RS50274B - Ob polipeptid i njegova dijagnostička i terapeutska primena - Google Patents

Ob polipeptid i njegova dijagnostička i terapeutska primena

Info

Publication number
RS50274B
RS50274B YU54995A YU54995A RS50274B RS 50274 B RS50274 B RS 50274B YU 54995 A YU54995 A YU 54995A YU 54995 A YU54995 A YU 54995A RS 50274 B RS50274 B RS 50274B
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
polypeptide
histidine
seq
sequence
serine
Prior art date
Application number
YU54995A
Other languages
English (en)
Inventor
Jeffrey M. Friedman
Yiying Zhang
Margherita Maffei
Jeffrey L. Halaas
Ketan Gajiwala
Stephen K. Burley
Ricardo Proenca
Original Assignee
The Rockefeller University,
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/292,345 external-priority patent/US6001968A/en
Priority claimed from US08/438,431 external-priority patent/US6429290B1/en
Priority claimed from US08/483,211 external-priority patent/US6309853B1/en
Application filed by The Rockefeller University, filed Critical The Rockefeller University,
Publication of YU54995A publication Critical patent/YU54995A/sh
Publication of RS50274B publication Critical patent/RS50274B/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/06—Preparations for care of the skin for countering cellulitis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/5759—Products of obesity genes, e.g. leptin, obese (OB), tub, fat
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

OB polipeptid, naznačen time, što je odabran iz grupe koju čine: a) polipeptid čija je aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO.2,4,5 ili 6; b) biološki aktivni fragment polipeptida iz (a) gde dati fragment modulira telesnu težinu životinje; c) polipeptid iz a) ili b) kod koga su izostavljene ili supstituisane aminokiseline na pozicijama koje ne utiču na strukturu ili funkciju polipeptida; d) OB polipeptid sposoban da modulira telesnu težinu, čija je sekvenca 83% ili više homologna sa OB polipeptidom čija je aminokiselinska sekvenca SEQ ID NOS. 2,4,5 ili 6; e) hemijski modifikovan polipeptid iz (a) do (d), tako što je za polipeptid vezana jedna ili više hemijskih grupa. Prijava sadrži još 14 nezavisnih i 30 zavisnih patentnih zahteva.

Description

OPIS PRONALASKA
Predmetni pronalazak se odnosi, uopšteno, na regulisanje telesne težine (mase) sisara, uključujući životinje i ljude, a posebno na materijale identifikovane u njima kao modulatori mase, kao i na dijagnostičke i terapeutske primene kojima se modulatori mogu izložiti.
Stanje tehnike
Gojaznost, definisana kao višak telesne masti u odnosu na masu tela bez masti, povezana je sa važnim psihološkim i medicinskim poremećajima, pri čemu ovi drugi obuhvataju povišen krvni pritisak, povećani sadržaj lipida u krvi, dijabetes melitus Tipa II, ili dijabetes melitus nezavisan od insulina (NIDDM). U SAD ima 6-10 miliona osoba sa NIDDM, uključujući 18% populacije starosti 65 godina [Harris i dr., Int. J. Obes., 11:275-283 (1987)]. Približno 45% muškaraca i 79% žena sa NIDDM je gojazno, a njihov se dijabetes bitno popravlja ili nestaje sa smanjenjem težine [Harris, Diabetes Care, 14(3):639-648
(1001)]. Kao što je opisano u daljem tekstu, i gojaznost i NIDDM su u velikoj
meri nasledni, mada geni koji stvaraju predispoziciju još nisu identifikovam. Molekulska genetska baza ovih metabolički srodnih poremećaja je važan, nedovoljno shvaćen problem.
Asimilacija, skladištenje i korišćenje energije iz hrane sačinjavaju jedan potpun homeostatski sistem koji je centralan za preživaljavanje metaoza. Među kopnenim sisarima, skladištenje u adipoznom tkivu velikih količina metaboličkog goriva u vidu trglicerida od bitnog je značaja za preživljavanje u periodu nestašice hrane. Potreba da se održi određen nivo rezervi energije bez kontinualnih promena veličine i oblika organizma, zahteva postizanje ravnoteže između unošenja i potrošnje energije. Međutim, molekuski mehanizam koji reguliše energetski bilans tek ostaje da se razjasni. Izolovanje molekula koji prenose nutritivne informacije i kontrolišu energetski bilans biće kritično za razumevanje regulacije telesne mase zdravog i bolesnog organizma.
Nivo gojaznosti nekog pojedinca je, u velikoj meri, genetski određen. Ispitivanja stepena podudarnosti mase tela i gojaznosti kod jednojajčamh i dvojajčanih blizanaca ih usvojene dece i njihovih bioloških roditelja, ukazuju da naslednost gojaznosti (0,4-0,8) prevazilazi onu za mnoge
druge osobine za koje se obično smatra da imaju znatnu genetsku komponentu, kao što su šizofrenija, alkoholizam i ateroskleroza [Stunkard i dr., N. Engl. J. Med., 322:1483-1487 (1990)]. Takode su zabeležene porodične sličnosti u stepenu potrošnje energije [Bogardus i dr., Diabetes, 35:1-5 (1986)]. Genetska analiza geografski ograničenih populacija ukazuje da bi jedan relativno mah broj gena mogao biti odgovoran za 30-50% odstupanja u telesnom sastavu [Moli i dr., Am. J. Hum. Genet; 49:1243-1255 (1991)]. Međutim, nijedan ođ gena odgovornih za gojaznost kod stanovništva uopšte nije genetski mapiran za određenu hromozomsku lokaciju.
Model gojaznosti kod glodara obuhvata sedam očigledno jednogenskih mutacija. Najintenzivnije proučavane mutacije gojaznosti miševa su geniob ( obese)idb ( dijabetes).Kada se nalaze na istojGENETIC STRAINBACKGROUND, ob i db daju metaboličke fenotipe i fenotipe ponašanja koji se međusobno ne mogu razlikovati, što ukazuje da bi ovi geni mogli delovati na istom fiziološkom putu [Coleman i dr., Diabetologia, 14:141-148 (1978)]. Miševi, homozigni za obe mutacije, su hiperfagični i hipometabotički, što vodi do jednog gojaznog fenotipa koji se uočava u starosti od mesec dana. Masa tih životinja teži da se stabilizuje na 60-70 g (u poređenju sa 30-35 g kod kontrolnih miševa), ob i db životinje iskazuju bezbroj drugih honnonalnih i metaboličkih promena koje otežavaju identifikaciju primarnog nedostatka kome se pripisuje mutacija [Bray i dr., Am. J. Clin. Nutr., 50:891-902 (1989)].
Svaki od modela gojaznosti kod glodara praćen je promenama metabolizma ugljenih hidrata koje liče na one kod dijabetesa Tip II kod čoveka. U nekin slučajevima ozbiljnost dijabetesa zavisi delimično i od porekla soja miševa [Leiter, Endocrinologv, 124:912-922 (1989)]. I kod ob i kod db miševa soja C57BL/Ks razvija se jak dijabetes sa konačnom nekrozom P ćelija i atrofijom Langerhansovih ostrvaca, što dovodi do relativnog nedostatka insulina. Nasuprot tome, kod ob i db miševa sola C57BL/6.1 razvija se prolazni dijabetes otporan na insulin koji se konačno kompenzuje hipertrofijom (3 ćelija, sličan dijabetesu Tip II kod čoveka.
Fenotip ob i db miševa predstavlja gojaznost kod čoveka na druge načine nego što je razvoj dijabetesa - mutar.tiu miševi jedu više i troše manje energije od mršavih kontrolnih životinja (kao što čine i gojazni ljudi). Ovaj fenotip je takođe potpuno sličan onome koji se viđa kod životinja sa povredama vendromedijalnog hipotalamusa, što ukazuje da obe mutacije mogu da ometaju sposobnost pravilnog integrisanja ili reagovanja na informaciju o unošenju hrane unutar centralnog nervnog sistema. Podrška ovoj hipotezi izvodi se iz rezultata parabiozmh opita [Coleman, Diabetologia, 9:294-298 (1973)], koji ukazuju da ob miševima nedostaje jedan cirkuliŠući faktor sitosti a da su db miševi otporni na delovanja ob faktora (verovatno zbog nekog nedostatka ob receptora). Ovi su opiti doveli do zaključka da gojaznost kod ovih mutantnih miševa može nastati usled različitih poremećaja u jednoj dovodnoj petlji i/ili centru za objedinjavanje pretpostavljenog mehanizma povratne veze koji upravlja telesnim sastavom.
Koristeći molekulske i klasične genetske markere, ob i db geni su povezani sa krajnjim unutrašnjim hromozomom 6 , odnosno središnim hromo-zomom 4 [Baharv i dr., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87:8642-8646 (1990); Friedman i dr., Genomics, 11:1054-1062 (1991)]. U oba slučaja se mutacije vezuju za područja mišjeg genoma koja su sintenična sa onima kod ljudi, što ukazuje, ako postoje humani homologzi za ob i db, da je verovatno da su vezani za humane hromozome 7q, odnosno lp. Nedostaci u db genu mogu dovesti do gojaznosti kod drugih vrsta sisara: kod genetskih ukrštanja pacova soja Zucker fa/fa i soja Brown Norway +/+, fa mutacija (hromozom 5 kod pacova) ograničena je istim lokusima koji ograničavaju db kod miša [Truett i dr., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 88:7806-7809 (1991)].
Zbog mnoštva činilaca koji izgleda utiču na masu tela, nije bilo moguće predvideti koji su činioci, tačnije, koji su homeostatski mehanizmi, prvenstveno odlučujući za masu tela. Zbog toga je glavni problem koji čini osnovu prikazanog pronalaska da se obezbede modulatonm mase tela koji će omogućiti regulisanje gojaznosti i sadržaja masti kod sisara.
Prema prikazanom pronalasku, problem regulisanja gojaznosti i sadržaja masti kod životinja, posebno sisara, rešen je pripremanjem, polipeptida gojaznosti (OB) i molekula nukleinske kiseline koji kodiraju ove polipeptiide, kako je ovde prikazano. Prikazani pronalazak obezbeđuje, po prvi put, izdvojene polipetide korisne za modifikacije, tj. kontrolu i regulisanje mase tela i gojaznosti, kao sekvence nukleidnih kiselina koje kodiraju ove polipeptide, a koje ne samo da omogućuju rekombinantnu proizvodnju OB polipeptida, već su i same korisne kod modulacije mase tela. •
Polipeptidi gojaznosti (OB) prema prikazanom pronalasku imaju od oko 145 do oko 167 amino kiselina, mogu da moduliraju masu tela životinje, naročito nekog sisara, i obuhvataju alelne varijante ili analoge istih, uključujući fragmente, koji imaju isto biološko dejstvo. Polipeptidi se mogu pripremati rekombinantnim postupcima ili postupcima hemijske sinteze. Danas preporučljivi OB polipeptidi obuhvataju one koji imaju sekvencu amino kiselina prema SEQ TI) NOS: 2, 4, 5 ili 6, ili alelne varijante ili analoge istih, uključujući fragmente.
Imunogem fragmenti OB polipeptida prema pronalasku obuhvataju: Val-Pro-Ue-Gm-Lys-Val~Gin-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Eeu-Ile-Eys-Thr (SEQ ID NO: 18); Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-Gln-Thr-Leu-Ala (SEQ ID NO: 19); Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gin-Thr-Ser-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp (SEQ ID NO: 20); i Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-Gln-Glu-Cys (SEQ ID NO: 21).
Analozi humanih OB polipeptida obuhvataju one koji imaju sekvence humanih amino kiselina iz SEQ ID NOS: 4 i 6, pri čemu je jedna ili više od amino kiselina 53, 56,71,85,89,92,95,98, 110, 118, 121, 122, 126, 127, 128, 129, 132, 139, 157, 159, 163 i 166 (prema numeraciji SEQ ID NO: 4) supstituisana nekom drugom amino kiselinom kao što je divergentna amino kiselina mišjeg OB polipeptida kako je prikazana u SEQ ID NO: 2, ili alamn. Ovi analozi obuhvataju one kod kojih: (a) serinski ostatak na položaju 53 supstituisan je glicinom, alaninom, valinom, cisternom, metioninom ili treoninom; (b) serinski ostatak na položaju 98 supstituisan je glicinom, alaninom, valinom, cisteinom, metioninom ili treoninom; i (c) argminski ostatak na položaju broj 92 supstituisan je asparaginom, lizinom, histidinom, glutaminom, glutaminskom kiselinom, asparaginskom kiselinom, sennom, treoninom, metioninom ili cisternom. Jedan analog OB polipeptida prema pronalasku ima, poželjno, 83% ili više homolognosl sekvence amino kiselina sa sekvencom amino kiselina humanog OB polipetida, datom u SEQ ID NO; 2, 4, 5 ili 6.
Dodatni analozi humanog OB polipeptida prema pronalasku imaju seqvencu amino kiselina SEQ ID NOS: 4 i 6 i imaju, (a) jedan ili više ostataka asparaginske kiseline supstituisanih glutaminskom kiselinom; (b) jedan ili više ostataka izoleucina supstituisanih leucinom; (c) jedan ili više ostataka glicina ili valina, supstituisanih alaninom; (d) jedan ili više ostataka arginina supstituisanih histidinom; (e) jedan ili više ostataka tirozina ili fenilalanma supstituisanih triptofanom; (f) jedan ili više ostatak 121 do 128 (prema numeraciji SEQ ID NO: 4) supstituisanih glicinom ili alaninom; i (g) jedan ili više ostataka u položajima 54 do 60 ili 118 do 166 (prema numeraciji SEQ ID NO: 4) supstituisanih lizinom, glutaminskom kiselinom, cisteinom ih probnom. Danas preporučljivi skraćeni analozi humanog OB polipeptida prema pronalasku obuhvataju one kod kojih (prema numeraciji SEQ ID NO: 4): (a) jedan ili više ostataka na položajima 121 do 128 su brisani; (b) ostaci 1-116 su izostavljeni, (c) ostaci 1-21 i 54 do 167 su izostavljeni; (d) ostaci 1-60 i 117 do 167 su izostavljeni; (e) ostaci 1-60 su izostavljeni; (f) ostaci 1-53 su izostavljeni; i (g) jedan analog đela (a) kod koga su ostaci 1-21 izostavljeni. OB polipeptidi i analozi ob polipeptida prema pronalasku, koji nemaju 21 aminokiselinsku „signalnu" sekvencu (na primer, amino kiseline 1 do 21 iz SEQ ID NO: 4) mogu imati jednu N-zavrŠnu amino kiselinu ih sekvencu amino kiselina kao što je (1) metionin, (2) glicin-serin-histidin-metionin sekvenca (SEQ ID NO. 38), (3) sekvenca metionin-glicin-serin-serin-histidin-histidin-histidin-histidin-histidin-histidin- serin- serin-glicin-leucin-vali-pirolin-arginin-glicin-serin-hiistidin-metionin (SEQ ID NO: 98), (4) jedna sekvenca leucin-glutaminska kiselina-lizin-arginin-glutaminska kiselina-alanin-glutaminska kiselina-alanin (SEQ-ID NO: 26), (5) jedna sekvenca glutaminska kiselina-alanin-glutaminska kiselina-alanin (SEQ ID NO: 27), (6) jedna sekvenca leucin-glutaminska kiselina-lizin-arginin (SEQ ID NO: 28), (7) jedna sekvenca metionin-glicin-serin-senn-histidin-histidin-histidin-histidin-histidin-histidin-senn-serin-glicin-leucin-valin-piolm-arginin-glicin-senn-prolin (SEQ ID NO: 99), i (8) jedna sekvenca glicin-serin-prolin.
Derivati jednog OB polipeptida prema pronalasku imaju jedno ili više hemijskih jezgara vezanih za njih, uključujući polimere rastvorljive u vodi kao što je polietilen ghkol. Polietilen glikolom derivatizovani (skraćeno pegilisani, od PEG-polietilen glikol) derivati mogu biti mono-, di-, tri- ili tetrapegilisani, na primer N-završno monopegilisani. Preporučljivi N-završni monopegilisani derivati ob polipeptida prema pronalasku obuhvataju OB polipeptide koji sadrže ostatke amino kiselina 22 do 167 iz SEQ ID NO: 4 ili ostatke 22 do 166 iz SEQ ID NO: 6, koji eventualno imaju jedan (pegilisan) metionin u položaju 21.
Izdvojen molekul nukleinske kiseline prema prikazanom pronalasku kodira jedan OB polipeptid, alelnu varijantu ili analog, uključujući fragmente, kako je napred opisano. Posebno su dobijem DNK molekuli za korišćenje kod obezbeđivanja izražavanja jednog OB polipeptida koji biološki deluje kod modulisanja telesne mase kod nekog sisara, a bira se iz grupe koja se sastoji od: (a) DNK molekula postavljenih u SEQ ID NOS: 1 i 3 ili njihovih fragmenata, (b) DNK molekula koji hibridizuju u DNK molekule definisane pod (a) ili njihovih fragmenata koji mogu hibridizovati, i (C) DNK molekula koji se kodiraju izražavanje za sekvencu amino kiselina kodiranu bilo kojim od prethodnih DNK molekula. Primer takvih molekula je humani genomski molekul DNK iz SEQ ID NOS: 22 i 24.
Preporučljivi molekuli DNK prema pronalasku kodiraju jedan polipeptid koji ima sekvencu amino kiselina postavljenu u: (a) SEQ ID NO: 2; (b) amino kiseline 22 do 167 u SEQ ID NO: 2; © SEQ ID NO: 4; (d) amino kiseline 22 do 167 iz SEQ ID NO: 4; (e) amino kiseline 22 do 166 iz SEQ ID NO: 5; i (g) SEQ ID NO: 6; i (h) amino kiseline 22 do 166 iz SEQ ID NO: 6, kao i polipeptidi koji imaju jednu N-završnu amino kiselinu ili sekvencu amino kiselina kako je ranije napomenuto. Kao primer, jedan preporučljiv molekul DNK ima sekvencu postavljenu kao sekvenca za kodiranje proteina iz SEQ ID NO: 3, a posebno ima sekvencu postavljenu kao sekvenca koja kodira amino kiseline 22 do 167.
Takođe su obezbeđeni i primetljivo označeni molekuli nukleinskih kise-lina, koji mogu hibridizovati u neki DNK molekul prema pronalasku, i obuhva-taju molekule nukleinskih kiselina koji mogu hibridizovati u neko nekodirajuće područje jedne OB nukleinske kiseline, pri čemu se to nekodirajuće područje bira od grupe koja se sastoji od jednog introna, jednog 5' nekodirajućeg područja i jednog 3' nekodirajućeg područja. Prikazani pronalazak takođe daje oligonukleidne osnove za pojačavanje humane genomske DNK koja kodira jedan ob polipeptid, kao što su oligonukleotidi postavljeni u SEQ ID NOS: 29 do 32.
Vektori koje obezbeđuje pronalazak sadrže jedan DNK molekul prema pronalasku kako je napred opisan i poželjno ima oblik jednog vektora izraža-vanja koji sadrži DNK molekul funkcionalno povezan sa jednom sekvencom za upravljanje izražavanjem. lednoćelijske ćelije domaćini prema pronalasku su transformisane nekim DNK molekulom prema pronalasku ili im je ubrizgan takav DNK molekul ih je to učinjeno jednim vektorom, kako je na-pred opisano. Preporučljive ćelije domaćini obuhvataju bakterije, kvasac, ćelije sisara, ćelije biljaka, ćelije insekata i humane ćelije u kulturi tkiva. Prime-ra radi, takve ćelije domaćini se biraju iz grupe koja se sastoji odE.coli, Pseudomonas, Bacillus, Slreptomyces,kvasca, CHO, Rl.l, B-W, L-M, COS 1, COS 1, BSC1, BSC40, BMT10 i Sf9 ćelija. Trenutno preporučljive ćelije domaćim kvasca obuhvatajuAacharomyces, Pichia, Candiđa, HaiisemdaiTorulopsis.Takođe su obezbeđene ćelije sisara koje sadrže jednu DNK sekvencu za kodiranje ob polipetida, a koje su modifikovanein vitroda bi se omogućilo više izražavanje ob polipeptida pomoću jednog homolognog rekombinantnog događaja koji se sastoji od umetanja jedne sekvence koja reguliše izražavanje u funkcionalnu blizinu sekvence za kodiranje polipeptida. Sekvenca za regulisanje izražavanja može biti jedno izražavanje ob polipep-ida, ili ne, i može da zameni neku mutantnu sekvencu za regulisanje ob polipeptida.
Prikazani pronalazak daje postupak za pripremanje jednog ob polipeptida, koji obuhvata: (a) gajenje jedne ćelije kako je napred opisana u uslovima koji obezbeđuju izražavanje ob polipeptida; i dobijanje izraženog ob polipeptida. Ovaj postupak može biti praćen i stupnjevima: (b) hromatogra-fisanja polipetida na jednom Ni-helatnom stubu; i (d) prečišćavanje polipe-ptida filtriranjem pomoću gela. Kod jednog preporučljivog izvođenja, posle stupnja © a pre stupnja (d), postupak obuhvata hromatograficanje ob poli-peptida na stubu jakog izmenjivača katjona
Prikazani pronalazak takođe obezbeđuje obeležena i neobeležena monoklonska i poliklonalna antitela specifična za ob polipeptide prema pro-nalasku, kao i besmrtne linije ćelija koje proizvode jedno monoklonsko antitelo prema pronalasku. Pripremanje antitela prema pronalasku obuhvata: (a) konjugovanje jednog ob polipeptida na jedan proteinski nosač; (b) ununi-ziranje životinje-domaćina konjugatom fragmenta OB polipeptida-proteinskog nosača iz stupnja (a) sa nekim ađjuvansom, i (C) dobijanje antitela od imunizovane životinje domaćina.
Pronalazak daje postupke za merenje prisustva jednog OB polipeptida u nekom uzorku, koji obuhvataku: (a) dovođenje u dodir uzorka za koji se sumnja da sadrži neki OB polipeptid sa jednim antitelom (poželjno vezanim na nepokretni oslonac) koje se specifično vezuje za OB polipeptid pod uslo-vima koji omogućuju obrazovanje reakciomh kompleksa koji sadrže antitelo i OB polipeptid; i (b) otkrivanje obrazovanja reakcionih konpleksa koji obuhva-taju antitelo i OB polipeptid u uzorku, pri čemu otkrivanje obrazovanja reakci-omh kompleksa ukazuje na prisustvo OB polipeptida u uzorku. Istovremeno su ostvareni postupciin vitroza procenu nivoa OB polipeptida u jednom biološkom uzorkz, koji obuhvataju: (a) otkrivanje obrazovanja reakciomh konpleksa u jednom biološkom uzorku prema napred pomenutom postupku; i (b) procenu količine obrazovanih reakciomh kompleksa, a koja količina odgovara nivou OB polipeptida u biološkom uzorku. Kod otkrivanja ili dija-gnosticiranja prisustva nekog oboljenja povezanog sa povišenim ili sniženim nivoom OB polipeptida prema pronalasku, vrši se napred pomenuta procena i otkriveni nivo se poredi sa nivoom OB polipetida koji se javlja kod normalnih subjekata ili kod dotičnog subjekta u nekom ranijem trenutku. Povećanje ni-voa OB polipeptida u poređenju sa normalnim ili ranijim nivoom, ukazuje na neko oboljenje povezano sa povišenim nivoima OB polipeptida, dok sniženi nivo OB polipeptida u poređenju sa normalnim nivoima ukazuje na neko obo-ljenje povezano sa sniženim nivoima OB polipeptida. Takođe su ostvareniin vitropostupci za praćenje lečeoja neke bolesti povezane sa povišenim ili sni-ženim nivoom OB polipeptida kod nekog sisara, koji obuhvataju procenu, kako je napred opisana, nivoa OB polipeptida u nizu bioloških uzoraka dobi-jenih u različitim vremenskim razmacima od sisara koji je podvrgnut takvom lečenju.
Farmaceutski preparati prema pronalasku sadrže jedan OB polipeptid, kako je napred opisan, zajedno sa nekim farmaceutski prihvatljivim nosačem i korisni su kod terapeutskih postupaka za smanjenje telesne mase neke živo-tinje. Dodatni farmaceutski preparati prema pronalasku, za primenu u terape-utskim postupcima za povećanje telesne mase neke životinje obuhvataju je-dan antagonist nekog OB polipeptida, poželjno biran iz grupe koja se sastoji od jednog antitela koje se vezuje za OB polipeptid i neutrahzuje njegovo dej-stvo, jednog fragmenta ob polipeptida koji se vezuje za receptor OB polipep-tida ali ga ne aktivira, i jednog malo-molekulskog antagonista OB polipeptida. Prikazani pronalazak takođe daje odgovarajuće kozmetičke preparate za po-boljšanje izgleda tela, za smanjenje ili povećanje telesne mase neke osobe, koji su preparati korisni kod kozmetičkih postupaka za poboljšanje spoljneg izgleda jedne osobe. Ovi kozmetički preparati daju se pojedincima kao dozne količine dovoljne da modulišu telesnu masu pojedinca do željenog nivoa.
Prikazanim pronalaskom je obuhvaćena i primena molekula nukleinske kiseline prema pronalasku, kao i molekula protivsmislene nukleinske kiseline koji se mogu hibridizovati u jednu nukleinsku kiselinu koja kodira jedan OB polipeptid prema pronalasku, za proizvodnju jednog medikamenta za (na primer, genskom terapijom) modifikovanje telesne mase jedne životinje. Ta-kođe je data i primena jednog OB polipeptida ili antagonista prema prona-lasku za proizvodnju jednog nedukamenta za modifikaciju telesne mase jed-ne životinje. Ovako razvijeni medikamenti mogu se koristiti za modifikovanje telesne mase jednog sisara kod lečenja poremećaja biranog iz grupe koja se sastoji od diabetesa, visokog krvnog pritiska i visokog holesterola, i kao deo kombinovane terapije sa nekim medikamentom za lečenje takvih poremećaja. Ovi se medikamenti mogu koristiti kod terapeutskih postupaka koji obuhva-taju mtravenske, intraarterijske, intraperitonalne, intramuskularne, podkožne, nazalne, oralne ili pulmonarne sisteme davanja.
Ovde izloženi podaci služe da potvrde da se OB polipetidi prema pronalasku u njihovom obliku izlučuju prvenstveno is adipocita sisara i da polipetidi deluju kao hormoni.
Ovde izneti primen pokazuju da OB polipeptid, alternativno nazvan „leptin", cirkuliše u plazmi miša, pacova i čoveka. Leptina nema u plazmi ob/ob miševa, a nalazi se u desetostruko većoj koncentraciji kod db/db miševa, i dvadesetostruko većoj koncentraciji kod fa/fa miševa. Što je najznačajnije, dnevne injekcije rekombinantnog leptina dramatično smanjuju telesnu masu ob/ob miševa, znatno smanjuju telesnu masu običnih miševa, i ne deluju na db/db miševe.
U jednom svom drugom vidu, ob polipeptid od jedne životinjske vrste biološki je aktivan kod druge vrste. Posebno, humani OB polipeptid aktivan je u miševima.
U jednom prvom primeru, modulatori prema prikazanom pronalasku obuhvataju molekule nukleinske kiseline, uključujući rekombinantne DNK mo-lekule (na primer, cDNK ili jedan vektor koji sadrži cDNK ili izolovanu genom-sku DNK) ili klonirane gene (na primer, izolovanu DNK), ili njihove degene-risane varijante, koji kodiraju same polipeptide koji služe kao modulatori za regulisanje mase, kako je kasnije definisano, ili njihove konzervirane varijante ili fragmente, posebno fragmente koji nemaju signalni peptid (ovde alterna-tivno pominjani kao zreli OB polipeptid), koji polipeptidi imaju sekvence ami-no kiseline kao što su one prikazane na slikama 1A do E (SEQ ID NO:2), slici 3 (SEQ ID NO: 4), slici 5 (SEQ ID NO: 5) i slici 6 (SEQ ID NO: 6). Kod spe-cifičnih izvođenja, date se seqvence amino kiseline za dve varijante polipe-ptida glodara (miševi i pacovi) i ljudi. Oba polipeptida se nalaze u obliku u ko-me je glutamin 49 brisan. Što moža proističe i neke anomalije u sastavljanju mRNK. OB polipeptidi raznih životinjski vrsta mogu biti veoma homologni; ka-ko pokazuje slika 4, OB pobpetidi glodara (miševa i pacova) i čoveka su više od 80% homologni.
Molekuli nukleinske kiseline, molekuli rekombinantne DNK, ili klonirani geni, mogu imati nukleotidne sekvence ili mogu biti komplementarni sekven-cama za kodiranje , prikazaanim na slici 1A do E (SWQ ID N0:1) i slici 2A i B (SEQ ID NO:3). Posebno, ovi DNK molekuli bin molekuli cDNK ili genomske DNK izolovane iz hromozoma. Molekuli nukleinskih kiselina prema prona-lasku mogu takođe odgovarati 5' i 3' FLANKING sekvencama DNK i intron-skim DNK sekvencama. Prema tome, prikazani pronalazak se takođe odnosi na prepoznavanje nukleinske kiseline koja ima nukleotidnu sekvencu biranu od sekvenci sa slike 1A do E (SEQ ID NO:l) i slike 2A i B (SEQ ID NO.3), i na degenerisane varijante, alelne varijacije i na slične srodne molekule.
Molekul nukleinske kiseline prema pronalasku može biti od DNK ili od RNk, uključujući njihove sintetičke varijante koje imaju fosfat ili fosvatni analog, na primer, tiofosfat, spojevi. Ovde su obuhvaćene i jednolančane i dvolančane sekvence.
Prikazani pronalazak dalje daje molekule nukleinskih kiselina za kori-šćenje u vidu molekularnih sondi, ili osnova za pojačanje lančane reakcije po-limeraze (PCR - polvmerase chain reaction), tj. sintetičkih ili prirodnih oligo-nukleotida koji imaju sekvencu koja odgovara delu sekvenci prikazanih na slici 1A do E (SEQ ID NO:l), slici 2A i B (SEQ ID NO:3) i slici 20A do C (SEQ ID Nos:22 i 24), ili 5' i 3' krajnjim sekvencama kodnih sekvenci, ili intronskih sekvenci genomske DNK. Posebno, pronalazak obuhvata jedan molekul nu-kleinske kiseline koji ima najmanje oko 10 nukleotida, pri čemu jedna sekven-ca molekula nukleinske kiseline odgovara jednoj nukleotidnoj sekvenci sa sli-ke 1A do E (SEQ ID NO: 1), slike 2A i B (SEQ ID NO:3) i slike 20A do C (SEQ ID No:22); ili nekoj njima komplementarnoj sekvenci. Poželjnije, sekvenca nu-kleinske kiseline tog molekula ima najmanje 15 nukleotida. Najpoželjnije, sek-venca nukleinske kiseline ima najmanje 20 nukleotida. Kod jednog izvođenja pronalaska kod koga je oligonukleotid jedna sonda, olionukleotid je pnmet-Ijivo označen, na primer, jednim radionukleotidom (kao stoje 12P) ili jednim enzimom.
Prema drugim svojim vidovima, prikazani pronalazak daje jedan vektor kloniranja, koji sadrži nukleinske kiseline prema pronalasku, koje kodiraju ob polipeptid, i jedan vektor izražavanja bakterija, insekta ili nekog sisara, koji sadrži molekule nukleidnih kiselina prema pronalasku, koji kodiraju ob polipe-ptid, funkcionalno povezan sa jednom sekvencom za kontolisanje izražava-nja. Prema tome, pronalazak se dalje odnosi na jednu ćeliju domaćina, kao što je ćelija bakterije, ćelija kvasca, ćelija insekta, ili ćelija sisara, zagađenu ili transformisanu jednim odgovarajućim vektorom izražavanja, i, shodno tome, primeni napred pomenutih proizvoda za pripremanje modulatora prema pronalasku.
Prema jednom svom sledećem vidu, prikazani pronalazak se odnosi na antitela koja se vezuju za ob polipeptide. Takva se antitela mogu generi-sati prema polipeptidu pune dužine, ili njegovim antigenskim fragmentima. Prema jednom vidu pronalaska, takva antitela suzbijaju funkcionalnu aktivnost (tj. modulisanje telesne mase i sastava masti) ob polipeptida. Prema jednom drugom vidu, antitela se mogu koristiti za određivanje nivoa ob polipeptida koji cirkuliše u plazmi ili serumu. Prema još jednom vidu pronalaska, antitela specifična po području, posebno monoklonska antitela, mogu se koristiti kao sonde OB polipeptidne strukture.
Sve napred pomenute materijale treba da se ovde posmatraju kao mo-dulatori telesne mase i sastava masti, i kao takvi se mogu koristiti u više svr-ha. Pronalazak, posebno, predviđa i dijagnostičku i terapeutsku primenu, kao i tzvesne poljoprivredne primene, sve zasnovane na primeni ovde definisanih modulatora, uključujući i molekule nukleinskih kiselina i peptide. Pored toga, modulacija telesne mase izaziva određene terapeutske implikacije i koristi, zbog toga što se stanja gde ili gojaznost, ili, nasuprot tome, mršavost, pred-stavljaju neželjena telesna stanja, mogu popraviti davanjem jednog ili više modulatora prema prikazanom pronalasku.
Na taj način je predložen postupak za modulisanje telesne mase jed-nog sisara, koji obuhvata regulisanje izražavanja proteina kodiranog nukleid-nom kiselinom koja ima nukleotidnu sekvencu biranu od sekvence sa slike lA do E (SEQ ID NO:l), sekvence sa slike 2A i B (SEQ ID NO:3) njenih degene-risanih i alelnih varijanti. Takvo regulisanje može se ostvariti uvođenjem pred-metnih nukleotida genskom terapijom i masne ćelije pacijenta ili domaćina da bi se regulisala ili smanjila gojaznost. Nasuprot tome, pripremanje i davanje antaonista nukleotidima, kao što su protivsmislem molekuli, biće indicirana i izvedena u slučaju gde se javljaju i lece stanja koja izazivaju preteran gubitak mase, kao što je anorexia nervosa, rak ili AIDS. Ovi se proizvodi unose isto kao nukleotidi, neposredno u masne ćelije, da bi se postigle takve promene.
U skladu s tim, proteini definisani slikama 1A do E, 3, 5 i 6 (SEQ ID NO:l, SEQ ID N0:4, SEQ ID NO:5 i SEQ ID NO:6), konzervirane varijante, njihovi aktivni fragmenti i srodni mali molekuli mogu se formulisati za nepo-sredno davanje u terapijske svrhe, da bi se ostvarilo smanjenje ili regulisanje telesne masti ili prirasta mase. Shodno tome, antitela i drugi antagonisti nave-denih proteinskih materijala, kao što su njihovi fragmenti, mogu se pripremiti i davati na isti način da bi se postiglo suprotno dejstvo. Prema tome, pronala-zak je usmeren na jedan farmaceutski preparat koji sadrži jedan OB polipep-tid prema pronalasku, ili, alternativno, jedan njegov antagonist, u smeši sa jednim farmaceutski prihvatljivim nosačem ili inertnim dodatkom.
Pored toga, OB polipetid prema pronalasku može se davati zbog njegovog kozmetičkog delovanja, na primer da se poboljša telesni izgled smanjenjem naslaga masti. OB polipeptid se može koristiti nezavisno, ili u sklopu sa drugim kozmetičkim strategijama, na primer hirurškim zahvatima, radi njegovog kozmetičkog delovanja.
Dijagnostička primena prikazanih nukleotida i odgovarajućih peptida ide do primene nukleinskih kiselina za identifikovanje sledećih mutacija njiho-vih alelnih varijanti, tako da se razvija jedna lepeza aktivnih nukleotidnih mate-rijala korisnih i za dijagnostičke, i za terapeutske primene. Posebno se mogu prepoznati i homozigotske i heterozigotske mutacije predmetnih nukleotida, što znači tačnije kvantitativno određivanje stanja pacijenata, da bi se odredila izdržljivost pojedinaca do pojave organskih oštećenja u pogledu gojaznosti. Posebno se danas smatra da su heterozigotske mutacije povezana sa malom do srednje gojaznosti, dok bi homozigotske mutacije bile povezane sa izraže-nijim i ozbiljnim stanjem gojaznosti. Odgovarajuća ispitivanja DNK tada bi se mogla izvoditi koristeći pomenute proverene materijale kao repere, da bi se olakšalo precizno dugoročno prognoziranje za posebne tendencije, tako da se mogu propisati promene ili u pogledu ishrane, ili ličnih navika, ili usmeriti terapeutska intervencija, kako bi se sprečila takva stanja.
Dijagnostička upotreba prikazanog pronalaska ide do postupaka za merenje prisustva i količine modulatora prema pronalasku u ćelijskim uzorci-ma ili biološkim ekstraktima (ili uzorcima) uzetim od subjekta koji se ispituje, tako se mogu utvrditi nivoi i nukleinskih kiselina (genomske DNK ili mRNK) i/ili proteina i tim uzorcima za ispitivanje. Polazeći od toga da povećana aktiv-nost nukleotida i prisustvo pri tome dobijenog proteina odražava sposobnost subjekta da spreči gojaznost, lekar koji proučava takve rezultate kod jednog gojaznog subjekta odrediće da li je neki činilac, osim poremećaja funkcije usled prisustva i aktivnosti nukleotida prema prikazanom pronalasku, uzrok stanja gojaznosti. Nasuprot tome, smanjeni nivoi nukleotida i/ili izraženog proteina ukazaće da se ti nivoi moraju povećati da bi se lečilo takvo stanje gojaznosti, pa će moći da se uvede odgovarajući režim lečenja.
Dalje, nukleotidi otkriveni i prikazani na slikama 1A do E i 2A i B, predstavljaju cDNK koja je, kako je ukratko ranije rečeno, korisna kod mere-nja odgovarajuće RNK. Na isti način, rekombinantan proteinski materijal, koji odgovara polipeptidima sa slika 1A do E i 3, može se pripremati i odgova-rajuće označiti za primenu, na primer, kod radioimunoloških ispitivanja, na primer u cilju merenja masti i/ili nivoa OB proteina u plazmi, ili za utvrđivanje prisustva i nivoa nekog receptora za OB na tkivima kao što je hipotalamus
Nadalje, pokazani pronalazak ne samo da predviđa identifikaciju nu-kleotida i odgovarajućih proteina koji se u njima nalaze, već i prikazivanje re-ceptora takvih materijala. U tom kontekstu, polipeptidi prema slikama l A do E, 3, 5 i/ili 6 mogu se pripremati i koristiti za pretraživanje odgovarajuće bibli-oteke izražavanja da bi izolovali aktivne receptore. Receptori se potom mogu klonirati, a zatim se recemtor, sam ili u konjukciji sa ligandom, može koristiti za pretraživanje za nalaženje malih molekula koji mogu imati slično dejstvo kao ovde pomenuti modulatori.
Prikazani pronalazak se, nadalje, odnosi na farmaceutske preparate koji obuhvataju neke od pomenutih modulatora, poželjno polipeptide čije su sekvence prikazane u SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 i SEQ ID NO.6, njihova antitela, njihove odgovarajuće malomolekulske agoniste i anta-goniste, ili aktivne fragmente pripremljene u preparatima za razne vrste dava-nja, tamo gde je takva terapija odgovarajuća. Ovi će preparati sadržati farma-ceutski prihvatljive nosače, ili druge dodatke prema potrebi, a pripremaće se u opsegu delotvornih doza koje će odrediti, za svaki pojedinačni slučaj, klinički lekar ili lekar koji leči pacijenta.
Prema tome, prvenstveni cilj prikazanog pronalaska je da ostvari mo-dulatore telesne mase kako su napred definisani u prečišćenom obliku, koji imaju izvesne karakteristike i aktivnosti povezane sa regulisanjem i menja-njem debljine i sadržaja masti kod sisara,
Sledeći je cilj prikazanog pronalaska da se dobiju postupci za otkriva-nje i merenje modulatora telesne mase, kako je napred izneto, kao sredstvo za efikasnu dijagnozu i praćenje patoloških stanja kod kojih promene nivoa tih modulatora jesu ili mogu biti jedno karakteristično svojstvo.
Jedan sledeći cilj prikazanog pronalaska je da se pripreme genetski proizvodi za primenu kod genetski terapeutskih protokola i/ili farmaceutskih preparata za uporedive terapeutske postupke, koji sadrže, ili se zasnivaju na jednom ili više modulatora, jedinjenjima koja se s njima vezuju, ili agensima koji mogu regulisati njihovu proizvodnju, ili mogu da podražavaju ili da se suprotstavljaju njihovim aktivnostima.
Ostali ciljevi i prednosti postaće jasni stručnjacima iz rasmatranja sledećeg opisa koji se nastavlja sa pozivom na sledeće crteže.
KRATAK OPIS CRTEŽA
SLIKA 1 (A do E) prikazuje sekvencu nukleinske kiseline (SEQ ID NO: 1) i dedukcijom dobijenu sekvencu amino kiseline (SEQ ID NO:2) izvedenu za glodarsku (miševi i pacovi) OB cDNK. Jedan 39-bazni parni 5' LEADER praćen je jednim predviđenim otvorenim okvirom za očitavanje 167 amino kiselina i jednom približno 3,7 kb 3' netransliranom sekvencom. (Kod ranije podnete prijave Ser.br. 08/347,563, podnete 30. novembra 1994 i Ser.br. 08/438,431, podnete 10. maja 1995, naknadno je utvrđeno za jednu dodatnu 58-baznu 5' nekodirajuću sekvencu da je proizvod kloniranja. Taj proizvod nema uticaja na područje kodiranja, na 39-bazno 5' nekodirajuće područje sada opisano na Slici 1, ni na 3' nekodirajuće područje gena.) Ukupno je prikazano oko 2500 osnovnih parova 3' netranslirane sekvence. Analiza predskazahe proteinske sekvence posmatranjem i korišćenjem SigSeq računarskog programa ukazuje na prisustvo jedne signalne sekvence (podvučena). Mikroheterogenost cDNK zapažena je tako što približno 70% CDNK ima jedan glutarninski kodon kod kodona 49, a 30% ga nema (videti slike 5 i 6, niže). Ova amino kiselina je podvučena, kao i argininski kodon koji je mutiran kod C57BL/6Job/ obmiševa (U miševi).
SLIKA 2 (A i B) prikazuje sekvencu nuklemske kiseline (SEQ ID NO:3) izvedenu za humanu OB cDNK. Nukleotidi su numensam od 1 do 701, sa početnim mestom kod nukleotida 46 i završetkom kod nukieotida 550.
SLIKA 3 prikazuje potpunu dedukcijom dobijenu aminokiselinku sekvencu (SEQ ID NO:4) izvedenu za humani OB gen, koja odgovara aminokiselinskoj sekvenci sa slike 2A i B. Amino kiseline su numensane od 1 do 167. Mesto cepanja signalne sekvence nalazi se iza amino kiseline 21 (Ala) tako da se zreo protein pruža od amino kiseline 22 (Val) do amino kiseline 167 (Cys).
SLIKA 4 prikazuje poređenje dedukovanih sekvenci amino kiselina za glodare (SEQ ID NO.2) i za ljude (SEQ ID NO:4). Sekvenca humane OB dedukovane sekvence amino kiselma bila je u velikoj meri podudarna sa onom od miša. Konzervativne promene su naznačene crticom, a nekonzervativne promene zvezdicom. Promenljivi glutarninski kodon je podvučen, kao i položaj besmeslene mutacije kod C57BL/6Job/ ob(U) miševa. Ukupno je bilo 83% identičnosti na nivou amino kiselina, mada je nađeno samo osam supstitucija između valina kod kodona 22 (neposredno nizvodno od ODVAJANJA signalne sekvence) i cisteina u položaju 117.
