시부트-1-엔-1-일]-2-메틸벤질}-5-(프로판-2-일)-1H-피라졸-3-일 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-베타-D-글루코피라노시드

반응식 2, 단계 B: 3-부텐-1-올 (6.1 mL, 70 mmol)을 아세토니트릴 (200 mL) 및 트리에틸아민 (50 mL) 중 4-(4-브로모-2-메틸벤질)-5-(프로판-2-일)-1H-피라졸-3-일 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-베타-D-글루코피라노시드 (15 g, 23.5 mmol)의 용액에 첨가하였다. 용액을 질소로 10분에 걸쳐 탈기하였다. 트리-o-톨릴포스핀 (1.43 g, 4.7 mmol) 및 아세트산팔라듐 (526 mg, 2.35 mmol)을 첨가하였다. 90℃에서 2시간 동안 환류한 후, 냉각시키고, 감압 하에 농축시켜 용매를 제거하였다. 생성된 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물 (7.5 g, 11.9 mmol)을 수득하였다.

MS (m/z): 631.2 (M+1), 629.2 (M-1).

제조예 11

4-{4-[(1E)-4-옥시부트-1-엔-1-일]-2-메틸벤질}-5-(프로판-2-일)-1H-피라졸-3-일 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-베타-D-글루코피라노시드

반응식 2, 단계 C: 3,3,3-트리아세톡시-3-아이오도프탈리드 (2.1g, 4.76 mmol)를 0℃에서 디클로로메탄 (50 mL) 중 4-{4-[(1E)-4-히드록시부트-1-엔-1-일]-2-메틸벤질}-5-(프로판-2-일)-1H-피라졸-3-일 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-베타-D-글루코피라노시드 (1.5 g, 2.38 mmol) 및 중탄산나트륨 (2 g, 23.8 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 15분 후, 반응물을 포화 수성 티오황산나트륨 (10 mL)으로 켄칭하였다. 디클로로메탄 (30 mL)으로 추출하고, 추출물을 물 (30 mL) 및 염수 (40 mL)로 세척하였다. 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물 (0.95 g, 1.51 mmol)을 수득하였다.

MS (m/z): 628.8(M+1), 626.8 (M-1).

제조예 12a

tert-부틸 2-{(3E)-4-[3-메틸-4-({5-(프로판-2-일)-3-[(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-베타-D-글루코피라노실)옥시]-1H-피라졸-4-일}메틸)페닐]부트-3-엔-1-일}-2,9-디아자스피로[5.5]운데칸-9-카르복실레이트

반응식 2, 단계 D: 소듐 트리아세톡시보로히드라이드 (303 mg, 1.4 mmol)를 1,2-디클로로에탄 (30 mL) 중 4-{4-[(1E)-4-옥시부트-1-엔-1-일]-2-메틸벤질}-5-(프로판-2-일)-1H-피라졸-3-일 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-베타-D-글루코피라노시드 (600 mg, 0.95 mmol) 및 tert-부틸 2,9-디아자스피로[5.5]운데칸-9-카르복실레이트 히드로클로라이드 (333 mg, 1.2 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 30분 후, 반응물을 포화 수성 중탄산나트륨 (15 mL)으로 켄칭하였다. 디클로로메탄 (60 mL)으로 추출하였다. 추출물을 물 (30 mL) 및 염수 (60 mL)로 세척하였다. 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물 (500 mg, 0.58 mmol)을 수득하였다.

MS (m/z): 866.8, 867.8 (M+1), 864.8, 865.8 (M-1).

제조예 13

4-{4-[(1E)-4-(2,9-디아자스피로[5.5]운데스-2-일)부트-1-엔-1-일]-2-메틸벤질}-5-(프로판-2-일)-1H-피라졸-3-일 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-베타-D-글루코피라노시드 디히드로클로라이드

반응식 2, 단계 E: 염화수소 (1,4-디옥산 중 4.0 M 용액, 1.5 mL, 5.8 mmol)를 디클로로메탄 (20 mL) 중 tert-부틸 2-{(3E)-4-[3-메틸-4-({5-(프로판-2-일)-3-[(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-베타-D-글루코피라노실)옥시]-1H-피라졸-4-일}메틸)페닐]부트-3-엔-1-일}-2,9-디아자스피로[5.5]운데칸-9-카르복실레이트 (500 mg, 0.58 mmol)의 용액에 첨가하였다. 실온에서 2시간 후, 감압 하에 농축시켜 용매를 제거하여 표제 화합물을 고체 (480 mg, 0.57 mmol)로서 수득하였다.

MS (m/z): 767.4 (M+1).

반응식 3

제조예 14

tert-부틸 4-부트-3-이닐-4,9-디아자스피로[5.5]운데칸-9-카르복실레이트

반응식 3, 단계 A: 탄산세슘 (46.66 g, 143.21 mmol)을 아세토니트릴 (167 mL) 중 tert-부틸 4,9-디아자스피로[5.5]운데칸-9-카르복실레이트 히드로클로라이드 (16.66 g, 57.28 mmol)의 현탁액에 첨가하였다. 혼합물을 주위 온도에서 10분 동안 교반한 다음, 4-브로모부틴 (6.45 mL, 68.74 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 환류 하에 가열하고, 18시간 동안 교반하였다. 혼합물을 냉각시키고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 물 (200 mL)과 에틸 아세테이트 (150 mL) 사이에 분배하였다. 상을 분리하고, 수성 층을 에틸 아세테이트 (100 mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 물 (200 mL)에 이어서 염수 (150 mL)로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜 표제 화합물 (17.2 g, 98% 수율)을 수득하였다.