SLIKA 5 prikazuje sekvencu amino kiselina pune dužine (SEQ ID NO:5) izvedenu za OB gen glodara kako je prikazana na slici 3, ali bez glutamina na položaju 49. Amino kiseline su numerisane od 1 do 166. Mesto cepanja signaine sekvence nalazi se iza amino kiseline 21 (Ala) (što znači pre izostavijanja glutamina 49) tako da se zreo protein pruža od amino kiseline 22 (Val) do amino kiseline 166 (Cys).
SLIKA 6 prikazuje punu dedukovanu sekvencu amino kiselina (SEQ ID NO:6) izvedenu za humani OB gen, kako je prikazana na slici 4, ali bez glutamina na položaju 49. Amino kiseline su numensane od 1 do 166. Mesto cepanja signalne sekvence nalazi se iza amino kiseline 21 (Ala) (što znači pre izostavljani a glutamina 49) tako da se zreo protein pruža od amino kiseline 22 (Val) do amino kiseline 166 (Cys).
SLIKA 7. (A) Fizička mapa mesta ob u hromozomu glodara, i mape kloniranja YAC i Pl. "M i N" odgovara mestimaMuliiNotirestrikcija. Brojevi odgovaraju pojedinačnim životinjama koje su bile rekombmantne od području ob kod 1606 mejoza koje su evidentirane. Met, Pax 4, D6Rck39, D6Rckl3 i Cpa odnose se na lokacije u području ob koje se vezuju za DNK probe. YAC-ovi su izdvojeni koristeći D6Rckl3 i Pax-4 kao probe, a krajevi su dobijem koristeći mali vektor PCR i/ili izdvajanje krajeva plazmida i korišćeni su da bi se izdvojili novi YAC-ovi. (B) Dobijen YAC CONTIG Jedan od YAC-ova u tom CONTIG-u, Y902A0925, bio je himerni. Svaka od proba konšćenih da se odredi genotip rekombinantnih životinja naznačena je stavljanjem u zagradu. (6) odgovara YAC 107; (5) odgovara M16(+) (ili M16(pLUS)); (4) odgovaraadu(+) ;(3) odgovaraaad( pICL) ;(2) odgovara 53(pICL); i (1) odgovara 53(+). (C) Pl CONTIG bakteriofagnih Pl klonova izdvojen izabranim sondama YAC krajeva,obgen je izdvojen u jednom Pl klonu izdvojenom konsšćenjem daljeg kraja YB6S2F12 YAC-a (kraj (4)) (alternativno ovde označen kaoadu(+),
SLIKA 8 predstavlja fotografiju etidijum bromidne mrlje 192 nezavisno izdvojene supstance u četvrtom eksperimentu hvatanja egzona, koje su PCR umnožene i okarakterisane.
SLIKA 9 je fotografija jedne etidijum bromidne mrlje PCR pojačanih klonova za koje se pretpostavljalo da sadrže ob. Svaki od 7 klonova koji nisu imali taj veštački proizvod, ponovo je pojačan korišćenjem PCR i izložen elektroforezi na 1% agaroznom gelu u tetrabrometilenu (TEB) i bojen etidijum bromidom. Markeri veličine (krajnja leva nenumerisana traka) au komercijalno dostupni "1 kB ladder". Traka 1 - klon IDI2, koji sadrži jednu "HIV sekvencu". Traka 2 - klon 1F1, novi klon van ob područja. Traka 3 - klon 1H3. Traka 4 - klon 2B2, koji je identičan klonu 1H1. Traka 5 - klon 2G7, koji sadrži jedanobegzon. Traka 6 - klon 2G11, koji je identičan klonu 1F1. Traka 7 - klon 2H1, koji ne sadrži neki umetak.
SLIKA 10 predstavlja sekvencu 2G7 klona (SEQ ID NO:7), koja sadrži jedan egzon koji kodira deoOBgena. osnovske sekvence, korišćene da se pojača ovaj egzon, na slici su uokvirene (SEQ ID NOS:8 i 9).
SLIKA 11 (A) PCR analiza obratne transkripcije rnRNK iz različitih tkiva istog miša pomoću 2g7 osnova (ili prajmera) i aktinskih osnova. RT-PCR reakcije su izvoženje koristeći 100 ng ukupne obratno transkribovanee RNK, sa oligo dT kao osnovom za sintezu prvog lanca cDNK. PCR pojačanje je vršeno u toku 35 ciklusa sa 94" denaturisanjem za 1'; 55° hibridizacijom za 1'; i 72°C ekstenzije za 2' sa jednom drugom autoekstenzijom 1' po ciklusu. Proizvodi RT-PCR rastvoreni su 'u 2% agaroznog gela niske tačke topljenja u lxTBE puferu. (B) Northern razmaz rnRNK iz različitih organa miša koristeći PCR obeleženi 2G7 kao sondu. 10 ug ukupne RNK iz svakog od tkiva podvrgnuto je elektroforezi na agaroznom gelu sa formaldehiđom Uzorak je hibridizovan na 65°C i Rapid Hybe (Amersham) uređaju za hibridizaciju. Autoradiografski signali su bili uočljivi posle l časa eksponiranja. Prikazani eksperiment je rezultat eksponiranja koje je trajalo 24 časova,
Slika 12 (A) Mrlja etidijum bromida iz jedne RT-PCR reakcije na RNK masne ćelije (belo adipozno tkivo) od svakog od navedenih mišjih sojeva. Ukupna RNK (100 ng) za svaki uzorak bila je suprotno transkribovaba koristeći oligo dT i suprotnu transkriptazu, a dobijena jednolančana cDNK bila je PCR pojačana 2G7 osnovima (donje trake) ili aktinskim osnovima (gornje trake). 2G7 i aktinski osnovi bili su uključeni u istu PCR reakciju. Proizvodi su obrađeni na 1% agarozno-TBE gelu. (B) Northern analiza koja odgovara tački (A). 10 pg RNK masnih ćelija (belo adipozno tkivo) od svakog od naznačenih sojeva izvađeno je ispitano PCR-označenom 2G7 sondom kao na pomenutoj slici 11B. Uočen je približno 20-tostruki porast nivoa 2G7 rnRNK u RNK bele masti od soja C57BL/6J ob/ob (U) u odnosu na mršave životinje iz istog legla. I kod RT-PCR i kod Northern eksperimenta nije bilo primetljivog signala u 2G7 RNK od SM/Ckc-+<Dl*>obJJ/ ob- v(2J) miševa čak i posle 2 nedelje izlaganja. Prikazano je jedno 24-časovno autoradiografsko eksponiranje. Isti filtar je hibridizovan u aktinsku sondu (donji deo slike).
SLIKA 13 je jedna Northern analiza dodatnih 2J životinja i kontrolnih životinja koja potvrđuje nepostojanjeobrnRNK kod 2J životinja. Northern analiza je izvedena kao i kod slika 11 i 12. U ovom slučaju je kontrolna RNK bila ap2, jedan transkript specifičan na mast. Promenljiva gustina ap2 traka nema značaja.
Slika 14 poredi DNK sekvncu C57BL/6j (normalnih) i C57BL.6Job/ ob(U) miševa u području tačkaste mutacije koja vodi do uvađenja prezrelog graničnog kodona (besmislena mutacija) kodcDNK mutantnog soja. ob/ob miševi su imali jednu C->T mutaciju koja je promenila argininski ostatak na položaju 105. Ta osnovna promena je prikazana kao izlaz iz automatizovanog DNK SEQUENCER. RT-PCR je izvedena koristeći RNK bele masti od oba soja (+/- iob/ ob)koristeći osnove iz 5' i 3' netransliranih područja. Proizvodi PCR reakcije prečišćeni su na gelu i neposredno ručno sekvencirani koristeći jedan automatizovan SEQUENCER firme Applied Giosystems, Inc., tipa 373 A, sa osnovima duž oba lanca sekvence za kodiranje.
SLIKA 15 (A) Southern mrlja genomske DNK od svakog od navedenih sojeva miševa. Približno 5 pg DNK (izvedene od genomske DNK pripremljene od jetre, bubrega ili slezine) bilo je restriktivno razložen ukazanim restriktivnim enzimom. DNK je potom podvrgnuta elektroforezi u 1% agaroznom TBE gelu i ispitana PCR-označenim 2G7. Restriktivno razlaganjeBg/ IIukazalo je na povećanje veličine jednog 9 kB velikog (najveći)Bglllfragmenta u DNK$ M/ Ckc-+ ob~ J o/ rJ(2J) miševa. Preliminarno restriktivno mapiranje genomske DNK ukazuje daje položaj polimorfnogBglllna oko 7 kB ispred mesta početka transkripcije. Nijedan od drugih ispitivanih enzima nije se pružao dalje od mesta početka rnRNK. (B) Izdvajanje jednogBglllpolimorfizma u$ MJCkc-+ obzl/ ob2Jsoju. Šest gojaznih i pet mršavih potomaka iz iste generacije koizogenskeSM/ Ckc-+ ob2"'/ ob21 (2J)kolonije bilo je ispitano na genotip registravanjemBglllpolimorfizma kako je prikazano na (A). Sve od fenotipski gojaznih životinja bile su homozigotske za veće alele polimorfnogBglllfragmenta. DNK u "kontrolnoj" traci pripremljena je od nesrodnog soja SM/Ckc-+Do<c>+/+ mišev<a,>gajenih neza-visno od SIvi<y>Ckc-+<Doc>ob^/ ob"kolonije.
SLIKA 16 je jedan Southern razmazEcorazložene genomne DNK od navedenih sojeva, koristećiOBcDNK kao sondu (tj. jedan ZOO razmaz). Signali hibridizacije su bili primetljivi u svakom uzorku kičmenjaka, čak i posle umerene strogosti hibridizacije. Cat DNK u ovom eksperimentu bila je nešto malo degradirana. Rstrikciona obrađena je na 1% agarosnom TBE gelu i premeštena na jednu imobilon membranu radi ispitivanja. Filtar je hibridizovan na 65°C i ispran u 2X SSC70,2% SDS na 65°C, dva puta u toku 20 minuta i eksponiran 3 dana koristeći Kodak (Rochester, N.Y) X-OMAT film.
SLIKA 17 predstavlja područje kloniranja izražavanja vektora pET-15b (Novagen) (SEQ ID NOS.: 11 i 12).
SLIKA 18 prikazuje analizu eluata iz (Ni) stuba sa His-vezujućom smolom za FUSION od jednog rekombinantnog zrelog glodara (miša ili pacova) na jedan His-tag
(A) i FUSION OB odraslog čoveka na jedan His-tag (B). Bakterije su transformisane vektorima pETM9 i pETHl4. Posle podsticanja jednim 1 mM IPTG pri optimalnim
uslovima, bakterije su mogle da proivedu 100-300 p.g/ml OB FUSION proteina, prvenstveno u telima uključaka. Tela uključaka su bila rastvorena 6M gvanidin-HCl-om ili ureom, a FUSION protein (koji se nalazio u površinskom sloju LYSIS) nanet je na (Ni) stub sa His-vezujućom smolom u 10 ml lx vezujućeg pufera sa ureom. Stub je ispiran po stupnjevima 5 ml ALIQUOTS 20 uM, 60p.M i 300 uM imidazola, i na kraju puferom za odvajanje. ALIQUOTS su analizirani radi otkrivanja prisustva FUSION OB polipeptida na 15% akrilamidnom gelu. Svaka od traka sadrži ekvivalent od 100 pl bakterijskog ekstrakta.
SLIKA 19 (A) Translacijain vitro OBRNK. HumanaOBcDNK je potklonirana u pGEM cektor. Plazmid je linearizovan a plus lanac RNK je sintetizovan koristeći Sp6 polimerazu. RNK sintetizovanain vitrotranslirana je u prisustvu ili bez mikrozomne membrane psećeg pankreasa. Posle translacije/>/vitroprimećeno je približno 18 kD primarnog proizvoda translacije. Dodavanje mikrozomnih membrana u reagujuću smešu dovelo je do pojave drugog proizvoda translacije, za oko 2 kD manjeg od prvobitnog proizvoda translacije. Veličina proizvoda translacije interleukin-Ict RNK, koji nema kodiranu signalnu sekvencu, nije se promenila dodavanjem mikrozomnih membrana. Ovi su podaci ukazali na prisustvo jedne funkcionalne signalne sekvence. (B) Translacijain vitrou prisustvu ili bez proteinaze K. Obrada proteazom dovela je do potpune proteoirze 18 kD prvobitnog proizvoda translacije, dok je 16 kD obrađenog oblika ostalo nedirnuto. Penneabilizovanje mikrozoma pomoću 0,1% TR1TON-X100 učinilo je obrađen oblik osetljivim na proteazu. Ovi rezultati ukazuiu daje proizvod transliran u zapreminu mikrozoma.
SLIKA 20 (A do E). Sekvenca humanogOBgena (SEQ ID NOs: 22 i 24). (F) Šematski dijagrama glodarskog (miš, pacov)OBgena. (G) Šematski dijagram humanogOBgena. I kod (F) i kod (G) podvučeni su početni i krajnji (stop) kodon Nema tragova u humanom genu prvog introna homolognog mišjem prvom intronu, ali njegovo postojanje se ne može isključiti.
SLIKA 21 predstavlja šematski crtež jedne od strategija kloniranja korišćene da se ostvari rekombinantno izražavanjeOBuPichiakvascu. (A) Vektor izražavanja OB sa signalnom sekvencom ot-tipa sparivamja. (B) Šematski crtež strukture rekombmantnog FUSION proteina, uključujući sekvencu amino kiseline (SEQ ID NO:26) koja trnaXholmesto i navodna KEX-2 i STE-13 mesta cepanja, i N-završne prekobrojne amino kiseline koje se tu nalaze posle KEX-2 cepanja (SEQ ID NO:27).
(C) Alternativna strategija za proizvodnju zrelog OB obuhvata pripremanje jednog proizvoda sa sekvencom amino kiselina koja odgovaraXholtnestu cepanja i KEX-2
inestu cepanja neposredno ispred sekvence zrelog ob polipeptida (SEQ ID NO:28).
SLIKA 22. Alternativna strategija izražavanja uPichiakvascu. (A) Vektor izražavanja jedne OB FUSION sa jednim His-tag usvojenim je pET sistema izražavanja pod kontrolom signalne sekvence ct-tipa sparivanja (SEQ ID NO:33). (B) Šematski crtež strukture rekombinantnog OB FUSION proteina koji sadrži jedan His-tag, koja obuhvata signahiu sekvencu a-tipa sparivanja, pretpostavljena KEX-2 i STE-13 mesta cepanja, His-tag, i mesto cepanja trombina, i koja će dati OB sa tri dodatna ostatka N-završne amino kiseline.
SLIKA 23. (A) PAGE analiza izražavanja mišjeg OB (oba mikroheterogena oblika, tj. koji ima i koji nema Gln 49) u transformisanom pichia kvascu. Očekivana traka od približno 16 kD je vidljiva u fluidu transformisane kulture kvasca (druga i treća traka), ali ne i u fluidu kulture netransformisanog kvasca (prva traka). (B) PAGE analiza delimično prečišćenog rekombinantnog OB polipeptida na karboksimetil celulozi, koja je slab izmenjivač katjona. Traka od oko 16 kD je veoma uočljiva u frakcijama 3 i 4 iz stuba, koji je ispran sa 250 mM NaCl. Traka 1 - unet uzorak, traka 2
- protekao uzorak; trake 3 - 5 - frakcije isprane sa 250 mM NaCl.
SLIKA 24 pokazuje da OB protein cirkuliše u mišjoj plazmi. (A) Imunoprecipitacije iz krvi miša. 0,3 ml mišje plazme bilo je prethodno izbistreno nekonjugovanom seforozom i inkubirano preko noći sa ununski prečišćenim anti-OB antitelima konjugovanim sa perlicama sefaroze 4B. Imonoprecipitat je izdvojen na 15% SDS-PAGE gelu, premešten i načinjen je Western razmaz jednim anti-OB antitelom. Protein se pomeno sa molekularnom masom od oko 16 kD do istog položaja kao i zreli mišji ob protein izražen u kvascu. Proteina nije bilo u plazmi C57BL/6Job/ obmiševa, a u plazmi C57BLB/Ksdb/ dbmiševa povećan je desetostruko u odnosu na obične miševe. Mišljenje je dadbmiševi prekomerno proizvode OB protein, što je posledica njihove otpornosti na njegovo delovanje. (B) Povećani nivoiOBkod debelih pacova. Debeli pacov je gojazan usled recesivne mutacije na pacovskom hromozomu 5. Genetski podaci su nagovestili defekt u istom genu mutiranom koddbmiševa. Plazma od debelih pacova i mršavih pacova iz istog legala bila je podvrgnuta imunoprecipitaciji i obrađena na VVestern razmazima. Kod mutantnih životinja je uočeno dvadesetostruko povećanje nivoa cirkulisanja OB. (C) Određivanje količine OB proteina u mišjoj plazmi. Povećavane količine rekombinantnog mišjeg proteina dodavane su u 100Xplazme od ob miševa i izloženelmunoprecipitaciji. Intenzitet signala na VVestern razmazima poređen je sa onim iz 100 A. plazme običnih miševa Uočeno je linearno povećanje intenziteta signala sa povećanjem količina rekombinantnog proteina, što ukazuje da su imunoprecipitacije izvedene u uslovima viška antitela. Slični signali su uočeni kod uzorka plazme običnih miševa i uzorka sa 2 ng rekombinantnog proteina, što ukazuje da je nivo cirkulisanja u mišjoj plazmi približno 20 mg/ml. (D) OB protein u ekstraktima adipoznog tkiva. Citoplazmični ektrakti mišjeg adipoznog tkiva pripremljeni su oddbi običnih miševa. VVestern razmazi su pokazali povišene nivoe 16 kD proteina u ekstraktima pripremljenim oddbmiševa.
SLIKA 25 prikazuje da OB protein cirkuliše sa promenljivim nivoima u humanoj plazmi. (A) VVestern razmazi humane plazme. Uzorci plazme dobijem su od šest mršavih dobrovoljaca. Imunoprecipitacija i VVestern razmazi otkrili su prisustvo imunoreaktivnog 16 kD proteina, identične veličine kao kod humanog proteina rekombinantne 146 amino kiseline izražene u kvascu. U šest uzoraka uočeni su različiti nivoi proteina. (B) ELISA (Enzvme Linked Immunoassav - imunsko ispitivanje povezano sa enzimima) za humani ob. Mikrotitarske ploče su prevučene imunski prečišćenim antihumanim OB antitelima. Pločama su dodavane poznate količine rekombinantnog proteina i otkrivane su koristeći imunski prečišćena biotinilisana anti-ob antitela. Mera apsorpcije svetlosti na 414 nm naneta je na dijagram u funkciji poznatih koncentracija OB da bi se dobila standardna kriva. Dobijena standardna kriva je ukazala da opit može otkriti 1 ng/ml ili više humanog OB proteina. (C) Određivanje količine OB proteina u humanoj plazmi. Izveden je ELISA imunski opit koristeći 100Xplazme od šest mršavih dobroboljaca i standarde korišćeni pod (B). Utvrđeni su nivoi OB proteina u opsegu od 2 ng/ml u HP1 do 15 ng/ml u HP6. Ovi podaci se slažu sa podacima Western razmaza pod (A).
SLIKA 26 pokazuje da OB protein obrazuje međućelijske ili unutarćelijske disulfidne spojeve. (A) VVestern razmazi u redukcionim i neredukcionim uslovima. VVestern razmazi mišje i humane plazme ponavljani su uz dodavanje i bez dodavanja sredstava za redukovanje puferu uzorka. Kada se p-merkaptoetanol izostavi iz pufera uzorka, Imunoprecipitatidbplazme kreću se sa vidljivom molekulskom masom od 16 kD i od 32 kD. Dodavanje f3-merkaptoetanola puferu dovodi do nestajanja jezgara od 32 kD (videti sliku 24). Ovaj rezultat je ponovljen kada je mišji protein izražen u kvascu,Pichia pastoris.U ovom slučaju se mišji OB protein pomera u položaj jednog dimera. U uslovima redukcije, prečišćen rekombinantni mišji protein kreće se sa uočljivom molekulskom masom od 16 kD, što ukazuje daje nolekularni oblik od 32 kD rezultat jednog ili dva međumolekulska disulfidna spoja. Humani protein izražen in vivo i u Pichia pastoris kreće se sa molekulskom masom od 16 kD i u redukcionim i u neredukcionim uslovima (podaci nisu prikazani). (B) Humani protein izražen u kvascu sadrži jedan unutarmolekulski disulfidni spoj. Izlučeni proteini obično poprimaju svoju pravilnu konformaciju kada su izraženi u Pichia pastoris sistemu izražavanja. Zreo humani protein 146 amino kiseline izražen je u Pichia pastoris i prečišćen iz kvasca dvostepenim protokolom prečišćavanja koji je obuhvatio IMAC i gelsko filtriranje. Prečišćen rekombinantni protein podvrgnut je masenoj spektrometriji pre i posle cepanja cijanbrpmidom. Cijanbromid vrši cepanje na karboksi završetku metioninskih ostataka. Molekulska masa rekombinantnog proteina kvasca bila je 16,024 ±3 Da (proračunska molekulska masa = 16,024 Da). Cijanbromid čepa iza tri metionina u proteinskoj sekvenci kod amino kiselina 75, 89 i 157. Cijanobromidni fragment izmerene mase od 8435,6 Da odgovara amino kiselinama 90-157 i 158-167 spojenim jednom disulfidnom vezom između cis-117 i cis-167 (proračunska molekulska masa = 8434,5 Fa). N.D. = not deiected - nije nađeno.
SLIKA 27 opisuje pripremanje bioaktivnog proteina Nukleotidna sekvenca, koja odgovara zrelom mišjem OB proteinu 145 amino kiseline klonirana je u pET 15b vektor izražavanja. pET vektor umeće jedan polihistidinski trakt (His-tag) ispred klonirane sekvence što omogućuje efikasno prečišćavanje koristeći afinitetnu hromatografiju na imobilisanomm metalu (lmmobilized Metal Affmitv Chromatographv - IMC) Rekombinantni bakterijski protein se na početku razdvojio na nerastvorljivu membransku frakciju nakon bakterijske lize. Membranska frakcija je rastvorena koristeći gvanidijum hidrohlorid i naneta na jednu IMAC kolonu. Protein je izdvajan po stupnjevima, povećanim koncentracijama imidazola, kako je prikazano. Izdvojen protein je ponovo savijen i obrađen trombinom da bi se uklonio His tag, kako je kasnije opisano. Konačni prinos rastvorljivog proteina bio je 45 ng/ml bakterijske kulture.
SLIKA 28 prikazuje biološko delovanje OB proteina. Prikazano je, u funkciji vremena, uzimanje hrane (dijagrami A-C) i telesna masa (dijagrami D-F). Grupe od po deset životinja dobijale su dnevno intraperitonalne injeksije OB proteina u dozi od 5 mg/kg/dan (puni kvadrata), ili dnevne injekcije PBS (kalijum bisulfida) (puni krugovi), ili nisu ništa primale (puni trouglovi). Grupe koje su primale injekcije obuhvatale su C57B1/6Job/ obmiševe (dijagrami A i D), C57B1/K.Sdb/ dbmiševe (dijagrami B i E) i CBA/J+/+ miševe (dijagrami C i F). Hrana koju su uzimali miševi merena je dnevno, a telesna masa je beležena u intervalima od tri do četiri dana, kako je naznačeno.
(Razmera telesne mase u gramima različita je za obične miševe u odnosu naob\dbmiševe.) Uzimanje hrane kod ob miševa koji su primali protein smanjeno je posle prve injekcije i stabilisano posle četvrtog dana na nivou od približno 40% onoga kod grupe koja je primala injekcije bez aktivne materije (p<<>0,001). Telesna masa ovih životinja se smanjivala u prošeku za 1,3 g/dan i stabilisala posle tri nedelje na nivou od približno 60% od početne mase (p<0,0001). Koddbmiševa nije se moglo primetiti delovanje proteina. Malo ali značajno delovanje na telesnu masu primećeno je kod CBA/J miševa u dve rane vremenske tačke (p<0,02) Standardna greška za svako od merenja naznačena je jednom vertikalnom crtom, a statistički značaj ovih rezultata prikazanje u Tabeli 1.
SLIKA 29 prikazuje rezultate paralelnog hranjenjaobmiševa. (A) jedna grupa od četiri C57B1/6Job/ obmiša dobijala je količinu hrane jednaku onoj koju je trošila grupaobmiševa koja je primala rekombinantni protein Gubitak mase za obe grupe je proračunat posle pet, osam i dvanaest dana. Miševi kojima je ograničavana hrana gubili su (šrarirano polje) manje mase odobmiševa koji su primali protein (puno polje)
(p<0,02). Ovaj rezultat ukazuje da je delovanje OB proteina na smanjenje mase rezultat delovanja i na uzimanje hrane i na utrošak energije. (B) Fotografija jednog obrađivanogobmiša. Prikazana su dva C57B1/6Job/ obmiša. Miš sa leve strane primao je PBS i težio je 65 g, što je bila početna masa. Miš sa desne strane primao je dnevne inekcije rekombinantnog OB proteina. Početna masa ove životinje takođe je bila 65 g, a masa posle tri nedelje dobijanja proteina bila je 38 g. (C) Jetraobmiša koji je primao i miša koji nije primao protein. Prikazane su jetre C57B1/6Job/ obmiševa, od kojih je jedan primao, a jedan nije primao protein Jetra miša koji je primao PBS ima opŠti izgled masne jetre i merila je 5,04 g. Jetra miša koji je primao rekombinantni ob protein imala je normalan izgled i merila je 2,23 g.
SLIKA 30 prikazujein siluhibridizacijuobna adipozno tkivo. Smislena i protivsmislenaobRNK obeležena jein vitrokonsteći Sp6 i T7 polimerazu i digoksigenin. Obeležene RNK su hibridizovane na sekcije, ulivene u parafin, adipoznog tkiva od naslaga masti kod testisa osam nedelja starih C57B1/Ks miševa (označeni kao prirodna vrsta) i C57B1/Ksdb/ dbmiševa (označenidb),Na slici se kapljice lipida javljaju kao neobojene šupljine unutar ćelija. Citoplazma je tanak okvir na periferiji ćelije i ne može se razlikovati od ćelijske membrane. Hibridizacija na sve adipocite u polju otkrivena je kod sekcija običnih miševa tek kad je korišćen protivsmisleni PROBE a veoma povećani nivoi su uočeni u sekcijama tkiva oddb/ dbživotinja.
SLIKA 31 pokazuje da jeOBRNK izražena u adipocitimain vivoiin vitro.Ukupna RNK (10 mikrograma) iz nekoliko različitih izvora podvrgnuta je elektroforezi nakon razmazivanja i hibridizovana na jednuobPROBE. Kao prvo je korišćena razlika u ćelijskoj BUOYANCY nakon razlaganja kolagenazom da bi se prečistili adipociti.OBRNK se nalazila samo u adipocitnoj frakciji. Traka S označava stromovaskularnu frakciju a A označava adipocitnu frakciju. Pored toga,OBRNK nije bila izražena u traci U nediferentovanih 3T3-442 predadipo-citmh ćelija. Diferentovani adipociti iz tih ćelijskih linija izražavali su jasno uočljive nivoeOBrnRNK (traka D).
SLIKA 32 pokazuje da jeOBRNK izražena u svim naslagama masnog tkiva. Sve ispitivanje naslage adipoznog tkiva izražavale suobRNK. Naslage masti kod prepona izražavale su nešto niže nivoe RNK, mada je bilo razlike u nivou signala u pojedinim eksperimentima. (Slika 31 A) Naslage masti, trake: (1) oko testisa, (2) kod prepona, (3) abdominalne, (4) okolomaterične. Mrko masno tkivo tzakođe je izražavalo nizak nivoOBRNK. (Slika 31B) NivoOBizražavanja u mrkom masnom tkivu nije se menjao kod životinja smeštenih na 4°C u toku jedne nedelje dana, dok je količina za mrko masno tkivo specifične UCP RNK, za koju se zna da se može izazvati hladnoćom, povećana za pet puta.
SLIKA 33 prikazuje izražavanjeOBRNK koddb/ dbi aurotioglukozom obrađenih miševa. Ukupna RNK od okolomateričnih naslaga masti miševa tretiranih aurotioglukozom (GTG) idb/ dbpodvrgnuta je elektroforezi i Northern razmazivanju. Poznato je da GTD data kao jedinstvena doza izaziva gojaznost izazivanjem specifičnih lezija hipotalamusa. (A) Ženke CBA miševa, starosti jedan mesec, tretirane su GTG-om (0,2 mg/kg), što je dalo porast >20 g kod tretiranih životinja u odnosu na kontrolne životinje (5 g). Hibridizacija jednogOBPROBE na RNK oddb/ dbi GTG tretiranih miševa pokazala je dvadesetostruki porast količineobRNK u odnosu na kontrolnu RNK (aktin ili GAPDH). 1.SLIKA 34 predstavlja analizu pomoću NOrthern razmaza humane RNK. Northern razmazi koji su sadržali 10 mg totalne RNK iz humanog adipoznog tkiva (FAT, slika A) i 2 mg polyA+RNK od drugih humanih tkiva (slika B) hibridizovano je na humanu ob PROBE ili na humanu (3-aktin PROBE, kako je naznačeno. Opažen je intenzivan signal na približno 5,5 kb sa totalnom RNK adipoznog tkiva. Hibridizacija na polyA+RNK dala je pnmetljive signale u srcu (HE) i placenti (PL), dokOBRNK nije otkrivena u mozgu (BR), plućima (LU), jetri (LI), skeletnim mišićima (SM), bubregu (Kl) i pankreasu (PA). U svakom od ovih slučajeva ukazana je dužina autoradiografske ekspozicije. Treba napomenuti da geneza donjih molekularnih traka opaženih u placentnoj RNK (na primer, naizmenično vezivanje, degradacija RNK) nije poznata.
SLIKA 35 predstavlja YAC CONTIC koji sadrži humani PB ge i 8 mikrosatelitskih markera. Prikazana je mapa sadržaja STS, zasnovana na YAC-u, područja hromozoma 7 koji sadrži humaniOBgen, kako je dobijena SEGMAP/Version 3,29 pngramom [Green i dr., PCR Nethods Applic, 1:77-90
(1991)]. 19 pojedinačno- rAspoređenih STS (videti tabelu 3) navedeno je duž gornje strane. 0 mikrosatelitski specifičnih STS naznačeno je zvezdicama (videti Tabelu 4). Take su navedeni STS koji odgovaraju Pax4 i OB genima, kao i predskazani položaji centromera (CEN) i 7q telomera (TEL) u odnosu na kontig. Svaki od 43 YAC klona označen je horizontalnom crtom, pri čemu je njegovo ime dato sa leve strane, dok je procenjena veličina YAC ( u kb, mereno gelskom elektroforezom sa pulzirajućim poljem) data u zagradi. Prisustvo jednog STS u jednom Yac-u naznačeno je zacrnjenim krugom na odgovarajućem mestu. Kada jedan STS odgovara ulaznom kraju jednog YAC, postavlja se jedan kvadrat oko odgovarajućeg kruga, oba duž gornje strane (blizu naziva STS) i kod kraja YAC-a iz koga je izveden. Za 5 YAC-a sa donje strane (ispod horizontalne isprekidane linije) 1 ilio više STS, za koje se očekivalo da će ih biti (na osnovu ustanovljenog STS redosleda) nije zapaženo (što se utvrđuje ispitivanjem pojedinačnih YAC-a odgovarajućim STS-specifičnun PCR testovima najmanje dva puta), i oni su prikazani kružićima na odgovarajućim pozicijama. Najveći deo YAC-ova je izolovan iz LIBRARY izvedene od hibridnih ćelija čoveka i hrčka [Green i dr., Genomics, 25:170-183 (1995)], sa njihovim ukazanim imenima. Preostali YAC-ovi su izolovani iz potpuno humanih genomskih LIBRARIES, i njihove početne lokacije u LI.BRARY su date u Tabeli 3. Okviri su stavljeni oko imena 3 YAC-a (yWSS691, yWSS999 i yWSS2935) za koje je utvrđeno FISH analizom da se" nalaze na 7q31.3. CONTIG je prikazan u njegovom "neproraračunskom" obliku, gde veličine YAC-ova nisu korišćene za utvrđivanje preklapanja klona ili rastojanja STS, pa su zato svi STS postavljeni na jednakim međusobnim raszojanjima. Kod "proračunskog" oblika, gde se veličine YAC-ova koriste da bi se utvrdilo relativno rastojanje koje razdvaja svaki od parova susednih YAC-ova kao i veličinu preklapanja klona, vidi se da ukupan YAC CONTIG obuhvata nešto više od 2 Mb.
DETALJAN OPIS
Prikazani pronalazak se odnosi na razjašnjavanje i otkrivanje jednog proteina, ovde označenog kao ob polipeptid ili leptin, nukleinske kiseline koja kodira protein, uključujući njegove degenerisane varijante, na primer one koje sadrže optimalne kodone za izražavanje u nekom određenom sistemu izražavanja, a koji protein pokazuje sposobnost da učestuje u regulisanju telesne mase sisara. Nukleinske kiseline o kojima je reč predstavljaju kodne sekvence koje odgovaraju mišjem i humanom OB polipeptidu, za koji se smatra da igra kritičnu ulogu kod regulisanja telesne mase i gojaznosti. Ovde prikazani podaci ukazuju da polipeptidski proizvod jedne nukleinske kiseline prema pronalasku luče ćelije koje ga izražavaju, i da polipeptide deluje kao hormon. Dodatni eksperimentalni podaci ukazuju da je OB polipeptid veoma efikasan kod lečenja gojaznosti kod miševa kod kojih je izvedena mutacijaobgena. Poreed toga, velike jedinične doze ili umerene kontinualne doze OB polipeptida izazivaju smanjenje mase kod normalni (nemutirani) miševa.
Pored toga, dati primeri pokazuju da OB polipeptid, alternativno nazvan i "leptin", cirkuliše u plazmi miševa, pacova i ljudi. Leptina nema u plazmiob/ obmiševa, a ima ga u desetostruko većoj koncentraciji u plazmidb/ dbmiševa, i u dvadesetostrukoj koncentraciji kod fa/fa pacova. Što je najznačajnije, dnevne injekcije rekombinantnog leptina dramatično smanjuju telesnu masuob/ obmiševa, značajno utiču na telesnu masu normalnih miševa, a ne deluju nadb/ dbmiševe.
U svom sledem vidu, OB polipetid od jedne vrste biološki je aktivan kod druge vrste. Posebno je humani OB polipeptid aktivan kod miševa.
U svom primarnom vidu, prikazani pronalazak je usmeren na identifikaciju materijala koji funkcionišu kao modulatori telesne mase sisara. Posebno se pronalazak odnosi na izdvajanje prečišćavanja i SEQUENCING određenih nukleinskih kiselina koje odgovaraju OB genu ili području njegovog kodiranja i kod miševa i kod ljudi, kao i na odgovarajuće polipeptide izražene ovim nukleinskim kiselinama. Na taj način pronalazak obuhvata pronalaženje nukleinskih kiselina koje imaju nukleotidne sekvence prikazane na slici 1A do E (SEQ ID NO:)) i na slici 2A i B (SEQ ID N0:3), i njihovih degenerisanih varijanti, alela i fragmeta, od kojih svi imaju sposobnost modulisanja telesne mase i gojaznosti. Odgovaranje prikazanih nukleinskih kiselina OB genu nagovestava njihov snačajan uticaj na stanja kao što je gojaznost, kao i na druga oboljenja i otkaze funkcionisanja kod kojih nenormalnosti u telesnoj masi predstavljaju jedan od činilaca koji ih izazivaju. Pronalazak obuhvata proteine izražene nukleinskim kiselinama prema pŠronalasku, a posebno proteine prikazane na slici 1A do E (SEQ ID NO:2), slici 3 (SEG ID NO:4), slici % (SEQ ID NO:5) i slici 8 (SEQ ID NO:6), kao i na konzervativne varijante, aktivne fragmente i srodne male molekule.
Kako je ranije rasmatrano, peptidi modulatora telesne mase, ili njihovi BINDING PARTNERS ili drugu ligandi ili agensi koji ih iii imitiraju ili imaju ili pokazuju antagonizam prema njima, ili regulišu njihovu proizvodnju, mogu se pripremati u vidu farmaceutskih preparata, sa pogodnim nosačem, a jačine pogodne za davanje na različite načine pacijentu koji pati od nenormalnih promena telesne mase ili od gojaznosti, bilo samih po sebi ili kao deo nekog nepovoljnog medicinskog stanja kao što je rak ili AIDS, radi njihovog lečenja. Može se koristiti više tehnika davanja, između ostalog oralno davanje, ušmrkavanje i drugi oblici davanja preko mukusa, parenteralne tehnike kao što su potkožne, intravenske i intrapentonalne injekcije, kateterizacije i slično. Prosečne količine aktivne materije ili njihove podjedinice mogu biti različite i moraju se zasnivati na preporukama i receptu kvalifikovog lekara (specijaliste) ili veterinara.
U skladu sa napred navedenim, može se pripremiti ispitivanje za pretraživanje potencijalnih lekova koji podražavaju ili antagoniziraju delovanje modulatora telesne mase. Modulator telesne masemože se uneti u sistem za ispitivanje, a potencijalni lek se takođe može uneti u dobijenu ćelijsku kulturu, pa se potom kultura ispituje da bi se utvrdilo da li ima promena aktivnosti ćelija, bilo od dodavanja samo potencijalnog leka, ili usled dejstva dodanih količina poznatog modulatora telesne mase.
Kako je ranije rečeno, ovde opisano molekulsko kloniranjeOB gena dovelo je do identifikacije klase materijala koji deluju na molekulskom nivou da bi modulisali telesnu masu sisara. Otkriće modulatora prema pronalasku ima važan značaj za dijagnoszu i lečenje poremećaja kod hranjenja, uključujući gojaznost, ali ne i ograničeno samo na nju, gubitka telesne mase povezanog sa rakom, i za lečenje bolesti povezanih sa gojaznošću, kao što je povišen krvni pritisak, sršana oboljenja i dijabetes tipa II. Pored toga, postoje potecijalne primene u poljoprivredi za genske proizvode u slučajevima kada se može želeti modulisanje telesne mase domaćih životinja. Na kraju, imajući u vidu da su jedan ili više od modulatora prema pronalasku izlučeni molekuli, oni se mogu koristiti diohemijski za izdvajanje njihovih receptora, koristeći tehnologiju kloniranja izražavanja. Sledeća diskusija sa posebnim osvrtom naOBgen uopšteno je primenljiva na klasu modulatora koji čine deo ovog pronalaska, pa je treba prihvatiti sa odgovarajućom širinom i opsegom interpretacije.
Kao što je napred rečeno, funkcionalno delovanje OB polipeptida se može proceniti transgenetički. U tom smislu se može koristiti mutiran miš kao opitna životinja,obgen se može koristiti u studijama komplemenata upotrebljavajući mutirane miševe. Transgenski vektori, uključujući virusne vektore, ili kosmidne klonove (ili fagne klonove) koji odgovaraju prirodnom lokusu CANDIDATE gena, mogu se sačiniti koristeći izdvojenobgen Kosmidi se mogu unositi u mutirane miševe koristeći objavljene procedure [Jaemsch, Science, 240:1468-1474 (1988)] Proizvodi se unose u oplođena jajašca dobijena ukrštanjem između Fl potomaka ukrštanja C57BL/6J ob/ob X DBA. Ova ukrštanja zahtevaju korišćenje C57BL/6J ob/ob transplanata jajnika da bi se generisale Fl životinje. DBA/2J miševi se koriste kao protivsoj zbog toga što imaju neaguti (nonagoutv) boju krzna, koja je važna kada se koriste transplanti jajnika. Genotip naoblokusima kod kosmidnih mutiranih životinja može se odrediti odabirom životinja sa čvrsto povezanim RFLP-ima ili mikrosatelitima FLANK mutaciju i koji su polimorfni između sojeva predaka. Komplementacija će biti dokazana kada jedan određeni CONSTRUCT učini da jedna genetski gojazna F2 životinja (definisana RFLP analizom) bude mršava i da nema dijabetes. Pod tim će uslovima konačan dokaz komplementacije zahtevati da se ob/ob ilio db/db životinje sa mutiranim genom spare sa ob/ob ili db/db transplantima jajnika, Kod tog ukrštanja, sve N2 životinje koje nemaju miniran gene biće gojazne imati dijabetes otporan na insulin, dok će one koje imajumutiran gen biti mršave i imati normalne koncentracije glukoze i insulina u plazmi. U genetskom smislu, mutirani gen deluje kao supresorska mutacija.
Alternativno,OBgeni se mogu ispitati proučavanjem njihovog fenotipskog delovanja kada su izraženi u protivsmislenoj orijentaciji kod normalnih životinja. Kod ovog pristupa je izražavanje prirodnog alela suzbijeno, što dovodi do mutantnog fenotipa. RNK-RNK dupleksna formacija (protivsmisleno-smisleno) sprečava normalnu obradu rnRNK, što dovodi do drlimičnog ili potpunog otklanjanja delovanja prirodnog, normalnog gena. Ova je tehnika korišćena da se spreči sinteza TK u kulturi tkiva i da se proizvedu fenotipoviKntppel- ovtmutacije kodDrosophila- e,iShiever-ova mutacija kod miševa, Izant i dr., Cell, 36:1007-1025 (1984), Green i dr., Annu. Rev. Biochem., 55:569-597 (1986); Katsuki i dr. Science, 241:593-595 (1988). Jedna važna prednost ovog pristupa je to, što je potrebno izražavanje samo jednog malog dela gena za efikasno suzbijanje izražavanja celokupne srodne rnRNK. Protivsmisleni mutirani gen biće stavljen pod kontrolu sopstvenog promotora ili drugog promotora izraženog u odgovarajućoj vrsti ćelija, i postavljen ispred mesta SV40 polyA. Ovaj mutirani gen koristiće se za proizvodnju mutiranih miševa. Mutiranim miševima će takođe biti uneti transplanti jajnika da bi se proverilo da li su ob heterozigoti više osetljivi na protivsmislene CONSTRUCTS.
U krajnjoj liniji, razjašnjavanje biohemijske funkcije proizvodaOBgena (OB polipeptid ili protein) korisno je za identifikovanje malih molekula agonista i antagonista koji utiču na njegovo delovanje.
Različiti izrazi koji se koriste u ovom opisu imaju sledeće, niže navedene, definicije.
Izraz "rnodulator telesne mae", "modulator", "modulatori", i sve varijante koje nisu posebno pomenute, mogu se koristiti međusobno zamenljivo, a kako se koriste u ćelom opisu i u zahtevima, odnose se u jednom slučaju i na nukleotide i na proteinski materijal, pri čemu ovaj drugi obuhvata i jednostaike i višestruke proteine. Tačnije, navedeni izrazi obuhvataju i nukleotide i DNK koja ima ovde opisane sekvence prikazane na slici 1A do E (SEQ ID NO: 1) i slici 2A i B (SEQ ID NO:3). Na isti način, proteini koji imaju ovde opisane podatke za sekvence amino kiselina, prikazane na slici 1A do E (SEQ ID NO:2) i na slici 3 (SEQ ID NO:4) takođe dolaze u obzir, kao i profil delovanja kako je prikazan u odnosu na sve materijale, bilo u opisu, bilo u zahtevima. Prema tome, nukleotidi koji iskazuju u suštini istovetno ilio izmenjeno delovanje takođe se uzimaju u obzir, uključujući u suštini homologe analoge i alelne varijante. Isto tako, proteini koji iskazuju u suštini istovetno ili izmenjeno delovanje, uključujući namerno modifikovane proteine, kao, na primer, mutagenezom usmerenom na mesto, ili slučajno putem mutacije u domaćinu, koji proizvode moduiatore, takođe dolaze u obzir.
Preparat koji sadrži "A" (gde je "A" jedinstven protein, DNK, molekul, vektor, rekombinantna ćelija domaćina, itd.) u suštini ne sadrži "B" (gde "B" obuhvata jedan ili više zagađivačkih proteina, DNK molekule, vektore, itd, sa izuzetkom racemskih oblika od A) kada najmanje 75% mas. proteina, DNK, vektora (u zavisnosti od kategorije vrste kojoj A i B pripadaju) u preparatu jeste "A". Poželjno je da "A" sadrži najmanje oko 90% mas. A+Đ vrsta u preparatu, najpoželjnije bar oko 99% mas. Takođe je poželjno da neki preparat, koji u suštini nije zagađen, sadrži samo vrstu jedne jedine molekulske mase, koja ima dejstvo ili karakteristike interesantne vrste
OB polipeptidi
Izrazi "protein", koji se odnosi na prirodni polipeptid, i "polipeptid", ovde se koriste međusobno zamenljivo u odnosu na proizvodobgena i njegove varijante. Izraz "zreli protein" ili "zreli polipeptid" posebno se odnosi na proizvodOBgena kod koga je signalna sekvenca (ili FUSION PROTEIN PARTNER) uklonjena.
Kao što je napred rečeno, specifičćna izvođenja polipeptida prema pronalasku obuhvataju ona koja imaju ovde prikazane sekvence amino kiselina, kao, na primer, SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 6 itd., uključujući ob polipetid modifikovan konzervativnim supstitucijama amino kiselina, kao i njihove biološki aktivne fragmente, analoge i derivate. Izraz "biološki aktivan" ovde se koristi za specifično delovanje polipeptida, koje obuhvata, mada nije na njega ograničeno, specifično vezivanje, na primer za neki receptor, antitelo, ili neki drugi molekul za prepoznavanje; aktiviranje puteva za prenošenje signala na molekulskom nivou; i/ili izazivanje (ili sprečavanje antagonistima) fiziološkog delovanja izazvanog posredstvom prirodnog ob polipeptidain vivoOB polipeptidi, uključujući fragmente, analoge i derivate, mogu se pripremati sintetički, na primer konšćenjem poznatih tehnika sinteze proteina pomoću čvrste faze ili faze rastvora. Poželjno je da se koristi tehnika sinzeze pomoću čvrste faze. Alternativno, OB polipeptidi prema pronalasku mogu se pripremiti korišćenjem poznatih tehnika genetskog inženjeringa, što će biti kasnije opisano. Kod jednog drugog izvođenja, OB polipetid se može dobiti prečišćavanjem, na prime lmunoafinitetmm prečišćavanjem, iz nekog biološkog fluida, kao što je, mada nije na njih ograničeno, plazma, serum, ili urin, poželjno humana plazma, serum ili urin, a još poželjnije od osobe kod koje se polipeptid preterano izražava, kao što je neka gojazna osoba koja pati od mutacije u OB receptoru, ili od gojaznosti koja je povezana sa mutacijom koja odgovara pojmu "masno".
Fragmenti OB polipeptida
Kod jednog posebnog izvođenja, prikazani pronalazak pretpostavlja da prirodni fragmenti OB polipeptida mogu biti važni. Peptidna sekvenca obuhvata više mesta koja su često meta za proteolitičko cepanje, na primer argininskih ostataka Moguće je da se polipeptid pune dužine može kidati na jednom ili više takvih mesta da bi obrazovao biološki aktivne fragmente. Takvi biološki aktivni fragmenti mogu da podržavaju ili da antagonizmu funkcionalno delovanje OB polipetida radi smanjivanja telesne mase.
Analozi OB polipeptida
Prikazani pronalazak posebno rasmatra pripremanje analoga OB peptida, koji su karakteristični po što mogu biološki delovati kao OB polipeptid, na primer da se vezuju za neki specifični BINDING PARTNER ob peptida, kao Što je OB receptor. Kod jednog izvođenja, analog podržava OB delovanje, na primer deluje slično kao ob peptid. Poželjno je da OB podržavatelj, ili agonist, bude efikasniji od prirodnog proteina. Tako, na primer, OB agonist može da se vezuje za OB receptor većim afinitetom, ili da pokaže veći poluživodin vivo,ili oba. Međutim, analozi agonista OB peptida koji su manje efikasni od prirodnog proteina, takođe dolaze u obzir. Kod jednog drugog izvođenja, analog se suprotstavlja delovanju OB. Tako, na primer, jedan OB analog koji se vezuje na OB receptor ali ne indukuje prenošenje signala, može uspešno sprečiti vezivanje prirodnog OPB na receptor, čime smanju je OB aktivnostin vivo.Takav analog OB antagonista može isto tako imati i različita svojstva u odnosu na ob peptid, na primer duži (ili kraći) poluzivotin vivo,veći (ili manj) afinitet vezivanja za OB receptor, ili oba.
Kod jednog izvođenja, analog OB peptida je OB peptid modifikovan supstitucijom amino kiselina u pozicijama na polipeptidu koje nisu bitne za strukturu ili funkciju. Tako, na primer, postoje poznato daje humani OB peptid biološki aktivan u mišu, supstitucija divergentnih ostataka amino kiselina u humanoj sekvenci u poređenju sa mišjom sekvencom amino kiselina, verovatno će dati korisne analoge OB peptida. Tako, na primer, serinski ostatak na poziciji 53 ili poziciji 98, ili na obe (kod sekvence neobrađenog peptida, prikazane na slici 4) dobijen od čoveka, može se supstituisati, na primer, glicinom, alaninom, velinom, cisteinom, metioninom, ih treoninom. Slično tome, argininski ostatak na poziciji broj 92 (slika 4) može se supstituisati, na primer, asparaginom, lizinom, histidinom, glutaminom, glutaminskom kiselinom, asparaginskom kiselinom, serinom, treoninom, metioninom ili cisteinom. I dalje prema slici 4, druge amino kiseline u humanom OB peptidu, za koje se čini da se mogu supstituisati, jesu histidin na poziciji 118, triptofan na poziciji 121, alanin na poziciji 122, glutaminska kiselina na poziciji 126, treonin na poziciji 127, leucin na poziciji 128, glicin na poziciji 132, glicin na poziciji 139, triptofan na poziciji 139 i glicin na poziciji 166. Kod jednog drugog izvođenja, može biti moguće supstituisati jedan ili više ostataka 121 do 128 (kako je prikazano na slici 4), na primer ghcinima ili alaninima, ili supstituisanjemm nekih od ostataka sa izuzetkom serina na poziciji 123, ili leucina na poziciji 125.
Kod jednog drugog izvođenja, analog OB peptida, poželjno humanog OB peptida, predstavlja skraćeni oblik polipeptida. Tako, na primer, već je bilo pokazano da glutamin na ostatku 49 nije bitan, i da se može brisati iz peptida. Na isti način mogu se brisati neki ili svi divergentni ostaci amino kiselina na pozicijama 121-128. Pored toga, pronalazak predviđa dobijanje jednog OB analoga koji ima minimalnu sekvencu amino kiselina potrebnu za biološko delovanje. Ovo se da lako utvrditi, na primer, proverom delovanja fragmenata OB u pogledu sposobnosti vezivanja za OB-specifična antitelasprečavanja delovanja prirodnog OB polipeptida, ili podržavanja delovanja prirodnog OB peptida. Kod jednog izvođenja pronalazak daje jedan skraćeni polipeptid koji se sastoji od strukture u vidu petlje, obrazovane disultidnom vezom koja se obrazuje između cisteinskih ostataka 117 i 167 (kako je prikazano na slici 4). Kod jednog drugog izvođenja, skraćeni analog odgovara amino kiselinama od ostatka 22 (koji se nalazi iza pretpostavljenog mesta otkidanja signalnog peptida) do 53 (ostatak amino kiseline koji neposredno prethodi području savitljive petlje, otkri-venom pomoću ograničene proteolize iza koje sledi masena spektiometrijska analiza OB polipetida; videti Cohen i dr., Protein Science, 4:1088 (1995)). Kod jednog drugog izvođenja, skraćeni analog odgovara amino kiselinama od ostatka 61 amino kiselina (ostatak neposredno iza područja savitljive petlje, kako je otkriveno ograničenom proteoliznom/masenom spektralnom analizom OB poli-peptida) do ostatka 116 amino kiselina (ostatak neposredno ispred prvog cistein-skog ostatka). Kod još jednog izvođenja, skraćeni analog odgovara amino kiseli-nama od ostatka 61 amino kiselina do ostatka 167 aminokiselina.
Pored toga, jedan ili više ostataka pretpostavljene savitljive petlje kod brojeva ostatka 54 do 60 je supstituisan. Tako na primer, jedan ili više ostatak može biti supstituisano lizinom, glutaminskom kiselinom ili čistinom (preporu-čljivo lizinom) radi ukrštenog vezivanja, na primeer, za neki polimer, pošto su strukture savitljive petlje pogodna mesta za derivaciju proteina. Alternativno, ostatci na pozicijama savitljivih petlji mogu se supstituiosati ostacima amino kiselina koji su otporniji na proteolizu, ah koji zadržavaju savitljivu strukturu, na primer jedan ili više prolina. Kod jednog drugog izvođenja, predviđaju se supstitucije ostacima amino kiselina koje se mogu dalje derivatizovati da bi bile otpornije na degradaciju, na primer proteolizu.
Prosečan stručnjak će shvatitida su navedene veličine fragmenata približne, i da od jedne do oko pet amino kiselina može biti uključeno ili brisano sa svakog, ili sa oba kraja, ili iz unutrašnjosti polipeptida ili njegovih fragmenata, ili navedenih skraćenih analoga, sa izutetkom da se kod disulfidnovezanih analoga sa petljom moraju zadržati cisteinski ostaci.
Utvrđeno je da mišu! OB peptid sadrži 50% a-lanca spirale, dok humani polipeptid sadrži oko 60% a-lanca spirale, kako je otkriveno pomoću kružnog hihroizma rekombinantnih peptida pod skoro fiziološkim uslovima. Prema tome,, prema jednom drugom izvođenju, ostaci amino kiselina mogu se supstituisati pstacima za obrazovanje analoga OB peptida koji imaju povećanu sklonost da obrazuju, ili koji obrazuju stabilnije ct-spiralne strukture. Tako će, na primer, a-spiralna struktura biti preporučljiva ako su Glu, Ala, Leu, His, Trp uneti kao supstituti za ostatke amino kiselina nađene u prirodnom OB phpeptidu. Poželjno je da se koriste konzervativne suspstitucije amino kiselina, na primer zamenom asparaginske kiseline na ostacima 29, 30, 44, 61, 76, 100 i/ih 106 (kako je prikazano na slici 4) glutaminskom kiselinom (Glu); zamenom izoleucina leucinom; zamenom glicina ili valina, ili bilo koje divergentne amino kiseline, alaninom (na primer serina na poziciji 53 humanog polipeptida alaninom), zamenom arginina ili lizina histidinom, i zamenom tirosina i/ili fenilalanina triptofanom. Povećan stepen, ili, što je važnije, stabilnost a-spiralne strukture može dati jedan OB analog povećane aktivnosti, povećanog afiniteta za vezivanje ili većeg poluživota. Kod jednog specifičnog izvođenja, povećan je potencijal za obrazovanje spirale dela OB peptida koji odgovara ostacima amino kiselina 2 do 53. Kod jednog drugog izvođenja, povećan je potencijal za obrazovanje spirale ili stabilnost ostatak amino kiselina 61-116. Kod jednog drugog izvođenja povećan je potencijal za obrazovanje spirale strukture disulfidne petlje koja odgovara amino kiselinama 117 do 167. Takođe su uzeti u obzir OB analozi koji sadrže povećan a-spiralni potencijal ili stabilnost u jednoj ili više od napred navedenih područja. Kod jednog sledećeg izvođenja, genensani su analozi skraćenog polipeptida koji obuhvataju ostatke amino kiselina koji oblikuju strukture, na primer za obrazovanje spirale, kako bi se kompensovala veća sklonost fragmenata polipeptida da nemaju stabilnu strukturu.
Analozi kao što su fragmenti, mogu se proizvoditi, na primer, pepsinskim digestiranjem peptidnog materijala modulatora telesne mase. Drugi analozi, kao što su muteini, mogu se proizvoditi standardniom mutagenezom usmerenom na položaj kodnih sekvenci peptida modulatora telesne mase. Analozi koji ispoljavaju "delovanje modulatora telesne mase" kao što su mali molekuli, bilo da deluju kao promotori, bilo kao inhibitori, mogu se identifikovati poznatim in vivo ili in vitro ispitivanjima.
Malomolekulski analozi i PEPTIDOMIMETICI OB polipeptida
Struktura ob polipeptida, poželjno humanog OB polipeptida, može se analizirati različitim poznatim metodama. Proteinska sekvenca može biti definisana analizom hidrofiličnosti [na primer, HOPP i dr., Proc. Nat. Acad. Sci USA, 78:3824
(1981)]. Profil hidrofiličnosti može se koristiti za definisanje hidrofobmh i hidrofilnth područja OB polipeptida, koji mogu ukazati područja zatvorena u unutrašnjost savijenog polipeptida, i područja pristupačna na spoljnoj strani polipeptida. Pored toga, može se izvesti i sekundarna strukturna analiza [na primer, Chou i dr., Biochem., 13:222 (1974)], da bi se identifikovala područja OB polipeptida koja imaju specifične sekundarne strukture Obrada predskazane ili određene strukture, uključujući pretskazivanje sekundarne strukture, može se izvesti korišćenjem računarskih progama koji se mogu naći u ovoj oblasti.
Obezbeđenjem dovoljnog izvora rekombinantnog OB polipeptida, prikazani pronalazak omogućuje kvantitativno strukturno određivanje polipeptida. Posebno, dobija se dovoljno materijala za spektroskopsku analizu nuklearnom magnetnom rezonancom (NMRE), infracervenim zracima (IR), po Raman-u, ultraljubičastim zracima (UV), a posebno cirkularnim dihroizmom (CD). Posebno NMR ostvaruje vema moćnu strukturnu analizu molekula u rastvoru, koji potpunije aproksimira njihovu prirodnu sredinu [Marion i dr., Biochem. Biophvs. Res. Comm, 113:967-974
(1983); Bat i dr., J. Magn. Resom, 65:355-360 (1985); Kimura i dr. Proc. Nat. Acas. Sci. USA, 77:1681-1685 (1980)]. Mogu se koristiti i druge metode strukturne analize. One obuhvataju, ali nisu na nju ograničene, rendgensku kristalografiju [Engstom, Biochem Exp Biol., 11:7-13 (1974)].
Kod jednog sledećeg izvođenja, analog OB polipeptida može se ispitati da bi se utvrdilo da li reaguje sa antitelom specifičnim za prirodni OB polipeptid, ili sa njegovim specifičnim fragmentima. Stepen tog reagovanja daje informaciju u strukturnoj homologiji ili sličnosti proteina, ili o pristupačnosti područja koja odgovaraju delovima polipeptida koji su korišćeni za generisanje fragmentno-specifičnih antitela.
Pretraživanje OB analoga
Poznate su razne tehnike za pretraživanje analoga polipeptida. Na raspolaganju su različite LIBRARIES hemikahja. Shodno tome, prikazani pronalazak predviđa pretraživanje takvih LIBRARIES, na primer LIBRARIES sintetičkih jedinjenja generisane nakon godina istraživanja. LIBRARIES prirodnih jedinjenja i kombinatorne LIBRARIES da bi se našli analozi OB polipeptida. Kod jednog izvođenja, pronalazak predviđa pretraživanje takvih LIBRARIES za jedinjenja koja se vezuju za anti-OB polipeptidna antitela, poželjno anti-humana ob polipeptidna antitela. Prema drugom vidu, kada se jednom definiše OB receptor (videti niže), svaka poznata tehnika pretraživanja može se koristiti za pretraživanje agonista ili antagonista za OB receptor. Prikazani pronalazak predviđa pretraživanja liganada malih molekula, ili analoge i podražavaoce liganada, kao i pretraživanje prirodnih liganada koji se vezuju, za podržavanje ili kao antagonisti, na OB receptor in vivo.
Poznavanje primarne sekvence receptora, kao i sličnost te sekvence sa proteinima poznate funkjcije, može dati početni nagoveštaj u pogledu agonista ili antagonista proteina. Identifikacija i pretražiovanje antagonista je dalje olakšano određivanjem strukturnih svojstava proteina, na primer korišćenjem rendgenske kristalografije, neutronske difrakcije, spektrometrije sa nuklearnom magnetskom rezonansom, i drugim tehnikama za .određivanje strukture. Te tehnike omogućuju racionalno projektovanje ili identifikaciju agonista i antagonista.
Drugi pristup koristi rekombinantne bakteriofage da bi se proizvele velike LIBRARIES Koristeći "fagni postupak" [Scott i dr., Science, 249:386-390 (1990); Cvvirla i dr., Proc Natl. Acad. Sci. USA , 87:6378-6382 (1990); Devlin i dr., Science, 249:404-406 (1990)], mogu se konstruisati veoma velike LIBRARIES (10<6->10<8>hemijskih jedinica). Drugi pristup koristi prvenstveno hemijske metode, od kojih su Geysen-ova metoda [Gevsen i dr., MOlecular Immunology, 23:709-715 (1986); Geysen i dr., Immunologic Method, 102:259-274 (1987)] i novija metoda Fodor-a i dr., Dcience, 251:767-774 (1991) primeri. Furka i dr. 14th International Congress of Biochemistrv, Volume 5, Anstract FR:013; Furka, Int. J. Peptide Protein Res., 37:487-493 (1991); Houghton (U.S. Patent No. 4,631,211, izdat decembra 1986), i Rutter i dr. (U.S. Patent No. 5,010,175, izdat 23. aprila 1991) opisuju metode za proizvodnju mešavme peptida koji se mogu ispitati kao agonisti ili antagonisti.
U jednom drugom vidu, sintetičke LIBRARIES [Needels i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:10700-10704 (1993); Lam i dr. International Patent Publication No. VVO 92/00252, od kojih je svaka ovde u celini uključena kao literatura)], i slične mogu se koristiti za pretraživanje liganada OB receptora prema prikazanom pronalasku. Pomoću takvih LIBRARIES mogu se otkriti antagonisti receptora koristeći ćelije koje izražavaju receptor bez stvarnog kloniranja OB receptora.
Alternativno, mogu se vršiti ispitivanja vezivanja rastvorljivog liganda na ćelije koje izražavaju rekombinantne oblike područja vezivanja liganda OB receptora. Rastvorljivi Ugandi se mogu lako pribaviti kao rekombinantam ili sintetički OB polipeptid.
Pretraživanje se može vršiti rekombinantmm ć
elijama koje izražavaju OB receptor, ili alternativno, koristeći prečišćen receptorski protein, na primer proizveden rekombinantno, kako je napred opisano. Tako, na primer, sposobnost označenog, rastvorljivog ili rastvorenog OB receptora, koji sadrži delove molekula koji vezuju ligand, da vezuje ligand može se koristiti za pretraživanje LIBRARIES, kako je opisano u napred navedenoj literaturi.
Derivati OB polipeptida
Opšte uzev, prikazani protein (ovde se izraz "protein" koristi da obuhvati "polipeptid", ukoliko nije drugačije ukazano) može se đrivatizovati vezivanjem jednog ili više hemijskih jezgara na proteinsko jezgro. Hemijski modifikovani derivati mogu se potom formulisatiza intraarterijsko, intraperitonalno, intramuskularno, potkožno, intravensko, oralno davanje, za ušmarkavanje, za davanje stavljanjem pod jezik, udisanjem, spolja, kroz kožu, ili drugim putevima. Utvrđeno je da hemijske modifikacije biološki aktivnih proteina pružaju dodatne prednosti pod izvesnim oklnostima, kao što je povećanje stabilnosti i vremena cirkulisanja terapeutskog peoteina i smanjenje imunogeničnosti, Videti U.S. Patent No. 4,179,337, Daviš i dr., izdat 18. decembra 1979. Kao pregled, videti Abuchowski i dr., "Soluble Polymer-Enzyme Adducts", u Enzymes as Drugs, str. 367-383, Holcenber i Riberts, uređivači, Wiley-Intertscience, New York, NY, (1981). Jedan pregled koji opisuje modifikaciju proteina i FUSION proteine, dao je Francis, Focus on Growth factors, 3:4-10 (1992).
Hemijska jezgra za derivatizovanje
Hemijska jezgra pogodna za derivatizivanje mogu se birati između polimera rastvorljivih u vodi. Izabrani polimer mora biti rastvorljiv u vodi tako da se protein za koji je vezan ne taloži u vodenoj sredini kao što je fiziološka sredina. Poželjno je, za terapeutsku primenu gotovog preparata, da polimer bude farmaceutski prihvatljiv. Stručnjak će moći da odabere željeni polimer na osnovu proučavanja da li će se polimer/proteinski konjugat koristiti u terapiji, i ako hoće, da odredi željenu dozu, vreme cirkulisanja, otpornost na proteolizu, i druge činioce. Za prikazane proteine i peptide, to se može utvrditi koristeći ovde navedena ispitivanja.
Vezivanje hemijskog jezgra
Molekuli polietilen glikola (PEG) (ili drugog hemijskog jezgra) treba da se vezuju na protein uzimajući u obzir delovanje na funkcionalnu ili antigensku oblast proteina. Stručnjacima stoji na raspolaganju izvestan broj postupaka, na primer EP 0 401 384, ovde uključen kao literatira (sparivanje PEG sa G-CSF). Videti takođe i Malik i dr., Exp. Hematol, 20:1028-1035 (1992) (izveštava o sparivanju PEG sa GM-CSF koristeći tresil hlond). Tako se, na primer, polietilen glikol može kovalentno vezati preko ostataka amino kiselina posredstvom jedne reaktivne grupe, kao što je neka slobodna amino ili karboksil grupa. Reaktivne su one grupe na koje se može vezati jedan aktiviran molekul polietilen glikola. Ostaci amino kiselina koji imaju jednu slobodnu aminu grupu mogu sadržati ostatke lizina i ostatke N-završne amino kiseline, dok oni koji imaju slobodnu karboksilnu grupu mogu obuhvatati ostatke asparaginske kiseline, ostatke glutaminske kiseline i ostatak C-završne amino kiseline. Sulfhydry grupe se takođe mogu koristiti kao reaktivna grupa za vezivanje molekula polietilen glikola. Za terapeutske svrhe je preporučljivo vezivanje na jednu amino grupu, kao što je vezivanje na N-završetak ili lizinsku grupu. Vezivanje na ostatke važne za vezivanje receptora treba izbegavati ako se želi receptorsko vezivanje.
N-završno hemijski modifikovani proteini
Može se specifično zahtevati N-završno hemijski modifikovan protein. Koristeći polietilen glikol kao ilustraciju za prikazane preparate, može se birati od različitih molekula polietilen glikola (prema molekulskoj masi, ravanju, itd ), odnos molekula polietilen glikola prema molekulima proteina (ilimpeptida) u reakcionoj smeši, vrsta reakcije vezivanja polietilen glikola koja treba da se ostvari, i metodu za dobijanje biranog proteina N-završno spojenog sa polietilen glikolom (ili, skraćeno, pegilisanog, prema PEG - polietilen glikol). Metoda za dobijanje N-završno pegilisanog preparata (tj., izdvajanje ovog jezgra od drugih monopegilisanih jezgara ako je potrebno) može biti prečišćavanje N-završno pegilisanog materijala iz populacije pegilisanih proteinskih molekula. Selektivna N-završna hemijska modifikacija može se izvesti redukcionom alkilacijom koja koristi različitu reaktivnost različitih vrsta primarnih amino grupa (lizina prema N-završetku) koje su na raspolaganju za derivatizovanje u jednom određenom proteinu. U odgovarajućim reakcionim uslovima, ostvaruje se u suštini selektivno derivatizovanje proteina na N-završetku jednom karbonil grupom koja sadrži polimer. Tako se, na primer, može selektivno N-završno pegilisati protein izvođenjem rekacije pri pH koje omogućuje da se koristi prednost razlika pKaizmeđu s-amino grupa ostatak lizina i ostatak ot-amino grupe N-uavršnog ostatka proteina. Kod takvog selektivnog derivatizovanja je vezivanje polimera rastvorljivog u vodi na neki protein kontrolisano: konjugovanje sa polimerom obavlja se pretežno na N-završetku proteina i ne dolazi da nekih značajnijih modifikacija drugih reaktivnih grupa, kao što su amino grupe bočnog niza lizina. Kada se koristi redukciona alkilacija, polimer rastvorljiv u vodi može biti napred opisane vrste, i treba da ima jedan jedini reaktivni aldehid za sparivanje sa proteinom. Može se koristiti polietilen glikol propionaldehid koji sadrži jedan jedini reaktivni aldehid.
Nukleinske kiseline povezane sa OB polipeptidom
Kao što je ranije napomenuto, prikazani pronalazak je usmeren na nukleinske kiseline koje kodiraju ob peptide, kao i na povezane genomske nekodirajuće sekvence 5', 3', i intronski na OB gen. Pri tome se, prema prikazanom pronalasku, može koristiti konvencionalna nuklearna biologija, mikrobiologija i tehnike rekombinantne DNK u poznatrom opsegu. Te su tehnike potpuno objašnjene u literaturi. Videti, na primer, Sambrook i dr., Molecular Ctoning: A Laboratorv Mamal, drugo izdanje, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); Glover, urednik, DNA Cloning: A Practical Approach, knjige I i II, MRL Press, Ltd.. Oxford, U K
(1985): Gait, urednik, Oligonucleotide Svnthesis, Oxford Umversitv Press (1984); Hames i dr., urednici, Nucleic Acid Hvbridization, Springer-Verlag (1985); Hames i dr., urednici, Transcription And Translation, Oxford Universitv Press (1984); Freshnev, urednik, Animal Cell Culture, Oxford University Press (1986); Immobiliozed Cells And Enzymes, IRL Press (1986); Perbal: A Practical Guide To Molecular Cloning, Wiley, New York (1984). Od posebnog su značaja za prikazani pronalazak strategije za izdvajanje, kloniranje, sekvenciranje, analiziranje i defmisanje jednog gena ih nukleinske kiseline na bazi poznatih tehnika lančane reakcije pohmeraze (PCR). "Replikon" je svaki genetski element (na primer plazmid, hromozom, virus) koji funcioniŠe kao autonomna jedinica DNK replikacijein vivo,tj. sposobna da se replicira pod sopstvenom kontrolom. "Vektor" je replikom, kao što je plazmid, fag ili kosmid, na koji se može vezati neki drugi segment DNK, tako da dođe do replikacije vezanog segmenta. "Kaseta" označava jedan segment DNK koji se može umetnuti u jedan vektor na specifična restrikciona mesta. Segment DNK kodira interesantan peptid, a kaseta i restrikciono mesto su projektovani da obezbede umetanje kasete u pravilan okvir za očitavanje za transkripciju i translaciju. "Heterologna" DNK označava DNK koja nije prirodno locirana u ćeliji, ili u nekom hromozomskom mestu ćelije, Poželjno je da heterologna DNK sadrži neki gen stran toj ćeliji.
Na ćeliji je izvršena "transfekcija" egzogenom ili heterolognom DNK kada je takva DNK uneta unutar ćelije. Ćelija je "transformisan" egzogenom ili heterolognom DNK kada ubrizgana DNK izvrši neku fenotipsku promenu. Preporučljivo je da transformišuća DNK bude integrisana (kovalentno vezana) u hromozomnu DNK koja obrazuje genom ćelije. "Klon" je populacija ćelija izvedena od jedne jedine ćelije ili zajedničkog pretka putem mitoze.
Izraz "molekul nukleinske kiseline" odnosi se na polimerni oblik fosfatnog estra ribonukleozida (adenosin, gvanosin, uridin ili citidin; "RNK molekuli") ili deoksiribonukleozide (deoksiadenosinm deoksigvanosin, deoksitimidin ili deoksicitidin; "DNK molekuli") bilo u jednolančanom obliku ili u dvostruko-lančanoj spirali. Moguće su dvolančane DNK-DNK, DNK-RNK i RNK-RNK spirale. Izraz "molekul nukleinske kiseline", a posebno molekul DNK ili RNK, odnosi se samo na primarnu i sekundarnu strukturu molekula, i ne ograničava je na neki određeni tercijarni ili kvaternami oblik. Tako taj izraz obuhvata dvolanačanu DNK koja se nalazi, između ostalog, kod linearnih ih kružnih DNK molekula (na primer restrikcionih fragmenata), plazmida i hromozoma. Kod rasmatranja strukture određenih molekula dvolančane DNK, mogu se opisati sekvence u skladu sa normalnom konvencijom davanja sekvenci samo u smeru od 5' ka 3' duž netranskribovanog lanca DNK (tj. lanca koji ima sekvencu homolognu rnRNK). "Rekombinantni DNK molekul" je DNK molekul koji je bio podvrgnut molekularno biološkoj obradi.
Molekul nukleinske kiseline može se "hibridizovati" na molekul druge nukleinske kiseline, kao što je CDNK, genomska DNK ili RNK, kada se jednolančani oblik molekula nukleinske kiseline može pripojiti na molekul daige nukleinske kiseline pod odgovarajućim uslovima temperature i jonske jačine rastvora (videti Sambrook i dr., 1989, napred). Uslovi temperature i jonske jačine određuju "strogost" hibridizacije. Za preliminarno pretraživanje homolognih nukleinskih kiselina mogu se koristiti manje strogi uslovi hibridizacije. koji odgovaraju Tniod 55°, na primer 5x SSC, 0,1% SDS, 0,25% mleka i bez formamida; ili 30% formamida, 5x SSC, 0,5% SDS. Umereno strogi uslovi hibridizacije odgovaraju višoj Tm, na primer 40% formamida sa 5x ili 6x SCC. Vrlo strogi uslovi hibridizacije odgovaraju najvišoj Tm, 50% formamida, 5x ili 6x SCC. Hibridizacija zahteva da dve nukleinske kiseline sadrže komplemen-tarne sekvcence, mada su u zavisnosti od strogosti hibridizacije, moguća nesla-ganja između baza. Odgovarajuća strogost za hibndizaciju nukleinskih kiselina zavisi od dužine nukleinskih kiselina i od stepena komplementacije, promenljivih poznatih u struci. Sto je veći stepen sličnosti ili homolognosti između dve nukleo-tidne sekvence, veća je vrednost T„, za hibride nukleinskih kiselina koje imaju te sekvence. Relativna stabilnost (koja odgovara većoj vrednosti Tm) hibridizacija nukleinskih kiselina smnjuje se po sledećem redosledu: RNK RNK, DNK:RNK; DNK:DNK Za nukleotide veće od 100 nukleotida po dužini izvedene su jednačine za proračun Tm (videti napred: Sambrook i dr., 1989, 9.50-9.51). Za hibridizaciju sa kraćim nukleinskim kiselinama, tj. ohgonukleotidima, položaj neslaganja postaje važniji, pa dužina oligonukleotiđa određuje njegovu specifičnost (videti napred: Sambrook i dr., 1989, 11.7-11.8). Poželjna minimalna dužina jedne nukleinske kiseline koja može hibridizovati iznosi najmanje oko 10 nukleotida; poželjnije najmanje oko 15 nukleotida, a najpoželjnije je dužina najmanje oko 20 nukleotida. "Homologna rekombinacija" se odnosi na umetanje jedne strane DNK sekvence jednog vektora u neki hromozom. Poželjno je vektor usmeren na specifično hromozomsko mesto za homolognu rekombinaciju. Za specifičnu homolognu rekombinaciju, vektor će imati dovoljnmo duga područja homolognosti sa sekvencama hromozoma, da bi se omogućilo komplementarno vezivanje i uključivanje vektora u hromozom. Duža područja homolognosti, i veći stepen sličnosti sekvenca, mogu povećati efikasnost homologne rekombinacije.
DNK "kodna sekvenca" je jedna dvolančana DNK sekvenca koja je transkribovana i translirana u jedan polipeptid u ćeliji,in vitroiliin vivo,kada se postavi pod kontrolu odgovarajućih regulatorskih sekvenci Granice kodne sekvence su određene početnim kodonom na 5' (amino) završetku i završnim kodonom translacije a 3' (karboksil) završetku. Kodna sekvenca moše obuhva-tati, ali nije na njih ograničena, prokariotske sekvence, cDNK iz eukariotske rnRNK, sekvence genomske DNK iz eukariotske (na primer od sisara) DNK, pa čak i sekvence sintetičke DNK. Ako je kodna sekvenca namenjena za izražavanje u eukariorskoj ćeliji, poliadenilacioni signal i sekvenca završetka transkripcije obično će biti 3' prema kodnoj sekvenci
Izdvajanje OB kodne i granične sekvence
Nukleinske kiseline obuhvaćene prikazanim pronalaskom, obuhvataju, kako je ukazano, i daige nukleinske kiseline koje kodiraju na izražavanju za peptide, kao što su one izložene na slici 1A do D (SEQ ID NO:2), slici 3 (SEQ ID NO:4), slici 5 (SEQ ID NO:5) i na slici 6 (SEQ ID N0 6). Prema tome, dok se specifična DNK izdvoji i sekvencira u odnosu naobgen, svaka životinjska ćelija može potencijalno služiti kao izvor nukleinsih kiselina za molekulsko kloniranje gena koji kodira peptide prema pronalasku. DNK se može dobiti poznatim standardnim postupcima od klonirane DNK
(na primer jedne DNK "biblioteke"), hemijskom sintezom, kloniranjem cDNK, ili kloniranjem genomske DNA ili njenili fragmenata, prečišćenih iz željene ćelije (videti napred , na primer, Sambrook i dr., 1989; Glover, 1985). Kloni izvedeni od genom ske DNK mogu sadržati regulaciona i tntronska područja DNK pored područja kodiranja; kloni izvedeni od cDNK neće sadržati intronske sekvence. Bez obzira na izvor, gen treba da bude molekulski kloniran u pogodan vektor za razmnožavanje gena.
Kod molekulskog kloniranja gena od genomske DNK, genomska DNK se može pojačati korišćenjem osnova odabranog iz cDNK sekvenci. Alternativno, generišu se fragmenti DNK, od kojih će neki generisati željeni gen. DNK može biti prekinuta na specifičnim mestima koristeći razne restnkcione enzima. Može se koristiti DNaza u prisustvu mangana da bi se DNK razložila na fragmente, ili se DNK može fizički šeći, na primer pomoću ultrazvuka. Linearni fragmenti DNK mogu se potom razdvojiti prema veličini standardnim tehnikama, uključujući, ali ne ograničujući se na iste, agaroznu i pohakrilamidnu gel-elektroforezu i hromatografiju na stubu.
Kada se generišu fragmenti DNK, identifikacija specifičnog fragmenta DNK koji sadrži željeniuhili oZ>-sličan gen, može se izvesti na više načina. Tako, na primer, ako je na raspolaganju izvesna količina jednog dela ob ili ob-sličnog gena, ili njegove specifične RNK, ili jednog njenog fragmenta, koja se može prečistiti i označiti, generisani DNK fragmenti se mogu izdvojiti hibndizacijom nukleinske kiseline kao obeležena PROBE [Benton i dr., Science, 196:180 (1077); Grunstein i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72:3961 (1975)]. Prikazani pronalazak daje takve PROBES nukleinske kiseline, koje se mogu lako pripremiti od ovde prikazanih specifičnih sekvenci, na primer PROBE koja se može hidrirati, a koja ima nukleotidnu sekvencu koja odgovara grupi od bar 10, a poželjno bar 15, nukleotidnih fragmenata sekvenci prikazanih na slici 1A do E (SEQ ID NO:l) ili na slici 2A i B (SEQ ID NO:3). Pogodno je da se odabere fragment koji je u velikoj meri jedinstven za peptide modulatora prema pronalasku. Ovi će se fragmenti DNK sa znatnom homolognošću prema PROBE hibridizovati. Kako je napred napomenuto, što je veći stepen homolognosti, to se mogu koristiti stroži uslovi hibridizacije. Kod jednog izvođenja se koriste uslovi hibridizacije male strogosti da bise identifikovao jedan homologni peptid mođu-latora. Međutim, kod preporučljivog vida pronalaska, a što je dokazano i ovde datim eksperimentima, nukleinska kiselina koja kodira peptid modulatora prema pronalasku, hibndiziraće u nukleinsku kiselinu koja ima nukleotidnu sekvencu ko što je ona prikazana na slikama l A do E (SEQ ID NO: 1) ili slici 2A i B (SEQ ID NO:3), ili u jedan njen fragment koji može hibridizovati, pod umereno strogim uslovima; poželjnije, hibridizovaće pod veoma oštrim uslovima.
Alternativno, prisustvo gena može se otkriti ispitivanjima zasnovanim na fizičkim, hemijskim ili imunološkim svojstvima njegovog proizvoda izražavanja. Tako se, na primer, mogu birati klonovi cDNK, ili klonovi DNK koji hibridizacijom biraju odgovarajuće rnRNK, koji proizvode jeda protein koji, na primer, ima slično ili identično elekti odoretsko kretanje, ISOELECTRIC FOCUSING BEHAVIOR, mape proteoiitičkog razlaganja, tirozin fosfatazno delovanje ili antigenska svojstva koja su poznata kod peptida prikazanog modulatora. Tako se, na primer, antitela prema ovom pronalasku mogu koristiti za pretraživanje homologa modulatorovih peptida iz drugih izvora.
Gen koji kodira neki modulatorov peptid prema pronalasku može se isto tako identifikovati izborom mRNK, tj. hibridizacijom nukleinske kiseline iza koje sledi translacijain vitro.Po tom postupku se koriste fragmenti da bi se hibridizacijom izdvojile komplementarne mRNK. Ovakvi fragmenti DNK mogu predstavljati raspoloživ, prečišćen modulator DNK. Imunoprecipitaciona analiza ili funkcionalna ispitivanja (na primer aktivnost tirosin fosfataze) proizvoda in vitro translacije od proizvoda izdvojenih mRNK, identifikuje mRNK pa, tako i fragmente komplementarne DNK koji sadrže željene sekvence. Pored toga, specifične mRNK se mogu birati adsorpcijom polimera izdvojenih iz ćelija da bi se imobilisala antitela specifično usmerena protiv modulatorovog peptida.
cDNK radio(aktivno)označenog modulatorovog peptida može se sinteti-zovati korišćenjem odabrane mRNK (od adsorbovanih polimera) kao kalupa. Radiooznačena mRNK ili cDNK može se potom koristiti kao PROBE za identifikovanje homolognih fragmenata DNK modulatorovog peptida između drugih fragmenata genomske DNK.
Kako je napred rečeno, DNK sekvenca koja kodira peptide modulatora telesne mase, kako je ovde opisano, može se pripremiti sintetički umesto kloniranjem. Sekvenca DNK može biti projektovana sa odgovarajućim kodonima za sekvence amino kiselina peptida modulatora telesne mase. Opšte uzev, birače se preporučljivi kodom za predviđenog domaćina ako će sekvenca biti korišćena za izražavanje. Kompletna sekvenca je sastavljena od preklopljenih ohgonukleo-tida pripremljenih standardnim metodama i grupisanih u jednu kompletnu kodnu sekvencu. Videti, na primer, Edge, Nature, 292, 292:755 (1981); Nambair i dr., Science, 223:1299 (1984); Jay i dr., J. Biol. Chem., 259:6311 (1984).
Sekvence sintetičke DNK omogućuju pogodnu konstrukciju gena koji će izražavati analoge modulatora telesne mase, kako je napred opisano. Alternativno, analozi za kodiranje DNK mogu biti načinjeni mutagenezom usmeienom na mesto prirodnihOBgena ili cDNK, a anlozi se mogu načiniti neposredno, koristeći komvencionalnu sintezu polipeptida.
Jedan opšti postupak za lokalno-specifičnu ugradnju neprirodnih amino kiselina u proteine opisali su Noren i dr., Science, 244:182-188 (1989) Ovaj se postupak može koristiti za obrazovanje analoga ob polipeptida pomoću neprirodnih amino kiselina.
Nekodirajuće nukleinske kiseline
Prikazani pronalazak obuhvata i pripremanje protivsmislenih nukleotida i ribozoma koji se mogu koristiti da ometaju izražavanje proteina modulatora telesne mase na nivou translacije. Ovaj pristup koristi protivsmislenu nukleinsku kiselinu i ribozome da bi blokirao translaciju jedne specifične mRNK, bilo maskiranjem te mRNK jednom protivsmislenom nukleinskom kiselinom, ili njenim kidanjem jednim ribozomom.
Protivsmislene nukleinske kiseline su molekuli DNK ili RNK koji su komplementarni bar jednom delu molekula jedne specifične mRNK [videti VVintraub, Sci. Am., 262:40-46 (1990); Marcus-Sekura, Anal. Biochem., 172:289-295 (1988)]. U ćeliji će hibridizovati na tu mRNK i obrazovati dvolančam molekul. Ćelija ne translira jednu mRNK složenu u ovakav dvolančani oblik. Na taj način protivsmislene nukleinske kiseline ometaju izražavanje mRNK u proteinu. Oligomen oko petnaest nukleotida i moilekula koji hibridizuju sa AUG inicijalnim kodonom biće posebno efikasni, jer se lako sintetizuju i verovatno stvaraju manje problema nego veći molekuli kada se unose u ćelije koje proizvode peptid modulatora telesne mase. Protivsmislem postupci su korišćeni za sprečavanje izražavanja in vitro mnogih gena [navedeni Marcus-Sekura, 1988, Hambor i dr., J. Exp. Med. 168:1237-1245 (1988)].
Ribotomi su molekuli RNK koji imaju sposobnost da specifično prekidaju druge jednolančane molekule RNK na način donekle analogan restrikcionoj endonukleazi DNK. Ribotomi su otkriveni iz zapažanja da izvesne mRNK imaju sposobnost za isecaju svoje sopstvene introne. Modifikovanjem nukleotidne sekvence ovih RNK, istraživači su uspeli da projektuju molekule koji prepoznaju specifične sekvence nukleotida u jednom molekulu RNK i isti odsecaju [Cech, J. Am. Med. Assoc, 260:3030-3034 (1988)]. Pošto su sekvencnospecifične, inaktiviraju se samo mRNK sa posebnim sekvencama.
Istraživači su identifikovali dva tipa ribozoma, Tetrahymena-tip i "čekić"-tip. Ribozomi tipa Tetrahvmena prepoznaju četvorobazne sekvence, dok oni tipa "čekić" prepoznaju jedanaesto do osamnaestobazne sekvence. Sto je duža sekvenca prepoznavanja, verovatnije je da će se javiti isključivo u TARGET vrstama mRNK. Zbog toga su su ribozomi tipa "čekić"bpogodniji od ribotoma tipa Tetrahymena za inaktiviranje jedne specifične vrste mRNK, a osamnaesto-bazne sekvence prepoznavanja su pogodnije od kraćih sekvenci prepoznavanja.
Ovde opisane sekvence DNK se tako mogu koristiti za pripremanje protivsmislenih molekula protiv mRNK i ribozoma koji kidaju mRNK za proteine modulatoar telesne mase i njihove ligande, čime se sprečava izražavanjeobgena, a što vodi do povećanja telesne mase i gojaznosti.