¹H NMR (300.11 MHz, CDCl₃): δ 3.43-3.31 (m, 4H), 2.53-2.48 (m, 2H), 2.37-2.29 (m, 4H), 2.20 (s, 2H), 1.94 (t, J= 2.6 Hz, 1H), 1.44 (s, 17H).

제조예 15

tert-부틸 4-[(E)-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)부트-3-에닐]-4,9-디아자스피로[5.5]운데칸-9-카르복실레이트

반응식 3, 단계 B: 트리에틸아민 (5.62 mmol; 0.783 mL), 4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란 (8.56 mL, 59.0 mmol) 및 지르코노센 클로라이드 (1.45 g, 5.62 mmol)를 tert-부틸 4-부트-3-이닐-4,9-디아자스피로[5.5]운데칸-9-카르복실레이트 (17.21 g, 56.16 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 65℃로 3.5시간 동안 가열하였다. 혼합물을 냉각시키고, 디클로로메탄 (150 mL) 중에 용해시켰다. 생성된 용액을 실리카 겔의 ~4cm 두께 패드를 통해 디클로로메탄 (2 x 200 mL)을 사용하여 용리하면서 통과시켰다. 여과물을 감압 하에 농축시켜 표제 화합물 (21.2 g, 87% 수율)을 수득하였다.

¹H NMR (300.11 MHz, CDCl₃): δ 6.65-6.55 (m, 1H), 5.49-5.43 (m, 1H), 3.42-3.29 (m, 4H), 2.40-2.27 (m, 6H), 2.25-2.08 (m, 2H), 1.70 - 1.13 (m, 29H).

제조예 16

tert-부틸 2-{(3E)-4-[3-메틸-4-({5-(프로판-2-일)-3-베타-D-글루코피라노실)옥시]-1H-피라졸-4-일}메틸)페닐]부트-3-엔-1-일}-2,9-디아자스피로[5.5]운데칸-9-카르복실레이트

반응식 3, 단계 C: 테트라히드로푸란 (200 mL) 및 물 (40 mL) 중 4-(4-브로모-2-메틸벤질)-5-(프로판-2-일)-1H-피라졸-3-일 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-베타-D-글루코피라노시드 (20 g, 31.3 mmol), tert-부틸 4-[(E)-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)부트-3-에닐]-4,9-디아자스피로[5.5]운데칸-9-카르복실레이트 (16.3 g, 37.5 mmol) 및 탄산칼륨 (12.97 g, 93.82 mmol)의 용액을 이를 통해 질소 기체를 버블링하여 15분 동안 탈기하였다. Pd(OAc)₂ (140 mg, 625 μmol) 및 2-디시클로헥실포스피노-2',4',6'-트리-i-프로필-1,1'-비페닐 (0.596 g, 1.25 mmol)을 첨가하고, 반응물을 환류 하에 16시간 동안 가열하였다. 용액을 주위 온도로 냉각시키고, 메탄올 (200 mL)을 첨가하였다. 30분 후, 용매를 감압 하에 제거하였다. 상 분리를 돕기 위해 수성 MgSO₄ (1M; 500 ml)를 첨가하면서 혼합물을 에틸 아세테이트 (500 mL)와 염수 (500 ml) 사이에 분배하였다. 층을 분리하고, 유기 층을 MgSO₄ 상에서 건조시키고, 실리카 겔의 10 cm 패드를 통해 에틸 아세테이트 (~1.5 L)를 사용하여 용리하면서 여과하였다. 여과물을 버리고, 실리카 패드를 THF (2 L) 중 5% MeOH로 플러싱하였다. 메탄올성 여과물을 감압 하에 농축시켜 표제 화합물 (20.1g, 92%)을 수득하였다.

MS (m/z): 699 (M+1).

반응식 4

제조예 17

tert-부틸 4-[(E)-4-[4-[(3-히드록시-5-이소프로필-1H-피라졸-4-일)메틸]-3-메틸-페닐]부트-3-에닐]-4,9-디아자스피로[5.5]운데칸-9-카르복실레이트

반응식 4, 단계 A: 메탄올 (130 L) 중 tert-부틸 4-[(E)-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)부트-3-에닐]-4,9-디아자스피로[5.5]운데칸-9-카르복실레이트 (35.8 kg, 82.4 mol)를 실온에서 메탄올 (440 L) 중 4-[(4-브로모-2-메틸-페닐)메틸]-5-이소프로필-1H-피라졸-3-올 (23.9 kg, 77.3 mol)의 용액에 첨가하였다. 물 (590 L) 및 인산삼칼륨 (100 kg, 471.7 mol)을 첨가하고, 반응물을 질소 분위기 하에 둔다. 교반 용액에, 메탄올 (15 L) 중 트리스(디벤질리덴아세톤) 디팔라듐 (1.42 kg, 1.55 mol) 및 디-tert-부틸메틸포스포늄 테트라플루오로보레이트 (775 g, 3.12 mol)의 현탁액을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 75℃에서 2시간 동안 가열하였다. 혼합물을 냉각시키고, 규조토 상에서 여과하였다. 필터 케이크를 메탄올 (60 L)로 헹구고, 여과물을 감압 하에 농축시켰다. 에틸 아세테이트 (300 L)를 첨가하고, 층을 분리하고, 유기 층을 15% 염수 (3 x 120 L)로 세척하였다. 유기 층을 감압 하에 농축시키고, 에틸 아세테이트 (300 L)를 첨가하고, 혼합물을 18 내지 20시간 동안 교반하였다. 헵탄 (300 L)을 첨가하고, 혼합물을 10℃로 냉각시키고, 혼합물을 추가 18 내지 20시간 동안 교반하였다. 생성된 고체를 여과에 의해 수집하고, 케이크를 에틸 아세테이트/헵탄 (2:3, 2 x 90 L)으로 헹구고, 진공 하에 40℃에서 건조시켜 표제 화합물 (29.3 kg, 70.6% 수율)을 백색 고체로서 수득하였다.