Kod jednog drugog izvođenja, kratki oligonukleotidi komplementarni kodirajućim i komplementarnim lancimaOBnukleinske kiseline, ili nekodirajućim područjimaOBgena 5', 3', ih interno (intronski) kodirajućem području, ostvareni su prikazanim pronalaskom. Takve nukleinske kiseline su korisne kao PROBES, bilo kao neposredno označene ohgonukleotidne PROBES, bilo kao osnova za lančanu reakciju polimeraze, za procenu spnsustva mutacija uobgenu, ili nivoa izražavanja OB mRNK. Poželjno je da su nekodirajuće nukleinske kiseline prema pronalasku od humanogOBgena.
Kod jednog specifičnog izvođenja, nekodirajuće nukleinske kiseline obezbeđuju homolognu rekombinaciju za integrisanje jednog gena koji se može pojačavati i/ili druge regulacione sekvence u bliziniOBgena, na primer da bi se ostvarili viši nivoi izražavanja OB polipeptida, ili prevladala neka mutacija uobgenu, regulacione sekvence koje sprečavaju pravilne nivoe izražavanja OB polipeptida (Videti Međunarodni patentni spis WO 91/06666, objavljen 16. maja 1991, od Skoultchi-ja; Međunarodni patentni spis VVO 91/09955, objavljen 11. jula 1991, od Chappel-a; videti takođe i Međunarodni patentni spis VVO 90/14092, objavljen 29. novembra 1990, od Kucherlapati-ja i Campbell-a).
Proizvodnja OB polipeptida: Izražavanje i sinteza
Kontrolne sekvence za transkripciju i translaciju su regulacione sekvence DNK, kao Što su promotori, pojačivači, terminatori, i slično, koji obezbeđuju izražavanje jedne kodne sekvence u ćeliji domaćina. Kod eukanotskih ćelija, signali poliadenilacije su kontrolne sekvence.
Kodna sekvenca je "pod kontrolom" kontrolne sekvence za transkripciju i translaciju u ćeliji kada polimeraza RNK prepisuje kodnu sekvencu u mRNK, koja je tada trans-RNK, spojena i translirana u protein kodiran kodnom sekvencom.
"Signalna sekvenca" je uključena na početak kodne sekvencxe jednog proteina koji treba da se izrazi na površini ć
elije. Ta sekvenca kodira jedan signalni peptid, N-završni za zreli polipetid, koji usmerava ćeliju domaćina da translocira polipeptid. Izraz "signalna sekvenca translokacije" takođe se koristi kada se misli na ovu vrstu signalne sekvence. Signalne sekvence translokacije mogu se naći povezane sa raznim vrstama proteina koji su prirodni sastojci eukariota i prokariota, i často su funkcionalni kod oba tipa organizama
Jedna DNK sekvenmcaje "operativno vezana" za neku sekvencu za kontrolisanje izražavanja kada sekvenca za kontrolu izražavanja upravlja i reguliše transkripciju i translaciju te DNK sekvence. Izraz "operativno vezan" obuhvata prisustvo odgovarajuće početnog signala (na primer ATG) ispred DNK sekvence koja treba da se izrazi i održavanje korektnog okvira očitavanja da bi se omogućilo izražavanje DNK sekvence pod upravljanjem sekvence za kontrolu izražavanja i proizvodnja željenog proizvoda kodiranog DNK sekvencom. Ako gen koji se želi umetnuti u molekul rekombinantne DNK ne sadrži odgovarajući početni signal, takav se početni signal može umetnuti ispred (5') gena a u okviru za očitavanje gena.
"Promotorska sekvenca" je jedno regulaciono područje DNK koje može da vezuje RNK polimerazu u jednoj ćeliji i da inicira transkripciju jedne kasnije po redu (3' smer) kodne sekvence. Radi definisanja prikazanog pronalaska, promotorska sekvenca je vezana na svom 3' završerku mestom iniciranja transkripcije, a pruža se unazad (5' smer) tako da obuhvata minimalan broj elemenata potrebnih da se inicira transkripcija na nivoima koji se mogu otkriti preko pozadine. Unutar promotorske sekvence naći će se mesto iniciranja transkripcije (pogodno definisano, na primer, mapiranjem nukleazom SI), kao i područja vezivanja proteina (konsenzusne sekvence) koja su odgovorna za vezivanje RNK polimeraze.
Drugo svojstvo ovog pronalaska je izražavanje ovde opisanih DNK sekvenci Kao što je inače poznato, DNK sekvence se mogu izražavati tako Što se operativno povežu sa jednom sekvencom za kontrolu izražavanja u odgovaraju-ćem vektoru izražavanja i korišćenjem tok vektora izražavanja da bi se transformisao jedan odgovarajući jednoćelijski domaćin.
Takvo operativno povezivanje jedne DNK sekvence prema ovom pronalasku sa jednom sekvencom za kontrolu izražavanja, obuhvata, svakako, ukoliko već nije deo DNK sekvence, obezbeđenje jednog inicijalnog kodona, ATG, u korektnom okviru za očitavanje ispred DNK sekvence.
Može se koristiti široka lepeza kombinacija domaći/vektor izražavanja za izražavanje DNK sekvenci prema ovom pronalasku. Korisni vektori izražavanja, mogu se, na primer, sastojati od segmenata hromozomskih, nehromozomskih i sintetičkih DNK sekvenci. Pogodni vektori obuhvataju derivate SV40 i poznate bakterijske plazmide, na primer E. coli, plazmide col El, pCRl, pBR322, pMB9 pUC, ili derivate pUC plazmida, na primer pGEX vektore, pET vektore pmal-cc, pFlag, itd., i njihove derivate, plazmide kao što je RP4; fagne DNK, na primer brojne derivate fagaX,na primer NM989, i druge fagne DNK, na primer Ml3, i vlaknastu jednolančanu fagnu DNK; plazmide kvasca kao što je 2p plazmid ili njegovi derivati; vektori korisni u eukanotskim ćelijama, kao što su vektori korisni u ćelijama insekata ili sisara; vektori izvedeni iz kombinacija plazmida i fagnih DNK, kao što su plazmidi koji su modifikovani da bi se koristitla fagna DNK ili druge sekvence za kontrolu izražavanja; i slično. Kod jednog preporučljivog izvođenja, izražavanje ob je ostvareno u metilotrofičnorn kvascu, na primer Pichia pastoris kvascu (videti, na primer, Međunarodni patentni spis br. VVO 90/03431, objavljen 5. aprila 1990, od Brierley-a i dr.: Međunarodni patentni spis br. WO 90/10697, objavljen 20. septembra 1990, od Siegel-a i dr ). Kod jednog specifičnog izvođenja, niže navedenog, projektovan je vektor izražavanja za izražavanje ob pod kontrolom signalne sekvence ct-faktora sparivanja.
Svaka od široke lepeze sekvenci za kontrolu izražavanja - sekvenci koje kontrolišu izražavanje jedne DNK sekvence operativno povezane sa njom - mogu se koristiti u tim vektorima da bi se izrazile DNK sekvence prema ovom pronalasku. Takve korisne sekvence za kontrolu izražavanja obuhvataju, na primer, rane ili kasne promotore SV40, CMV, virusa kravljih boginja, polioma ili adenovirusa,lacsistem,trpsistem,TACsistem,TRCsistem,LTRsistem, glavno opertorsko i promotorsko područje fagaX,kontrolna područja fd obloženog proteina, promotor za 3-fosfogliceratnu kinazu ili druge glikolitske enzime, promotore za fosfataze kiselina (na primer Pho5), AOX 1 promotor metilotrofičkog kvasca, promotore a-faktora sparivanja kvasca, i druge sekvence za koje se zna da kontrolišu izražavanje gena prokanotskih ili eukanotskih ćelija ili njihovih virusa, kao i njihove razne kombinacije.
Široka lepeza jednoćelijskih ćelija-domaćina takođe je korisna kod izražavanja DNK sekvence prema ovom pronalasku. Ti domaćini mogu obuhvatati poznate eukariotske i piokariotske domaćine kao što su sojeviE. coli, Psendomonas, Bacillus, Streptomices;gljivice kao što su kvasci( Saccharomyces,i metilotrofički kavasac kao što jePichia, Candida, HamermlaiTorulopsis) ;i životinjske čelike kao što je CHO, RI.I, B-W i LM ćelije, bubrežne ćelije afričkog zelenog majmuna (na primer COS 1, COS 7, BSC1, BMSC40, i BMT10) ćelije insekata (na primer Sf9), i humane ćelije i biljne ćelije u kulturi tkiva.
Podrazumeva se da neće svi vektori, sekvence za kontrolu izražavanja i domaćini funkcionisati podjednako dobro kod izražavanja DNK sekvenci prema ovom pronalasku. Niti će svi domaćini funkcionisati podjednako dobro sa istim sistemom izražavanja. Međutim, stručnjak će moći da odabere odgovarajuće vektore, sekvence za kontrolu izražavanja i domaćine, bez nepotrebnog eksperimentisanja, da bi se ostvarilo željeno izražavanje bez istupanja iz opsega ovog pronalaska. Tako na primer, kod biranja jednog vektora, mora se uzeti u obzir domaćin pošto vektor treba u njemu da funkcioniše. Broj kopija vektora, sposobnost kotrolisanja tog broja kopija i izražavanje bilo kojih drugih proteina kodiranih vektorom, kao što su antibiotički markeri, takođe treba uzeti u obzir.
Kod biranja sekvence za kontrolu izražavanja, normalno će biti uziman u obzir veći broj činilaca. Oni obuhvataju, na primer, relativnu snagu sistema,, mogućnost njegovog kontrohsanja, i njegovu kompatibilnost sa sekvencom određene DNK ili gena koji treba da se izražava, posebno u pogledu potencijalnih sekundarnih struktura. Pogondne jednoćelijske ćelije-domaćim biće birane uzimajući u obzir, na pnmer, njihovu kopatibilnost sa izabranim vektorom, njihove karakteristike izlučivanja, njihovu sposobnost da pravilno FOLD proteine, i njihove zahteve u pogledu fermentacije, kao i toksičnost za domaćina proizvoda kodiranog DNK sekvencama da bi se izražavao, kao lakoću prečišćavanja proizvoda izražavanja.
Uzimajući u obzir te i druge činioce, stručnjak će moći da načini veliki broj različitih kombinacija vektor/sekvenca za kontrolu izražavanja.domaćin, a koje će izražavati DNK sekvence prema ovom pronalasku nakon fermentacije ili u životinjskim kulturama velikog obima.
Kod jednog specifičnog izvođenja, može se izražavati jedan OB FUSION protein. OB FUSION protein sadrži najmanje jedan funkcionalno aktivan deo jednog ne-OB proteina spojenog preko jedne peptidne veze sa najmanje jednim funkcionalno aktivnim delom jednog OB polipeptidfa. Ne-ob sekvenmce mogu biti amino ili karboksi-završne za OB sekvenmce. Poželjnije je, radi stabilnog izražavanja jednog proteolitički neaktivnog OB FUSION proteina, da je deo ne-OB FUSION proteina spojen preko jedne peptidne veze na amino-završetak OB proteina. Molekul rekombinantne DNK koji kodira takav FUSION protei, sadrži jednu sekvencu koja kodira bar funkcionalno aktivan deo ne-OB proteina povezanu okvirno za OB kodnu sekvencu, i poželjno kodira jedno mesto kidanja za jednu specifičnu proteazu, na primer trombin ili Factor Xa, poželjno na mestu spoja OB-ne-OB. Kod jednog specifičnog izvođenja, FUSION protein je izražen uEscherichia coliili uP. pastoris.
Kod jednog, niže opisanog, specifičnog izvođenja, vektori su bili pripremani da izražava mišje i humaneobgene, sa i bez kodona za gin-49, u bakterijskim sistemima izražavanja i u sistemima izražavanja kvasaca( Pichia),kao FUSION proteini,obgen je je pripremljen sa mestom kidanja endonukleaze, na primer korišćenjem PCL i novih osnova. Poželjno je da se potvrde sekvence koje su generisane PCR, pošto je verovatnoćće uključivanja jedne tačkaste mutacije veća kod ove tehnike. Korišćen je plazmid koji je sadržavao histidinsku oznaku (u daljem His-tag) kao i jedno mesto za proteolitičko kidanje. Prisustvo histidina omogućuje selektivno izdvajanje rekombinantnog proteina na Ni-helacionom stubu, ili afinitetnim prečišćavanjem. Mesto proteolitičkog kidanja, kod jednog niže opisanog specifičnog izvođenja mesto kidanja trombina, projektovano je tako će obrada proteazom, na primer trombinom, osloboditi zreo (tj. koji nema signalnu sekvencu) OB polipeptid pune dužine.
Prema jednom drugom vidu, može se koristiti pGEX vektor [Smith i dr.. Gene 67 31-40 (1988)]. Taj fektor vektor FUSES schistosoma japonicum glutationin S-transferazu cDNK na interesantnu sekvencu. Bakterijski proteini se sakupljaju a rekombinantni proteini se mogu brzo prečistiti na redukovanoj glutationskojj afmnitetnoj koloni. GST nosač se potom može otkinuti od FUSION proteina razlaganjem mesno-specificnom proteazom. Nakon otkidanja, nosač i neotkinut FUSION protein mogu se odvojiti apsorpcijom ma glutationskoj agarozi. Povremeno se javljaju teškoće sa sistem ako kodirani protein nije rastvorlji u vodenim rastvorima.
Izražavanje rekombinantnih proteina u bakterijskim sistemima može dovesti do nepravilnog FOLDING izraženog proteina, što zahteva REFOLDING. Rekombinantni protein se može ponovo saviti pre ili nakon otkidanja da bi se obrazovao funkcionalno aktivan OB polipeptid. OB polipeptid može biti ponovo savijen stupnjevima (i) inkubiranja proteina u puferu za denaturisanje koji sadrži agens za redukciju, a potom (ii) inkubiranja proteina u nekom puferu koji sadrži neki oksidator, a poželjno je da sadrži i neko sredstvo za stabilisanje proteina ili neki haotropni agens, ili oba. Pogodni parovi sredstava za redukciju i oksidaciju obuhvataju, ali nisu na iste ograničeni, redukovam glutation/glutation disulfid, cistin/cistein, cistamin/cisteamin i 2-merkaptoetanol/ 2-hidroksietildisulfid. Kod jednog posebnog vida, FUSION protein se može rastvoriti u nekom sredstvu za denaturisanje, kao što je karbamid (ili urea), pre lizmene u redukcionom puferu. Kod preporučljivog izvođenja, protein je takođe prečišćen, na primer izmenom jona ili Ni-helacionom hromatografijom, pre izmene u redukcionom puferu. Sredstva za denaturisanje obuhvataju ureu i gvanidin-HCl, ali nisu ograničena samo na njih Rekombinantni protein je tada razblažen oko najmanje desetostruko, poželjnije stostruko, u oksidacionom puferu koji sadrži neki oksidant kao što je, 0,1 M TRis-HCl, pH8,0, 1 mM EDTA, o,15 M NaCl, 0,3 M oksidisan glutation, ali nije samo na njih ograničen. FUSIO protein se potom inkubira od oko 1 do oko 24 časa, poželjno od oko 2 do oko 16 časova, u oksidacionom puferu na sobnoj temperaturi. Oksidacioni pufer može da sadrži neko sredstvo za stabilisanje proteina, na primer neki šećer, alko-hol ili amonijum sulfat. Oksidacioni pufer može dalje da sadrži jedan haotropni agens u maloj koncentraciji, kako bi se destabilizovale nekorektne intermole-kulske interakcije i time podstaklo pravilno FOLDING. Pogodni haotropni agensi obuhvataju, ali nisu na iste ograničeni, neki deterdžent, poliol, L-arginin, gvanidin-HCl i polietilen glikol (PEG). Važno je da se koristi dovoljno niska koncentracija haotropnog agensa da bi se izbeglo denaturisanje proteina, ponovo savijeni protein se može koncentrisati najmanje desetostruko, ali je poželjno da se koncentriše onoliko za koliko je razblažen u oksidacionom puferu.
Procesi bakterijske fermentacije mogu takođe dati rekombinantni prote-inski preparat koji sadrži neprihvatljive nivoe endotoksina. Zbog toga pronalazak predviđa uklanjanje takvih endotoksina, na primer primenom endotoksin-speci-ličnih antitela ili drugih molekula koji vezuju enđotoksine. Prisustvo endotoksina se može odrediti standardnim tehnikama, kao što je korišćenje E-TOXATE Reagents (Sigma, St. Louis, Mlssouri) ili bioispitivanjima
Pored specifičnih pnmera, prikazani pronalazak predviđa korišćenje sistema za izražavanje BACULOVIRUS, sisara i kvasaca, za izražavanje ob proteina. Tako se, na primer, u BAKULOV1RUSNOM sistemima izražavanja, mogu izražavati oba NON7FUSION transferska vektora, kao što su, ali nije na na iste ograničeno, pVL941( BamHlmesto kloniranja, Summers); pVL1393( BamHl, Smal, Xbal, EcoRl, Norl, Xmalll, BgllliPstlmesta kloniranja; Invitrogen), pVL1392(B<g>lllPstI, Noti, Xmalll, EcoRl, Xbal, SmaliBamHlmesta kloniranja; Summers i Invitrogen), i pBlueBacIII( BamHl, Bglll, Pstl, NcoliHindlllmesta kloniranja, sa mogućim plavo-belim rekombinantnim pretraživanjem; Invitrogen), i FUSION TRANSFER vektori, kao što su, ali ne na njih i ograničeno, pAc700( BamHliKpnlmesta klonitranja, u kojimaBamHlmesto prepoznavanja počinje sa inicijalnim kodonom; Summers), pAc701 i pAc702 (isti kao i pAc700, ali sa različitim okvirima očitavanja), pAc360( BamHlmesto kloniranja za 36 baznih parova iza polihednnskog inicijalnog kodona; Invitrogen (1952)), i pBlueBacHisA, B, C (tri različita okvira očitavanja, saBamHl, BgHl, Pstl, NcoliHindlllmestima kloniranja, jedan N-završm peptid za ProBond prečišćavanje i plavo/belo rekombinantno pretraživanje plakova; Invitrogen (220)).
Vektori izražavanja sisara predviđeni za primenu u pronalasku, obuhvataju vektore sa podsticajnim promotorima kao što je promotor dihidrofolatne reduktaze, na primer svaki vektor izražavanja sa jednim vektorom izražavanjaDHFR,ili jedan b//F/č/metotreksat koamplifikacioni vektor, kao što je pED( Pstl, Sali, Sbal, Smali A'coRl mesta kloniranja, pri čemu vektor izražava oba klonirana gena iDHFR;videti Kaufman, Current Protocols in Molecular Biologv, 16.12 (1991). Alternativno, jedan glutamin sintetaza/metionin sulfoksimin koamplifikacioni vector, kao što je pEEl4( Hindlll, Xbal, Smal, Sbal, EcoRliBellmesta kloniranja, gde vektor izražava glutamin sintazu i kloniran gen; Celltech). Kod jednog drugog izvođenja može se koristiti vektor koji usmerava episomalno izražavanje pod kontrolom Epstein Barr Virusa (EBV), kao što je pREP4( BamHl, SffL, Mol, Noti, Nhel, Hinćlll, Nhel, PvulliKpnlmesta kloniranja, konstitutivni RSV-LTR promotor, higromicinski selektabilni marker; Invitrogen), pCEP4( BaniHl, Sfil, Xhol, Noti, Nhel, Hindlll, Nhel, PvulliKpnlmesta kloniranja, konstitutivni hCMV neposredni rani gen, higromicinski probran marker; Invitrogen), pMEP4( Kpnl, Pvul, Nhel, Hindlll, Noti, Xhol, Sfil, BanHlmesta kloniranja, podsticajni metalotionein Ha genski promotor, probran higromicinski marker; Invitrogen), pREPS( BamHl, Xhol, Noti, Hindlll, Nhel,iKpnlmesta kloniranja, RSV-LTR promotor, histidinolski probran marker; Invitrogen), pREP9( Kpnl, Nhel, Hindlll, Noti, Xhol, SfiliBamHlmesta kloniranja, RSV-LTR promotor, G418 selektabilni marker; Invitrogen), i pEBVHis (RSV-LTR promotor, higromisinski probran marker, N-završni peptid koji se može prečistiti ProBond smolom i prekinut enterokmazom, Invitrogen). Probrani vektori izražavanja sisara, za primenu kod pronalaska, obuhvataju pRc/CMC( Hindlll, BstXl, Noti, SbaliApalmesta kloniranja, G418 selekciju; Invitrogen), pRc/RSV( Hindlll, Spel, BstXl, Norl, Xbalmesta kloniranja, G418 selekciju; Invitrogen), i druge. Vektori izražavanja sisara na virusu kravljih boginja (videti napred: Kaufman, 1991) za primenu prema pronalasku obuhvataju, ali nisu na njih ograničeni, pSCll{ Smalmesto kloniranja, TK- i (3-gal selekcija), pMJ60i( Sali, Smal, Afll, Narl, BspMll, BamHl, Apal, Nhel, Sadi, KpnliHindlllmesta kloniranja; TK- i (3-gal selekcija) i pTKgptFlS( EcoRl, Pstl, Sali, Accl, Hindll, Sbal, BamHlitipamesta kloniranja, TK ili XPRT selekcija).
Prema pronalasku se i sistem izražavanja kvasaca može koristiti za izražavanje OB polipeptida. Tako, na primer, NON-FUSION pYES2 vektor( Xbal, Sphl, Shol, Noti, GstXl, EcoRl, BstXl, BamHl, Sad, KpnliHindlllmestima kloniranja; Invitrogen) ili FUSION pZESHisA, B, C (Xbal, Sphl, Shol,Noti BstXl, EcoRl BamHl, Sad, KpnliHindlllmesta kloniranja, N-završni peptid prečišćen ProBond smolom i prekinut enterokinazom; Invitrogen), da se pomenu samo dva, mogu se koristiti prema pronalasku.
Dalje se teži da se analozi peptida modulatora telesne mase mogu pripremiti od nukleotidnih sekvenci izvedenih u opsegu prikazanog pronalaska.
Pored rekombinantnog izražavanja OB polipeptida, prikazani pronalazak predviđa i u potpunosti omogućuje pripremanje OB polipeptida, ili njegovih fragmenata, koristeći poznate i veoma razvijene tehnike sinteze peptida u čvrstoj fazi. Pronalazak predviđa korišćenje obe popularne Boe i Fmoc, kao i druge strategije zaštitnih grupa, za pripremanje ob polipeptida ili njegovih fragmenata. Poznate su razne tehnike za REFOLDING i oksidisanje cisteinskih bočnih nizova da bi se obrazovala disulfidna veza
Antitela za OB polipetid
Prema pronalasku, OB polipeptid proizveden rekombinantno ili hemij-skom sintezom, i njegovi fragmenti ili drugi derivati, uključujući FUSION prote-ine, mogu se koristiti kao imunogen za generisanje antitela koja prepoznaju OB polipeptid. Takva antitela obuhvataju, ali nisu na njih ograničena, poliklonalne, monoklonske, himerne, jednolančane, Fab fragmente ijednu LIBRARY Fab izražavanja.
Jedan je molekul "antigenski" kada je u stanju da specifičnu međusobno deluje sa jednim molekulom za prepoznavanje antigena iz imunog sistema, kao što je imunoglobulin (antitelo) ili T ćelijski antigenski receptor. Jedan antigenski polipeptid sadrži najmanje oko 5, a poželjno bar oko 10, amino kiselina. Antigenski deo jednog molekula može biti onaj deo koji je imunodominantan za prepoznavanje antitela ili T ćelijskog receptora. ili može biti deo koji se koristi za generisanje jednog antitela za taj molekul konjugovanjem antigenskog tela na jedan noseći molekul za imunizaciju. Molekul koji je antigenski ne mora sam da bude imunogenski, tj. sposoban da ostvari imunsko reagovanje bez nosača.
"Antitelo" je svaki imunoglobulin, uključujući antitela i njihove fragmente, koji vezuje jednu specifičnu epitopu. Izraz obuhvata poiiklonska, monoklonska i himerna antitela, pri čemu se poslednje pomenuta detaljno opisana u američkim patentnim spisima br. 4,816,397 i 4,816,567, kao i delove antitela koji vezuju jedan antigen, uključujući Fab, F(ab')2i F(v) (uključujući jednolančana antitela). Prema tome, izraz "molekul antitela" u raznim gramatičkim oblicima, kako se ovde koristi, podrazumeva i potpun imunoglobulinski molekul i imunološki aktivan deo jednog imunoglobulinskog molekula koji sadrži mesto kombinovanja antitela. "Mesto kombinovanja antitela" je onaj deo strukture jednog molekula antitela, sačinjen od područja promenljivih teškog i lakog lanca i hiperpro-menljivih, koja specifično vezuju antigen.
Primeri molekula antitela obuhvataju potpune imunoglobulinske mole-kule, u suštini potpune imunoglobulinske molekule i one delove imunoglo-bulinskog molekula koji sadrže paratopu, uključujući one delove poznate kao Fab, Fab', F(ab')2i F(v), a koji su delovi preporučljivi za primenu kod ovde opisanih terapeutskih metoda.
Fab i F(ab')2delovi molekula antitela pripremaju se proteolitičkom reakcijom papina i pepsina, na u suštini potpunim molekulima antitela, koristeći inače poznate postupke. Videti, na primer, američki patentni spis br. 4,342,566, Theofilopoulos i dr. Fab' delovi molekula antitela takođe su dobro poznati i proizvode se od F(ab')2delova, posle čega se vrši redukcija disulfidmh veza koje povezuju dva dela teškog lanca na primer merkaptoetanolom, posle čega se vrši alkilacija dobijenog merkaptana proteina nekim reagensom kao što je jodoacetamid. Poželjno je antitelo koje sadrži potpune molekule antitela.
Izraz "monoklonsko antitelo" u svojim raznim gramatičkim oblicima, odnosi se na antitelo koje ima samo jednu vrstu mesta za kombinovanje antitela koje može imunski reagovati sa jednim određenim antigenom. Na taj način monoklonsko antitelo tipično iskazuje jedinstven afinitet za vezivanje za svaki antigen sa kojim imunski reaguje. Zbog toga jedno monoklonsko antitelo može sadržati jedan molekul antitela koji ima više mesta kombinovanja antitela, svako imunospecifično za jedan različit antigen; na primer jedno bispecifično (himerno) monoklonsko antitelo.
Izraz "ađjuvans" odnosi se na jedinjenje ili smešu što povećava imunsko reagovanje na neki antigeni. Ađjuvans može služiti kao spremnik u tkivu koji lagano ispušta antigen, a takođe i kao aktivator limfoidnog sistema koji nespecifično pojačava imunsko reagovanje [Hood i dr., Immunologv, str. 384, drugo izdanje, Benjamin/Cummings, Menlo Park, California (1984)]. Cesto jedno primarno inficiranje samo antigenom, u odsustvu adjuvansa, neće izazvati humoralno ili ili ćelijsko imunsko reagovanje. Adjuvansi obuhvataju, ali nisu na njih ograničeni, potpun Freund-ov ađjuvans, nepotpun Freund-ov ađjuvans, saponin, mineralne gelova kao što je aluiminijum hidroksid, površinski aktivne supstance kao što je lizolecitin, višestruki polivalentni alkoholi, polianjoni, peptidi, emulzije ulja ili ugljovodonika, hemocijanini škloljki-prstaca, dinitrofeml, i potencijalno korisni humani adjuvansi kao što je be-se-že (BCG -bacile Calmette- Guerin)iCotjnebacterium parvum.Preporučljivo je da ađjuvans bude farmaceutski prihvatljiv.
Mogu se koristiti razni poznati postupci za proizvodnju poliklonskih antitela za OB polipeptide, ili njihovih fragmenata, derivata ili analoga. Za proizvodnjun antitela mogu se razne životinje-đomaćini imunizovati ubrizga-vanjem OB polipeptida, ili nekog njegovog derivata (na primer fragmenta ili FUSION proteina), uključujući, ali bez ograničavanja na njih, zečeve, miševe, pacove, ovce, koze i td. Kod jednog izvođenja OB polipeptid ili njegov fragment može se konjugovati sa jednim imunogenim nosačem, na primer albuminom goveđeg seruma (BSA) ili hemocijaninom prstaca (KLH). Mogu se koristiti razni adjuvansi da bi se povećalo imunološko reagovanje, u zavisnosti od vrste domaćina, uključujući, ali ne i ograničeno na iste, Freund-ov (potpun ili nepotpun) ađjuvans, mineralne gelove kao što je aluminijum hidroksid, površinski aktivna sredstva kao što je lizolecitin, višestruki polivalentni alkoholi, polianjoni, peptidi, uljne emulzije, hemocijanini škloljki-prstaca, dinitrofenil, i potencijalno korisni humani adjuvansi kao što je be-se-že (BCG -bacile
Calrnetie- Cjverm)iCorytiebacterium parvum.
Za pripremanje monoklonskih antitela usmerenih na OB polipeptid, ili na njegov fragment, analog ili derivat, može se koristiti svaka tehnika koja obezbeđuje proizvodnju molekula antitela kontinualnim linijama ćelija u kulturi. Ove obuhvataju, ali nisu na njih ograničene, tehniku hibridoma koju su razvili Kohler i dr., Nature,265:495-497 (1975), kao i tehniku trioma, tehniku hibridoma humane B-ćelije [Kozbor i dr., Immunologv Today, 4:72 (1983)], i EBV-hibridoma tehniku da bi se proizvela humana monoklonska entitela [Cole i dr., u Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, str. 77-96, Alan R. Liss, Inc., (1985)]. Besmrtne linije ćelija koje proizvode antitela mogu se obrazovati drugim tehnikama osim FUSION, kao što je neposredna transformacija B limfocita onkogenom DNKm ili ubrizgavanjem Epstain-Barr virusa. Videti, na primer, M. Schreier i dr., "Hvbridoma Techmques" (1980); Hammerling i dr., "Monoclonal Antibodies And T-cell Hybridomas" (1981); Kennett i dr., "Monoclonal Antibo-dies" (1980); videti takođe i američke patentne spise br. 4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,451,570; 4,466,917, 4,472,500; 4,491,63214,493,890.
Kod jednog dopunskog izvođenja pronalaska, monoklonska antitela mogu se proizvesti u životinjama bez klica, koristeći najnoviju tehnologiju (PCT/US90/02545). Prema pronalasku, mogu se koristiti humana antitela i mogu se dobiti koristeći humane hibndome [Gote i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:2026-2030 (1983)] ili transformisanjem humane B ćelije EBV virusom in vitro ( navpred navedeni Cole i dr., 1985). U stvari, prema pronalasku se mogu koristiti tehnike razvijene za proizvodnju "himernih antitela" [Morrison i dr., J. Bacteriol, 159-870 (1984; Neuberger i dr., Nature, 312:604-608 (1984); Takeda i dr., Nature, 314:452-454 (1985)] spajanjem gena iz molekula mišjeg antitela specifičnog za ob peptid sa genima iz molekula humanog antitela odgovarajuće biološke aktivnosti; takva su antitela u opsegu ovog pronalaskaTakva humana ili humanizovana himerna antitela preporučljiva su za primenu kod tečenja humanih oboljenja ili poremećaja (opisanih kasnije), pošto je za humana ili humanizovana antitela mnogo manje verovatno nego za strana antitela da će sama izazvati imunu reakciju, posebno alergijsku reakciju.
Prema šronalasku, tehnike opisane za proizvodnju jednolančanih antitela (američki patentni spis 4,946,778) mogu se prilagoditi za proizvodnju OB pohpeptidno-specifična jednolančana antitela. Jedno dodatno izvođenje pronalaska koristi tehnike opisane za konstrukciju LIBRARIES za izražavanje Fab [Huse i dr., Science, 246.1275-1281 (1989)] da bi se omogućilo brzo i lako identifikovanje monoklonskih Fab fragmenata sa željenom specifičnošću za ob polipeptid, ili njegove derivate ili analoge
Fragmenti antitela koji sadrže idiotipe molekula antitela mogu se gene-risati poznatim tehnikama. Tako, na primer, takvi fragmenti obuhvataju, ali nisu ograničeni na iste, F(ab')2fragment koji se može proizvesti pepsinskim razlaga-njem molekula antitela, Fab' fragmente koji se mogu generisati redukcijom disulfidnih mostova F(ab')2fragmenta, i Fab fragmente koji se mogu generisati obradom molekula antitela papainom i nekim sredstvom za redukovanje.
Kod proizvodnje antitela, pretraživanje željenog antitela može se ostvariti poznatim tehnikama, kao što su, na primer, radioimunska ispitivanja, ELISA (imunsko ispitivanje povezano sa enzimima), "sendvič" imunska ispitivanja, imu-noradiometrijska ispitivanja, gel difuzione precipitinske reakcije, imunodifu-ziona ispitivanja,in situimunoispitivanja (koristeći koloidno zlato, enzimske ili radioizotopne oznake, na primer), VVestern razmaz, precipitacione reakcije, ispitivanja aglutinacijom (na primer gel aglutaciona ispitivanja, hemaglutaciona ispitivanja), ispitivanja sa fiksacijom komplemenata, ispitivanja imunofluores-cencijom, ispitivanja proteinom A, i ispitivanja imunoelektroforezom, itd. Kod jednog izvođenja je vezivanje antitela otkriveno nalaženjem jedne oznake na pri-marnom antitelu. Kod jednog drugog izvođenja, primarno antitelo je otkriveno nalaženjem vezivanja sekundarnog antitela ili reagensa na primarnom antitelu. Kod jednog sledećeg izvođenja je sekundarno antitelo obeleženo. Poznato je mnogo načina za otkrivanje veza kod jednog imunoispitivanja i ona su u opsegu ovog pronalaska. Da bi se, na primer, izabrala antitela koja prepoznaju jednu specifičnu epitopu jednog OB polipeptida, mogu se ispitivati generisane hibridome da bi se našao proizvod koji se vezuje za fragment OB polipeptida koji sadrži takvu epitopu. Kod biranja antitela specifičnog za OB polipeptid od jedne određene vrste životinja, biranje se može vršiti na bazi pozitivnog vezivanja sa OB polipeptidom izraženim ćelijama te vrste životinja, ili izdvojenim iz istih.
Pomenuta antitela se mogu koristiti u poznatim postupcima koji se odnose na lokalizaciju i delovanje OB polipeptida, na primer za VVestern razmaz, prikaz OB polipeptidain situ,merenje njegovih nivoa u odgovarajućim fiziološkim uzorcima, itd.
Kod jednog specifičnog izvođenja mogu se generisati antitela koja podržavaju ili se suprotstavljaju delovanju OB polipeptida. Ta se antitela mogu ispitati koristeći niže opisana ispitivanja za identifikaciju liganada.
Kod jednog specifičnog izvođenja razvijena su antitela imunizovanjem zečeva sintetičkim peptidima predviđenim proteinskom seqvencom ili rekombi-nantnim proteinima, načinjenim koristeći bakterijske vektore izražavanja. Izbor sintetičkih polipeptida vrsi se posle pažljive analize predviđenih proteinskih struktura, kako je napred opisano. Posebno se biraju peptidne sekvence između pretpostavljenih mesta kidanja. Sintetički peptidi su konjugovani sa nekim nosačem kao što je KLH hemocijanin ili BSA, koristeći karbodiimide a koriste se u Freunds-ovom adjuvansu za imunizovanje zečeva Da bi se pripremio rekombinantni protein, može se koristiti pGEX vektor da bi se izrazio polipeptid napred (navedeni Smith i dr., 1988). Alternativno mogu se koristiti samo hidrofilična područja za generisanje FUSION proteina. Izraženi protein će biti pripremčjen u većim količinama i korišćen za imunizovanje zečev u Freunds-ovom adjuvansu.
Kod jednog drugog specifičnog izvoženja, rekombinantni OB polipeptid se koristi za imunizovanje pilića, i pileća anti-OB antitela dobijaju se iz žuman-ceta jajeta, na primer efinitetnim prečišćavanjem na OB-koloni. Poželjno je da se pilići korišćeni za imumzaciju drže u posebnim uslovima bez patogena (SPF).
Kod jednog drugog izvođenja, antitela protiv leptina generisana su u ob/ob miševima koji nemaju cirkulišući OB protein, pa se zato očekuje da će biti u stanju da generišu jedan anti-OB polipeptidni odgovor pošto neće biti tolerizovani prema polipeptidu i normalnim miševima. Ćelije slezine od obe grupe miševa mogu se FUSE sa ćelijama mijelome da bise pripremile hibridome za monoklonska antitela.
Kod jednog sledećeg izvođenja, rekombinantni OB polipetid se koristi za imunizovanje zečeva, a poliklonska antitela su imunski prečišćena pre dalje upo-trebe. Prečišćena antitela su posebno korisna za polukvantitativna ispitivanja, na-ročito kod otkrivanja prisustva cirkulišućeg OB polipeptida u serumu ili plazmi.
Paneli monoklonskih antitela, proizvedenih protiv peptida modulatora, mogu se pretraživati za različita svojstva, tj. izotipe, epitope, afinitet, itd. Od posebnog su interesa monoklonska antitela koja neutrališu aktivnost peptida modulatora. Takvi se monokloni mogu lako otkriti kod ispitivanja aktivnosti modulatora telesne mase. Antitela velikog afiniteta takođe sui korisna kada je moguće imunoafinitetno prečišćavanje prirodnog ili rekombinantnog modulatora.
Poželjno je da antimodulatorsko antitelo, koje se koristi u dijagnostičkim i terapeutskim metodama prema ovom pronalasku, bude jedno afmitetno prečišćeno poliklonsko antitelo. Još poželjnije je daje antitelo jedno monoklonsko antitelo (mAn). Pored toga, preporučljivo je da molekuli antimodulatorskih antitela koja se ovde koriste budu u vidu Fab, Fab', F(ab')2ili F(v) delova potpunih molekula antitela.
Dijagnostičke implikacije
Prikazani pronalazak se takođe odnosi na razne dijagnostičke primene, uključujući metode za otkrivanje postojanja stanja i/ili stimulansa koji utiču na abnormalnosti u telesnoj masi ili na gojaznost, s obzirom na njihovu sposobnost da ostvaruju delovanja posredstvom prikazanih modulatora telesne mase. Kako je ranije pomenuto, peptidi modulatora telesne mase mogu se koristiti za proizvodnju njihovih sopstvenih antitela raznim poznatim tehnikama, i ta se antitela mogu izdvojiti i koristiti kod ispitivanja postojanja određenog transkripcijskog delovanja u SUSPECTED TARGET ćelijama, alternativno, nukleinske kiseline prema pronalasku mogu se koristiti u dijagnostici.
Dijagnostika na bazi antitela
Kako je ranije ukazano, dijagnostiča metoda koja je korisna u ovom pronalasku obuhvata ispitivanje jednog ćelijskog uzorka ili medijuma jednim postupkom koji obuhvata delotvornu količinu antagonista jednog proteina modulatora, kao što je antimodulatorsko antitelo, poželjno jedno afinitetno prečišćeno poliklonsko antitelo, a poželjnije jedno mAb. Pored toga, poželjno je da su molekuli antimodulatorskog antitela, koji se ovde koriste, u obliku Fab, Fab', F(ab')2ili F(v) delova, ili potpunih molekula antitela. Kako je ranije rasmatrano, pacijenti koji mogu imati koristi od ove metode, obuhvataju one koji pate od raka, AIDS-a, gojaznosti ili drugih stanja kod kojih je abnormalna telesna masa karakteristika ili činilac. Metode za izdvajanje modulatora i aktiviranja antuuodulatorskih antitela i za određivanje i optimizovanje sposobnosti antimodulatorskih antitela da doprinesu kod ispitivanja TARGET CELLS, poznate su u ovoj oblasti.
Isto tako antitela, uključujući i poliklonska i monoklonska antitela, i lekovi koji modulišu proizvodnju ih delovanje modulatora telesne mase i drugi činioci za prepoznavanje i/ili njihove podjedinice, mogu imati određene dijagnostičke primene i mogu se, na primer, koristiti u svrhu otkrivanja i/ili merenja stanja gde su se razvile abnormalnosti u telesnoj masi, ili je verovatno da će se razviti. Tako, na primer, peptidi modulatora, ili njihovi aktivni fragmenti, mogu da se koriste da proizvedu i poliklonska i monoklonska sopstvena antitela u većem broju ćelijskih sredina, a pomoću poznatih tehnika, kao što je tehnika primene hibridoma, koristeći, na primer, FUSED limfocite slezine miša i mijelomske ćelije. Te su tehnike detaljno opisane u sledećem delu opisa. Isto tako se mogu otkriti ili smtetizovati mali molekuli koji podražavaju ili se suprostavljaju delovanju (ili delovanjima) činilaca prema pronalasku za prepoznavanje receptora, a mogu se koristiti u dijagnostici i/ili terapeutskim protokolima.
Prisustvo modulatora telesne mase u u ćelijama može se potvrditi uobičajenim imunološkim procedurama koje su primenljive za takva određivanja. Poznato je više korisnih procedura. Tri takve procedure, koje su posebno korisne, koriste bilo faktor prepoznavanja receptora obeležen nekom primetljivom oznakom, antitelo Abioznačeno nekom primetljivom oznakom, ili antitelo Ab2označeno nekom primetljivom oznakom. Procedure se mogu sažeto prikazati sledećnn jednačinama, gde zvezdica ukazuje daje čestica obeležena, a "WM" označava modulator mase:
A. WM<*>+ Ab, = WM<*>Abj
B. WM + Ab*, = WMAbi*
C. WM + Abi+ Ab2<*>= AbiWMAb2<*>
Procedure i njihova primena su poznate stručnjacima, pa se mogu koristiti u sklopu prikazanog pronalaska. "Kompetitivna" procedura. Procedura A, opisana je u američkim patentnim spisima br. 3,654,090 i 3,850,752. Procedura B predstavlja poznate tehnike kompetitivnog ispitivanja. Procedura C, "sendvič" procedura, opisana je u američkim patentnim spisima br. RE 31,006 i 4,016,043. Poznate su još i druge procedure kao stoje procedura "dvostrukog antitela" ili "DASP" procedura.
U svakom od primera, modulatori telesne mase obrazuju komplekse sa jednim dl više antitela ili BINDING PARTNERS a jedan član kompleksa je obeležen primetljivom oznakom. Činjenica da je obrazovan jedan kompleks i, ako se želi, njegova količina, mogu se odrediti poznatim metodama primenljivim za otkrivanje oznaka.
Iz navedenog će se videti da je jedno karakteristično svojstvo Ab2to, da će reagovati sa Abi. To zato stoje Abi, odgajeno u jednoj vrsti sisara, korišćeno u drugoj vrsti sisara kao antigen za ostvarivanje antitela, Ab2. Tako se, na primer, Ab2može odgajiti u kozama koristeći zečja antitela kao antigene. Zbog toga će Ab2 biti anti-zečje antitelo odgajeno u kozama. Za svrhu ovog opisa i patentnih zahteva, Abiće biti nazivano primarnimm ili anti-modulatorskim antitelom, a Ab2će biti nazivano sekundarnim ili anti-Abiantitelom.
Oznake koje se najčešće koriste za ova istraživanja su radioaktivni elementi, enzimi, hemikahje koje fluoresciraju kada se izlože ultraljubičastoj svetlosti, i druge.
Poznato je više fluorescentnih materijala koji se mogu koristiti kao oznake. Oni obuhvataju, na primer, fluorescein, rodamin i auramin. Poseban materijal za detektovanje je anti-zečje antitelo pripremljeno u kozama i konjugovano sa fluorescemom posredstvom jednog izotiocijanata.
Modulatori telesne mase ili njihovi BINDING PARTNERS mogu se isto tako označavati nekim radioaktivnim elementom ili nekim enzimom. Radioaktivna oznaka se može otkriti bilo kojomm danas raspoloživih procedura brojanja. Preporučljivi izotopi se mogu birati od<S>H,,<4>C,32P,35S,36C1,51Cr,<57>Co,<5S>Co,<59>Fe, 9<0>Y, 12T1186Re.
Isto tako su korisne i enzimske oznake, a mogu se otkriti bilo kojom od danas primenjivanih kolorimetrijskih, spektrofotometrijskih, fluorospektro-fotometrijskih, ampermetarskih i gazometarskih tehnika. Enzimi se konjuguju sa izabranom česticom reagovanjem sa molekulima za preošćevanje kao Što su karbodiimidi, diizocijanati, glutaraldehid i slični. Poznati su mnogi enzimi koji se mogu biti korisi u ovim postupcima i mogu se primenjivati. Preporuljivi su perosidaza, p-glicironidaza, f3-D-glukozidata, p-D-galaktozidaza, ureaza, gluko-zna oksidaza plus peroksidaza i alkalna fosfataza. Treba pomenuti američke patentne spise br. 3,654,090; 3,850,752 i 4,016,043, kao primere u kojima su prikazni alternativni materijali za obeležavanje i metode obeležavanja.
Kod jednog sledećeg izvođenja pronalaska, mogu se pripremiti kompleti za ispitivanje, pogodni za korišćenje od strane medicinskih radnika, za utvrđivanje postojanja ili nepostojanja unapred određene delatnosti na transkripciji, ili sposobnosti za unapred određenu delatnost na transkripciji u SUSPECTED TARGET ćelijama. U skladu sa napred rasmatranim tehnikama ispitivanja, jedna klasa ovakvih kompleta sadržaće najmanje obeležen modulator telesne mase ili njegov BINDING PARTNER, na primer jedno antitelo specifično na njega, kao i uputstva, svakako u zavisnosti od izabrane metode, na primer "kompetitivne", "sendvič", "DASPO" i slične. Kompleti takođe mogu sadržati periferne agense kao što su puferi, stabilizatori itd.
Prema tome, može se pripremiti komplet za prikazivanje prisustva ili sposobnosti ćelija za unapred određenu delatnost na transkripciji, koji sadrži: (a) unapred određenu količinu najmanje jedne obeležene, imunohemijski reaktivne komponente, dobijene neposrednim ili posrednimm vezivanjem prikazanog modulatora mase, ili nekog njegovog specifičnog BINDING PARTNER, za neku prepoznatljivu oznaku;
(b) druge reagense; i
(c) uputstva za korišćenje pomenutog kompleta.
Preciznije, dijagnostički komplet za ispitivanje može sadržati:
(a) poznatu količinu modulatora telesne mase, kako je napred opisan (ili nekog BINDING PARTNER) obično vezanog za neku čvrstu fazu kako bi se obrazovao jedan ununosorbent, ili, alternativno, vezan za neki pogodan označivao; ili više takvih krajnjih proizvoda, itd. (ili njihovih BINDING PARTNERS) po jedan od svakog;
(b) akoliko je potrebno, druge reaktanse; i
(c) uputstva za korišćenje tog kompleta za ispitivanje.
Kod jedne druge varijante, komplet za ispitivanje se može pripremiti i koristiti za napred navedene svrhe, a koji funkcioniše prema nekom unapred određenom protokolu (na primer "kompetitivnom", "sendvič", "dvostruko antitelo", itd ), a sadrži: (a) obeleženu komponentu koja je dobijena pripajanjem modulatora telesne mase na jedan prepoznatljiv obeleživač; (b) jedan ili više dodatnih imunohemijskih reaktanata od kojih je bar jedan reaktans jedan ligand ili jedan imobilisan ligand, pri čemu je taj ligand biran iz grupe koja se sastoji od: (i) liganda koji se može povezati sa označenom komponentom (a); (h) liganda koji se može povezati sa BINDING PARTNER označene komponente (a); (111) liganda koji se može povezati bar sa jednom od komponenata koja treba da se odredi, i (iv) ligand koji se može povezati sa bar jednim BINDING PARTNER od bar jedne od komponenata koje treba odrediti; i (c) uputstva za izvođenje protokola za otkrivanje 1/1I1 određivanje jedne ili više komponenata jedne imunohemijske reakcije između modulatora telesne mase i jednog za njega specifičnog BINDING PARTNER.
Dijagnostika na bazi nukleinskih kiselina
Kao što je prikazano u sledećim pnmerima, nukleinske kiseline prema pronalasku mogu se koristiti za optkrivanje defekata povezanih sa defektima u OB polipeptidu koji dovode do gojaznog fenotipa. Tako, na primer, PROBES nukleinske kiseline (na primer kod Northern analize ili RT-PCR analize) mogu se koristiti za određivanje da li je jedan gojazan fenotip povezan sa nedostatkom izražavanjaOBmRNK, ili izražavanjem nefunkcionalneOBmRNK, na primer kako kod db/db miševa (gde je poremećaj posledica nedostatka jednogOBreceptora) ili gde neka mutacija daje netranskribovanu mRNK, Pored toga, dijagnostička tehnika prema pronalasku, zasnovana na nukleinskim kiselinama,, može se upotrebiti zajedno sa tehnikama na bazi antitela, kako bi se dalje razvilo molekulsko shvatanje gojaznog ili mršavog fenotipa
Kloni humane cDNK, koji su nedavno izdvojeni, sekvencirani su kako je ovde izloženo. To olakšava određivanje potpune sekvence humanog gena (videti slike 20A do C, SEQ ID NO: 22). Dobijene su DNK sekvence od introna humanogOBgena (slika 20), i one su korišćene za pripremanje PCR osnova da bi se PCR-ski pojačala kodna sekvencaOBgena iz humane genomne DNK, kako bi se identifikovale mutacije ili alelne varijanteOBgena, a sve u skladu sa ranije detaljno opisanim protokolima. Specifilni PCR osnovi za pojačanje humanog genomskogOBopisani su kasnije u jednom specifičnom primeni.
Postojeća hipoteza je da da će heterozigotne mutacije uobgenu biti povezane sa blgom/umerenom gojaznošću, dok će homozigotne mutacije biti povezane sa nekoliko dijagnostičkih ispitivanja na gojaznost, baziranih na DNK sekvenci. Ako je to tačno, omogućiće određivanje ljudi kod kojih postoji rizik od gojaznosti i omogućiti primenu lečenja lekovima i/ili promene u načinu života pre no što dođe do punog zamaha povećanja telesne mase
Alternativno, postojanje mikrosatelita koji se izdvajaju zajedno sa mutantnim oblicima humanogOB,može se koristiti u dijagnozama. Razni PCR osnovi, uključujući one zasnovane na nukleotidnoj sekvenci datoj na slici 220A do C, mogu se koristiti u tu svrhu.
OBgen takođe može biti koristan za merenje njegove kodirane RNK i proteina kod poremećaja u ishrani. Biće važno da se zna, kod nekog određenog poremećaja u ishrani, da li jeOBRNK i/ili njen kodiran protein regulisan na veću ili na manju vrednost. Tako, ako jedna gojazna osoba ima povećane nivoe OB, problem će biti iza OB, a ako jeOBsmanjen, činiće se da neodgovarajuće niski nivoi OB mogu biti uzrok gojaznosti (bez obzira da li je defekt uOBgenu ili ne). S druge strane, ako pacijent koji boluje od raka ili AIDS-a i koji je gubio masu ima povišene nivoe OB, može se zaključiti daje neodgovarajuće veliko izražavanjeOBodgovorno za gubitak mase.
Klonirana humana cDNA biće od koristi za merenje nivoa humaneOBRNK. Pored toga, rekombinantni humani protein će biti pripremljen i korišćen za razvoj imunskih ispitivanja da bi se omogućilo merenje nivoa masti i možda nivoa plazme OB proteina.
Terapeutske implikacije
Polipeptidi, nukleinske kiselina i antitela prema pronalasku imaju značajan terapeutski potencijal. Preporučljivo je da se jedna terapeutski delotvoma količina takvog jednog agensa da u nekom farmaceutski prihvatljivom nosaču, razređivaču ili nekom inertnom vezivnom sredstvu.
Izraz "farmaceutski prihvatljiv" odnosi se na molekulske celine i preparate koji su fiziološki podnošljivi u opštem slučaju ne proizvode neku alergijsku ili sličnu nepovoljnu reakciju, kao što je poremećaj u želucu, ošamućenostz i slično, kada se da čoveku. Poželjno je da izraz "farmaceutski prihvatljiv", kako se ovde koristi, označava da je odobren od strane organa nadležnog za donošenje propisa federalne vlade ili vlade neke od država SAD, ili da je upisan u U.C. Pharma-copeia (Farmakopeja SAD) ili druge opšte prihvaćene farmakopeje za primenu kod životinja, a posebno kod ljudi. Izraz "nosač" odnosi se na neki razređivač, ađjuvans, punilac ili sredstvo kojim se jedinjenje daje pacijentu, Takvi farmaceut-ski nosači mogu biti sterilne tečnosti, kao što su voda i ulja, uključujući petrole-umska, životinjska, biljna ili sintetička, kao što je ulje od kikirikija, sojino ulje, mineralno ulje, susamovo ulje i slično. Voda ili slani rastvori, i vodeni rastvori dekstroze i glicerola se preporučljivo koriste kao nosači, posebno za rastvore koji se daju injekcijama. Pogodne farmaceutske nosače opisao je Martin, Remin-gton's Pharmaceutical Sciences, 18 izd., Mack Publishing Co., Baston, PD
(1990).
Izraz "terapeutski delotvoma količina" koristi se da označi količinu da smanji najmanje za oko 15%, poželjno za bar 50', poželjnije za najmanje 90%, a najpoželjnije da spreči klinički značajan nedostatak aktivnosti, funkcije i reago-vanja domaćina. Alternativno, terapeutski delotvoma količina je dovoljna da izazove poboljšanje klinički značajnog stanja kod domaćina.
Davanje rekombinantnog OB polipeptida dovodi do gubljenja telesne mase, posebno do smanjenja masnog tkiva. OB polipepti se može pripremati koristeći standardne bakterijske i/ili sisarske vektore izražavanja, sintetički, ili dobiti prečišćavanjem iz plazme ili seruma, što je sve napred detaljno izneto. Alternativno, povećano izražavanje prirodnog OB polipetida može se izazvati tehnikom homologne rekombinacije, kao je napred opisano.
Smanjenj aktivnosti OB polipetida (razvojem antagonista, inhibitora, korišćenjem antitela za neutralisanje ili protivsmislenih molekula) trebalo bi da dovede do povećanja mase, što može biti poželjno za lečenje gubitaka mase povezanih sa rakom, AiDS-om ili anorexia nervosa. Modulisanje OB aktivnosti može biti korisno za smanjenje telesne mase (povećanjem njegove aktivnosti) ili za povećanje telesne mase (smanjenjem njegove aktivnosti).
Lečenje na bazi polipeptida
Prema najjednostavnijoj analizi,OBgen određuje telesnu masu kod sisara, posebno miševa i ljudi. ProizvodOBgena i, prema tome, srodni molekuli, čini se da su deo signalnog puta kojim adipozno tkivo komunicira sa mozgom i drugim organima Veruje se da je sam OB polipeptid signalni molekul, tj. hormon.
OB polipeptid ili njegov funkcionalno aktivan fragment, ili njegov antagonist, može se dati oralno ili parenteralno, poželjno parenteralno. Kako je metabolička homeostaza jedan kontinualan proces, poželjno je kontrolisano ispuštanje polipeptida Tako, na primer, polipeptid se može davati koristeći intravensku infuziju, ugradljivu osmotsku pumpu, transdermalni flaster, lipozome ili druge načine davanja. Kod jednog izvođenja može se koristiti pumpa [Langer i dr., urednici, Medical Applications of Controlled Release, CRC pres, Boca Raton, Florida (1974); Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng., 14:201 (1987); Buchvvald i dr., Surgerv, 88:507 (1980); Saudek i dr., N. Engl., J. Med., 321:574 (1989)]. Kod jednog drugog izvođenja mogu se koristiti polimerni materijali [Langer, 1974, kao gore; Sefton, 1987, kao gore; Smolen i dr. urednici, Controlled Drug Bioavailabilitv, Drug Product Design and Performance, Wiley, New York (1984); Ranger i dr., J. Macromol. Sci. Rev. Macromol Chem., 23:61 (1983), videti takođe Levy i dr., Science, 228:190 (1986), During i dr., Ann. Neurol , 25:351 (1989); Hovvard i dr., J. Neurosurg., 71:105 (1989)]. Kod još jednog drugog izvođenja, sistem za kontrolisano ispuštanje može biti postavljen u neposrednu blizinu organa koji se leči, tj. mozga, tako da je potreban samo jedan mali deo sistemske doze [videti, na primer, Goodson, u Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, str. 115-138 (1984)]. Drugi sistemi kontrolisanog ispuštanja rasmatrani su u pregledu Langer-a, Science, 249:1527-1533 (1990). Kod jednog drugog izvođenja, terapeutsko jedinjenje se može dati u neku vezikulu, naročito u lipozomu (videti Langer, 1999, napred navedeno); Treat i dr. u Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Beeerestein i Fidler (urednici), Liss, New York, str. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, isto, str. 317-327; videti isto u celmi).
Prema jednom drugom vidu pronalaska, rekombinantne ćelije koje su transformisane OB genom i koje izražavaju visoke nivoe polipeptida, mogu se transplantirati u osobu koja ima potrebu za ob polipeptid. Preporučljivo je da se transplantiraju autologne ćelije transormisane OB-om kako bi se izbeglo odbacivanje; alternativno, postoji tehnologija da se ne-autologne ćelije koje proizvode rastvorljive faktore zaštite unutar jedne pohmerne matrice koja sprečava imunsko prepoznavanje i odbacivanje.
OB polipetid se može unositi intravenskim, intraarterijskim, intraperitonealnim intramuskularnim, ili potkožnim putevima davanja. Alternativno, OB polipeptid, pravilno formulisan, može se davati ušmrkavanjem ili oralno. Kon-stantan dovod OB može se obezbediti davanjem jedne terapeutski delotvorne doze (tj. dose koja može izaszvati metaboličke promene kod neke osobe) u potrebnim vremenskim razmacima, na primer dnevno, svakih 12 časova, itd. Ovi će parametri zavisiti od stanja bolesti koja se leči, drugih delatnosti, kao što je modifikacija ishrane, koje se ostvaruju, mase, starosti i pola subjekta, i drugih kriterijuma, a koje stručnjaci mogu lako odrediti prema standardnoj dobroj medicinskoj praksi.
Farmaceutski preparati
Prema još jednom vidu prikazanog pronalaska, ostvareni su farmacetski preparati od navedenih supstanci. Takvi farmaceutski preparati mogu biti za davanje injekcijama ili za oralno, pulmonarno, nazalno ili druge oblike davanja. Opšte uzev, pronalaskom su obuhvaćeni farmaceutski preparati koji sadrže delotvorne količine proteina ili derivatnih proizvoda prema pronalasku, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim razređivačima, konzervansima, pojačivačima rastvorljivosti, emulgatorima, adjuvansima i/ili nosačima. Ovi preparati obuhvataju razređivače različitog sadržaja pufera (na primer, Tris-Hcl, acetat, fosfat) pH i jonske jačine; aditive kao što su detergenti i sredstva za povećanje rastvorljivosti (na primer Tween 80, Polvsorbate 89), antioksidatore (na primer askorbinsku kiselinu, natrijum metabisulfit), konzervanse (na primer Thimersol, benzil alkohol) i pšunioci (na primer laktoza, manitol); ugradnju materijala u čestičaste preparate od polimernih jedinjenja kao što je poli-mlečna kiselina, poliglikolna kiselina, itd., ili u lipozome. Takođe se može koristiti hilauronska kiselina Ovi preparati mogu uticati na fizičko stanje, stabilnost, brzinu ispuštanja in vivo i na brzinu in vivo klirensa proteina i derivata prema pronalasku. Videti, na primer, Martin, Remington's Pharmaceuticai Sciences, 18. izdanje (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) strane 1435-1712, što je ovde uključeno kao literatura. Preparati mogu biti pripremljeni u tečnom obliku, ili mogu biti u vidu suvog praška, kao što je liofilizovan oblik.
Oralno davanje
Predviđeni su za upotrebu čvrsti oralni dozni oblici, koji su uopšteno opisani kod Martin, Remington's Pharmaceuticai Sciences, 18. izdanje (1990, Mack Publi-shing Co, Easton, PA 18042) u poglavlju 89, što je ovde uključeno kao literatura. Čvrsti dozni oblici obuhvataju tablete, kapsule, pilule, pastile ili bombone, pilule sa oblogom ili zrnca. Isto tako se može koristiti lipozomalno ili proteinoidno kapsuiiranje da bi se formulisali ovi preparati (kao, na primer, proteinoiđne mikrosfere prikazane u američkom patentnom spisu br. 4,925,673). Može se koristiti lipozomalno kapsuiiranje a lipozome se mogu deri vatizovati raznim polimerima (na primer američki patentni spis 5,013,556). Opis mogućih čvrstih doznih oblika za lekove dao je Marshall, u Modem Pharmaceutics, glava 10, Banker and Rhodes de., (1979), što je ovde uključenbižo kao literatura. Opšte uzev, formulacija će obuhvatati protein (ili hemijski modifikovan protein) i inertne sastojske koji omogućuju zaštitu protiv želudačne sredine i ispuštanje biološki aktivnog materijala u crevima.
Takođe je posebno razmiŠljano o oralnim doznim oblicima od pomenutog deri vatizo vanog proteina. Protein se može hemijski modifikovati tako da oralno davanje derivata bude efikasno. U celini, rasmatrana hemijska modifikacija je vezivanje bar jedne hemijske supstance za sam molekul proteina (ili peptida), pri čemu ta supstanca omogućuje (a) inhibiciju proteolize, i (b) uvođenje u krvotok iz želuca ili iz creva. Takođe je poželjno ukupno povećanje stabilnosti proteina i povećanje vremeba cirkulacije u telu. Primeri takvih supstanci obuhvataju: polietilen glikol, kopolimere etilen glikola i propilen glikola, karboksimetil celulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon i poliprolin. Abichowski i dr., 1981, kao napred; Newmark i dr., J. Appl. Biochem., 4:185-189 (1982). Drugi polimeri koji se mogu koristiti jesu poli-1,3-dioksolan i poli-l,3,6-tioksokan. Za farmaceutsku primenu su poželjni, kao je napred pomenuto, supstance na bazi polietilen glikola.
Za protein (ili derivat) mesto ispuštanja može biti želudac, tanko crevo (duodenum, jejunum ili ileum) ili debelo crevo. Stručnjak ima na raspolaganju for,ulacije koje se neće rastvoriti u želucu, već će ispustiti materijal u dvanaestoplačanom crevu ili negde drugdeu crevima. Poželjno je da ispuštanje izbegne uništavajuće dejstvo želudačne sredine, bilo zaštitom proteina (ili derivata), bolo ispuštanjem biološki aktivnog materijala iza želudačne sredine, na primer u crevima.
Da bi se obezbedila potpuna zaštita od želuca,, neophodna je obloga od najmanje pH 5,0. Primeri uobijanijih inertnih sastojaka koji se uzimaju kao zaštitne obloge su tnmetilat acetata celuloze (CT), ftalat hidroksi-propilmetilceluloze (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, polivinil acetat ftalat (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, ftalat acetata celuloze (CAP), Eudragit L, Eudragit S i Shellac. Ove se obloge mogu koristiti kao mešani slojevi.
Obloga, ili smeša obloga, koje nisu namenjene za zaštitu od želuca, takođe se mogu koristiti na tabletama. One mogu obuhvatti obloge od šećera, ili obloge koje olakšavaju gutanje tableta. Kapsule mogu tvrde (recimo želatinske) za uzimanje suvog medikamenta, tj. praška, dok se za tečne oblike može koristiti meka želatinska kapsula. Materijal obloge za obložene pilule može biti debeo škrob ili drugi jestivi omotač. Za pilule, pastile, livene tablete i si. mogu se koristiti tehnike vlažnog meŠanja.
Medikament može biti uključen u formulaciju u vidu finih delića u vidu granula ili čestica veličine oko 1 mm. Formulacija materijala za davanje u kapsulama može biti u vidu praška, lako komprimovanih čepova ili čak i tableta. Medikament se može pripremati komprimovanjem.
Takože mogu biti uključena sredstva za bojenje i davanje ukusa: Tako, na primer, protein (ili derivat) može biti formulisan (kapsuliranjem u vidu lipozoma ili mikrosfera) a potom stavljen u neki jjestiv proizvod, kao što je rashlađen sok koji sadrži sredstva za davanje boje i ukusa.
Zapremina medikamenta se može razblažiti ili povećati nekim inertnim materijalo. Razređivači mogu obuhvatati ugljovodonike, naročito manitol, a-laktozu, bezvodnu laktozu, celulozu, saharozu, modifikovane dekstrane i škrob. Takođe se mogu koristiti izvesne neorganske soli kao punioci, uključujući kalcijum trifosfat, magnezijum karbonat i natnjum hlorid. Neki komercijalno dostupni razređivači su Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress i Avicell
U formulaciju mogu u čvrstom doznom obliku biti uključena i sredstva za razlaganje. Materijali koji se koriste kao sredstva za razlaganje, obuhvataju, ali nisu ograničena na isti, škrob uključujući komercijalno dostupno sredstvo za razlaganje na bazi škroba, Explotab. Takođe se mogu koristiti Natrijum škrob glikolat, Amberlite, natrijum karboksimetilceluloza, ultramilopektin, natrijum algmat, želatin, ljuska pomorandže, kisela karboksimetil celuloza, prirodni sunđer i bentonit. Drugi oblici sredstava za razlaganje su nerastvorljive smole za izmenu katjona. Smole u prašku se mogu koristiti kao sredstva za razlaganje i kao veziva, i mogu da obuhvataju smole u prašku kao što su agar, Karava ili tragakant. Alginska kiselina i njena natrijumova so takođe su pogodni kao sredstva za razlaganje.
Mogu se koristitiveziva da drže medikament i ostalo zajedno da bi se obrazovala tvrda tableta i obuhvataju materijale od pneodmh materijala kao što su bagrem,, tragakant, škrob i želatin. Drugi obuhvataju metil celulozu (MC), etil celulozu (EC) i karboksimetil celulozu (CMC). Polivinil pirolidon (PVP) i hidroksipropilmetil celuloza (HPMC) mogu se koristiti u alkoholnim rastvorima za obrazovanje granula medikamenta.
Može biti u formulaciju medikamenta uključeno neko sredstvo protiv tre-nja da bi se sprečilo slepljivame u toku procesa fomulacije. Maziva se mogu kori-stiti u vidu sloja između medikamenta i zida kaluoa, a mogu obuhvatati, ali nisu na njih ograničena, steannsku kiselinu uključujući njenu magnezijumovu i kalci-jumovu so, politetrafluoroetilen (PTFE), tečan parafin, biljna ulja i voskove. Takođe se mogu koristiti tečna maziva kao što je natrijum lauril sulfat, magne-zijum lauril sulfat, polietilen glikol različitih molekulskih masa i Carbowax 4000 i 6000.
Mogu se koristiti sredstva za povećanje tečljivosti za poboljšanje svojstava tečljivosti u toku formulisanja i da pomognu kod premeštanja delova materijala kod komprimovanja. Ta sredstva omu obuhvatati škrob, talk, pirogenski silicijum dioksid i hidratovan silikoaluminat.
Da bi se pospešilo rastvaranje medikamenta u vodenoj sredini, mode se dodati neko površinski aktivno sredstvo kao okvašivač. Površinski aktivna sredstva mogu obuhvatati najonske deterdžente kao što je natrijum lauril sulfat, dioktil natrijum sulfosukcinat i dioktil natrijum sulfonat. Mogu se koristiti katjonski deterdženti i mogu obuhvatati benzalkonijum hlorid ili benzetomijum hlond. Spisak potencijalni nejonskih deterdženata koji se mogu uključiti u formulaciju kao površinski aktivna sredstva, obuhvata lauromakrogol 400, polioksil 40 stearat, polietilen hidrogenovano ricinusovo ulje 10, 50 i 60, glicerol monostearat, polisorbat 40, 60, 65 i 80, estar saharoza masne kiseline, metil celuloza i karboksimetil celuloza. Ova površinski aktivna sredstva mogu biti prisutna kod formulacije proteina ili derivata, bilo sama, bilo ka mešavina u raznim odnosima.
Aditivi koji potencijalno ubrzavaju uzimanje proteina (ili derivata) jesu, na primer, masne kiseline, oleinska kiselina, linolna kiselina i linolenska kiselina.
Može biti poželjno regulisano ispuštanje formulacije. Lek treba da bude ugrađen u inertnu matricu koja omogućuje ispuštanje bilo difuzijom bilo mehanizmom luženja, tj. smolama. Isto tako se u formulaciju može uključiti matrica koja se lagano degeneriše. Drugi jedan oblik regulisanog ispuštanja ovog medikamenta je po postupku zasnovanom na Oros terapeutskom sistemu (Alza Corp), tj. lek je zatvoren u jednu polupropustljivu membranu koja dozvoljava da ulazi voda i istiskuje lek kroz jedan jedini mali otvor usled osmotskog dejstva. Neke obloge za zaštitu od želudačnog soka takođe imaju svojstvo odloženog ispuštanja.
Mogu se koristit i druge obloge za formulaciju. One obuhvataju razne šećere koji se mogu naneti u posudi za oblaganje. Terapeutski agens isto tako može biti dat u
tableti sa tankim slojem obloge. Materijali koji se pri tome koriste podeljeni su na 2 grupe. U prvoj su materijali koji nisu otporni naželudačni sok i obuhvataju metil celulozu, etil celulozu, hidroksietil celulozu, metilhidroksipetil celulozu, hidroksipropil celulozu, hidroksipropil-metil celulozu, natrijum karboksi-metil celulozu, providon i polietilen glikole. Druga se grupa sastoji od enteričkih (otpornih na želudačni sok) materijala koji su obično estri ftalne kiseline.
Može se koristiti mešavina materijala da bi se ostvarila optimalna slojevita obloga. Oblaganje tankim slojem, filmom, može se izvesti u loncu za oblaganje ili u nekom fluidiziranom sloju ili oblaganjem pod pritiskom.
Davanje inhaliranjem (preko pluća)
Takođe je rasmotreno pulmonarno (inhaliranjem) davanje proteina (ili njegovog derivata). Protein (ili derivat) se dostavlja u pluća sisara pri udisanju i prolazi kroz epitelnu oblogu pluća u krvotok. Druga saopštenja o tome obuhvataju: Adjel i dr., Pharmaceuticai Research, 7(6):565-569 (1990): Adjel i dr., International Journal of Pharmaceutics, 63:135-144 (1990) (leuprolid acetat); Braquet i dr., Journal of Cardiovascular Pharmacologv, 13(suppl. 5): 143-146 (1989) (endothelin-1); Hubbard i dr., Annals of Internal Medicine, 3(3):206-212 (1989) (al-antitnpsin); Smith i dr., J Clin. Invest., 84:1145-1146 (1989) (al-proteinaza); Osvvein i dr., "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Svmposium in Respiratory Drug Delivery II, Kevstone, Colorado (mart 1990) (rekombinantni humani hormon rasta); Debs i dr., J. Immunol., 140:3482-3488 (1988) i Platz i dr., U.S. Patent No. 5,284,656 (faktor stimulisanja granulocitne kolonije). Za praktično izvođenje ovog pronalaska rasmatrana je primena široke lepeze mehaničkih naprava projektvana za davanje medikamenata inhaliranjem, uključujući, ali bez ograničenja na iste, fine rasprsivače,, inhalatore sa merenim dozama, i inhalatore sa praškom, koji su svi poznati stručnjacima iz ove oblasti.
Neki specifični primeri komercijalno dostupnih naprava za praktično izvođenje ovog pronalaska jesu Ultraven raspršivač, proizvodnje Malhnckrodt, Inc., St. Louis, Missoun; Acorn II raspršivač, proizvodi Marquest Medical Products, Englewood, Coloradi; Ventolid inhalator sa merenom dozom, proizvodi Glaxo Inc., Research Tnangle Park, North Čarobna, i Spinhaler, inhalator sa praškom, proizvodi Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.
Sve ove naprave zahtevaju primenu formučacija pogodnih za ispuštanje proteina (ili derivata). Obično je svaka formulacija specifična za vrsteu korišćene naprave i može zahtevati primenu jednog odgovarajućeg pogonskog materijala, pšored uobičajenih razredivača, adjuvansa i/ili nosača korisnih u terapiji. Takođe dolazi u obzir primena lipozoma, mikrokapsula ili mikrosfera, inkluzionili kompleksa, ili drugih vrsta nosača. Hemijski modifikovan protem se takođe može pripremiti u različitim formulacijama u zavisnosti od vrste hemijske modifikacije ili vrste korišćene naprave.
Formulacije pogodne za upotrbu sa nekim raspršivačem, vilo mlaznim, bilo ultrazvučnim, tipično će sadržati protein (ih derivat) rastvoren u vodi u koncentraciji od oko 0,1 do 25 mg biloški aktivnog proteina po ml rastvora. Formulacija može takođe da obuhvata jedan pufer i neki jednostava šećer (na primer za stabilizaciju proteina i regulisanje osmotskog pritiska). Formulacija za raspršivač može takođe sadržati neko površinski aktivno sredstvo, da bi se smanjila ili sprečila površinskim naponom izazvana agregacija proteina izazvana raspršivanjem rastvora kod obrazovanja aerosola.
Formulacije za primenu kod inhalatora sa merenim dozama obično sadrže jedan fino isitnjen prašak koji sadrži protein ili (derivat) suspendovan u nekom pogonskom sredstvu uz pomoć nekog površinski aktivnog sredstva. To pogonsko sredstvo može biti svaki konvencionalni materijal koji se koristi u tu svrhu, kao što je hlorofluorougljenik, hidrohlorofluiorougljenik, hidrofluoro-ugljemk, ili neki ugljovodonik, uključujući tnhlorofluorometan, dihlorfluoro-metan, dihlorotetrafluorometanol i 1,1,1,2-tetrafluoroetan, ili njihovu kombina-ciju. Pogodna površinski aktivna sredstva obuhvataju sorbitan trioleat i soja leci-tin. Oleinska kiselina takođe može biti korisna kao površinski aktivno sredstvo.
Formulacije za ispuštanje iz inhalatora sa praškom ibuhvataju fino isitnjen suvi prašak koji sadrži protein (ili derivat) i takođe mogu sadržatu neki punilac, kao što je laktoza, sorbitol, saharoza ili manitol, u količinama koje olakšavaju dispergovanje praška iz naprave, na primer 50 do 90% mas. formulacije. Najpogodnije je da protein (ili derivat) bude pripremljen u vidu čestica prosečne veličine manje od 10 pm (ili mikrona), najpogodnije 0,5 do 5 pm, da bi se ostvarilo najefikasnije dopremanje do pluća.
Davanje ušmrkavanjem (nazalno davanje)
Takođe je rasmatrano davanje proteina ili derivata nazalno - ušmrka-vanjem. Ušmrkavanje omogućuje prolaz proteina do krvotoka neposredno posle davanja medikamenta u nos, bez potrebe za unošenje proizvoda u pluća. Formulacije za ušmrkavanje obuhvataju one sa dekstranom ili ciklodekstranom.
Postupci lečenja, postupci pripremanja medikamenta
Prema još jednom vidu prikazanog pronalaska, dati su postupci za lečenje i za proizvodnju medikamenta. Stanja koja se ublažuju ili modulišu davanjem pomenutih derivata jesu ona koja su ranije ukazana.
Doziranje
Za sve pomenute molekule, kako se budu nastavila dalja proučavanja, pojaviće se informacije koje se odnose na odgovarajuće nivoe doziranja za razna stanja kod raznih pacijenata, pa će običan kvalifikovan radnika, uzimajući u obzir terapeutski kontekst, starost i opšte zdravstveno stanje primaoca, moćiće odrditi pravilnu dozu. Opšte uzev, za davanje injekcijama ili infuzuju, doziranje će biti između 0,01 u.g biološki aktivnog proteina/kg telesne mase (računajući samo masu proteina, bez hemijske modifikacije) i 10 mg/kg (bazirano na istom) Raspored doziranja može se menjati, u zavisnosti od cirkulacionog poluživota korišćenog proteina ili derivata, da li je polipeptid dat u vidu jednokratne doze ili kontinualnom infuzijom, i korišćene formulacije.
Davanje sa drugim jedinjenjima
Za lečenjepovezano sa gojaznošću, mogu se davati navedeni proteini (ili derivati) zajedno sa jednim ili više farmaceutskih preparata koji se koriste za lečenje drugih kliničkih komplikacija od gojaznosti, kao špto su oni koji se koriste za lečenje diabetesa (na primer insulin), visokog krvnog pritiska, povećanog holesterola, i drugih nepovoljnih stanja koja se posledica gojaznosti. Takođe se mogu istovremeno davati i druga sredstva za suzbijanje apetita, na primer amfetamini. Davanje može biti istovremeno (naprimer davanjem mešavine pomenutih proteina i insulina) ili može biti jedno za drugim.
Lečenje na bazi nukleinskih kiselina
OB gen treba da bude unet u humane masne ćelije da bi se razvila genska terapija protiv gojaznosti. Od takve se terapije očekuje da smanji telesnu masu. Ili suprotno, unošenjem protivsmislenih proizvoda u humane masne ćelije sniziće se nivoi aktivnog OB polipeptida i predviđa se da će to povećati masu tela.
Kod jednog izvođenja, jedan gen koji kodira UB polipeptid, unosi se in vivo u jedan virusni vektor. Takvi vektori sadrže jedan prigušen ili defektan DNK virus, kao što je, ali ne i ograničen na iste, herpes simpleks virus (HSV), virus bradavica, Epstain Barr virus (EBV), adenovirus, adeno-povezan virus (AAV), i slični. Poželjniji su defektni virusi, koji su potpuno, ili skoro potpuno, bez virusnih gena. Defektni virus nije infektivan nakon unošenja u ćeliju. Primena defektnog virusnog vektora omogućuje delovanje na ćelije u specifičnim, lokalizovanim područjima, bez straha da bi vektor mogao zaraziti druge ćelije. Na taj se načim može specifično usmeravati na adipozno tkivo. Primeri posebnih vektora obuhvataju, ah' nisu na iste ograničeni defektni vektor herpes virusa 1 (HSVl) [Kaplitt i dr., Molec. Cell. Neurosci., 2:320-330 (1991)], jedan prigušen adenovirusni vektor, kao što je vektor koji su opisali Stratford-Perrcaudet i dr., J. Chn. Invest., 90:626-630 (1992), i jedan defektni vektor adeno-povezanog virusa [Samulski i dr., J. Virol., 61:3096-3101 (1987); Samulski i dr., J. Virol., 63:3822-3828 (1989)].
Kod jednog drugog izvođenja, gen se može uneti u jedan retrovirusni vektor, kako su opisali Anderson i dr., U.S. Patent No. 5,399,346; Mann i dr., Cell, 38:183
(1983); Temm i dr., U.S. Patent No. 4,650,746; Temin i dr., U.S. Patent No. 4.980,289; Markovvitz i dr., J. Virol., 62:1120 (1988), Temin i dr., U.S. Patent No 5,124,263; International Patent Publication No. WO 95/07358, objavljena 16 marta 1995, Dougherty i dr ; i Kuo i dr., Blood, 82:845 (1993).
Alternativno, vektor se može unetiin vivolipofekcijom (ubrizgavanjem lipozoma). Tokom poslednjih deset godina povećavala se primena lipozoma za kapsuiiranje i ubrizgavanje nukleinskih kiselinain vitro.Sintetički katjonski lipidi, projektovani da ograniče teškoće i opasnosti koje se sreću kod ubrizgavanja nukleinskih kiselina posredovanih lipozomima, mogu se koristiti za pripremanje lipozoma za ubrizgavanjein vivogena koji kodira jedan marker [Felgner i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-74417 (1987), videti Mackey i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8027-8031 (1988)]. Primena katjonskih lipida može proizvesti kapsuiiranje negativno naelektrisanih nukleinskih kiselina, a takođe i proizvesti pripajanje sa negativno naelektrisanom ćelijskom membra-nom [Felgner i dr., Science, 337:387-388 (1989)]. Primena ubrizgavanja lipozoma za unošenje egzogenih gena u specifične organein vivoima izvesne praktične prednosti. Molekulsko usmeravanje lipozoma na specifične ćelije predstavlja jedno korisno područje. Jasno je da će usmeravanje ubrizgavanja nukleinske kiseline na poseban tip ćelija biti posebno pogodno kod tkiva sa ćelijskom heterogenošću, kao kod pankreasa, jetre, bubrega i mozga. Lipidi se mogu hemijski povezati sa drugim molekulima u cilju usmeravama (videti Mackey i dr., 1988, napred citiran). Usmereni peptidi, na primer hormoni i neurotransmiteri, i proteini kao što su antitela, ili nepeptidni molekuli mogu se hemijski priključiti lipozomima.
Takođe se može uneti vektor in vivo kao ogoljen DNK plazmid. Ogoljeni DNK vektori za gensku terapiju mogu se uneti u željenu ćeliju domaćina pozna-tim metodama, na primer ubrizgavanjem nukleinskih kiselina, elektroporacijom. mikroubrizgavanjem, transdukcijom, ćelijskim pripajanjem, DEAE dekstranom, precipitacijom kaicijum fosfata, korišćenjem genskog pištolja, ili korišćenjem jednog transportera DNK vektora (videti, na primer, Wu i dr., J. Biol. Chem., 267:963-967
(1992); Wu i dr., J. Biol. Chem., 263:14621-14624 (1988), Hartmut i dr., Kanadska patentna prijava br. 2,012,311, podneta 15. marta 1990).
Primene u poljoprivredi
OBgen se takođe može izolovati od domaćih životinja i tako dobiti odgovarajući OB polipeptid. Kod jednog specifičnog, kasnije datog, primera uzorak izveden iz mišjegOBgena hibridizuje na odgovarajuće homologne kodne sekvence od velikog broja životinjski vrsta. Kao i kada je reČ o humanoj terapiji, rekombinantni proteini se takođe mogu pripremati i davati domaćim životinjama. Davanje polipetida može se koristiti da se dobiju manje masne životinje za ishranu, recimo mesna goveda, svinje, živibam ovce itd. Pogodno je da se daje autologni OB polipeptid, mada pronalazak rasmatra i davanje anti-autolognog polipeptida. Pošto se OB polipeptid sastoji od približno ostataka 160 amino kiselina, on ne mora biti vrlo tmunogeničan. Zbog toga davanja neautolognog polipeptida može da ne dovede do imunskog reagovanja.
Alternativno, unošenje kloniranih gena u mutirane domaće živptinje omogućiće da se potencijalno poveća telesna masa i ugojenost preteranim izražavanjem jednogOBtrangena. Najjednostavniji način da se to postigne, bilo bi usmeravanje jednogOBtransgena na mast, koristeći njegov sopstven ili neki drugi na mast specifičan promotor.
Nasuprot tome, povećanje masti u telo može biti poželjno u nekim okolnostima za dobijanje soepijaliteta (tzv. Kobe govedina) ili debele jetre za jetrenu paštetu. To se može ostvariti usmeravanjem jednog protivsmislenog OB transgena na mast, ili koristeći tzv. "gensku nokaut" tehniku. Alternativno, kada je poželjno povećanje telesne mase u procentima masti, može se dati neki inhibitor ili antagonist OB polipeptida. Takvi inhibiton ili antagonisti obuhvataju, ali nisu ograničeni na site, antitela koja reaguju sa polipeptidom, i fragmente polipeptida koji se vezuju za OB receptor ali ga ne aktiviraju, tj, antagonisti OB polipeptida.
Kozmetičke implikacije
OB polipetid ima značjnu vrednost za kozmetičku primenu, pored zdravstvenih pogodnosti. Posebno, kako su OB polipeptidi prema pronalasku, uključujući njihove derivate i analoge za podržavanje, pogodni za modulisanje brzine i koločine naslaga masnih ćelija u nekoj životinji, korisni su za uklanjanje ružnog masnog tkiva, na primer naslaga masti u abdomenu, bokovima, butinama, vratu i podbratku, koje ne moraju obavezno da dostignu do stanja gojaznosti, ali koje u svakom sluČajui nepovoljno utiču na izgled neke osobe. Smatra se da se smanjenje masi ostvaruje, delom, smanjenjem apetita, tj. smanjenjem uzimanja hrane, povećanjem bazalnog metabolizma, i jednim i drugim. Na taj način je prikazani polipeptid, ili njegovi derivati ili agonist, koristan za davanje jednom subjektu da bi se ostvarile kozmetičke promene naslaga masnog tkiva, bilo modulisanjem naslaga masti, smanjenjem apetita, ili jednim i drugim.
Pored toga, prikazana jedinjenja i postupci mogu se koristiti uajedno sa raznim postupcima kao što je kozmetička hirurgija nemenjena da promeni opšti izgled tela (na primer isisavanje masnog tkiva ili laserska hirurgija,predviđeni zza smanjenje telesne mase usisavanjem ili skidanjem masnog tkiva), vežbanje (naročito trčanje i dizanje tereta), ishrana sa malo masnoća, hipnoza, biološka povratna sprega, što predstavlja primere načina na koji se može pokušati smanjiti procenat masnog rkiva i poboljša izgled tela.
Prema tome, prikazani pronalazak se odnosi na postupak za vršenje kozmetičke modulacije masnog tkiva kod pojedinaca, koji obuihvata davanje OB polipeptida u količini za modulisanje masnoće, ili njegovog derivata ili analoga, pojedincu koji želi modulisanje masnog tkiva da bi popravio ukupan izgled tela. Prema jednom svom posebnom vidu, modulacija masnog tkiva je posledica suzbijanja apetita, Poželjno je da je modulacija masnog tkiva smanjenje masnog tkiva.
Kod jednog sledećeg izvođenja, pronalazak se odnosi na postupak za izvođenje kozmetičkog uklanjanja masnog tkiva, koji obuhvata kombinovanje jednog postupka za promenu izgleda tela sa davanjem jedne količine OB polipeptida, ili njegovog derivata ili analoga, u količini koja vrši modulisanje nasnoće, pojedincu koji želi kozmetičko modulisanje masnog tkiva da bi popravio opšti izgled tela.
OB receptor
Razvoj malomolekulskih agonista i antagonisat OB faktora bio bi znatno olakšan izdvajanjem njegovog receptora. To se može ostvariti pripremanjem aktivnog OB poliopeptida i njegovim korišćenjem za pretraživanje jedne EXPRESSION LIBRARY koristeći standardnu metodologiju. Vezivanje receptora u EXPRESSION LIBRARY može se ispitati davanjem rekombinantnog poliopeptida pripremljenog koristeći bilo bakterijske, bilo od sisara, vektore izražavanja i posmatranja dejstva kratkotrajnog i kontinualno davanja tekombinantnog polipeptida na ćelije EXPRESSION LIBRARYm ili neposrednim otkrivanjem vezivanja OB polipeptida za ćelije.
Kako se zasada veruje da je OB receptor verovatno smešten u hipotalamusu i možda u jetri, poželjno je da se cDNK LIBRARIES iz tih tkiva kontruišu u standardnim vektorima kloniranja izražavanja. Ovi cDNK kloni će se potom unositi u COS ćelije kao kombinacije u dobijeni transformanti će biti pretraživani aktivnim ligandom da bi se identifikovale COS ćelije koje izražavaju OB receptor. Potom se mogu izdvojiti pozitivni kloni da bi se dobio kloniran receptor. Kloniran receptor će se koristiti zajedno sa OB ligandom (pod pretpostavkom daje on hormon) sa bi se razvile potrebne komponente za pretraživanje malomolekulskih modulatora OB-a.