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 7.14 (s, 1H), 7.07 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 6.92 (d, J= 7.6 Hz, 1H), 6.39 (d, J= 16.0 Hz, 1H), 6.25-6.12 (m, 1H), 3.63 (s, 2H), 3.45-3.38 (bs, 3H), 3.34 (s, 3 H), 3.33 (s, 3H), 2.85-2.75 (m, 1H), 2.49-2.40 (m, 5 H), 2.33 (s, 3H), 1.68-1.62 (m, 2H), 1.60-1.36 (m, 15H), 1.11 (s, 3H), 1.10 (s, 3H).

제조예 12b

tert-부틸 2-{(3E)-4-[3-메틸-4-({5-(프로판-2-일)-3-[(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-베타-D-글루코피라노실)옥시]-1H-피라졸-4-일}메틸)페닐]부트-3-엔-1-일}-2,9-디아자스피로[5.5]운데칸-9-카르복실레이트의 대안적 제조.

반응식 4, 단계 B: tert-부틸 4-[(E)-4-[4-[(3-히드록시-5-이소프로필-1H-피라졸-4-일)메틸]-3-메틸-페닐]부트-3-에닐]-4,9-디아자스피로[5.5]운데칸-9-카르복실레이트 (17.83 kg, 33.2 mol), 아세토니트릴 (180 L), 및 벤질트리부틸암모늄 클로라이드 (1.52 kg, 4.87 mol)를 실온에서 합하였다. 탄산칼륨 (27.6 kg, 199.7 mol)을 천천히 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-알파-D-글루코피라노실 브로마이드 (24.9 kg, 60.55 mol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 30℃로 가온하고, 18시간 동안 교반하였다. 감압 하에 혼합물을 농축시키고, 에틸 아세테이트 (180 L)에 이어서 물 (90 L)을 첨가하였다. 층을 분리하고, 유기 상을 15% 염수 (3 x 90 L)로 세척하고, 혼합물을 농축시키고, 실리카 겔 (63 kg, 용리액으로서 에틸 아세테이트/헵탄 (1:2→1:0)) 상에서 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 정제함으로써 표제 화합물 (19.8 kg, 94% 순도, 68.8% 수율)을 황색 발포체로서 수득하였다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.13 (s, 1H), 7.03 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 6.78 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 6.36 (d, J= 16.0, 1H), 6.25-6.13 (m, 1H), 5.64 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 5.45-5.25 (m, 2H), 5.13-4.95 (m, 2H), 4.84-4.76 (m, 1H), 4.25-4.13 (m, 2H), 4.10-4.00 (m, 2H), 3.90-3.86 (m, 1H), 3.58-3.50 (m, 2H), 3.40-3.22 (m, 4H), 2.89-2.79 (m, 1H), 2.10-1.90 (m, 18 H), 1.82 (s, 3H), 1.62-0.82 (m, 22H).

제조예 18

2-{(3E)-4-[3-메틸-4-({5-(프로판-2-일)-3-[(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-베타-D-글루코피라노실)옥시]-1H-피라졸-4-일}메틸)페닐]부트-3-엔-1-일}-2,9-디아자스피로[5.5]운데칸

반응식 4, 단계 C: tert-부틸 2-{(3E)-4-[3-메틸-4-({5-(프로판-2-일)-3-[(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-베타-D-글루코피라노실)옥시]-1H-피라졸-4-일}메틸)페닐]부트-3-엔-1-일}-2,9-디아자스피로[5.5]운데칸-9-카르복실레이트 (19.6 kg, 22.6 mol)와 디클로로메탄 (120 L)을 합하고, 0℃로 냉각시켰다. 트리플루오로아세트산 (34.6 L, 51.6 kg, 452 mol)을 천천히 첨가하고, 9시간 동안 교반하였다. 반응물을 빙수 (80 L)로 켄칭하고, 수산화암모늄 (85-90 L)을 첨가하여 반응 혼합물을 pH (8-9)로 조정하였다. 디클로로메탄 (120 L)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 층을 분리하였다. 유기 층을 물 (75 L), 염수로 세척하고, 감압 하에 농축시켜 표제 화합물 (16.2 kg, 95.0% 순도, 93% 수율)을 황색 고체로서 수득하였다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.08 (s, 1H), 6.99 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 6.76 (d, J= 7.6 Hz, 1H), 6.38 (d, J=15.6 Hz, 1H), 6.00-5.83 (m, 1H), 5.31 (d, J= 7.6 Hz, 1H), 5.25-5.13 (m, 4H), 4.32 (dd, J= 12.8, 9.2 Hz, 1H), 4.14 (d, J= 11.2 Hz, 1H), 3.90 (d, J= 10.0 Hz, 1H), 3.75-3.50 (m, 3H), 3.30-3.00 (m, 5 H), 2.85-2.75 (m, 1H), 2.70-2.48 (m, 3H), 2.25 (s, 1H), 2.13-1.63 (m, 19H), 1.32-1.21 (m, 1H), 1.14 (s, 3H), 1.13 (s, 3H), 1.12 (s, 3H), 1.10 (s, 3H).

실시예 1

수화된 결정질 4-{4-[(1E)-4-(2,9-디아자스피로[5.5]운데스-2-일)부트-1-엔-1-일]-2-메틸벤질}-5-(프로판-2-일)-1H-피라졸-3-일 베타-D-글루코피라노시드 아세테이트

4-{4-[(1E)-4-(2,9-디아자스피로[5.5]운데스-2-일)부트-1-엔-1-일]-2-메틸벤질}-5-(프로판-2-일)-1H-피라졸-3-일 베타-D-글루코피라노시드 (유리 염기)의 제1 대안적 제조.

반응식 1, 단계 I: 수산화나트륨 (0.5 mL, 0.5 mmol, 1.0 M 용액)을 메탄올 (2 mL) 중 4-{4-[(1E)-4-(2,9-디아자스피로[5.5]운데스-2-일)부트-1-엔-1-일]-2-메틸벤질}-5-(프로판-2-일)-1H-피라졸-3-일 2,3,4,6-테트라-O-벤조일-베타-D-글루코피라노시드 디히드로클로라이드 (258 mg, 0.24 mmol)의 용액에 첨가하였다. 40℃에서 2시간 후, 감압 하에 농축시켜 용매를 제거하여 잔류물을 수득하였으며, 이를 정제용 HPLC 방법: 높은 pH, 4분 동안 25% B, 4분 동안 25-40% B ＠ 85 mL/분에 의해 30 x 75 mm, 5 μm C18엑스브리지(C18XBridge) ODB 칼럼, 용매 A - H₂O와 NH₄HCO₃ ＠ pH 10, 용매 B - MeCN을 사용하여 정제하여 표제 화합물 (유리 염기)를 고체 (46 mg, 0.08 mmol)로서 수득하였다.

MS (m/z): 598.8 (M+1), 596.8 (M-1).

4-{4-[(1E)-4-(2,9-디아자스피로[5.5]운데스-2-일)부트-1-엔-1-일]-2-메틸벤질}-5-(프로판-2-일)-1H-피라졸-3-일 베타-D-글루코피라노시드 (유리 염기)의 제2 대안적 제조.

반응식 2, 단계 F: 메탄올 (5 mL), 트리에틸아민 (3 mL), 및 물 (3 mL)을 4-{4-[(1E)-4-(2,9-디아자스피로[5.5]운데스-2-일)부트-1-엔-1-일]-2-메틸벤질}-5-(프로판-2-일)-1H-피라졸-3-일 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-베타-D-글루코피라노시드 디히드로클로라이드 (480 mg, 0.24 mmol)에 첨가하였다. 실온에서 18시간 (밤새) 후, 감압 하에 농축 건조시켰다. 생성된 잔류물을 정제용 HPLC 방법: 높은 pH, 4분 동안 25% B, 4분 동안 25-40% B ＠ 85 mL/분에 의해 정제하여 30 x 75 mm, 5 μm C18엑스브리지 ODB 칼럼, 용매 A - H₂O와 NH₄HCO₃ ＠ pH 10, 용매 B - MeCN을 사용하여 표제 화합물 (유리 염기)를 고체 (50 mg, 0.08 mmol)로서 수득하였다.

MS (m/z): 598.8 (M+1), 596.8 (M-1).

¹H NMR (400.31 MHz, CD₃OD): δ 7.11 (d, J=1.3 Hz, 1H), 7.04 (dd, J=1.3,8.0 Hz, 1H), 6.87 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 6.36 (d, J= 15.8 Hz, 1H), 6.16 (dt, J= 15.8, 6.3 Hz, 1H), 5.02 (m, 1H), 3.81 (d, J= 11.7 Hz, 1H), 3.72 (d, J= 16.8 Hz, 1H), 3.68 (d, J= 16.8 Hz, 1H), 3.64 (m, 1H), 3.37-3.29 (m, 4H), 2.79 (m, 1H), 2.72 (t, J= 5.8 Hz, 4H), 2.44-2.33 (m, 6H), 2.30 (s, 3H), 2.26 ( 넓은 s, 2H), 1.59 (m, 2H), 1.50 (m, 2H), 1.43 (m, 2H), 1.36 (m, 2H), 1.11 (d, J= 7.0 Hz, 3H), 1.10 (d, J= 7.0 Hz, 3H).

4-{4-[(1E)-4-(2,9-디아자스피로[5.5]운데스-2-일)부트-1-엔-1-일]-2-메틸벤질}-5-(프로판-2-일)-1H-피라졸-3-일 베타-D-글루코피라노시드의 제3 대안적 제조.

반응식 3, 단계 D: 트리플루오로아세트산 (32.2 mL; 0.426 mol)을 빙수에서 냉각시킨 디클로로메탄 (149 mL) 중 tert-부틸 2-{(3E)-4-[3-메틸-4-({5-(프로판-2-일)-3-베타-D-글루코피라노실)옥시]-1H-피라졸-4-일}메틸)페닐]부트-3-엔-1-일}-2,9-디아자스피로[5.5]운데칸-9-카르복실레이트 (14.87 g; 21.28 mmol)의 용액에 첨가하였다. 용액을 실온으로 가온되도록 하였다. 30분 후, 일정한 온도를 유지하기 위해 필요에 따라 냉각을 적용하면서 혼합물을 MeOH 중 암모니아 (2M; 300 mL)에 천천히 첨가하였다. 용액을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 혼합물을 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 SCX-2 수지를 사용하여 정제하였다. 염기성 여과물을 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트 중에서 연화처리/초음파처리하고, 여과하고, 건조시켰다. 생성된 고체를 MeOH (200mL) 중에 용해시키고, 진공 하에 농축시켰다. 이를 여러 번 반복하여 표제 화합물 (유리 염기) (12.22 g, 수율 96%)을 수득하였다.