Jedan poseban istem ispitivanja koji treba da se koristi prema ovom pronalaskui, poznat je kao receptorsko ispitivanje. Kod receptorskog ispitivanja, materijal koji se ispituje označava se na pogodan način, pa se potom izvesne ćelijske opitne kolonije inokuliraju jednom količinom i označenog i neoznačenog materijala, posle čega se vrše istraživanja vezivanja, da bi se utvrdilo u kojoj se meri označeni materijal vezuje za ćelijski receptor. Na taj se način mogu utvrditi razlike u afinitetu između materijala.
Prema ovome se jedna prečišćena količina modulatora mase može označiti radioaktivnim materijalom i kombinovati, na primer antitelima ili njegovim drugim inhibitorima, posle čega će se vršiti proučavanja vezivanja. Pripremaće se rastvori koji sadrže različite količine obeleđenog i neobeleženog nekombinovanog modulatora telesne mase, posle čega će uzorci ćelija biti kontamirani a zatim inkubirani. Dobijeni ćelijski monoslojevi se potom ispiraju, rastvaraju i potom broje u jednom gama brojaču u pogledu dužine vremena dovoljne da da se dobije standardna gređka od <5%. Ti se podaci potom podvrgavaju Scatchard-ovoj analizi posle čega se mogu izvući zapažanja i zaključci u pogledu aktivnosti materijala. Iako je sve ovo rečeno samo primer, pokazuje način na koji se može izvršiti i upotrebiti receptorsko ispitivanje u slučaju kada sposobnost ispitivanog materijala da se veže za ćelije može služiti kao karakteristika za razlikovanje. S druge strane, receptorsko ispitivanje će biti posebno korisno kod prepoznavanja receptora specifičnih za prikazane modulatore, kao što jedbreceptor.
Sledeće ispitivanje koje je korisno i rasmotreno u vezi sa ovim pronalasko, poznato je kao "cis-trans" test. Ukratko, to ispitivanje koristi dva genetska proizvoda, od kojih je jedan tipičan plazmid koji kontinualno izražava jedan određeni receptor koji je interesantan kad se unese u jednu odgovarajuću ćelijsku liniju, dok je drugi jedan plazmid koji izražava jedan "reporter" kao što je luciferaza, pod kontrolom receptor/ligand kompleksa. Tako, na primer, ako se želi da se oceni neko jedinjenje kao ligand za jedan određeni receptor, jedan od plazmida će biti proizvod koji dovodi do izražavanja receptora u izabranoj ćelijskoj liniji, dok će drugi plazmid imati jedan promotor vezan za gen luciferaze u koji je umetnut element koji reaguje na određeni receptor. Ako je jedinjenje koje se ispituje pojačivač, odnosno agonist, receptora, ligand će načiniti kompleh sa receptorom, i taj će kompleks vezati element za reagovanje i inicirati transkripciju gena luciferaze. Dobij ena hemiluminescencija se potom meri fotometrijske, a dobijene krive u reagovanja na dozu porede se sa onima za poznate ligande. Ovaj protokol je detaljno opisan u U.S. patentu br. 4,981,784 i u PCT International Publication No. VVO 88/03168, na koje se stručnjak upućuje.
Proteinska sekvenca može biti definisana analzom hidrofiličnosti (na primer Hopp i drugi, napred navedeno). Može se koristiti profil hidrofiličnosti da bi se identifikovala hidrofobna i hidrofilna područjja OB receptorskog proteina, koja mogu ukazati na vancitoplazmička i intracitoplazmička područja i područja vezivanja membrane.
Sekundarna strukturna analiza (na primer Chou i dr., 1974, napred navedeno) može se takože izvoditi da bi se odredila područja OB receptora koja imaju specifične sekundarne strukrure.
Mampulisanje, translacija i predviđanje sekundarnih struktura, kao i predviđanje otvorenog okvira očitavanja i izrada dijagrana, mogu se izvoditi korišćenjem računarskih programa koji su na raspolaganju za ovu oblast.
Obezbeđivanjem obilnog izvora rekombinantnog OB polipeptida, i mogućnošću da se izdvoji OB receptor (tj. proizvoddbgena), prikazani pronalazak omogućuje kvantitativno sktrukturno određivanje aktivne konformacije OB polipeptida i OB receptora, ili njihovih područja. Posebno, obezbeđeno je dovoljno materijala za spektroskopske analize, kao što su nuklearna magnetska rezonanca (NMR), infracrvenim zracima (IR), Raman-ova, ultraljubičastim zracima (UV), a posebno pomoću cirkularnog dihroizma (CD). Posebno NMR omogućuje veoma moćnu strukturnu analizu molekula u rastvoru, koji koji je bliži njihovoj prirodnoj sredini (Marion i dr., 1983; Bar i dr. 1985; KImura i dr., 198= ranije navedeni). Mogu se koristiti i druge metode strukturne analize. One obuhvataju, mada nisu na nju ograničene, rendgensku kristal ografij u (navedeni Engstom, 1974),
Pogodnije je to, što se mogu proučavati ko-knstali OB polipeptida i OB receptora. Analiza ko-knstala daje detaljnu informaciju o vezivanju, što omogućuje racionalno projektovanje agonista i antagonista liganada. Takođe se može koristiti i računarsko modelovanje u vezi sa NMR ili rendgenskim metodama [Fletterick i dr., urednici, Computer Graphicks and Molecular Modeling, u Current Communications in Molecular Biologv, Cold Spring Harbor Laboratorv, Cold Spring Harbor, New York
(1986)].
Identifikacija i izdvajanje gena koji kodira OB receptor prema pronalasku, obezbeđuje izražavanje receptora u količinama većim od onih koje se mogu izdvojiti iz prirodnih izvora, ili u indikatorskim ćelijama koje su posebno projektovane da ukažu na delovanje jednog receptora izraženog nakon transfekcije ili transformacije ćelija. S tim u skladu, pored racionalnog projektovanja agonista i antagonista zasnovanih na strukturi OB polipeptida, prikazani pronalazak rasmatra jedan alternativni postupak za identifikovanje specifičnih liganada OB receptora koristeći razne testove za pretraživanje poznate u struci.
Pronalazak će se bolje shvatiti sa pozivom na sledeće primere, koji su dati da prikažu primere pronalaska, a ne da ga ograničavaju.
PRIMERI
U sledećem je ukratko prikazan postupak koji se koristi da se identifikuje genetski materijal koji je tipičan za ovaj pronalazak. Ovaj postupak obuhvata čeiti stupnja koji se odvijaju jedan za drugim: A) genetsko mapiranje, B) fizičko mapiranje, C) izdvajanje CANDIDATE gena i D) otkrivanje mutacije. Nakod potvrde da je mišji gen u pitanju izdvojen (stupanj D), tražen je homologni humani gen, pa su i mišji i humani gen i pretpostavljeni proteini bili definisani. Ovi su stupnjevi detaljnije prikazani u sledećem tekstu.
A. Genetsko mapiranje
ob mutacije su bile izdvojene u genetskim ukrštanjima, pa je korišćena standardna analiza vezivanja da bi se odredile mutacije u odnosu na RFLPs (polimorfizmi dužine restrikcionih fragmenata). Ovi su podaci postavili OB gene u ledan intervala od približno 5cM na proksimalnom mišjem hromozomu 6. (5cM je meta genetskog rastojanja koja odgovara iznosu od 5 uočljivih genetski ukrštanja na 100 životinja). Ukupno je generisano 771 informativna mejoza i korišćena za potonje genetsko mapiranje (napred pomenuti Friedman i dr., 1991) Genetski lokusi koji su mapirani u odnosu na OB svi su bili ranije objavljeni. Dva najbliža opisana RFLPs bila su defmisana uzorcima izvednim iz karboksipeptidaze i met onkogemh gena.
Genetska rezolucija napred opisanih eksperimenata ije bila dovoljna da bi se kloniraoob,prvenstveno stoga, što ni jedan od primenjenjih genetskih markera nije bio u čvrstoj vezi. Da bi se identifikovali traženi čvrsto vezani RFLPs, izdvojeni su dodatni uzorci i genetsko ukrštanje je prošireno. Postupak poznat kao hromozomna mikrodisekcija korišćen je da se izdvoje slobodni komadi DNK od proksimalnog mišjeg hromozoma 6 [Baharv i dr., Mammalian Genome, 4:511-515 (1993)]. Pojedinačni klonirani uzorci su ispitivani u pogledu čvrstog vezivanja zaob.Na osnovu ovih proučavanja, jedan uzorak, D6Rckl3, nazvan i psd3, izabran je za dalje analize zbog njegove genetske bliziniOB-\ x.Ovaj je uzorak korišćen da se genotipski 'odredi 853 ob potoma interspecifičnih i intersubspecifičnih ukrštanja, što je ukazalo da je D6Rckl3 nerekombinantan kod sveih 835 životinja, kako su izvestili Baharv i dr. U toku fizičkog mapiranja, defimsan je jedan novi polimorfni marker iz jednog COSMID subklona izvedenog iz YAC 53A6. Taj novi marker nalazio se između D6Rckl3 i OB gena i korišćen je za genotipsko određivanje 771 informativne mejoze od lntraspecifiČnih ukrštanja i povratnih ukrštanjaNađena je samo jedna jedina životinja, #167, kod koje je utvrđeno da ima rekombinantno ukrštanje između ob i D6Rcj39. Ova su istraživanja ukazala je D6Rck39/D6RcK13 oko 0m06 cM odob.Identifikovan je dodatan uzorakPax4,za koji je utvrđeno da je 0,12 cM odob. Pax4je bio rekombinantan kod dve životinje, #111 i #420.Pax4je pseudogen koji prethodno mapiran kod proksimalnog mišjeg hromozoma 6 od strane Gruss-a i saradnika [Gruss i dr., Genomics, 11:424-434 (1991)]. Na bazi toga, utvrđeno je da seOBgennalazi u intervalu od oko 0,2cM izmeđuPax4i D6Rckl3. To je dovelo do pokušaja da se klonira umetnuta DNK u težnji da se izolujeOB.
B. Fizičko mapiranje
Kloniranje DNK u tom intervalu uvelo je u upotrebu veštačke hromozome kvasca (YACs - vest artificial chromosomes), relativno nov vektor kloniranja koji omogućuje kloniranje dugih odsečaka contiguozne DNK, često dužine veće od milion baznih parova.
Veštački hromozomi kvasca izdvojeni su korišćenjem D6Rckl3 i Pax4. To je izvedeno pripremanjem prečišćenih uzoraka DNK i njihovim korišćenjem za izdvajanje odgovarajućih YAC-ova. Ovi Yac-ovi (#8, #16, #107 i #24) bili su izdvojeni i početno definisam, a na bazi ostvarenih analiza zaključeno je da je YAC 16 onaj YAC koji se najdalje distalno pruža, tj. najbliže doob.Ključni kraj YAC#16 je potom izdvojen i utvrđeno je da je bio bliži doobnegoPax4.Taj je kraj označen 16M(+). Ovo je zaključeno pošto se pokazalo da taj uzorak nije bio rekombinantan kod životinje #420 (kao što je bioPax4).Taj je kraj sekvenciran i korišćen da se razvije jedno PCR ispitivanje. To PCR ispitivanje je korišćeno da se pretraži jedna YAC LIBRARY. Izolovana su četiri pozitivna klona. Potonjim definisanjem ovih YAC-ova izdvajanjem krajeva, restricionim mapiranjem, gel elktroforezom sa pulzirajućim poljem, Southern razmazima sa genetskim ukrštanjima, utvrđeno je da su dva od tih YAC-ova,aduiaad,kritična za sledeća proučavanja YACaadjc jedan550 kB nehimerni YAC koji se distalno najdalje pružao. Zbog toga je distalni kraj ovog YAC-a,aad( plCL)korišćen da se upotpuni fizička mapa. YACaduje 370 kb nehimerni YAC i utvrđeno je da je njegov distalni kraj,adu(+)nerekombinantan kod svihobpotomaka genetskih ukrštanja, uključujući šivotinje #111 i #167, što nagoveŠtava da bi seOBgen mogao nalaziti u tom YAC-u.
Razvijen je jedan PCR test za ova dva kraja,aad( p\ CL)iadu(+),i korišćen za dobijanje više YAC i Pl klonova da bi se nastavilo fizičko mapiranje. Važni Pl kloni izdvojeni kod ovog pokušaja obuhavatli su 498, 499, 500 (izdvojene koristeći uzorak izveden odaad( plCL))i 322, 323 i 324 (koristeći uzorak odadu(+)).
U međuvremenu su definisani YAC-ovi izdvojeni pomoću D6Rckl3 (53A6, 25A8, 25A9, 25A10). Ova su istraživanja utvrdila da se 53A6 proksimalno pruža najdalje premaaadYAC. Utvrđeno je daje veličina razmaka između 53 A6 iaadoko 70 kB. Ključni kraj od 53A6, 53(pICL) korišćen je za pretraživanje tri raspoložive LIBRARIES YAC-ova i jedne Pl LIBRARY. Izdvojen je jedan kritičan Pl klon. Taj se Pl klon preklapao sa Pl klonima izdvojenim pomoćuaad( plCL)kako je napred opisano, pa je tako služio da zatvori procep između 53(pICL) iaad( plCL).Pažljivim mapiranjem mesta rekombinovanja zapaženih kod životinja #111 i #167, zaključeno je dajeOBsmešten u jednom intervalu veličine 400 kB. Da bi se obezbedio radni izvor DNK za izdvajanjeOBgena, izdvojeno je oko 500 kB koji pokrivaju to nerekombinantno područje u ukupno 24 Pl klona. Ovi Pl klonovi, uključujući 322 i 323, za koje je kasnije utvrđeno da su korisni klonovi, korišćeni su za hvatanje egzona.
Fizička mapa dela hromozoma koji nosi OB prikazana je na slici 7A. Slika 7B predstavlja YAC CONTIG. Slika 7C predstavlja Pl CONTIG.
C. Izdvajanje izglednih gena
Postupak korišćen za izdvajanje gena u tom intervalu bio je hvatanje egzona. Taj postupak je koristio jedan komercijalni vektor za identifikacuju egzonske DNK (tj, kodne sekvence) biranjem sekvenici primaoca i davaoca kod spajanja u genomskoj DNK unetoj u jedan opitim CONSTRUCT. DNK iz tih Pl klona kajene su i porklonirane u vektor za hvatanje egzona. Ti se klonovi bili kratki umeci klonirani u jedan Bluescript vektor. Svaki od klonova ne PCR-pojačavan PCR osnovima koji odgovaraju plazmidnim sekvencama koje ograničavaju umetak. PCR-pojačavanje je vršeno neposredno na bakenjama koje su nosile plazmid. Reakcije su pokrenute koristeći jedan BIOMEK robot. Proizvodi PCR su podvrgnuti elektroforezi u 1% agaroznom gelu u TBE puferu koji je sadržao etidijum bromid. Tehnika hvatanja egzona je modifikovana da bi se otklonilo zagađivanje DNK E. koli iz Pl klonova, i da se pretraživanjem ukloni velika količina veštačkih egzona, koji prelaze 60-90% verovatno uhvaćenih egzona. Vektor hvatanja egzona obuhvata HIV sekvence; kratak segment ovih sekvenci vektora odgovara ovom proizvodu.
Eksperiment hvatanja egzona izveden je koristeći razne P1 klonove. Proizvodi hvatanja egzona potom su pojačani PCR-om, birani i sekvencirani. Sekvence pretpostavljenih "egzona" su poređene sa onima u Genbank-u koristeći računarski program Blast. Oko petnaest egzona je odabrano za dalje ispitivanje pomoću RT-PCR, Northern analize i zoo-razmaza prisustva odgovarajuće DNK ili konzervativnih sekvenci. Nađeno je da sedam od 15 pretpostavljenih egzona, 325-2, 323-9, D1-F7, 1H3 i 2G7 kodiraju jedan transkript RNK, 325-2 je testis-specifičan gene; 323-8 i 323-9 su verovatno dva egzona istog gena izraženog uglavnom u mozgu i bubregu, 1H3 i 322-5 predstavljaju dva transkripta mozga niskog nivoa. D1-F7 je jedan egzon iz jednog prethodno kloniranog gena, inosin monofosfat dehidrogenaze (IMPDH) koja ima sveprisutnu šemu izražavanja. Nijedan od ovih egzona nije kodiraoOB.2G7, koji jeOBegzon, biće kasnije rasmatran.
Posle tri neuspela pokušaja da se hvatanjem egzona dobijeOBgen, načinjen je sledeći pokušaj sakupljanjem DNK svih Pl iz kritičnogOBpodručja Obuhvaćeni su sledeći Pl: 258, 259, 322, 323, 324, 325, 498, 499, 500, 653, 654 i drugi. Potom su Pl kloni 258, 260, 322, 498 i 499 potklonirani u jedan vektor za hvatanje egzona, pa je zatim pripremljeno nekoliko pločica sa bakterijskim klonovima od kojih je svaki imao po jedan pozitivan egzon, Dobijeno je 192 klona koji su predstavljali pretpostavljene kandidate za OB. Kako je napred napomenuto, zapaženo je da mnogi od uzoraka sadrže po dva uhvaćena egzova izvedena iz vektora. Tako su kloni identifikovani i po svojoj veličini i po činjenici da je hibridizacija uzoraka DNK koji odgovaraju ovom veštačkom proizvodu hibridizovala na odgovarajućim trakama jednog Sothern razmaza gela. Na taj način je iz daljeg ocenjivanja ieključeno 185 od 192 klona. Isključivanje istih samo na osnovu njihove veličine nije bilo moguće, jer je to, u krajnjoj liniji, moglo dovesti do isključivanja egzona koji odgovarajuOB.
Na taj način je od 192 egzona izabrano ukupno sedam egzona za dalja istraživanja. Preipremljeni su kalupi za sekvenciranje sedam egzona i izvršeno je sekvenciranje. Potom su analizirane sekvence za sedam egzona i utvrđeno je da je sedam bilo identičnih a da je jedan očigledno veštački proizvod. Posebno je klon 1D12 sadržao "HIV sekvencu", tj. traku veštačkog proizvoda. To je ostavilo tri egzona za dalju analizu: 1F1, 2G7 i 1H3. 1FI je isključen jer je mapiran van kritičnog područja.
Izabrani su i sintetizovani PCR osnovi i za 1H3 i za 2G7
Određena je sekvenca za egzon na 2G7, a prikazana je na slici 10 (SEQ ID NO:7). Izabrani su i sintetizovani PCR osnovi za 2G7. Delovi sekvence koji odgovaraju PCR osnovima su podvučeni. Korišćeni su sledeći osnovi:
Ovi su osnovi pojačali genomnu DNK PCR uslovima na sledeći macin: 25-30 ciklusa na 55°C - otpuštanje u toku 2', na 72°C - ekstenzija u toku 2', na 94°C - denaturisanje u toku 1', u standardom PCR puferu. Ovi su osnovi takođe korišćeni da generišu jedan označeni uzorak uključivanjem<32>P-dCTP u PCR reakciju, uz odgovarajuće smanjenje količine hladnog dCTP.
Izveda je jedna RT-PCR na RNK raznih tkiva i zaključeno je da je 2G7izražavan isključivo u beloj masti od ispitivanih tkiva (slika 11 A). Posle toga je<32>P-označeni 2G7 hibridizovan na jedan Northern razmaz RNK tkiva (slika 11B) i pokazalo se daje njegova RNK izražena na visokom nivou u masnom tkivu, ali da nije izražavanam ili je izražavana na veoma niskim nivoima, u svim ostalim tkivima (gde su signali možda posledica kontaminacije masti preparatima tkiva). 10 u,g totalne RNK od svakog od navedenih tkiva podvrgnuto je elektroforezi na agaroznom gelu sa formaldehidom. Uzoral je hibridizovan na razmaz na 65°C u standardnom hibridizacionom puferu, Rapid Hybe (Amersham) Veličina RNK bila je približno 4,9 kB. U tom se trenutku smatrako daje 2G7 značajan izgledan gen zaOBpa je dalje analiziran.
D. Otkrivanje mutacije
Da bi se potvrdilo da je 2G7 kodirao OB gen, bilo je potrebno da se pokažu razlike u nivoima izražavanja RNK sekvence DNK ovog gena kod mutanta u poređenju sa normalnim đivotinjama. Za proučavanje su na raspolaganju bile dva različite mutacije ob gena, C57BL/6J ob/ob (U) i Ckc/Smj ab/ab (2J). Oni će dalje biti označaveki sa U, odnosno 21 (Korišćena je neformalna nomenklatura da bi se pozivalo na proučavane mišje sojeve. Kroz ceo ovaj opis i na crtežima podrazumeva se da se C57BL/6J odnosi na C57BL/6J +/+; CKC/smj se odnosi na SM/Ckc-+<D<*->+/+; CKC/smj 0/ob se odnosi naSM/Ckc-+<Đoe->ož<2J>/oi<2>,.RNK je pripremljena od masnog tkiva koje je izdvojeno od U, 2J i kontrolnih životinja. Totalna RNK za svaki od primera je obrađena DNazom a potom obratno transkribovana koristeći oligo-dT kao osnov i reverznu transkriptazu. Dobijena jednolančana cDNK je potom PCR-pojačana bilo 2G7 osnovima (uslovi prikazani napred) za donju traku, bilo komercijalno dostupnim acin osnovima za gornju traku. KT-PCR proizvodi bili su pušteni preko 1% agaroznog TBE gela koji je bio bojen etidijum bromidom (slika 12A). Koristeći RC-PCT utvrđeno je da, mada je mRNK od 2G7 bila izražena kod U i svih drugih kontrolnih miševa, kod 2.T miševa je uopšte nije bilo. Nijedan signal nije otkriven posle 30 ciklusa pojačavanja. Taj je eksperiment dao neposredan dokaz da 2G7 odgovara jednom egzonu izOBgena.
Pošto je 2J mutacija relativno skorašnjeg datuma kao koizogenski soj, ovaj je rezultat bio prvi dostupan dokaz koji je ukazao na 2G7 kao egzon iz OB gena. Mutacija je verovatno locirana u promotorskom području što dovodi do potpunog prekida sinteze mRNK, Prisustvo signala u U miševima u ovom RT-PCR eksperimentu ukazuje na to da U može imati jednu tačkastu mutaciju koja ne dovodi do velike promene veličine uzorka ENK. Pored toga, kod provere pomoću RT-CPR 2G7 mRNK nije bilo kod četiri dodatne 2J životinje.
Ovaj je rezultat potvrđen jednim Northern razmazom (slika 12B). RNK masnih ćelija pripremljena je od svakog od sojeva (C57B1/6J, U, CKC/smj i 2J). Deset pg ovih RNK je uzeto i razmazano. Razmaz je ispitan jednim 2G7 uzorkom koji je bio PCR-oznaČen, pojačavanjem materijala, tj. trake, na slici 11 koristeći<J>~P-dCTP u PCR reakciji. Aktin je kontrola unete količine RNK. Aktinski signal vrlo sličan kod svih uzoraka,OBsignala nema u mozgu pošto je mRNK specifična na masne ćelije.
Rezultati Northern analize potrđuju da 2G7 specifične RNK nema kod 2J miševa,obRNK nema kod CKC/mjob/ obmiševa jer je kod ovog gojaznog mutantnog soja gen tako probijen, da nije proizvedena RNK. Pored toga, nivo 2G7 RNK je povećan oko 10-20 puta kod 1J kao i koddb/ dbdebelih. Ovi su rezultati kopatibilni sa hipotezom da OB ili kodira cirkulišući hormon, ili je odgovoran za generisanje signala iz masnih ćelija koji koduliŠe telesnu masu. Ovi rezultati podržavaju zaključak da je 2G7OBgen i predskazuju da U miševi imaju tačkastu mutaciju, verovatno jednu besmislenu mutaciju koja dovodi do prevremenog završetka translacije.
Ovi Northern rezuktati su ponovljeni koristeći RNK preparate masnih ćelija od 4 različite 2J životinje (slika 13). Kod tog ispitivanja,aplje masno-specifičan transkript koji je korišćen kao kontrola, na sličan način kao aktin na slici 12B. Promenljiva gustinaapltrake nema značaja,aplje obeležen projekto-vanjem PCR osnova iz objavljeneaplsekvence. RT-PCR proizvodi RNK ma-snih ćelija bili su potom ponovo označeni koristeći isti protokol za PCR označa-vanje. Ova je analiza pokazala prisustvoOBmRNK kod normalnih homozi-gotmh ili heterozigotmh životinja, i njeno odsustvo kod 2J mutantnih životinja.
Mutacija je identifikovana kod U miševa. Mutacija je promenat C u T bazu, koja dovodi do promene jednog arginina u jedan vidljiv prevremenu stop kodon kod amino kiseline 108, i po svemu sudeći je odgovoran za U mutaciju (slika 14) uprkos visokom nivou izlaganjaobmRNK (videti slike 12 i 13, trake C57BL/6Job/ ob).
U novije su vreme korišćeni Southern razmazi da bi se zajljuČilo da je 2J mutacija rezultat primetljive promene DNK kod 5' krajaOBkoji izgleda da potpuno isključuje izražavanje RNK. Ostaje da se odredi tačna priroda ovih mogućih premeštanja.
Načinjen je genomni Southerm razmaz DNK od CKC/smj (SM/Ckc-+Dac)iC57BL/6J miševa koristeći četiri različite restrikcione endonukleaze, da bi se odredilo da li mutantniobdaje jedinstvenu šemu fragmenata (slika 15A). Približno 10 pg DNK (izvedeno iz genomske DNA pripremljene ud jetre, bubrega ili slezine) rastvoreno je ukazanim restrikcionim enzimom. Potom je DNK izložena elektroforezi u 1% agaroznom TBE gelu DNK je premeštena na jednu imobilon membranu i hibridizovana na PCR-oznaČen 2G7 uzorak. Ključna traka je najgornja traka uBglllizvodu za CKC/smajob ob ( SM/ Ckc-+ lx*- ob2% b2})DNK. Ova traka ima veću molekulsku masu nego kod drugih sojeva, što ukazuje na mutaciju u tom soju.
Slika 15B je jedan Southern razmazBglllizvoda genomske DNK iz potomaka jednogob<2!>/+xob2' l+ukrštanja. Neke od DNK imaju samo goernju traku, neke samo donju traku, a neke imaju obe trake. Životinje sa samo gornjom trakom su takođe i ALLO-OBESE, tj.obZ3/ ob2}.Ovi podaci ukazuju da polimorfizam (tj. mutacija) prikazan na slici 15A razdvaja u genetskom smislu.
PRIMER 1: Kloniranje cDNK i određivanje sekvence za OB
Koristeći obeležen 2G7 PCR uzorak, izdvojeno je ukupno pedeset mišjih cDNK klonova iz jedne Xgtl 1 cDNK LIBRARY masnih ćelija (Clonetech S'-STRECH cDNK iz testikularnih masnih ćelija švajcarskog miša, "ML3005b), i trideset unakrsno hibridizujućih humanih cDNK klonova iz humane Xgtlo cDNK LIBRARY masnih ćelija (Clonetech 5-STRECH cDNK iz amdomena #HL1108a). Pretraživanje LJBRARY izvršeno je koristeći postupak PLAQUE LIFT. Filtri iz PLAQUE LIFT denaturisani su koristeći postupak sa autoklavom. Filtri su hibridizovani u duplikatu sa PCR-označenim uzorkom 2G7 (Rapid Hybe pufer, 65°C, preko noći). Posle 2-4 časa predhibridizacije, filtri su isprani u 2x SSC, 2% SDS, dva puta za 30 minuta na 65°C i eksponirani na rendgen-film. Duplicirani pozitivi su PLAQUE prečišćeni. Plaque prečišćeni fagovi su PCR-pojačani koristeći komercijalno dostupne vektorske osnove, na primer X.gtl0 i Xgtl 1. Dobijeni PCR proizvod odgovara cDNK umetku za svaki fag sa malom količinom vektorske sekvence sa oba kraja. Trake su gel prečišćene i sekvencionisane koristeći ABI automatizovan SEQIJENCER vektorske osnove za PROBE DNK polimerazu.
Podaci grubog sekvenciranja su potom ručno pregledani, baza po baza, da bi se kongovali poremećaji iz računarskog programa. Kako je korektna sekvenca postajala dostupna, sledeći osnovi su sintetizovani i korišćeni da se na stavi sekvenciranje. Ti su eksperimenti ponavljani dok svaki od raspoloživoh cDNK klona nije bio sekvenciran i sintetizovanu jedan CONTIG. Do danas je sastavljeno oko 3000 baznih porova od 5<*>kraja mNRK. Jedan od cDNA klonova pruža se do 5' kraja mRNK pošto je njegova sekvenca identična sekvenci 5' RACE proizvoda RNK masnog tkiva (nije prikazano).
Podaci iz sekvenci su pokazali da postoji jedan otvoren okvir za očitavanje od 167 amino kiselina (slika 1). Postojala je jedna Kozak-ova istosmislena sekvenca za inicijaciju translacije sa adenosinskim ostatkom tri baze ispred ATG Nađene su dve klase cDNK koje su se razlikovale po uključenju ili isključenju jednog jedinog glutaminskog kodona. Ovaj ostatak je nađen u položaju neposredno 3' do akceptora spoja 2G7 egzona. Kako CAG kodon glutamina obuhvata jednu moguću sekvencu AG spojnog akceptora, izgleda da postoji pomeraj kod mesta akceptora spoja sa uočenim brisanjem 3 bazna para u jednoj podgrupi cDNK, kako je niže prikazano:
U gornjim sekvencama "ag" odgovara pretpostavljenoj intronskoj sekvenci ispred glutaminskog kodona, a AGje pretpostavljeno alternativno mesto spajanja. Ovaj je glutarninski ostatak smešen u jako konzervativnom području molekula i njegov je značaj za biološku aktivnost još uvek nepoznat.
Otkrivena je jedba pretpostavljena N-završna signalna sekvenca, čije je mesto kidanja signala predviđeno da bude karksi-terminal alamnskog ostatka na položaju amino kiseline 21. Pretpostavljena signalna sekvenca je potvrđena primeno računarskog algoritma na postupak von Heijn-a. Koristeći tu tehniki, identifikovana je najverovatnija signalna sekvebca u području kodiranja polipeptida, koje odgovara amino kiselinama 1-23 koje imaju sekvencu:
MCWRPLCRFLWLWSYLSYVQA t VP (SEQ JD NO.10)
gde strelica ukazuje mesto kidanja pretpostavljene signalne sekvence. Ostali deo amino sekvence je u velikoj meri hidrofilan i nema neku zapaženo strukturnu šemu ili područja premošćavanja membrane osim N-završne signalne sekvence. Tačnije, nisu nađene istosmislene sekvence za N-vezanu glikosilaciju ili sekvence dvobaznih amino kiselina koje bi ukazale na kidanje proteina kod predskazanog obrađenog proteina (Sabatini i dr., The methabolic basis of inhented disease, str. 177-223, C.V. Scriver i dr., ured., McGraw-Hill, New York). Pretraživanja baze podataka korišćenjem Blast i Block programa nisu identifikovale ni jednu homolognu sekvencu.
RNK humanog masnog tkiva analizirana je na Northern razmazima, pri čemu su otkrivene RNK vrste slične mišjem ob genu. Sekvenciranje i analiza cDNK klona pokazala je da i humani OB takođe kodira polipetid od 167 amino kiselina (slika 2A i B i slika 3). Isto tako su u humanom OB nađene dve klase cDNK, sa ili bez delecije tri bazna para (slika 6). Mišji i humani OB geni bili su uvelikoj meri homologni u predviđenom podrčju kodiranja, ali su imali samo 30% homologiju u rapoloživim 3' i 5' netransliranim podrčjima. U humanom OB polipeptidu postojala je i jedna N-završna sekvenca. Poređenje sekvenci humanog i mišjeg OB polipeptida pokazalo je da ta dva molekula imaju ukupnu identičnost od 83% na nivou amino kiselina (slika 4). N-završeci zrelih proteina obe vrste poseduju još veću homolognost, sa samo 6 konzervativnih i tri nekonzervativne supstitucije amino kiselina između N-završnih ostataka amino kiselina.
Genomna DNK je izdvojena od miša, pacova, zeca, voluharice, mačke, krave, ovce, svinje, čoveka, šivine, jegulje i Drosophila-e, a restrikcije su razlagane pomoću EcoRl. Razložene materije su podvrgnute elektroforezi na 1% agaroznom TBE gelu. DNK je ptom premeštena na jednu imobilon membranu i ispitanja PCR-označenim 2G7 uzorkom. Filtar je hibridizovan na 65°C i ispran u 2x SSC, 0,2% SDS na 65°C, dva puta u toku dvadeset minuta za svako ispiranje, tj. izvršene su dve promene pufera (slika 16). Ovi podaci pokazuju dajeOBkonzervativan kod kičmenjaka (slika 16). S tim u vezi treba napomenuti da postoji 2+ signal u DNK jegulje; jegulja je jedna riba.
Kao zaključak, raspoloživi podaci ukazuju da se telesna masa i gojaznost mogu fiziološki kontrolisati. Pre sedam godina se pokušaloldentitikovatidve od ključnih komponenata ovog sistema:OB i DBgene. Kao što je prikazano u ovom pnmeru,OBje sda identifikovan kao jedan masno-speciftčan gen koji igra glavnu ulogu kod regulisanja telesne mase. Proizvod toga gena, najvero vat nije jedanlzlučen hormon, imaće važne implikacije za dijagnostiku i lečenje poremećaja u ishrani kod čoveka i ne-humanih životinja.
PRIMER 2: IzražavanjeOBu bakterijama
I mišje i humane cDNK koje kodirajuobbile su klonirane u jednom pET-15b vektoru izražavanja (Novagen). Taj vektor sadrži jedan T7 promotor povezan sa jednim lac operatorom, i izražava jedan FUSION proteinkoji sadrži jednu histidinsku oznaku (His-tag) i mesto kidanja trombina neposredno ispred mesta umetanja kodne sekvence (slika 17) (SEQ ID NOS: 11 i 12).
Mišja i humana cDNK modifikovane su tako da je alanin na kraju signalne sekvence pretvoren uNdelmesto, kao i jedna posebna sekvenca u 3' području. UmetanjeNdelmesta izvedeno je korišćenjem PCR sa novim osnovima :
osnovi sadrže jednu neusklađenost od 6 baznih parova na svojoj sredini koja unosiNdelrestrikciona mesta na oba kraja PCR fragmenta. Fagovi koji nose bili mišju, bilo humanu cDNK bili su PCR-pojavani koristeći ove osnove. PCR proizvod je razlaganAfcM-omi gel prečišćen na 1% agaroznom gelu niske tačke topljenja. Gel prečišćene trake su potklonirane u pET vektor. Dobijeni plazmidi su sekvencirani da bi se proverilo da nisu unete mutacije u toku stupnja PCR pojačavanja kloniranja. Bili su pripremljeni proizvodi za humanu i mišju cDNK koji kodiraju i koji nemaju glutamin 49. Posebno su bili načinjeni, kori-steći jedan PCR postupak kloniranja, pET 15b
proizvodi koji sadrže bilo huma-nu, bilo mišjuOBkodnu sekvencu, minus signalna sekvenca i FUSED na jedan His-tag. Proizvodi su bili sekvencirani da bi se obezbedilo da nisu unete greške sekvenciranja u kodirajuće područjeOBgena u toku stupnja PCR-pojačavanja.
Dva rezultujuća plazmidna proizvoda, pETM9 i pETHl.4, izabrani su da transformišu jednog bakterijskog domaćina izražavanje. Nakon indukcije 1 nM IPTG-a pod optimalnim uslovima, transformisana bakterija je mogla da proizvede 100-300 pg /ml OB FUSION. Najveći deo OB FUSION proteina nažen je u telu inkluzije. Posle rastvaranja 6M gvamdin-HCl-om ili karbamidom, FUSION protein je prečišćen His-vezujućom (Ni-helacionom) kolonom sa smolom. Uslovi zza prečišćavanje na stubu OB FUSION proteina (uključujući vezivanje, ispiranje i izdvajanje) određeni su eksperimentalno OB FUSION protein se vezuje za smolu kod 5 mM imidazol/6M gvanidin-HCl i ostaje vezan sve do 20 nM imidazol/6M gvanidin-HCl. Proteini se mogu isprati sa smole pri 60 nM imidazol/6M gvanidinu (slika 18A, B). Prečišćeni i humani i mišji OB FUSION proteini potom su dijalizovane u PBS da bi se uklonio gvanidin-HCl iz preparata, pa su onda korišćeno da se izvedu poliklonska antitela.
Da bi se ispitala biološka aktivnost proizvoda FUISION proteina, ispitani su i razvijeni REFOLDING uslovi za prečišćen protein. To je zahtevalo početnu dijalizu FUSION proteina u IM gvanidinskom rastvoru, praćeno razblaživanjem 0,4 M argininsknn rastvorom. His-tag je uklonjen sa FUSION proteina pre proveravanja biološke funkcije. Uklanjanje oznake je ostvareno obradom FUSION proteina trombinom iz humane placente.
Pored toga, kodne sekvence humanog i mišjegOBgena, minus signalna sekvenca, bile su svaka umetnuta u po jedan pET 12c vektor koristeći postupak PCR kloniranja. Ovi proizvodi mogu sintetizovanOBprotein usmeriti u periplazmički prostor bakterijske ćelije domaćina.OBFUSION protein dobijen iz periplazmičkog prostora može zahtevati samo jednu običnu gel filtraciju da bi se prečišćavanjem izdvojio od daigih domaćinovih proteina i neće biti denaturisan u toku takvog procesa.
PRIMER: Pripremanje antitela zaOBpolipeptide
Pored primene rekombinantnog proteina za generisanje poliklonskih antitela, identifikovana je, koristeći paket programa za pravljenje dijagrama imunogeniČnosti (GCG Package), grupa od četiri peptidne sekvence iz izvedene mišje OB sekvence. Četiri karboksil-završna peptidna fragmenta jesu:
Ovi su peptidi konjugovani na KLH, pa su peptid-KLH konjugati korišćeni za imunizovanje zečeva koristeći standardne tehnike. Od zečeva je dobijen poliklonski antiserum specifičan za svaki od peptida.
PRIMER 4: Translokacijain vitro jednogOB polipeptida
Da bi se potvrdilo prisustvo jedne funkcionalne signalne sekvence, jedna humana cDNK, koja je sadržala jedan potpun okvir za očitavanje, potklonirana je u pGEM vektor. Kod ovog eksperimenta je korišćena samo humana cDNK, jer nisu dobijeni pogodni mišji potkloni. Pozitivan lanac humane ob RNK je transkribovan koristeći sp6 polimerazu i korišćen u jednojin vitroreakciji trans-lacije sa i bez psećih pankreatskih mikrosomskih membrana. Primarni proizvod translacije pomerao se sa vidljivom molekulskom masom od oko 18 kD, što je kozistentno sa onom predskazanom cDNK sekvencom. Uključivanje mikrozom-skih membrana u reakciju inhibiralo je ukupnu efikasnost translacije oko pet puta. Ipak je približno 50-70% OB primarnog proizvoda translacije bili skraćeno za približno 2 kD u prisustvu membranskog preparati što ukazuje da je signalna sekvenca funkcionalna (slika 19A). Veličina primarnog proizvoda translacije interleukin-la RNK, koja ne kodira signalnu sekvencu, bila je nepromenjena kada su u reakciju uključene mikrozomske membrane. Da bi se potvrdilo da je izvešena translokacija OB proteina, proizvodi translacije in vivo obrađeni su proteazom-K. Obrada proteazom dovela je do potpune proteolize 18 kD primar-nog proizvoda translacije, dok je 16kD obrađen oblik ostao nedirnut pri enzim-skoj obradi, što ukazuje da se translocirao u zapreminu mikrozoma (slika 19B). Ovi su podaci kompatibilni sa hipotezom daje OB jedan izlučen molekul.
Nakon kidanja signalne sekvence, ostaće dva cisteinska ostatka unutar predskazanog proteina, što postavlja mogućnost da molekul sadrži jednu disulfidnu vezu karakterističnu za druge izlučene polipeptide. [Shen i dr., Science, 224:168-171
(1984)].
PRIMER 5: Defmisanje OB gena
Da bi se uspostavila veza između gojaznosti i genetskih promena u OB genu kod ljudi, određena je sekvenca humanog OB gena (slika 20a do C) (SEQ ID NOS: 22 i 24). Specifični osnovi iz humane kodne sekvence korišćeni su za pretraživanje jedne humane Pl LIBRARY. Dobijen su tri različita Pl klona, gajena i PCR-pojačana koristeći osnove koji ograničavaju mesto spajanja između prvog i drugog kodirajućeg egzona. Celo intronsko područje, oko 2 kbm pojačano je i delimično sekvencirano (videti sliku 20A; a kako je ukazano u SEQ ID NOS:22 i 24).
Genska struktura i mišjeg i humanog gena je definisana koristeći PCR ispitivanja i druge standardne tehnike. Utvrđeno je da se mišji OB gen sastoji od tri egzona, pri čemu drugi i treći egzon odgovaraju za kodnu sekvencu (slika 20D). Kodirajuće područje humanog OB gena ima istu strukturi, ali humani gen nema 5' egzon i intron (slika 20E).
Pripremljene su dve grupe osnova generisanih od intronskih sekvenci humanog gena (slike 20A do C). Sekvence osnova su sledeće (F označava u napred, a R označava obratno):
Uzorci DNK su dobijeni iz različitih izvora, a ove grupe osnova su korišćene da se pojača humana genomska DNK od nekoliko gojaznih ljudi. PCT-proizvodi su prevedeni preko agaroznog gela niske tačke topljenja, i odsecane su trake i razlagane agarazom. Sekvence su dobijene koristeći ABI 373A DNIK SEQUENCER i Taq dideoksi terminatorski komplet (ABI, Perkin-Elmer). Do danas je otkrivena jedna tačkasta mutacija u jednom ob genu kod jednog uzorka od pacijenta. Ova je mutacija u prvom egzonu i ne menja sekvencu amino kiselina. Preliminarni podaci ukazuju da jedna sekvenca umetanja možda prisutna u prvom egzonu jednog drugog pacijenta.
Može se primeniti drugačiji postupak automazizovanog sekvenciranja koristeći sekvenazu (Sequenase) umesto Daq DNA polimeraze, kako bi se dobile lakše šitljive sekvence za otkrivanje mutacija.
PRIMER 6: Izražavanje OB u kvascu.
Posle pozicionskog kloniranjaOB,postalo je važno da se otkrije fiziološki mehanizam kojim OB protein smanjuje uzimanje hrane i telesnu masu. Prvi korak u tom pravcu bio je da se rekombinantno proizvede funkcionalni protein koji koristi jedan sistem izražavanja. Pored uspešnog bakterijskog sistema izražavanja, izabran je i sistem izražavanja na kvascu. Izražavanje na kvascu ima nekoliko privlačnih svojstava za izražavanjeOB.Najvažnije je to, daje više verovatno da će biti proizvedeni biološki aktivni eukanotski proteini. OB polipeptid luče ćelije sisara. Lučenje proteina je veoma slično za sve eukariote, što znači da je aparat za lučenje kvasaca mnogo sličniji putevima za lučenje kod sisara nego putevi za lučenje kod bakterija. Posebno je verovatno da će proteinske modifikacije OB koje se sreću u čelima sisara biti viđene kod izražavanja kroz sistem izlučivanja kod kvasca. Pored toga, proteinsko savijanje se vrši pri prolazu kroz aparat za izlučivanje pa je zato kod ispuštanja kroz aparat izlučivanja kvasca verovatno da će se dobiti pravilno savijen protein sa prirodnom biološkom aktivnošću. To je značajno za OB poštoi dva cistemska ostatka mogu obrazovati jedan disulfidni most. Nasuprot putevima za lučenje, redukciona sredina ćelijske citoplazme sprečava obrazovanje disulfitnih mostova, pa je zbog toga bitno da OB prolazi kroz puteve za izlučivanje kako bi se ova disulfidna veza obrazovala in vivo. Druga prednost je povezana sa lakoćom i brzinom manipulisanja sa kvascom, mogućnošću nabavke vektora i sojeva i ogromnim iskustvom u rekombinantnoj tehnologiji kvasca.