MS (m/z): 599 (M+1); [α]_D ²⁰ =-12° (C=0.2, MeOH).

최종 표제 화합물인 수화된 결정질 4-{4-[(1E)-4-(2,9-디아자스피로[5.5]운데스-2-일)부트-1-엔-1-일]-2-메틸벤질}-5-(프로판-2-일)-1H-피라졸-3-일 베타-D-글루코피라노시드 아세테이트의 제조.

4-{4-[(1E)-4-(2,9-디아자스피로[5.5]운데스-2-일)부트-1-엔-1-일]-2-메틸벤질}-5-(프로판-2-일)-1H-피라졸-3-일 베타-D-글루코피라노시드 (902 mg)를 둥근 바닥 플라스크 (100 mL)에 넣고, 습윤 에틸 아세테이트 (18 mL)로 처리하였다. [주 - 습윤 에틸 아세테이트는 에틸 아세테이트 (100 mL) 및 탈이온수 (100 mL)를 혼합하여 제조함. 혼합 후, 층이 분리되도록 하고, 사용을 위해 상부 습윤 에틸 아세테이트 층을 제거함. 아세트산은 에틸 아세테이트의 가수분해 생성물이고, 습윤 에틸 아세테이트 중에 존재함.] 습윤 에틸 아세테이트가 완전히 첨가되지 않았더라도, 화합물은 용해되었다. 수분 후, 백색 침전물이 형성되었다. 추가량의 습윤 에틸 아세테이트 (2 mL)를 첨가하여 나머지 화합물을 용해시켰다. 용액을 실온에서 밤새 덮지 않은 채로 교반되게 하고, 그 시간 동안 용매가 부분적으로 증발되었다. 생성물 슬러리로부터의 나머지 용매를 진공 하에 제거하고, 생성된 고체를 질소의 스트림 하에 건조시켜 최종 표제 화합물을 결정질 고체로서 수득하였다. 소량의 무정형 물질을 고체 상태 NMR에 의해 생성물 중에서 확인하였다. 이 결정질 최종 표제 화합물은 추가의 결정질 최종 표제 화합물을 제조하기 위한 시드 결정으로서 사용될 수 있다.

최종 표제 화합물인 수화된 결정질 4-{4-[(1E)-4-(2,9-디아자스피로[5.5]운데스-2-일)부트-1-엔-1-일]-2-메틸벤질}-5-(프로판-2-일)-1H-피라졸-3-일 베타-D-글루코피라노시드 아세테이트의 대안적 제조.

질소 분위기 하에 4-{4-[(1E)-4-(2,9-디아자스피로[5.5]운데스-2-일)부트-1-엔-1-일]-2-메틸벤질}-5-(프로판-2-일)-1H-피라졸-3-일 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-베타-D-글루코피라노시드 (2.1 kg, 2.74 mol), 메탄올 (4.4 L), 테트라히드로푸란 (4.2 L), 및 물 (210 mL)을 합하였다. 탄산칼륨 (460 g, 3.33 mol)을 첨가하고, 4 내지 6시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 여과하여 고체를 제거하였다. 감압 하에 여과물을 농축시킨 후, 에탄올 (9.0 L)에 이어서 아세트산 (237 mL, 4.13 mol)을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 교반 용액에, 습윤 에틸 아세테이트 (10 L, 대략 3 w/w% 물 함유)를 5시간에 걸쳐 천천히 첨가하고, 이어서 물 (500 mL)을 첨가하였다. 현탁액을 12시간 동안 교반하고, 습윤 에틸 아세테이트 (4.95 L, 대략 3 w/w% 물 함유)를 8시간의 기간에 걸쳐 첨가하였다. 현탁액을 12시간 동안 교반하고, 추가의 습윤 에틸 아세테이트 (11.5 L, 대략 3 w/w% 물 함유)를 16시간에 걸쳐 천천히 첨가하였다. 현탁액을 12시간 동안 교반하고, 여과에 의해 고체를 수집하고, 고체를 습윤 에틸 아세테이트 (3.3 L, 대략 3 w/w% 물 함유)로 헹군다. 감압 하에 30℃ 미만에서 오븐에서 건조시켜 표제 화합물을 회백색 결정질 고체 (1.55 kg, 2.35 mol, 96.7% 순도, 72.4 w/w% 효력, 효력 기준 68.0% 수율)로서 수득하였다.

HRMS (m/z): 599.3798 (M+1).