Sistem izražavanja kvascaPichia pastorisizabran je iz četiri razloga: (1) ima više nivoe izražavanja heterolognog izražavanje od drugih sistema kvasaca kao što jeS. cerevisiae,(2) proteinska glikosilacija je kodP. pastorissličnija sistemu kod sisara nego kodS. cerevisiae(mada mesta klikosilacije nisu otkrivena u obkorišćenjem računaskog pretraživanja, još uvek ostaje mogućnost glikosilazije na neprepoznatim mestima); (3)P. pastorisprirodno luči veoma malo proteina, pa je običnoj ednostavno da se prečisti izraženi strani protein, i (4) vektori i sojevi kvasaca su komercijalno dostupni (od firme Invitrogen). Dve strategije za generisanje izražavanja na kvasu prikazane su na slikama 21 i 22.
Izabran je vektor PIC.9. Taj vektor sadrži mesto kloniranja neposredno iza prepro kodne sekvence a-faktora sparivanja koja usmerava protein kodiran genom kloniranim na mestu kloniranja da bude izlužen putevima lučenja. Drugo važno svojstvo vektora je HIS4 gen koji omogućuje prihvatanje vektora koristeći auksotropni soj kvasca gajen na medijumdu bez histidina nakon transformacije kvasca vektorom. Strategija kloniranja je bila sledeća: PCR-pojačatiOBcDNK koristeći jedan 5' osnov koji sadrži na svom 3' kraju sekvencu komplementarnu sekvenciOBneposredno iza predskazanog mesta kidanja vodećeg peptida, a na svom krajnjem 5' kraju sekvencu komplementarnu 3' kraju sekvence a-faktora sparivanja vektora. 5' osnov je projektovan da na svom 3' kraju ima sekvencu komplementarnu sa poslednjih nekoliko amino kiselina OB, kao ijednoEcoRlmesto na svom 5' kraju. Posle PCR pojačavanja, PCR proizvod je razložen pomoćuXho\ liRcoRli kloniran u slično razložen pPIC.9. Nakon kloniranja i mišje i humaneOBcDNA, svake sa i bez glutamina na kodonu 49, izdvojeni su pojedinačni kloni za sva četiri proizvoda i sekvencirani da bi se proverilo da li su proizvodi klonirani sa pravilnom orijentacijom i okvirom, i da ne sadrže mutacije iz stupnja PCR pojačavanja. Nakon identifijacihe klonova sa korektnom sekvencom, isti su transformisani uP. pastorissoj GS 115, koji je histidinski auksotrof.
Za dva mišjaOBproizvoda, transformisani klonovi kvasva pretraživani su na izražavanje proteina. Kao dokaz da transformisani kvasac sadrži OB, izveden je jedan "mrlja-razmaz" test i ispitivanje hibridizacije kolonije, koji su oba poka-zalaOBsekvencu unutar transformisanog kvasca, ali ne i unutar netransfor-misanog kvasca. Osim toga, transformisani kvasac je lučio jedan 16 kDa protein u medijum kulture, dok netransformisani kvasac nije lučio protein te veličine (slika 23 A). To je predskazana veličina OB. Identifikovani su pojedinačni kio-novi za oba mišja proizvoda koji jako izražavaju OB, i trenutno se razrađuje strategija prečišćavanja za prečišćavanjeobdo homogeničnosti. Jedna je stra-tegija bila da se OB prečisti na stubu za izmenu katjona (slika 23B), prethodni podaci ukazuju da bi jedan jak izmenjivač katjona mogao biti koristan. Međutim, posle hromatografije izmenom katjona pretpostavljen ob proizvod je izgubljen. To ukazuje na prisustvo proteaze u uzorku.
Jedna strategija da se prevlada ovaj problem jeste da se pripreme oZ>-His-tag FUSIONS za izražavanje u kvascu (slika 22). Dalje procene su pokazale da se OB bez His-tag čvrsto povezuje sa Ni-helacionom kolonom. Prečišćavanje OB polipeptida No-helacijom, praćeno gel filtracijom, dalo je proizvod dovoljne čistoće za masenu spektralnu analizu. Masena spektralna analiza potvrđuje da je kolekulska masa izraženog proteina identična očekivanoj molekulskoj masi, što jako potvrđuje da je OB uspešno izražen uPichia- i.
Međutim, protokol Ni-helacija/gel filtraciono prečišćavanje ne daje OB polipeptid u dovoljno čistom obliku. Prisutni su dodatni mali molekuli. Čini se da se proteolitičko delovanje izdvaja ispiranjem sa Ni-helacione kolone u praznu zapreminu. Zbog toga je planiran trostepen proces: Ni-helacija, potom izmena katjona (koja uklanja malomolekulske zagađivače), a zatim gel filtracija.
Procena nivoa izražavanja Coomassie-ovim plavim bojenjem SDS-PAGE gelova pokazala je približno 20 mg/l kada je kvasac gajen u vibracionim balonima. Očekuje se da će se ovi nivoi povećati u fermentacionim posudama, i mi smo pripremljeni da započnemo fermentaciju u nadi da ćemo dobiti veće količine proteina. Sto se tiče humanihOBproizvoda, identifikovani su klonovi transformisanog kvasca koji sadrže veliki broj kopijaOBgena, i od njih se očekuje da izražavaju OB protein. Kako su razvijena i antitela, ista će biti korišćena za potvrđivanje identiteta izlučenog 16 kDa proteina.
PRIMER 7: Izražavanje visokog nivoa ob FUSION peptida u bakterijama
Pripremanje zabrznutog materijala:
Svakom od dva alikvota od 4 ml sterilisanog M9ZB medijuma bez izvora ugljenika, dodano je 40 pl standardne dekstroze (0,4 g/ml, sterilisana filtriranjem), 10 pl standardnog ampicilina (200 mg/ml) i 5 pl standardnog hloramfenikoila (34 mg/ml, u etanolu). Po jedna kolonijaE. colisa klonirani mišjim i humanim OBI DNK u Novagen pET-14b vektoru korišćena za njihovu inokulaciju. Epruvete su inkubirane preko noće na 37°C. 0,50 ml preko noći inkubiranih kultura korišćeno je za mokulisanje 50 mi M9ZB medijuma dekstrozom, ampicilinom i hloramfenikolom. Oni su inkubirani na 30°C i periodično je praćena apsorpcija svetlosti na 600 nm (A6oo)- Na A<g>oo od oko 1 - 1,2, 175 pl alikvota kulture pomešano je sa 25 pl 60% glicerola u Eppendorf-ovim epruvetama od 2 ml, naglo zamrznuto u tečnom azotu i pohranjeno na -80°C. Gajenje kulture; 50 ml M9ZB medijuma sa 0,5 ml 40% dekstroze, 125 pl standardnog ampicilina i 50 pl hloramfenikola inokulisano sa 1 ml zamrznutog materijala i inkubirano na 30°C. Pri A^oood 1 0 1,2, 10 ml ove kulture je korišćeno da se mokuliraju četiri boce od 2 1 zapremine sa 500 ml M9ZB medijuma sa deks-trozom, ampicilinom i hloramfenikolom. Iste su inkubirane na 30°C do dosti-zanja Aeoo od oko 1 - 1,2, sa krajnjom koncentracijom od 0,5 mM IPTG. Kulture su inkubirane preko noći. Ćelije su izdvojene centrifugiranjem na 4000 m"<1>u toku 20 minuta. Sistem izražavanja je dao rekombinantni peptid kao prilično veliki procentni udeo ukupne količine proteina; reda veličine gram/litar E. coli.
Liza ćelija i resuspenzija inkluzionih ćelija:
Celijska pasta je resuspendovaba u minimalnoj zapremini od 20 mM HEPES, pH 7,2, 10% ghcerolui, 0,1 M KC1, 5 nM MgCl2, 5 u/ml leupeptina i 50 pg/ml DNaze I. Suspenzija je zamrzavana i topljena tri puta koristeći tečan azot i mlaku vodu. Lizovane ćelije su izdvojene centrifugiranjem na 18000 min"<1>u toku 30 minuta i ponovo suspendovane u 20 mM HEPŠES, pH 7,5, 0,1 M NaCl. Suspenzija je obrađena ultrazvukom i dodan je Triton XI00 do krajnje koncentracije od 2%. To je centrifugirano 15 minuta na 18000 min"<1.>Posle još dva takva ciklusa, izvršena su tri ciklusa ispiranja bez Triton-a. Najzad je grudva rastvorena u 6 M GdHCl (gvanidin-HCl), 20 mM HEPES, pH 7,5 pomoću ultrazvuka, posle čega je centnfugirana. Površinski sloj, supernatant, korišćen je za dalje prečišćavanje.
Ob protein je prečišćen u nesavijenom stanju afinitetnom hromatogra-fijom sa imobilisanim metalnim jonom (IMAC). Rastvor je sipan u 40 ml-sku kolonu Pharmacia helatinske brzoproročne sefaroze, punjene sa 7 zapremma kolone 50 mM NiS04i uravnotežen u 6M GdHCl, 20 mM HEPES, pH 7,5. Kolona je isprana 6 M GdHCl-om, 30 mM imidazolom, 20 mM HEPES, pH 7,5. Najzad je protein ispran istim puferom koji je sadržao 0,2 imidazola. Nesavijeni protein u 6 M GdHCl pohranjen je na 4°C nakon dodavanja natrijum acetata (NaAc) do 10 nM i podešavanja pH na oko 4,5 sirćetnom kiselinom.
Ponovno savijanje i prečišćavanje proteina:
Rastvor 6 M GdHCl koji je sadržao 100 mg proteina, obrađen je sa 67 pl 1 M ditiotreitola (DTT) i razblažen na oko 67 ml sa 6 M GdHCl, 10 mM NaAc, pH 4,5. Ostavljen je je da se mesa na sobnoj temperaturi oko 1 čas. Potom je razblažen u 4 L 20% glicerola, 2,5 mM CaCl2, 2o mM Tris, pH 8,4 puferom uz mešanje. Posle dobrog mešanja, rastvor je ostavljen oko 8 časova na sobnoj temperaturi bez daljeg mešanja. Tada je dodano 2000 jedinica prečišćenog goveđeg trombina )iz tromostata, proizvoda firme Parke-Davis), pa je rastvor ostavljen uz lagano mešanje. Posle 2,5 časova ponovo je dodano 2000 jedinica trombina i nastavljeno je kidanje histidinske oznake još tri časa. Kidanje trombina je zaustavljeno dodavanjem PMSF do krajnje koncentracije od 0,1 mM. Rastvor je filtriran i pohranjen na 40"C.
Otkinut protein je dalje prečišćen na istoj IMAC koloni kao napred, uravnotežen u 1 M KC1, 20% glicerol, 20 mM HEPES, pH u,4 puferu. Posle sipanja proteinskog rastvora, isti je ispran istim puferom pa je otkinuti protein ispran pomoću IM KC1, 20% glicerola, 40 nM imidazola, 20 mM HEPES, pH 8,4. Neotkinuti protein je ispran sa 0,2 M imidazolom.
Prečišćen otkinut protein bio je koncentrisan, obrađen sa 50-100 mM EDT, 10 mM kalijum fericijanida (da bi se dovršile sve nepotpune oksidacije) i gel filtriran na jednoj superdex 75 16.60 koloni. Prinosi kod konšćenja ove procedure dostižu do 50% početnog peptida.
Kada je prečišćen, izraženi protein je bio analiziran i definisan nekolikim metodama. Fizičko definisanje je obuhvatilo dinamičko rasejavanje svetlosti da bi se odredila homogeničnost strukture t koristi se kao mera pravilnog savijanja. Podaci o rasejavanju svetlosti ukazuju da se humani OB polipeptid izražava pretežno ili isključivo kao monomer, dok se mišji OB polipeptid može naći kao dimer i kao monomer.
Ispitivanja EUman-ovim reagensom i masena spektroskopska analiza potvrđuju da citeinski ostaci obrazuju jednu disulfidnu vezu u proteinu. Oksidisan oblik polipeptida je dat miševima, kako je kasnije opisano, i iskazao je biološku aktivnost.
Cirkularni dihroizam je korišćen da bi se grubo odredila strukturna geometrija proteina. CD spektri u fiziološkom rastvoru (pH oko 8, približno fiziološka jonska jačina) ukazuju da humani OB polipeptid ima oko 60% a-spiralne strukture i oko 40% proizvoljno ovijene strukture. CD spektroskopijom je nađeno da mišji polipeptid ima oko 50& a-spiralne strukture i 50% proiz-voljno uvijene strukture.
Ograničena proteoliza, iza koje sledi masena spektrometrija (Cohen i dr., 1995, napred citirano) korišćena je da se iđentifikuju delovi OB polipeptida koji su dostupni proteolizi. Ova je analiza pokazala prisustvo jedne strukture u vidu savitljive petlje od ostatak amino kiseline 54 do 60 (kako je prikazano na slici 4). Verovatno je da da savitljiva petlja povezuje dva područja definisane2"strukture, na primer a- spiralu.
Važno je, kako je prikazano u sledećim primerima, da je ispitivana bioaktivnost prečišćenih proteina davanjem proteina i mršavim i gojaznim glodarima preko jedne osmotske pumpe (na primer ALZET osmotske pumpe od Alza Corporation, Palo Alto, CA) ili dnevnom velikom dozom intraperitonalno u toku jednog najmanje dvonedeljnog perioda, pa su posmatrani delovanje na ponašanje kod hranjenja i telesna masa.
PRIMER 8: Delovanje OB polipeptida (leptina) na smanjenje mase
Genski proizvod mišjeg OB mesta, locusa, igravažnu ulogu kod regulisanja telesne mase. Prikazani primer utvrđuje da OB protein cirkuliše u plazmi miša, pacova i čoveka. Cirkulacioni oblik kod sve tri vrste ima identičnu molekulsku masu prema SDS PAGE prema izvedenoj polipeptidnoj sekvenci bez signalne sekvence, što ukazuje da, in vivo, protein nije obrađen posle otkidanja signalne sekvence, OB proteina nije bilo u plazmi C57/B16J ob/ob miševa, a nalazila se u desetostrukoj koncentraciji u plazmi db/db miševa i na dvadesetostruko višim nivoima u plazmi fa/fa pacova u odnosu na kontrolne životinje. Ukazuje se da su ti gojazni mutanti gojaznih životinja otporni na delovanje OB. Bila je sedmostruka razlika u nivoima u plazmi OB proteina u grupi od šest meršavih humanih subjekata. Dnevne injekcije rekombinantnog mišjeg OB proteina dramatično su snizile telesnu masu kod ob/ob miševa, imale su značajan uticaj na telesnu masu normalnih miševa, ali nisu imale nikakvo dejstvo na db/db miševe. Ovi podaci ukazuju da genski proizvod OB locusa ostvaruje endokrinsku funkciju da reguliše telesnu masu.
Materijali i postupci
Zečevi su imunizovani rekombinantnim proteinom u Freunds-ovom adjuvansu (HRP, Ine). Imunski prečišćena anti-mišja OB antitela bila su pripremljena propuštanjem antiseruma preko sefarozne 4B kolone konjugovane na rekombinantni protein kako je opisano [Harlovv i dr., Antibodies; A Laboratorv Manual, Cold Spring Labiratorv Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)]. Imunoprecipitacija mišje plazme izvršena je na sledeći način, 0,5 ml mišje plazme, plazme pacova i humane plazme koja je sadržala približno 2,5 mM EDTA prethodno je izbistreno nekonjugovanom sefarozom-5B na sobnoj tempe—raturi uz ljuljanje, u trajanju od 2 časa. Sefaroza je uklonjena centrifugiranjem i dodano je 50 ml 50% mulja na antitelo konjugovane sefaroze koja je nosila afinitetno prečišćeno antitelo u koncentraciji od 1 mg/ml pakovane sefaroze. Dodano je 0,5 ml 2x RIPA pufera da bi se dobili krajnji uslovi vezivanja, i to: 30 mM Tns-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5 natrijum deoksiholata i 0,025' natrijum azida. Rakcija se odvijala preko noći na 4°C uu ljuljanje. Sa antitelom konjugovana sefaroza prana je 8 puta RIPA puferom, potom tri puta ispirana PBS-om, i propuštena preko 15% SDS-PAGE. Proteini su preneti na nitrocelulozu i načinjeni su Westem raznazi sa biotinilisanim imun-ski prečišćenim antitelima nasuprot rekombinantnom proteinu. Upotrebljeno sekundarno antitelo bio je HRP-streptavidin, a ECL je korišćen za detekciju.
Da bi se količinski odredio OB u mijem serumu, dodavane su povećavane količine ponovo savijenog rekombinantnog mišjeg OB proteina (0,01, 0,1, 0,6, 2,0, 15,0 ng) u 100 X C57BL/6J ob/ob plazme i inkubirane na 4°C u toku 3 časa sa protein A sefarozom konjugovanim antitelom. Posle iscrpnog pranja puferom A(10 mM natrijum fosfatni pufer, pH 7,4: 100 mM NaCl; 1% Triton X-100, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF), uzorci su ponovo suspendovani puferu uzorka, sipani na 15% SDS-PAGE i preneti na jednu nitroceluloznu membranu. Načinjen je VVestern razmaz koristeći jedno imunski prečišćeno biotinilisano antitelo anti-amino završetka (terminusa) kao primarno telo i HRP-streptavidin kao sekundarno antitelo, posle čega je sledila ECL detekcija.
Citoplazmičm ekstrakti su pripremani homogenizovanjem adipoznog tkiva u NDS puferu (10 mM Tris, pH 7,5, 10 mMNaCl, 60 mM ICCI, 0,15 mM spermina, 0,5 mM spermidina, 14 mM (3-merkaptoetanola, 0,5 EGTA, 2 mM EDTA, 0,5% NP-40) polvtronskom i vibracionom homogenizacijom, a uklanja-nje jezgara izvedeno je centrifugiranjem pri 700 g.
Imunoprecipitacija je izvedena kao što je napred opisano, osim što su korišćena imunski prečišćena antihumana OB antitela. Za ELISA je 100 ml jednog 1 mg/,1 rastvora imunski prečišćenog antihumanog OB antitela rastvoreno u borat puferisanom PBS rastvoru i naneto preko noći na milrotitarske (Corning cat. #2595) ploče na 4°C. Ploče su potom prane 4 buta borat slanim rastvorom koji je sadržao 0,05% Tween 20, a višak tečnosti je uklonjen. Ploče su blokirane inkubiranjem na sobnoj temperaturi u toku 2 časa sa 240 ml po udubljenju borat slani rastvor pufera koji je sadržao 0,3% želatina a potom oprane i sušene. Bilo poznate količine ponovo savijenog humanog OB proteina, bilo uzorci plazme u zapremini od 100 ml, bili su inkubirani u pojedinačnim udubljenjima preko noći i na 4°C. Posle ispiranja pločama je dodan HPR-streptavidin (0,1 mg/ml u boratnom puferu, 0,3% želatina). Potom je upotrebljen rastvor HRP supstrata (ABTS, 0,3 mg/ml i FL^, 0,01% u limunovoj kiselini) za detekciju a O.D. je merena na 414 nM da bu se količinski odredilo obrazovanje antitela.
Mišja i humana kodna sekvenca OB gena bile su PCR pojačane iz plazmida koji je sadržao OB cDNK sekvence t potklonirane u pPlC.9 plazmid (Invitrogen).
Upotrebljeni humani 5' osnov (prajmer), bio je
a 3' osnov bio je Za miša, 5' osnov bio je a 3'bio je
3' osnov i za miša i za čoveka sadrži jednoXho\mesto na 5' kraju i kodne sekvence za poslednje 4 amino kiseline signalne sekvence a-faktora sparivanja koji se nalazi u vektoru pPIC.9. Ovaj vektor usmerava lučenje heterolognoo izraženih gena iz ćelije u medijum kulture. 3' PCR osnov takođe obuhvata prvih 19 nukleotida otvorenog okvira za očitavanjeOBgena iza mesta kidanja signalne sekvence, ispred alanina na položaju 21 amino kiselina, 3' osnov sadrži jednoEcoRlmesto kod njegovog 5' mesta, iza koga neposredno slede sekvence komplementarne pretpostavljenom završnom, ili stop kodonu. PCR uslovi su bili sledeći: denaturisanje tokom 1 minute na 94°C, otpuštanje 1 minuta na 55°C i ekstenzija 2,5 minuta na 72°C. Malociklična PCR (15 ciklusa) i polimeraza za proveru PFU (Stratagene) korišćene su da se ograniči broj mutacija generisanih PCR-om. PCR proizvodi su razlagani pomoćuXholi£coRIi klonirani u slično razlagan vektor, pPIC.9. Svi su proizvodi sekvencirani na oba lanca da bi se obezbedilo otklanjanje bilo koje mutacije generisane PCR-om. Kloni su trans-formisani uPichia pastoris(His<1>) sferoplast postupkom i birani na bezhisti-dinskim medijumima. Približno je pretraživano 200 mišjih i humanih klonova na integraciju velikog broja kopija a pomoću ispitivanja hibridizacije kolonije. Kloni sa velikim brojem kopija su potom provereni na izražavanjeOB,početno Coomassie-jevim bojenjem koje pokazuje prisustvo jednog novog 16 kD proteina u
medijumu kulture transformisanog kvasca. Za 16 kD traku je potvrđeno da je OB, koristeći antitela gajena protiv bakterijski izraženogOBproteina. Rekom-binantni proteini su prečišćeni dvostepemm postupkom prečišćavanja koji će ka-snije biti opisan. Masena spektrometnja i obrada cijanogen bromidom izvedene su kako je opisano kod Beavis i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6873-6877 (1990).
Cele OB kodne sekvenca mišjih i humanih OB gena, C-završne za signalnu sekvencu, potklonirane su u pETLSb vektor izražavanja (Novagen) i preizraženi u Escherichia coli [BL21(DE3)plYsS] koristeći sistem T7RNK polimeraze [Studier i dr., Meth. Enzymology, 185: 80-89 (1990)]. Ćeliju su se razvijale na 30°C do apsorpcije svetlosti od 0,7 pri 595 nM, i indukovane 0,3 mM izopropil-(3-D-tiogalakto-piranozidom preko noći, izdvojene su malobrzinskim centrifugiranjem. Liza je izvedena pomoću tri ciklusa zamrzavanja/otopljavanja, a razlaganje DNK vršeno je DNazom I. Membranska ekstrakcija izvedena je pomoću ultrazvuka i rastvaranjem deterdžentima, a konačno je grudva tela uključka rastvorena u 6M gvanidm-HCl, 20 mM HEPES, pH 8,4. Rekombinantni proteini su prečišćeni u uslovima denaturacije IMACoom koristeći Ni-jonsku afinitetnu kolonu i ispiranjem sa povećavanim količinama imidazola. Prečišćen denaturisan OB protein je potom pohranjem u 6 M gvanidin-HCl, 10 mM natrijum acetata (NaAc), pH 5, i redukovan koristeći 1 mM DTT na sobnoj temperaturi u toku 1 časa. Denaturacija je izvedena razblaživanjem redukovanog proteina u 20% glicerolu, 5 mM CaCl2, 5 mM NaAc, pH 5, dobrim mešanjem i inkubacijom na sobnoj temperaturi u toku 8 do 12 časova. Posle denaturisanja pH je podešeno na 8,4 dodavanjem Tris do 10 mM, pa je hexa-histidinska oznaka uklonjena kidanjem tromina. Otkinut, ponovo naturisan protein je ponovo prečišćen IMAC-om da bi se proizvod odvojio od trombina i neotkinutog FUSION proteina. Otkinut, ponovo naturisan protein izspira se iz Ni-jonske afmitetne kolone pri 40 mM imidazola, pri čemu se trombin ne zadržava a neotkinut FUSION protein se ispira pri 0,2 mM imidazola. Proizvod je potom koncentrovan, obrađen sa 100 mM EDTA i 10 mM kalijum fericijanida pa dalje prečišćen gel filtracijom koristeći Pharma ciasuperdex 75 16/60 kolonu.
Izveden je EUman-ov tekst, kako je opisano kod Ellman, Arch. Biochem. Biophys., 82:70-77 (1959). Ellman-ov reagens je pripremljen rastvaranjem 39,6 mg 5,5'Oditiobis(2-mtrobenzojeva kiselina)(DTNB) u 10 ml 0,55 M fosfata, pH 8. Konstruisana je kriva kalibracije u opsegu koncentrovanja od 10-120 mM slobodnog sulfhidrila(koristeći 1 mM gotovog rastvora redukovanog DTT) na 412 nm. Svako od ispitivanja je izvedeno koristeći 0,02 ml Ellman-ovog reagensa i ukupnu reagujuću smešu od 0,5 ml. Mereni koeficijent stinjavanja bio je 12974 M^m"<1>za slobodnu sulfhidrilnu grupu (koeficijent korelacije 0,99987) što je u opsegu 5% ranije opisane vrednosti od 13600 M^m"<1.>50 ml 2 mg/ml čistog gel-filtriranog proteina, što odgovara mogućoj koncentraciji slobodnog sulfhidrila od oko 24 mM u krajnjoj reagujućoj smeši, podvrgnuto je Ellman-ovom ispitivanju. Dobijeni rastvor dao je A412od oko 0,02, što ukazuje da su dva cisteinska ostatka u proteinu u oksidisanom stanju tako da obratuju cistin, ili da su njihove slobodne sulfhidrilne u potpunosti ukopane unutar nepristupačnog jezgra savijenog proteina. Identični rezultati su dobijeni izvođenjem istog ispitivanja nesavijenog proteina u prisustvu 6 M gvanidin -HC1.
Miševi su bili pojedinačno zatvoreni u kaveze bez u sredini bez patogena i aklimatizovani na hranu koja sadrži 35 % mas. hrane za glodare (Laboratory Rodent Diet 5001, PMP Feeds Inc.), 5,9% smeše taspioka pudinga (Gneral Foods) i 59,1 vode, koja ima energetski sadržaj od 1,30 kcal/g. Ta hrana je stenlisana u autoklavu i pakovana u plastične posude veličine 60 mm, koje su bile pričvršćene na gornju stranu Petri-posuda od 100 mm. Tapioka daje hrani pastastu teksturu, koja otežava životinji razbacuje hranu po kavezu. Poklopac veličine 100 mm preihvata malu količinu hrane koju životinja prosipa. Sveža posuda se hranom stavlja se svako jutro u kavez, a posuda od prethodnog dana se uklanja i meri. Razlika u masi daje meru dnevne potrošnje hrane. Uticaj rekombinantnog proteina na uzimanje hrane i telesna masa merem su kod tri soja miševa: C57B1/6J ob/ob, C57 Bl/Ks db/db i CBA/J +/+, nabavljenih kod Jackson Laboratorv. Trideset miševa od svakog soja bilo je podeljeno na grupe od po 10. Po jedna grupa od od svakog soja primala je dnevno intraperitonalne injekcije (i.p.) ponovo savijenog bakterijskog ob proteina u dozi od 5 mg/g/dan u 300 pl PBS. Druga grupa je primala i.p. injekcije iste zapremine PBS. Ovi kontrolni miševi su primali injekcije PBS dijalizata rekombinantnog proteina. PBS je očišćen od endotoksina koristeći jednu Acticlean ETOX kolonu.. Treća grupa životinja nije primala injekcije. Uzimanje hrane je beleženo svakodnevno a merenja telesne mase su beležena redovno u toku perioda od 3,5 nedelje. Za eksperiment uporednog hranjenja, uzimanje hrane jedne odvojene grupe ob miševa poređeno je na dnevnoj bazi sa hranom koju su utrošili ob miševi koji su primali protein.
Rezultati
OB protein cirkuliše u plazmi miševa, pacova i ljudi
Rekombinantni mišji i humani protein pripremljeni su koristeći pET 15b bakterijski vektor izražavanja (Novagen) i kloniranjem u Pichia pastoris sistem izražavanja na kvascu koji luči rekombinantne proteine neposredno u medij um kulture. Ob protein izražen u kvascu obuhvata 146 amino kiselina karboksi završnih za signalnu sekvencu. Zečevi su inunizovani bakterijskim proteinima (HRP, Inc.). Antitela su imunski prečišćena (Research Genetics) i korišćena za lmunoprecipitaciju i za VVestern razmaze proteina iz plazme i adipoznog tkiva.
OB protein iz mišje plazme kreće se sa vidljivom molekulskom masom od 16 kD prema SDS-PAGE. Elektroforetska popkretljivost je identična onoj od rekombinantnog proteina koji izluči kvasac posle uklanjanja signalne sekvence (slika 24A). Protein nije otkriven u plazmi C57BL/6J ob/ob miševa koji imaju besmislenu mutaciju kod kodona 105. Nekoliko različitih antiseruma nije uspelo da identifikuje skraćen Ostatak 105 polipeptidnog lanca predskazan cDNK sekvencom.
Desetostruko povećanje nivoa cirkulišućeg proteina primećeno je kod db/db miševa u poređenju sa jednom kontrolnim šibotinjom (slika 24A). Imunoprecipitacija plazme prirodnih i fa/fafa pacova pokazala je dvadesetostruko povećanje nivoa OB proteina kod m utantnog pacova u poređenju sa prirodnim (slika 24B). db mutacija je dala jedan gojazan fenotip identičan onome koji se viđa kod ob miševa (Bahan i dr., 1990, citiran napred). Debeli pacovi su gojazni kao rezultat recesivne mutacije u genu homolognom db (Truett i dr., 1991, citirano ranije) Da bi se količinski definisao nivo OB u mišjoj plazmi, serumu su dodavane povećavane količine rekombinantnog proteina i imunoprecipitirane (slika 24C). Linearno povećanje intenziteta signala na Western razmazima stavljeno je u vezu sa povećavanim količinama rekombinantnog proteina. Poređenje intenziteta signala prirodnog proteina u mišjoj plazmi prema standardima, ukazalo je da je nivo cirkulisanja OB proteina kod prirodnih miševa približno 20 ng/ml. Ovi podaci pokazuju da su imunoprecipitacija i Western razmazi izvedeni u uslovima viška antitela. Povećani nivoi OB proteina takođe su zapaženi kod proteinskih ekstrakta adipoznog tkiva od db/db miševa u odnosu na kontrolne 8 SLIKA 24d9. Kako se očekivalo za izlučen protein, protein od adipoznog tkiva lomio se sa grubom membranskom frakcijom (podaci nisu prikazani). Uzorci plazme od šest mršavih humanih subjekata sa koeficijentom telesne mase manjim od 25 (BM1 = masa/dužina<2>) bili su imunoprecipitirani koristeći imunski prečišćena anzitela ua humani protein. Imunoprecipicirani materijal kretao se sa elektroforetskom pokretljivošću identičnom onoj koja se sreće za humani protein za 146 amino kiselina izraženih u kvascu. Intenzitet signala je značajno varirao između šest izoraka (slika 25A). Merenje gustine autoradiografa pokazalo je približno petostruku razlikuu nivoima kod pojedinaca HP1 i HP6, sa srednjim nivoima kod drugih subjekata. Razvijeno je imunsko ispitivanje povezano sa enzimima (ELISA) koje koristi imunski prečišćena antitela i ponovo savijen bakterijski protein kao standard (videti niže). Dobijena standardna kriva prikazana je na slici 25B. Koristeći ovaj test, plazmeni nivoi OB proteina u 6 uzoraka humanih plazmi menjao se između 2-25 ng/ml (slika 35C)Nivo OB proteina u plazmi od HP6 bio je van linearnog opsega imunskog ispitivanja i jednak je >15 ng/ml. Ove kvantitativne razlike u korelaciji su sa onima primećenim kod VVestern razmaza. Preliminarni podaci ukazuju da leptim može cirkulisati, bar delom, u kompleksu sa nekim drugim proteinom ili proteinima. Ovaj je zaključak zasnovan na heterogeničnosti oblika krive titracije za serim poreženjem sa rekombinantnim standardom. Analiza jedne velike količine leptina imunski prečišćenog na jednoj zečjoj anti-OB koloni gel filtracionom HPLC, pod uslovima đenaturisanih i nedenaturisamh uslova sa praćenjem preko ELISA i SDS-PAGE ukazalo je da se OB polipeptid ponaša kao kompleks velike molekulske mase. Međutim, ovi podaci ostaju preliminarni, jer OB vezni protein, ukoliko ga ima, tek treba da se definiše.
Strukturna svojstva OB proteina
Kako OB protein ima dva cisteinska ostatkam on može obrazovati bilo intrarnolekulske, bilo intermolekulske disulfidne veze u oksidacionim uslovima in vivo. VVestern razmazi su ponavljani sa i bez dodavanja sredstva za redukovanje u pufer uzoraka. I u jednim i u drugim uslovima, OB protein u humanom serumu se kretao kao monomer (podaci nisu prikazani). U neredukcionim uslovima, protein dobijen imunoprecipitacijom od db mišjeg seaima pronađen je na pozijama konzistentnim i sa monomerom od 16 kD i sa dimerom od približno 32 kD (slika 26A). Supstanca veće molekulske mase nestala je u redukcionim uslovima, što ukazuje da jedna frakcija mišjeg OB cirkuliše kao vrsta veće molekulske mase preko obrazovanja jednog međumolekulskog disulfidnog spoja. Približno 80% mišjeg OB cirkuliše kao približno 16 kD protein, a 20% kao pribli+no 32 kD oblik.
Isti molekulski oblici se vide kada se mišji i humani proteini izražavaju u Pichia pastoris [Abrams i dr., Immunol. Rev., :5-24 (1992)]. U ovim studijama je DNK sekvenca, koja odgovara zrelom OB proteinu 146 amino kiselina, klonira iza signalne sekvence a-faktora sparivanja kvasca u pPIC.9 vektoru (Invitrogen). OB protein je prečišćen iz kvasaca sojeva koji izražavaju mišji i humani protein i podvrgnut elektroforezi i neredukcionim uslovima (slika 26A). Mišji protein je bio izražen u kvascu uglavnom kao dimer pod neredukcionim uslovima, a samo kao monomer u prisustvu sredstva za redukovanje. Rekombinantni humani protein pomerao se na položaj jednog monomera i pod jednim, i pod drugim uslovima (podaci nisu prikazani).
Prečišćen humani protein izražen u Pichia imao je molekulsku masu od 16,024+3 Da kako je utvrđeno masenom spektrometrijom 1990 (Beavis, 1990, citirano napred). Ova vrednost je u skladu sa masom proračunatom iz sekvence amino kiselina proteina koji sadrži samo jedan intramolekulski disulfidni most (16,024 Da). Masena spektrometrija sa laserskom desorpcijom pomognutom matricom cijanogen bromidskog proizvoda kidanja proteina, ukazuje da su cisteini 117 i 167 povezani jednom intramolekulskom disulfidnom vezom (slika 26B).
Pripremanje i definisanje bioaktivnog rekombinantnog proteina
Mišji OB protein je izražen u E. coli iz pET 15b plazmida kao nerastvorljiv FUSION protein, sa 20-ostataka, N-terminalni heksa-histidinski obeleživač koji sadrži jedno mesto kidanja trombina. Bakterijska inkluziona tela se rastvorena koristeći gvanidin-HCl i prečišćena pod uslovima denaturisanja koristeći afinitetnu hromatografiju sa imobožilisanim metalnim jonom (IMAC) (slika 27). Prečišćen, denaturisan FUSION protein je redukovan, razblažen i pušten da se ponovo savije u vodenom rastvoru na sobnoj temperaturi. Nakon kidanja trombina, ponovo naturisan mišji protein koji je sadržao četiri dodatna N-završna ostatka (Gly-Ser-His-Met; SEQ ID NO:38) bio je ponovo prečišćen IMAC-om do<>>98% homogeničnosti, kako je procenjeno pomoću SDS-PAGE i masene spektrometrije. Masena spektrometrija sa laserskom desorpcijom pomognutom matricom dala je merenu masu od 16,414±Da (predskazana masa = 16,415 Da). I redukcioni i neredukcioni SDS-PAGE gelovi dali su jednomolekulske vrste sa vidljivom i molekulskom masom od 16 kD (podaci nisu prikazani).
Dinamičko rasejavanje svetlosti koristeći jedan DP801 detektor molekulske veličine (Protein Solutions, Inc.) pokazao je da je ponovo naturisan mišji OB protein uglavnom monomeran, sa nešto agregata višeg reda. Protein je obrađen pomoću EDTA i hemijski oksidisan. Gel filtracijom su uklonjene vrste veće molekulske mase. Sledeće dinamičko rasejavanje svetlosti je potvrdilo da je prečišćen, ponovo naturisan rekombinantni mišji OB protein monodispergovan. Sledećom dijalizom fosfatno puferovanog rastvora (PBS), uklonjen je bakterijski endotoksin koristeći jednu Acticlean ETOX kolonu (Sterogene Bioseparations, Inc.). Krajnji prinos proteina bioje 45mg/l.
Ellman-ov test je izveden na puferovanom, ponovo naturisanom rekombinantnom mišjem OB proteinu da bi se ocenilo njegovo stanje oksidisanja (Ellman, 1959, napred ciriran). 1 ponovo naturisan protein, i protein razvijen 6M gvanidin-HCl-om pokazali su <0,5% sadržaja slobodnog sulfhidrila, pokazujući da monomerni proizvod sadrži jednu intramolekulsku disulfidnu vezu. Ovo je potvrđeno masenom spektrometrijom cijanogen bromidnim proizvodima kidanja ponovo savijenog bakterijskog proteina (podaci nisu prikazani).
Bioaktivnost OB proteina
Prečišćen, ponovo naturisan rekombinantni mišji OD protein davan je kao dnevna intraperitonalna injekcija od 5 mg.kg.dan grupama od po 10 miševa C57B1-67 ob/ob (starost 16 nedelja), C57Bl-Ks db/db (starost 12 nedelja) i CBA/J+/- (starost 8 nedelja). Isti broj životinja dobijao je PBS kao dnevnu injekciju. PBS za kontrolne injekcije izveden je iz dijalizata posle uravno-težavanja proteina. Deset dodatnih životinja od tri mišja soja nije primalo injekcije. Uzimanje hrane pojedinačnih životinja praćeno je dnevno, a masa životinja je merena u razmacima od tri ili četiri dana. Kumulativni podaci za uzimanje hrane i telesnu masu za svaku od 9 grupa miševa prikzani su na slikama 28A do F, a statistički značaj podataka prikazan je u tabeli 1. Uzimanje hrane C57B16J ob/ob miševa kojima je ubrizgavan protein bilo je značajno smanjenoposle prve injekcije i nastavilo je da se snižava do petog dana kada se stabilizovalo na nivou jednakom približno 40% od uzimanja hrane šivotinja koje primaju injekcije PBS (p< 0,001). OB miševi koji su primali injekcije bez aktivne materije nisu gubili masu u toku tronedeljnog perioda ispitivanja. C57B1/6J ob/ob miševi koji su primali protein izgubili su približno 10% njihove telesne mase posle 5 dana (p<0,001). Ove su životinje nastavile da gube masu tokom tri nedelje ispitivanja do kada se masa ob životinja koje su primale protein smanjila na prosečno 60% početne telesne mase (p<0,0001). Jedna odvojena grupa ob miševa je podjednako hranjena kao ob miševi koji su primali protein. Podaci na slici 29B ukazuju da su paraleno hranjeni miševi gubili značajno manje od mase nego životinje koje su primale rekombinantni protein (p<0,02). Fotografija dva miša koji su primali injekcije proteina ili injekcije nosača, prikazuje ukupnu razliku u izgledu koja je rezultat davanja proteina (slika 29B). Da bi se još više potvrdilo delovanje proteina, izvršena je autopsija po dva miža iz svake grupe. Opšti pregled ob mieva koji su primali protein pokazao je dramatično smanjenje telesne masnoće kao i veličine jetre. Masa jetre db i normalnih miševa ostale je nepromenjena u toku eksperimenta. Jetra ob miševa koji su primali injekcije PBS iznosila je 5,04 i 5,02 grama prema 2,23 i 2,03 grama kod životinja koje su primale rekombinantni protein. Na suprot bledoj masnoj jetri, karakterističnoj za ob miševe, jetra ob miševa koji se primali protein dobila je tamnu boju karakterističnu za normalnu jetru (slika 26C). Histološki preseci jetre ukazali su da su neobrađivane životinje imale masnu jetru koja je izrazito poboljšana kod životinja koje su primale protein (podaci nisu prikazani).
Nasuprot ob miševima, nije bilo značajnijih promena telesne mase kod C57BL/Ks db/db miševa koji su primali protein, u odnosu na kontrolnu grupu koja je primala nosač (slike 28 A do F, Tabela 1). Sve tri grupe db/db miševa gubile su između 2 i 5 grama u toku perioda ispitivanja. Prosečna glukoza u krvi db miševa merena je glukometrom, i iznosila je > 500 mg/dl kod svih miševa, što ukazuje da se kod tih životinja razvio dijabetes kao posledica gojaznosti. Davanje injekcija db miševima prekinuto je posle dve nedelje.
Kod normalnih miševa javilo se malo ali značajno smanjenje telesne mase posle davanja rekombinantnog ob proteina (slike 28A-F, Tabela 1). Posle pet dana primanja injekcija, životinje su u prošeku gubile 0,5 g, dok su kontrolni miševi dobili 0,4 g ) p<0,02). U dve uzastopne vremenske tačke, životinje koje su primale protein imale su značajno manju masu od životinja koje su primale dnevno injekcije PBS. Značaj promene mase bio je smanjen u kasnijim vremenskim tačkama. Kod životinja koje se gubile masu, uzimanje hrane nije se značajnije razlikovalo od kontrolnih životinja. Ubrizgavanje PBS imalo je malo, ali značajno dejstvo na uzimanje hrane i na telesnu masu kod ob, db i normalnih miševa u poređenju sa miševima koji nisu primali i<n>jekcije.
Diskusija
Coleman je prvi ukazao na endokrinu funkciju proteinskog proizvoda OB lokusa, i pokazao da je telesna masa ob/ob miševa bila smanjena posle parabiotičke unije sa normalnim ili db miševima (Coleman i dr., 1978, napred citirano). Gore pokazani rezultati podržavaju tu hipotezu pokazujući da OB protein cirkuliše u krvi i da injekcije rekombinantnog proteina smanju telesni masu Molekulska masa genskog proizvoda kodiranog OB genok iznosi približno 16 kD, što je jednako karboksi-završetku sekvence 146 amino kiselina prema signalnoj sekvenci. Rekombinantni OB protein nije modifikovan kada je izražen u Pichia pastoris. Izražavanje gena sisara u Pichia obično dovodi do obrazovanja korektne proteinske strukture [Cregg i dr., Bio/Technology, 11:905-914 (1993)]. Ovi nalazi ukazuju da OB protein nije glikosilizovan i nije naknadno translaciono obrađen in vivo. Podaci ne isključuju mogućnost da je OB protein nekonvalentno vezan na sebe ili na druge proteine u plazmi ili adipoznom tkivu Mada proteolitičko kidanje proteina nije isključeno, nisu otkrivani oblici OB proteina male molekulske mase ni jednim od korišćenih seruma, uključujući četiri anti-peptidna antitela.