X선 분말 회절 (XRD)

CuKα 공급원 (λ = 1.54060 Å) 및 링스아이(Linxeye) 검출기가 구비되어 있고 40 kV 및 40 mA에서 작동하는 브루커(Bruker) D8 어드밴스(Advance) X선 분말 회절계 상에서 결정질 고체의 XRD 패턴을 수득하였다. 샘플을 2-세타 4 내지 40°에서 2-세타 0.0084°의 스텝 크기 및 0.5 초/스텝의 스캔 속도로 0.2 mm 발산 슬릿을 사용하여 스캔하였다. 건조 분말을 낮은 배경값의 실리카 샘플 홀더 상에 패킹하고, 유리 슬라이드를 사용하여 평활면을 얻었다. 결정 형태 회절 패턴을 22℃ 및 42% 상대 습도에서 수집하였다. 임의의 주어진 결정 형태에 대해, 회절 피크의 상대 강도는 특정한 인자, 예컨대 결정 형태로부터 초래되는 바람직한 배향으로 인해 달라질 수 있다는 것은 결정학 분야에 널리 공지되어 있다. 바람직한 배향의 영향이 존재하는 경우, 피크 강도는 변경되지만, 다형체의 특징적인 피크 위치는 변하지 않는다. 예를 들어, 문헌 [The United States Pharmacopeia #23, National Formulary #18, pages 1843-1844, 1995]을 참조한다. 게다가, 임의의 주어진 결정 형태의 경우에, 각도 피크 위치는 약간 변할 수 있다는 것이 결정학 분야에 또한 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 피크 위치는 샘플이 분석되는 온도 또는 습도의 변동, 샘플 변위, 또는 내부 표준의 존재 또는 부재로 인해 이동될 수 있다. 본 경우에, 2-세타에서의 ± 0.2의 피크 위치 변동성은 나타낸 결정 형태의 명백한 확인을 저해하지 않으면서 이들 잠재적 변동을 고려할 것이다. 결정 형태의 확인은 특징적인 피크 (° 2-세타의 단위에서), 전형적으로 보다 현저한 피크의 임의의 고유한 조합을 기준으로 수행될 수 있다. 주위 온도 및 상대 습도에서 수집된 결정 형태 회절 패턴은 8.853 및 26.774도 2-세타에서의 국립 표준국 (NBS) 675 표준 피크를 기준으로 조정되었다.

수화된 결정질 4-{4-[(1E)-4-(2,9-디아자스피로[5.5]운데스-2-일)부트-1-엔-1-일]-2-메틸벤질}-5-(프로판-2-일)-1H-피라졸-3-일 베타-D-글루코피라노시드 아세테이트의 제조된 샘플은 하기 표 1에 기재된 바와 같은 회절 피크 (2-세타 값)를 갖고, 특히 5.2°에서의 피크와 7.8°, 8.0° 및 10.7° (각각 ±0.2°)로 이루어진 군으로부터 선택된 피크 중 하나 이상을 조합으로 갖는 CuKα 방사선을 사용한 XRD 패턴을 특징으로 하였다.

수화된 결정질 4-{4-[(1E)-4-(2,9-디아자스피로[5.5]운데스-2-일)부트-1-엔-1-일]-2-메틸벤질}-5-(프로판-2-일)-1H-피라졸-3-일 베타-D-글루코피라노시드 아세테이트의 X선 분말 회절 피크.

<표 1>

¹³C 고체 상태 NMR (¹³C ssNMR)

¹³C 교차 편극/매직각 스피닝 NMR (고체-상태 NMR 또는 ssNMR) 스펙트럼은 100.622 MHz의 탄소 주파수 및 400.131 MHz의 양성자 주파수에서 작동하고 브루커 4mm 이중 공명 프로브가 구비된 브루커 아반스(Avance) II 400 MHz NMR 분광계를 사용하여 얻었다. TOSS 측파대 억압이 SPINAL64 탈커플링 및 RAMP100 형 H-핵 CP 펄스를 이용하는 교차 편극과 함께 사용되었다. 획득 파라미터는 다음과 같았다: 2.6 μs의 90° 양성자 r.f. 펄스 폭, 2.0 ms의 접촉 시간, 3 s의 펄스 반복 시간, 10 kHz의 MAS 진동수, 30 kHz의 스펙트럼 폭, 34 ms의 획득 시간 및 18,661의 스캔 수. 화학적 이동은 별개의 실험에서 아다만탄 (δ = 29.5 ppm)을 기준으로 하였다.

수화된 결정질 4-{4-[(1E)-4-(2,9-디아자스피로[5.5]운데스-2-일)부트-1-엔-1-일]-2-메틸벤질}-5-(프로판-2-일)-1H-피라졸-3-일 베타-D-글루코피라노시드 아세테이트에 대한 전형적인 ¹³C ssNMR 공명은 하기를 포함하였다: 181.8, 161.2, 160.0, 147.6, 137.4, 135.9, 135.3, 132.6, 131.6,129.4, 127.3, 126.4, 122.2, 101.9, 99.7, 98.5, 97.9, 78.3, 77.7, 77.2, 76.3, 75.6, 69.1, 68.1, 64.2, 62.6, 60.1, 56.1, 54.2, 41.7, 40.5, 39.1, 34.7, 32.3, 31.5, 31.0, 29.2, 27.8, 26.4, 23.8, 20.8, 19.9, 18.4 및 16.9 ppm (각각 ± 0.2 ppm).

나트륨-의존성 글루코스 수송체 1 (SGLT1) 및 SGLT2 검정

인간 SGLT1 (slc5a1, NM_000343), 인간 SGLT2 (slc5a2, NM_003041) 및 마우스 SGLT1 (slc5a1, NM_019810.4)을 코딩하는 cDNA를 각각 오픈바이오시스템즈(Openbiosystems), 인비트로젠(Invitrogen) 및 오픈바이오시스템즈로부터 구입하였다. 상기 cDNA를 포유동물 발현을 위하여 pcDNA3.1+에 클로닝하고, 표준 포유동물 형질감염 절차를 사용하여 차이니즈 햄스터 난소 (CHO)-K1 세포에 안정하게 형질감염시켰다. 네오마이신 (제네티신(Geneticin), 인비트로젠)에 대한 내성, 및 ¹⁴C-α-메틸-D-글루코피라노시드 (¹⁴C-AMG) 흡수 검정 (하기 참조)에서의 활성을 기준으로 각각의 과다-발현 세포주의 SGLT-발현 하위-클론을 선택하였다. 표준 세포 배양 기술을 사용하여 안정한 SGLT-발현 세포를 유지하였다.

SGLT 활성은 하기와 같이 기재되는 상기 세포주에서의 나트륨-의존성 ¹⁴C-AMG 흡수로서 측정하였다. 30,000개 세포를 함유하는 100 μL의 배양 배지를 96-웰 바이오코트(BioCoat) 폴리-D-리신 플레이트 (벡톤 딕슨(Becton Dickson))의 각 웰에 시딩하고, 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양 배지를 흡인하고, 200 μL의 반응 완충제 (140 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM CaCl₂, MgCl₂ 및 14 mM N-2-히드로에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산 (헤페스(Hepes)), pH 7.5)로 세포를 2회 세척하였다. 과량의 완충제를 종이 타월 상에 두드려 제거하였다. 35 μL의 반응 완충제를 각 웰에 첨가하였다. 가변 농도의 시험 화합물을 함유하거나 대조군으로서 화합물을 함유하지 않는 반응 완충제 중 10% 디메틸술폭시드 (DMSO) 5 μL를 각 웰에 분배하였다. 최종 농도가 4 μM이 되도록 반응 완충제 중 ¹⁴C-AMG 10 μL를 첨가함으로써 반응을 개시하였다. 플레이트를 37℃에서 125분 동안 인큐베이션하였다. 반응 완충제를 흡인 제거함으로써 반응을 종료한 다음, 200 μL의 빙냉 반응 완충제로 3회 세척하였다. 반응 완충제의 완전한 제거를 보장하기 위해 수동 흡인을 적용하였다. 10 μL의 0.1 N NaOH를 각 웰에 첨가한 다음, 100 μL의 슈퍼믹스(Supermix) 섬광 칵테일 (퍼킨엘머(PerkinElmer))을 첨가하였다. 혼합한 후, 마이크로베타(MicroBeta) (퍼킨엘머)에서 플레이트의 섬광 신호를 계수하였다. 액티비티베이스(ActivityBase) (ID 비지니스 솔루션(ID Business Solution))를 사용하여 10-투여 반응 곡선을 실험적 4-파라미터 모델에 피팅함으로써, 반수-최대 억제에서의 억제제 농도 (IC₅₀)를 결정하였다. 실시예 1의 유리 염기는 본질적으로 상기 기재한 바와 같이 시험하였다.

<표 2> SGLT1 및 SGLT2에 대한 실시예 1의 유리 염기의 시험관내 효력

보다 구체적으로, 표 2의 데이터는 실시예 1의 유리 염기가 인간 및 마우스 SGLT1을 시험관내에서 억제하고, 시험관내에서 인간 SGLT2에서보다 인간 및 마우스 SGLT1에서 더 강력하다는 것을 입증하였다.

경구 글루코스 내성 검사 (OGTT)에서의 글루코스 저하 효과

1% 히드록시에틸셀룰로스, 0.25% 트윈(Tween)® 80 w/ 소포제 0.05%의 비히클을 사전칭량된 시험 화합물에 첨가하여 1 mg/ml 용액을 제조함으로써 시험 화합물을 제제화하였다. 혼합물을 대략 30초 동안 프로브 초음파처리하였다. 생성된 용액을 원액으로 사용하고, 비히클로 희석하여 그로부터 보다 저농도 투여 용액을 제조하였다.

시험 전일 늦은 오후부터 음식물에 대한 접근을 제거함으로써 단일 수용 C57Bl/6 마우스를 밤새 단식시켰다. 다음날 아침에, 마우스를 칭량한 후, 꼬리 절단에 의해 단일 공복 혈액 샘플을 채취하여, 혈당측정기 (로슈 아큐체크(Roche AccuChek))에 의해 글루코스를 측정하였다. 연구군 (n=5)은 공복 혈액 글루코스를 기준으로 결정되고, 바람직하게는 80-100 mg/dl 글루코스 범위의 동물을 포함하였다.

군 결정 후, 제1 마우스에 10ml/kg의 시험 화합물 제제를 경구로 위관영양시키고, 타이머를 개시하였다. 각 후속 동물에 1분 30초 간격으로 투여하였다. 제1 화합물 처리 개시 3시간 후, 글루코스를 측정하기 위해 기준선 혈액 샘플을 채취하였다 (제1 동물로부터, 꼬리 절단을 통해). 이어서, 상기 동물에게 즉시 3g/kg으로 50% 덱스트로스 (호스피라(Hospira))의 경구 용량을 제공하였다. 정확히 1분 30초 간격으로 꼬리 정맥에 의해 글루코스용으로 혈액 샘플을 채취함으로써, 덱스트로스 투여 20, 40, 60 및 120분 후에 각각의 동물에서 혈액을 수집하였다.

<표 3> OGTT에서의 글루코스 저하 효과.

상기 표 3에 제시된 바와 같이, 실시예 1의 유리 염기는 정상적인 혈당의 C57Bl/6 마우스에서 50% 덱스트로스 (호스피라®)의 경구 볼루스 후 글루코스 변동의 용량 의존성 감소를 산출하였다. 실시예 1의 유리 염기는 또한 OGTT 동안의 기준선 조정된 글루코스 곡선하 면적 (AUC)의 용량 의존성 감소를 입증하였다. 또한, 실시예 1의 유리 염기는 OGTT 동안 혈장 글루코스의 평균 최대 농도 (Cmax)가 용량 의존적으로 감소되었다.

스트렙토조토신 유발 당뇨병에 걸린 수컷 래트에서의 혼합식 내성 검사에서의 글루코스 값

스트렙토조토신 (STZ)이 투여된 래트는 당뇨병을 발생시켰다. 이들 동물에서 글루코스 수준을 조절하는 작용제는 인간에서의 당뇨병의 치료에 유용한 것으로 여겨진다.

1% 히드록시에틸셀룰로스 (HEC), 0.25% 트윈® 80 w/ 소포제 0.05%의 비히클을 사전칭량된 시험 화합물에 첨가하여 2.5 mg/ml 용액을 제조함으로써 시험 화합물을 제제화하였다. 혼합물을 대략 30초 동안 프로브 초음파처리하였다. 생성된 용액을 원액으로 사용하고, 비히클로 희석하여 그로부터 보다 저농도 투여 용액을 제조하였다. 3 ml 분취량으로 0.1M 시트레이트 완충제 중에 용해시킴으로써 STZ 45 mg/kg을 제제화하고, 투여되지 않을 때에는 어둠 속에서 얼음 상에 보관하였다. 지방 칼로리 (60%), 탄수화물 칼로리 (26%) 및 단백질 칼로리 (15%)를 포함하는 높은 지방 함량의 혼합식 (바이오-서브(Bio-Serv)® 설치류 식이 F3282 고지방)을 이용하였다. 단일 수용 스프라그 돌리(Sprague Dawley) 래트를 3 내지 7일의 기간 동안 순응시켰다.

동물이 최근에는 식이되지 않았음을 보장하기 위한 노력으로, STZ는 대략 6시간의 광 주기 (6 am에 점등, 6 pm에 소등)로 오후에 투여하였다. 이소플루란을 사용하여 동물을 마취시키고, 꼬리 정맥 주사를 통하여 STZ를 전달하였다. 동물이 의식을 찾고 나면, 이들을 우리로 복귀시키고, 7일 동안 회복되게 하였다.

식사 내성 검사 (MTT) 바로 2일 전에, 소량 (2-4g)의 F3282 식이를 모든 래트에 제공함으로써, 이들이 실험 동안 이를 제공받기 전에 이에 순응되도록 하였다. 실험 전 저녁에, 래트를 깨끗한 케이지로 이동시키고, 그의 먹이를 제거하였다. 다음날 아침에, 동물을 칭량하고, 글루코스 측정 (애보트 알파트랙(Abbott AlphaTRAK)™ 혈당측정기: 코드 29)을 위해 꼬리 절단에 의해 혈액 샘플을 채취하였다. 공복 체중 및 글루코스를 기준으로 동물들을 n=6의 군으로 나누었다. 30분 후, 시험 화합물을 경구로 투여하고, 2회 글루코스 측정치를 수집하였다. 이어서, 바이오-서브® 식이 3282의 5 그램 펠릿을 제공하였다. 20분 후, 나머지 먹이를 치우고, 칭량하였다. 글루코스 측정을 위해 20, 40, 60 및 120분에 혈액 샘플을 채취하였다.

<표 4> STZ-유발 당뇨병에 걸린 수컷 래트에서의 혼합 MTT에서의 글루코스 값

상기 표 4에 제시된 바와 같이, 실시예 1의 유리 염기는 비히클 대조군에 비해 MTT에서 글루코스를 상당히 및 용량 의존적으로 감소되었다. 양성 대조군인 아카르보스는 임의의 시점에서 대조군과 비교하여 글루코스를 현저하게 감소시키지 않았다. 게다가, 실시예 1의 유리 염기 처리와 연관된 글루코스 기준선 조정된 AUC의 용량 의존성 감소가 존재하였다. 아카르보스는 10 mg/kg에서는 실시예 1의 것과 유사한 수준까지 글루코스 AUC를 현저하게 감소시켰다. 표 4는 실시예 1의 유리 염기가 수컷 래트에서의 글루코스 수준을 조절한다는 것을 입증하였다.

Claims

하기 화학식의 화합물 또는 그의 수화물.
제1항에 있어서, 결정질 형태의 수화된 화합물.
제2항에 있어서, 다음 중 적어도 하나를 특징으로 하는 화합물:
a. 5.2°의 회절각 2-세타에서의 피크를 7.8°, 8.0° 및 10.7° (각각 ± 0.2°)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 피크와 조합하여 갖는, CuKα 방사선을 사용한 X선 분말 회절 패턴; 및
b. 아다만탄의 고자장 공명 (δ=29.5 ppm)을 기준으로 181.8, 161.2, 160.0, 147.6 및 137.4 ppm (각각 ±0.2 ppm)에서의 피크를 포함하는 ¹³C 고체 상태 NMR 스펙트럼.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 주위 온도에서의 물 함량이 9 중량% 내지 12 중량% 범위인 화합물.
유효량의 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하는, 환자에서 당뇨병을 치료하기 위한 제약 조성물.
유효량의 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하는, 환자에서 제1형 당뇨병을 치료하기 위한 제약 조성물.
유효량의 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하는, 환자에서 제2형 당뇨병을 치료하기 위한 제약 조성물.
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