OB protein ima dva cisteinska ostatka i cirkuliše kao monomer u čoveku, a kao monomer i dimer u mišu. Nađen je intramolekulski disulfidni spoj tipičan za izlučene molekule kada je humani protein izražen u Pichia pastoris, što ukazuje da je verovatno da će biti prisutan i in vivo. To je podržano bioaktivnošću rekombinantnog bakterijskog proteina, koji ima jedam intramolekulski disulfidni spoj. Mišji OB protein može se naći u plazmi kao monomar i kao dimer. Monomer i dimer se vide kdaje mišji OB protein izražen ui kvascu, što pokazuje da je težnja mišjeg proteina da obrazuje jedan dimer rezultat razlika u primarnoj sekvenci u odnosu na humanu. Dok je jasno da monomer ima biološku aktivnost, funkcionalna aktivnost dimera je nepoznata.
Dejstvo OB proteina na uzimanje hrane i na telesnu masu je dramatično. Polse tri nedelje lečenja, ob miševi koji su dnevno primali in jekcije rekombinantnog proteina izgubili su 40% njihove mase i uzimah su 40% hrane u odnosu na kontrolne životinje. Pored toga, masa lečenih miševa se još nije ustalila u vreme kada je eksperiment završen. Rezultat eksperimenta uporednog hranjenja ukazao je da je gubitak mase rezultat delovanja i na uzimanje hrane i na utrošak energije. Tako je posebna grupa ob miševa čije je uzimanje kalorija ograničeno na ono koje su imali miševi koji su primali protein, gubila značajno manje mase od životinja koje su primale protein. Smanjenje uzimanja hrane kod ob/ob miševa do nivoa nižeg nego kod normalnih miševa, za jedan dan primanja OB proteina, ukazuje da su oni posebno osetljivi na njegovo dejstvo. U stvari, možda je kod tih životinja OB receptor regulisan na veću vrednostz. Uzimanje hrane kod lečenih ob mišeba postaje relativno konstantno posle pet dana lečenja. Ako je to rezultat toga da je protein dostigao nivoe ustaljenog stanja, to bi ukazalo da protein ima relativno velik poluživot, [The Pharmacological Basis of Therapeutics, str, 19-45; Goodman i Gilman, uredmici, Pergamon Press, New York (1990)]. Ovaj je zaključak konzistentan sa podacima parabioznih eksperimenata [Coleman i dr., 1978, napred citiran; VVeigle, Uni J. Obesity, 12:5670578 (1988)].
Uticaj rekombinantnog proteina na telesnu masu normalnih miševa bio je mali ali statiskički značajan u toku prve dve nedelje studije. Dok je razlika u masi između normalnih miševa koji su primali protein u odnosu na PBS bila održana u kasnijim vremenskim tačkama, statistički značaj podatak se jako smanjio posle tri nedelje. Rani gubitak mase nije mogao biti uzrok za razliku u uzimanju hrane. Pretpostavlja se da merenje uzimanja hrane nije bilo dovoljno tačno da bi se otkrilo smanjenje koje daje razliku od jednog grana telesne mase u toku lečenja. Ova se zapažanja razlikuju od rezultata ranijih ekspenmeta gde su normalni glodari bili spojem paravitičkim vezama sa db miševima, fa pacovima, pacovima sa lezijama hipotalamusa i pacovima ugojenim visokokaloričnom ishranom [ Colemanet al,1978,supra;Hamset al.,1987,supra;Harriset al,"Phvsiological and metabolic changes in parabiotic partners of obese rats", inHormones, Thermogenesis and Obesity,Lardy and Straatman, eds., Elsevier Science Publishing Co., New York (1989),Hervey,./. Physiol,145:336-352 (1959)]. U svakom od tih slučajeva normalne životinje su postajale anoretičke i gubile su ogromne količine telesne mase. Kako se povećavaju nivoi PB proteina u ob mišavima i fa pacovima i nivo OB RNK se povećava kod pacova sa lezijama hipotalamusa, verovatno je da normalni miševi mogu reagovati na OB kada on cirkuliše u plazmi na dovoljno visokom nivou. Ovde navedeni nalazi su konzistentni sa mogućnošću da su nivoi davanog proteina bili ispod endogenih nivoa, što dovodi do ustaljivanja na nežto malo nižoj telesnoj masi. Kvantitativno određivanje cirkulacionih nivoa OB proteina kod lečenih miševa rešiće ovo pitanje. Mada imunska ispitivanja mišjeg proteina još nisu raspoloživa, imunoprecipitacije su ukazale da nivoi cirkulišućeg OB proteina nisu bili bitno povećani kod normalnih miševa koji su primali protein.
Manje delovanje proteina kod normalnih mišava i odsustvo reagovanja kod db miševa, čini neverovatnim da lečenje nespecifično ili nepovoljno delovanje. Svi od db miševa su izgubili malu masu u periodu lečenja, bilo da su primali ili ne ob protein. Db životinje su bile izrazito hiperglikemične a gubitak mase je verovatno rezultat dijabetesa a ne eksperimentalnog protokola. C57BL/Ks db/db miševi često dobijaju dijabetes i počinju da gube male količline mase kada su starosti životinja korišćenih u ovoj studiji (Coleman i dr., 1973, gore). C57BL/6J ob/ob miševi slične starosti ne dobijaju značajniju hiperglikemiju. Smatra se da su ove fenotipske razlike rezultat genetskih razlika u solu 'C57B16J prema C57B1/Ks) koji su mutirani (Coleman i dr., 1978, kao napred).
Nenalaženje skraćenog proteina amino kiseline 105, predskazane cDNK sekvencom OB gena kod C57B1/6J ob/ob miševa ukazuje da je mutantni protein ili degradiran ili nije transliran. Međutim, ne može se isključiti mogućnost da korišćeni antiserumi ne mogu otkriti ovaj skraćeni protein. Zapaženo desetostruko povećanje nivoa ob proteina kod db miševa u poređenju sa normanim, ukazuje da je ob protein proizveden u prevelikim količinama kada postoju otpor na njegovo delovanje. Ovi se podaci slažu sa studijama OB mRNK. Kao što je pomenuto, prethodni eksperimenti su pokazali da mutacije mišjih db i fa gena kod pacova, koje su mapirane u homolognom hromozomalnom području, dovode do oorevelike proizvodnje jednog plazma faktora koji suzbija telesnu masu (Truet i dr., 1991, Coleman, 1974; Harvev, 1959, svi napred navedeni). U oba slučaja je ukazano da su mutantne životinje otporne na delovanje OB proteina. Ova je mogućnost potvrđena zapažanjem da OB protein ne deluje na telesnu masu ni na uzimanje hrane kada se da db miševima.
Gojaznost kod ljudi se može povezati sa povećanim nivoima OB proteina u plazmi kod pojedinaca koji su relativno neosetljivi na hormon. S druge strane, smanjeno izražavanje OB može takođe odvesti u gojaznost, u kom se slučaju mogu naći "normalni" (tj. neodgovarajuće niski) nivoi proteina. Na taj način nivoi OB proteina u humanoj plazmi mogu biti marker za različite oblike gojaznosti. Kod jedne male grupe mršavih subjekata s MBI < 25, mali nanogramski nivoi cirkulišućeg OB proteina mogu se otkriti testom ELISA. Zapažene su značajne, promenljive koncentracije koje ukazuju da nivo izražavanja i/ili osetljivosti na protein može imati ulogu kod određivanja telesne mase.
Mesto delovanja OB proteina je nepoznato. Protein utiče i na uzimanje hrane i na utrošak energije, što je nalaz konzistentan sa kliničkim studijama koje ukazuju da promene oba sistema deluju tako da regulišu telesnu masu [Leibel i dr N. Engl, J. Med., 332:621-628; Keesev i dr., "Metabolic defense of the body vveight set-point", u Association for Research in Nervous and Mental Disease, str. 87-96, Stunkard i Stellar, ured., Eaven Press, New York, (1984)]. Verovatno je da je hipotalamus iza OB na putu koji reguhse telesnu masu, mada je moguće neposredno delovanje na više organa.
PRIMER 9: Povećano izražavanje OB RNK u adipocitima kod miša sa
lezijama hipotalamusa i mutacijama na db lokusu.
Genski proizvod mišjeg gena gojaznosti (OB) koji je nedavno Uoniran ima važnu ulogu kod regulisanja mase adipoznog tkiva. OB RNK je specifično izražena adipocitima miša in vivo kod svakog od nekoliko razlčičitih naslaga masnih ćelija, uključujući mrko masno tkivo. Takodje je izražen u taltivisanim 3T3-442A predapocitnim ćehjama koje su bile podstaknute da se diferentuju. Miševi sa lezijama hipotalamusa kao i miševi koji su mutantoi na db lokusu izražavaju dvadesetostruko viši nivo OB RNK u adipoznom tkivu. Ovi podaci ukazuju da su i db gen i bipotalamus iza OB gena na putu koji reguliše masu adipoznog tkiva i konzšstentni su sa prethodnim eksperimentima koji ukazuju da db lokus kodira OB receptor. Kod db/db i miševa sa lezijom kvantitativne razlike u nivou izražavanja OB RNK odgovaraju sadržaju lipida u adipocitima. Molekuli koji regulišu nivo izražavanja OB gena u adipocitima verovatno imaju značajnu ulogu u ođređjrvanju telesne mase kao i molekuli koji posreduju delovanju OB na njegovom mestu delovanja.
Materijali i postupci
Hibridizacija in Situ
Belo masno tkivo iz identičnih abdominalnih područja normalnih (wt) i db miševa obradjeno je istovremeno prema modifikovanoj metodi Richardson-a i dr., Grovvth, Development & Aging, 56:149-157 (1992). Ukratko, tkiva su fiksirana u Bouinovom rastvoru u toku 2 časa na 4°C. Potom su bila demdrirana serisjkom obradom povećanim koncentracijama etanola od 10%-100%, svaka u trajanju od 5 min. na 4°C. Dalja inkubacija tkiva silolom (1 čas) i parafinom (2 Časa) vršena je na 65°C . Uliveno wt i db/db masno tkivo bilo je secirano i postavljeno kasnije pod istim usloivima. Sekcije su pečene na 65° u toku 1 časa, pa obradjeno ksilolom i nizom rastvora etanola od 100% do 50%, svaki put po 3 min, na sobnoj temperaturi Jedan uzorak protivsmislene RNK od OB gena bio je sintetizovan in vitro transkripcijom linearizovane kodne sekvence OB gena ispred jednog Sp6 promotora polimeraze RNK.
m situ hibridizacija je izvršena tačno prema Schaeren-VViemers i dr. Histochemistrv, 100:431-440(1993).
Priprema RNK i kultura ćelije
Totalna RNK i Northern razmaz pripremljeni su kao što je opisano. Stromalne vaskularne ćelije i adipociti su pripremljeni prema Rodbell-u, a RNK iz obe frakcije je pripremljen prema Dani i dr., Mol. Cell. Endocrinol, 63:199-208 (1989); RodbelL J. Biol. Chem. 239:375-380 (19). Posle podkloniranja 3T3-F442 ćelije su bile gajene u Dulbecco-vom modifikovanom Eagl-ovom medijumu koji je sadržao 10% seruma govedjeg fetusa (definisan kao standardni medijum)[ Dani i dr., "Molecular vbiologv techniques in the study of adipocvte differentiation", u Obesity in Europe vol. 88, pp. 371-376, Bjorntorp and Rossner, Eds., John Libbey Company Ltd., London, England
(1989) ]. Pri konfluenciji ćehje su bile obradjene u standardnom medijumu sipanom sa 2 nM triidotironina (T3) i 17 nM msulina. Dvanaest dana kasnije RNK je pripremljena kao napred.
Obrada aurotioglukozom (GTG)
Dva meseca stare ženke CBA7J miševa bile su lečene jednom jedinom intraperitonalnom injekcijom aurotioglukoze (Sigma Katalog br. A0632) u dozi od 0,2 mg/g u normalnom slanom rastvoru. Kontrolne životinje su dobile injekciju normalnog slanog rastvora. Miševi su mereni mesec dana posle tretmana. Adipozno tkivo je bilo izdvojeno iz onih tretiranih životinja čija je masa porasla za više od 20g posle GTG tretiranja. ,
Rezultati
Nedavno je utvrdjeno da se OB gen izražava u adipoznom tkivu (Zhang i dr. Nature, 372:425-432 (1994)). Kako je adipozno tkivo sastavljeno od više ćelijskih tipova, uključujući adipocite, predadipocite, fibroblaste i vaskularne ćelije, hibridizacija in Situ izvedena je na sekcijama epididimalnih masnih naslaga od normalnih životinja sa smislenim i antismislenim OB ribo uzorcima (Richardson i dr. , 1992, supra; VVasserman, "The concept of the fat organ" u Rodahl, Issekutz, fat as a tissue", pp. 22-92, McGrew HilL New York (1964). Kada je korišćena antismisleni uzorak, pozitivni signali su bih primetljivi u svim adipocitima u sekciji (slika 30 - obeležena Wt). Signali nisu bili primećeni kada je antismisleni uzorak bio hibridizovan na sekcije mozga (podaci nisu prikazani). Hibridizacija antismislenog uzorka na sekcije sntipoznog tkiva od C57B1/Ks db/db miševa bila je veoma povećana, potvrdjujući adipocitno specifično izražavanje OB RNk i pokazujući veliko povećanje u nivou OB RNK po adipocitu kod ovih životinja (slika 30 - obeležena db/db). Miševi mutanti na db lokusu su masivno gojazni kao deo sindroma koji je fenotipski identičan onome koji se sreće kod C57B1/6J ob/ob miševa (Bahary i dr., 1990, supra).
OB RNK nije bio sintetizovan stromalnim ćelijama adipoznog tkiva izdvojenim iz adipocita. Kao što se očekivalo, ćelije u adipocitnoj frakciji izražavale su OB RNK koristeći Northern razmaze (slika 31). Isti rezultat je dobijen koristeći RT-PCR (podaci nisu prikazani). Ovi podaci podržavaju zaključak da samo adipociti izražavaju OB gen. Podaci iz kultivisanih adipocita potvrdjuju ovaj zaključak. Kod ovih studija 3T3-F442A ćehje su kultivisane koristeći uslove koji vode do akumulacije lipida, kao deo jednog ćelijskog programa koji vodi do diferentovanja u adipocite. Nije bila izražena OB RNK u eksponencijalno rastućim ćelijama niti u korjrfluentnim 3T3-F442A preadrpocitnim ćelijama koje izražavaju ranije markere, dok je diferentovanje ovih ćelija u adipocite vodilo do izražavanja prepoznatljivih nivoa OB RNK (slika 31) (Dani i dr., J. Biol. Chem. 264:10119-10125 (1989)). Nivo OB RNK je krajnje osetljiv na uslove kulture pošto nije primećena ni jedna poruka u kasnijim, postkonfluentnim ćelijama koje nisu bile izložene msulinu.
Studije hirbridizacije pokazuju da je OB RNK izražena in vivo u nekoliko različitih naslaga masti uključujući masne naslage sa testisa, okolomaterične, adbominalne, nadbubrežnei preponske (slika 32A). Precizan nivo izražavanja od naslaga bio je u nekoj meri promenljiv pri čemu su preponske i okolomaterične masne naslage izražavale niže nivoe OB RNK. OB RNK je takodje izražavana u mrkom adipoznom tkivu, mada je nivo izražavanja približno 50-struko niži u mrkom masnom tkivu u odnosu na druge naslage adipoznog tkiva. Ove kvantitativne razlike uopšteno se poklapaju sa prethodno objavljenim razlikama u veličini ćelija izmedju različitih naslaga masnih ćelija. (Johnson i dr. , J. Lipid Res. , 13:2-11(1972)). Na količinu OB RNK u mrkom masnom tkivu ne utiče izlaganje hladnoći, (slika 33B). Kod tog eksperimenta nivo odvajajućeg proteina RNK (UCP) povećao se u mrkom masnom tkivu posle izlaganja hladnoći, dok se nivo ob RNK nije promenio. (Jacobsson idr., J. Biol. Chem, 260:16250-16254 (1985)). U celini ovi podaci potvrdjuju da su svi adipociti sposobni za proizvodnju OB RNK i pokazuju promenljiv nivo izražavanja u različitim masnim naslagama. Ovi podaci podržavajmu mogućnost da je nivo kodiranog proteina u vezi sa ukupnom masom adipoznog tkiva.
Mereni su nivoi OB RNK kod db/db miševa i miševa sa lezijama hipotalamusa. Lezije ventromedijalnog hipotalamusa (VMH) dovode do gojaznosti kao deo sindroma koji liči na onaj koji se sreće kod ob/ob i db/db miševa (Bray i dr., Metabolism, 24:99-117 (1975)). Parabiozni eksperimenti ukazuju da takve lezije dovode do preteranog izražavanja jednog faktora u krvi koji suzbija uzimanje hrane i smanjuje telesnu masu (Hervey, 1959), supra). Slični rezultati su zapaženi kada su miševi mutantni na db lokusu biološki povezani sa nomalnim miševima, što ukazuje da bi OB receptor mogao biti kodiran db lokusom (Coleman i dr., 1978, supra). Na taj način gojaznost koja potiče od VMH lezija i db mutacija može biti rezultat otpornosti na delovanje OB proteina. Ako je to tako, predskazaće se sekundarno povećanje nivoa OB RNK u adipoznom tkivu.
Lezija hipotalamusa su izazvane kod ženki CBA miševa koristeći aurotioglukozu (GTG) (Debons i dr., Fed. Proc, 36:143-147 (1977)). Ova obrada dovodi do specifičnih lezija hipotalamusa, prvenstveno kod ventromedijalnog hipotalamusa (VMH), uz potonji razvoj gojaznosti za nekoliko nedelja. Obično jedna jedina intraperitonalna injekcija GTG od 0,2mg/gm telesne mase dovodi do razvoja gojaznosti u roku od četiri nedelje. Mesec dana stare ženke CBA miševa (20-25 grama) bile su tretirane sa GTG i došlo je do povećanja telesne mase kod tretiranih i kontrolnih životinja (tabela 2). RNK adipoznog tkiva pripremljena je od db/db miševa i od GTG tretiranih životinja koje su dobile > 20gm. Northern razmazi pokazali su 20-struko povećanje nivoa OB RNK u dva meseca starim db/db i GTG tretiranim miševima u poredjenju sa nomalnim životinjama (slika 33).
Dva meseca stare ženke CBA/J miševa bile su tretirane aurotioglukozom (GTG). Aurotiogiukoza (Sigma A0632) intrapeirtonealno je data u normalnom slanom rastvoru u dozi od 2,0 mg/g. Telesna masa kontrolnih i životinja kojima je data injekcija zabeležena je pre i jedan mesec posle davanja injekcije. Životinje su bile smeštene po pet u jednom kavezu i hranjene su bez ograničenja. Kohčina dobijene mase mesec dana posle injekcije prikazana je u tabeli 2. Životinje sa povećanjem telesne mase većim od 20 g mesec dana posle primljene injekcije odabrane su za dalje proučavanje.
Diskusija
Genski proizvod mišjeg OB gena cirkuliše u mišjoj humanoj plazmi, gde može da deluje tako da reguliše masu adipoznog tkiva. Dalje studije regulisanja izražavanja i mehanizma delovanja OB imaće važne implikacije na naše shvatanje fizioloških puteva koji regulišu telesnu masu.
Ovaj primer pokazuje da je proizvod OB gena izražen isključivo adipocitima u svim naslagama adipoznog tkiva. Ovaj rezultat je konzistentan sa verovatnoćom da je proteinski proizvod OB gena u korelaciji sa telesnim naslagama lipida. Pored toga OB RNK je regulisana na veću vrednost, dvadesetostmku kod db miševa i miševa sa lezijama hipotalamusa. Kod ovih životinja stvaran porast nivoa OB RNK po ćeliji verovatno je čak viši nego dvadeset puta, pošto je veličina adipocitnih ćelija kod ovih životinja uvećana približno pet puta (videti sliku 3) (Debons i dr., 1977, supra). Ovi podaci postavljaju db gen i hipotalamus iza OB na putu koji kontroliše telesnu masu i konzistentan je sa hipotezom da je OB receptor kodiran na db lokusu (Coleman i dr., Diabetologia 14:141-1,48 (1978)). Molekusko kloniranje OB receptora i/ih db gen rešiće će ovo pitanje. Povećanje nivoa OB RNK u db/db i GTG tretiranim nnševima takodje ukazuje na ne ćelijski autonomnu funkciju proizvoda OB gena u masnim ćelijama (Ashvvell i dr., Proc. R. Soc. Lond. 195:343-353 (1977); Ashvvell i dr., Diabetologia, 15:465-470). Prema tome ako je kodirani protein delovao direktno na masne ćehje da bi sprečio rast ih drferentovanj, preterano izražavanje prirodnog OB gena u GTG tretiranim miševima dovelo bi do mršavog fenotipa.
Najverovatnije objašnjenje ovih podataka je to da OB protein funkcioniše kao jedan endokrini signalni molekul koga izlučuju adipociti i koji deluje neposredno ih posredno na hipotalamus. Dnektni uticaj na hipotalamus zahtevao bi da postoji mehanizam koji omogućuje prolaz proizvoda OB gena kroz barijeru krv-mozak. Mehanizmi koji obuhvataju cirkumventrikularni organ i/ih specifične transportere, može omogućiti pristup mozgu molekulu veličine kao što je ona koj kodira OB gen (Johnson i dr., FASEB J., 7:678-686 (1983); Baura i dr., J. Clin. Invest. 92:1824-1830
(1993); Pardrige, Endocrine Revievvs, 7:314-330 (1986)). Medjutim ova se hipoteza mora oprezno razmotriti dok ne bude identifikovan način kakom protein može da prodje kroz barijeru krv-mozak. Pored toga mora se proceniti moguće dejstvo na druge izložene organe.
Signal(i) masnih ćelija koje su odgovorne za kvantitativne varijacije nivoa izražavanja OB gena još nije poznat, ah postoji korelacija sa razlikama u veličini adipocitnih ćelija. Adipociti iz db/db miševa pet puta su veći od onih od normalnih miševa, sa veličinom ćelija od približno l.Op lipid/ćeliji (Johnson i dr., 1972, supra). Raniji podaci ukazuju da je sadržaj i/ili veličina lipida u masnim ćelijama važan parametar kod odredjivanja telesne mase (Faust i dr., Am. J. Phvsiol., 238:279-286
(1978); Faust i dr., Science, 197:393-396 (1977)). Moglo bi biti da svaka od masnnih ćelija izražava nizak nivo OB RNK koji se dalje uvećava u srazmeri sa veličinom ćelije. Isto tako je moguće da veličina ćelije nije detetktovan parametar, već je u korelaciji sa intracelularnim signalom koji uvećava izražavanje OB gena u adipocitima od db/db i VMH leziranim miševa. U svakom slučaju verovatno je da komponente putanja transdukcije signala koji reguliše sintezu OB RNK mogu biti važne kod odredjrvanja telesne mase. Genetski uticaji i uticaji okoline koji smanjuju nivo izražavanja OB, delovaće tako da povećavaju telesnu masu, kao što će učiniti uticaji koji smanjuju osetljivost na kodirani protein. Specifični molekuli koji regulišu nivo izražavanja nivo OB gena još uvek su nepoznati, i očekuju odredjivanje nivoa genske kontrole koja vodi ka kvantitativnim varijacijama nivoa OB RNK, kao i ispitivanje reguladonih elemenata OB gena. Identifikacija molekula koji regulišu izražavanje OB gena u adipocitima i onih koji posreduju delovanju kodiranog proteina na mestima njegovog delovanja, mnogo će pomoći našem shvatanju fiziološkog mehanizma koji regulišu telesnu masu.
PRIMER 10. Šema izražavanja RNK i mapiranje fizičkim citogenetskim i
genetskim mapama hromozoma 7
OB RNK je izražen na visokim nivoima u humanom adipoznom tkivu a na znatno nižim nivoima u placenti i srcu. Humani OB gen mapira se na velikim Contig veštačkog hormozoma kvasca (YAK) izvvedenog iz hromozoma 7q31.3. Pored potvrđjivanja relativne lokacije gena baziranog na komparativnom mapiranju mišje-humanih gena, ova je studija identifikovala osam utvrdjenih rnikrosatehtskih markera u neposrednoj fizičkoj blizini humanog OB gena. Pošto mutacije u mišjem OB genu mogu dovesti do jednog sindroma koji mnogo liči na bolesnu gojaznost kod ljudi, ovi genetski markeri predstavljaju važan alata za proučavanje moguće uloge OB gena kod naslednih oblika humane gojaznosti.
Materijali i postupci
Analiza Northern razmaza.
Totalna RNK pripremljena je od adipoznog tkiva koristeći postupak Chirgvvin-a i dr., Biochem, 18:5294-5299 (1979). Northern razmazi i radioaktivno obeležavanje i hibridizacija, izvodjeni su kako je opisano (Zhang i dr., 1994, supra). Northern razmazi poliA+ RNK (humani MTN, humani MTN II i humani fetalni MTN II) dobijeni su od CLONETECH (Palo Alto, CA), kaio i PCR osnovi (prajmeri) koji su korišćeni za generisanje radioaktivno obeleženih humanih aktinskih uzoraka.
Razvoj STS
PCR ispitivanja specifična na mesta obeležena sekvencom (STS - sequence tagged-site) razvijena su i optimizovana kako je opisano [Green i dr., PCR Methods Applic, 1991, Green i dr., Genomics, 11:548-564 (1991); Green, "Phvsical mapping of human chromosomes: generation of chromosome-specific sequence-tagged sites", u Methods in Molecular Genetics Vol. 1, Gene and Chromosome Analvsis (Part A), str. 192-210, Adolpf, ed., Academic Press, Inc., San Diego (1993); Green i dr., Hum. Mod. Genet, 3:489-501 (1994)]. Svako STS je imenovano koristeći prefiks "sWSS" praćen jednim jedinstvenim brojem. Detalji za 19 STS koja se ovde pominju dati su u Tabeli 3, pri čemu je dodatna informacija (na primer, uslovi PCR reakcije, kompletna sekvenca DNK) dostupna u GenBank ili u Genome Data Base (GDB) (Genomska baza podataka). Za mikrosatelitski-specifična STS, oligonukleotidni osnovi (prajmeri) korišćeni u PCR testovima (Tabela 3) odgovarali su bilo onima primenjenim na genotipske analize 'Tabela 4), ili onim projektovanim (najčešće računarskim programom OSP) [Hilier idr., PCR Methods Applic., 1:124-128 (1991)]koristeći DNK sekvencu koja se može dobaviti iz GenBank. Tabela 3 prikazuje STS u YAC kontigu koji sadrži humani OB gen.
Navedeno je 19 hromozom 7-specifičnih STS mapiranih na YAC kontig koji sadrži humani OB gen (slika 35). Za svako od njih je naznačeno "sWSS" ime, važeći drugi naziv, GDB naznačeno ime lokusa, STS izvore, sekvenca PCR osnva, veličina STS i GDB identifikacioni broj. Izvori STS su sledeći: "YAC kraj" (izdvojen ulazni kraj jednog YAC-a(Green, 1993, supra), "Lambda klon" (proizvoljan hromozom 7-specifičan lambda klon) (Green i dr., 1991, supra; Green, 1993, supra), "genetski marker" (mikrosatelitski marker, videti Tabelu 2) (Green i dr., 1994, supra), "YAC insert" (proizvoljan segment YAC inserta) i "Gen" (gen-specifično STS). Treba napomenuti da su za neke genetski marker-specifične STS, PCR osnovi koji se koriste za identifikovanje YAC-ova (navedeni u ovoj tabeli) različiti od onih koji su korišćeni za vršenje genotipske analize (Tabela 4), pošto otkrivanje YAC-ova koji sadrže genetski marker ne zahteva pojačavanje samog polimorfnog trakta. Sva od naznačenih PCR uvek su koristila temperaturu opuštanja od 55°C, osim sWss494, sWSS883, sWSS1529 i SVVSS2619 (koja su koristila 50°C), sWSS999 i sWSS1174 (koja su koristila 60°C) i sWSS808 (koje je koristilio 65°C). Dodatni detalji koji se odnose na STS-specifična ispitivanja mogu se pribaviti u GDB.
Prikazano je osam mikrosatelitskih markera mapiranih na YAC kontig koji sadrži humani OB gen (slika 35). Za svaki od njih je naznačeno ime markera (naznačeno kao drugi naziv u Tabeli 3), tip mikrosatelitske šeme (tetra-nukleotidna, "Tetra" ponovljena ili (SA)nponovljena), GDB-naznačeno ime lokusa, sekvence osnova korišćene za PCR-zasnovanu genotipsku analizu, kao i GDB identifikacioni broj. Dodatni detalji koji se odnose na PCR ispitivanja i na polimorfizme, mogu se dobiti kod GDB.
Humano OB-specifično STS (sWSS2619) projektovano je koristeći DNK sekvencu dobijenu iz 3' netransliranog područja cDNK. Humano Pax4-specifično STS (sVVSS808) razvijeno je koristeći sledeću strategiju. Oligonukleotidni osnovi specifični za mišji Pax4 gen (GGCTGTGTGAGCAAGATCCTAGGA) (SEO ID NO:63) i (GGGAGCCTTGTCCTGGGTACAAAG) (SEO ID NO:93) [ VValther i dr. 1991, Genomics 11:424-434) (1991)] korišćeni su da se pojača jedan 204-pb ffagmet humane genomske DNK (koji je bio proizvod iste veličine kao onaj generisan iz mišje genomske DNK). Ovo PCR ispitivanje nije bilo pogodno za identifikovanje odgovarajućih YAC-ova, jer je jedan proizvod slične veličine (200 bp) takođe pojačan iz DNK kvasca. Međutim, analiza DNK sekvence PCR proizvoda generisanog iz humane DNK otkrila je supstitucije na 20 pozicija duž 165 analiziranih baza (podaci nisu prikazani). Koristeći ovu humano-specifičnu sekvencu, projektovan je novi osnov (TTGCCAGGCAAAGAGGGCTGGAC)
(SEQ ID NO:64) i korišćen sa prvim od gore navedenih mišjih Pax4-specifičnih osnova (videti Tabelu 3). Dobijen humano Pax4-specifičan PCR test nije pojačao neli značajniji proizvod iz DNK kvasca pa je zato korišćen za identifikovanje odgovarajućih YAC-ova.
Identifikacija YAC-ova PCR-baziranim pretraživanjem
Mećina YAK-ova prikazanih na slici 35 izvedena je iz kolekcije klonova visoko obogaćenih humanim hromozomom 7 DNK ("YAC izvor hromozoma 7")
(Green i dr., supra) koristeći jednu PCR-zasnovanu strategiju pretraživanja [Green i dr., 1995, supra; Green i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1213-1217
(1990)]. U nekoliko slučajeva klonovi su izdvojeni PCR-zasnovanim pretra-živanjem (Green i dr., 1990, supra) raspoloživih totalnih humano genomskih YAC biblioteka sastavljenih u CEPH [Dasset i dr., Behring Inst. Mitt., 91:13-20
(1002); Albertsen i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4256-4269 (1990)] ili ICI [Anand i dr., Nucl. Acids Res., 17:3425-3433 (1989): Anand i dr., Nuc. Acids Res., 18:1951-1956 (1990)]. Svaki od YAC-ova je imenovan koristeći prefiks "yVVSS" iza koga sledi jedinstven broj.
Rezultati i diskusija
Ispitivanje izražavanja u tkivu humanog OB gema analizom pomoću Northern razmaza, pokazalo je da je OB RNK izražena na visokom nivou u humanom adipoznom tkivu a na mnogo nižim nivoima u placenti i srcu (slika 34), Veličina RNK (približno 4,5 kb) bila je podjednaka kod čoveka i kod miša kao i u svakom od tkiva za izražavanje. Kod tih istraživanja, petostruko viši signali su uočeni u 10 pg totalne RNK adipoznog tkiva nego u 2 pg polyA<+>placentne RNK. Petostruko niži signal je uočen u polyA<+>iz srca u odnosu na placentu. Utvrđeno je da je nivo OB RNK približno 250 puta manji u placenti nego u adipoznom tkivu. Kod tog eksperimenta, OB RNK nije otkrivena ni u jednom od drugih analiziranih tkiva, uključujući mozak, pluća, jetru, skeletne mišiće, bubrege i pankreas. Dodatni eksperimenti nisu otkrili OB RNK ni u slezini, timusu, prostati, testisima, jajnicima, tankom crevu, debelom crevu, leukocitima periferne krvi, niti u mozgu, jetri ili bubrezima fetusa (podaci nisu prikazani). Moguće je da je OB izražena na nekom neprepoznatljivom nivou (za analizu Northern mrljom) u ovim tkivima ili u drugim tkivima koja nisu proučavana. Posmatrana šema izražavanja kod ljudi nešto se razlikuje od mišje, kod koje je OB RNK otkrivena skoro isključivo u adipoznom tkivu.
Uporedno mapiranje područja OB gena u mišjim i humanim genomima
Mišji OB gen je lociran na proksimalnom hromozomu 6 podrčju homolognom delu humanog hromozoma 7q. Geni unutar tog segmenta obuhvataju (od proksimalnog do distalnog); Met protoonkogen, regulator provodljivosti cističko fibrozne membrane (Cff), "paired box-containing" gene 4 (Pax4), OB i karboksipeptidazu A (Cpa) (Zhang i dr., 1994, supra; Friedman i dr., supra). Kod miša, genetsko mapiranje korišćeno da bi se pokazalo da je Pax4 čvrsto vezan za ob [VValther i dr., 1991, supra, Zhang i dr., 1994, supra]. Utvrđeno je da je fizičko rastojanje između OB i pax4 približno jedan megabazni par (Mb) (Zhang i dr., supra). Na bazi ovih uporednih proučavanja mapiranja, očekivalo se da će se humani OB gen nalaziti između Pax4 i CPA na hromozomu 7q. Pored toga, pošto su humani CFTR [Ueng i dr., Cell Genrt, 62:108-109
(1993)] i Pax4 [Tarama i dr., Cvtogenet. Cell Genet, 66:1320134 (1994)] mapirani pomoću fluorescensne in situ hibridizacije (FISH) na 7q31.3 i 7q32, najverovatniji citogenetički položaj humanog gena bio bi u blizini granice 7q31.3-7q32.
Mapiranje OB gena na humanom hromozomu 7
Jedno STS (sWSS2619) koja pojačava jedan mali segment 3' netransliranog područja humanog OB gena, korišćeno je da se pretraži kolekcija YAC klonova koja je bila veoma obogaćena DNK humanog hromozoma 7 (Green i dr., 1955a, Genomics 25: 170-183) i identifikovano je 9 YAC-ova (yWSS691, vWSS1332, yVVSS1998, yWSS2087, yWSS3319, yWSS3512, yWSS4875, yWSS4970 i yWSS5004). Da bi se potvrdilo da ovi YAC-ovi sadrže autentični humani OB gen, itvedena su dva dodatna eksperimenta. Kao prvo, svaki od YAC-ova je ispitan drugim humano OB-specifičnim PCR-testom, i utvrđeno je da su svi pozitivni (podaci nisu prikazani). Kao drugo, DNK kvasca iz svakog od klonova bila je razložena pomoću EcoRl i analizirana gel-transfer hibridizacijom, koristeći uzorak izveden iz humane OB cDNK. U svin slučajevima je uočena jedna jedina traka hibridizovanja, a ta je traka bila iste veličine kao kod YAC-ova i jednog Pl klona za koji se zna da sadrži humani OB gen (podaci nisu prikazani).
Koristeći računarski program SEGMAP (Green i Green, 1991, supra) i druge podatke o sadržaju STS, bazirane na YAC-ovima, a koje smo generisali za hromozom 7 (green i dr., 1991, supra; Freen i dr., 1994, supra; Green i dr., 1995, supra), utvrđeno je da se humani OG gen nalazi unutar YAC kontiga prikazanog na slici 35: Tačnije, ovaj se kontig sastoji od 43 preklapajuća YAC-a i 19 pojedinačno raspoređenih STS. Detalji o svakoj od 19 STS dati su u Tabeli 3. Pored OB-specifičnih STS, kontig takođe sadrži jedno STS (sWSS808) specifično za humani Pax4 gen (Tamura i dr., 1994, supra; Stapleton i dr., 1993. Nature Genet. 3:292-298), 7 STS izvedenih hromozom 7-specifičnih YAK-ova, 2 STS izvedena iz hromozom 7-specifičnih lambda klonova, i, što je važno, 8 mikrosatelitski-specifičnih STS. Dodatni detalji o ovih 8 genetskih markera, uključujući sekvence osnova korišćene za genotipsku analizu, dati su u Tabeli 2. Treba napšomenutida postoji redundantna spojivost, na bazi YAC-ova, kroz ceo kontig (tj. postoje 2 ili više YAC-ova koji povezuju svaka dva susedna para STS), što daje jaku podršku relativnom rasporedu STS prikazanom na slici 35.
Kao što je prikazano na slici 35, predskazana orijentacija YAC kontiga koji sadrži humani OB je takva, da je sWSS1734 najviše centromerno STS (tj, najbliže do CFTR), dok je sWSS2367 najviše telomerno STS (tj, najbliže do CPA). Ova se orijentacija pretežno zasniva na podacima komparativnog mapiranja, koji postavljaju Pax4 proksimalno a OB distalno unutar sintetičkog bloka koji postoji u mišjoj i humanoj DNK (Zhang i dr., 1994, supra). OB gen je mapiran blizu telomernog kraja kontiga, zasnovano na smeštanju OB-spccifičnog STS (sWSS2619). Dok je kontig prikazan na slici 35 izveden programom SEGMAP bez uzimanja u obzir veličina YAC-ova (zbog čega su STS prikazana na jednakim međusobnim rastojanjim), slična analiza podataka programom SEGMAP koji je uzimao u obzir veličine YAC-ova, ukazala je da je područje pokriveno kontigom nešto vrlo malo veće od 2 Mb (podaci nisu prikazani). S tim u vezi, mada su svih 8 mikrosatelitski specifičnih STS (Tabela $) sadržana u genomskom intervalu koji obuhvata, grubo, 2 Mb, tri najbližih telomernom kraju kontiga (sWSS1392, sWAA1148 i sWSS2367) posebno su blizu samog OB gena (možda unutar intervala od svega oko 500 kb). U stvari, sve tri ova STS nalaze se u bar jednom od kontiga koji sadrže humani OB. Treba napomenuti procenjeno da je interval između humanog Pax4 (sWSS808) i ob(sWSS2619) približno 400 kb, pri čemu je bilo predskazano da to područje obuhvata približno 1 Mb kod miša 'Zhang i dr., 1994, supra). Konačno, 3 od YAC-ova unutar kontiga (yWSS691, yWSS999 i yWSS2935) takođe su analizirani FISH-omi utvrđeno je da svaki od njih hibridizuje isključivo na 7q31.3. Jedan od ovih YAC-ova (yWSS691) sadrži OB-specifično STS, dok druga dva klona sadrže Pax4-specifično STS.
Ovi drugi rezultati su uglavnom konzistentni sa prethodnim citogene-tičkim smeštanjem humanog Pac4 u 7q32 (Tamura i dr., 1994, supra). Na osnovu ovih podatak, humani OB gen može se pripisati citogenetičkoj traci 7q31.3
PRIMER 11: Humani OB polipeptid je biološki aktivan kod miševa
Grupe od po 10 ob/ob miševa dobijale su peritonealne injekcije lOpg/g/dan rekombinantni (bakterijski) humani i mišji OB polipetid ili slani rastvor. Posle četiri dana, grupa koja je primala slani rastvor izgubila je 0,3 g. Grupa koja je primala mišji OB izgubila je 3,2 g. Grupa koja je primala ljudski OB izgubila je 2 g (p<0,01 u poređenju sa kontrolnim koji su primali slani rastvor). Kod ovi grupa je proveravano i uzimanje hrane. Podaci za uzimanje hrane prikazani su u Tabeli 2, a podaci o telesnoj masi prikazani su u Tabeli 6.
Ovi podaci pokazuju da je human OB biološki aktzivan kod miševa.
PRIMER 12; Velika doza OB utiče nepovoljno na normalne miševe
Normalni miševi )C57B16J+/?) dobijali su 10 pg/g/dan rekombinantnog mišjeg OB a telesna masa im je merena svaka četiri dana. Rezultati su prikazani u Tabeli 7.
Ovi podaci pokazuju da OB utiče na telesnu masu normalnih moševa kao i kod gojaznih (ob/ob) miševa, mada u mnogo manjoj meri.
Primer 13: OB polipeptid davan pumpom za kontirtualnu infuziju
Ovaj primer pokazuje da kontinualna infuzija OB polipeptida dovodi do gubitka telesne mase normalnih miševa. Normalnim (negojazni ) miševima davan je mišji ob polipeptid infuzijom pomoću osmotske pumpe. Doza od 0,5 mg proteina/kg telesne mase/dan dovela je do gubitka ođ 4,62% (+1,34%) od osnovne telesne mase do 6. dana infuzije.
Materijali i metode
Životinje
U ovom su primeru korišćeni normalni miševi (+/-) C57B1&. Miševi su držani izdvojeno, po jedan u kavezu i održavani u humanim uslovima. Starost miževa na početku bila je 8 nedelja, a kod životinja je telesna masa bila stabilisana. Po deset miševa je korišćeno za svaku grupu (nosač prema proteinu).
Merenje ishrane i mase
Miševima je davana mlevena glodarska hraba (PMI Feeds, Inc.) u hranilicama za hranu u prahu (Allentovvn Caging and Equipment), što je omogućili tačnije i osetljivije merenje uzimanja hrane nego redovna kompaktna hrana. Telesna masa je merena u isto vreme svakog dana '14:00 časova) u periodu od 6 dana. Telesna masa na dan pred infuziju definisana je kao osnovna masa.
Kloniranje mišje OB DNK
Kloniranje mišje OB DNK za izražavanje u E. coli izvršeno je na sledeći načinDNK sekvenca izvedena iz publikovane peptidne sekvence koja je objavljena kod (Zhang i dr., 1994, supra, Primer !, supra) reverzno je translirana koristeći optimalne kodone E. coli. Terminalna mesta kloniranja su bila Xbal do BamHl. Jedan ribosomalni pojačavač vezivanja i jednojako ribosomalno mesto vezivanja su uključeni u prednji deo područja kloniranja. Dupleksna DNK sekvenca je sintetizovana koristeći standardne tehnike. Korektni klonovi su potvrđeniprikazivanjem izražavanja rekombinantnog proteina i prisustvom korektne OB DNK sekvence u postojećem plazmidu. Sekvenca amino kiselina (i DNK sekvenca) je sledeća : Sekvenca rekombinantne mišje met OB (dvolančane) DNK i amino kiselina
(SEQ ID NOS.94 i 95)
Vektor izražavanja i soj domaćina
Korišćen plazmidni vektor izražavanja za proizvodnju proteina bio je pCDM1656, American Type Culture Collection (ARCC) Accession No, 69576. Navedena DNG je vezana u vektor izražavanja pCFM1656 koji je bio linerizovan pomoću Xbal i BamHl, i transformisana u E.coli soj domaćin, FM5. E. coli FM5 ćelija bile su izvedene u Amgen Inc., Thousand Oaks, CA iz soja E. coli K-12 (Bachmann i dr.m Bacteriol, Rev., 40:116-167 (1976)) i sadrže integrisan lambda fagni supresorski gen clg^. Proizvodnja vektora, transformacija ćelija i biranje kolonije vrđeni su standardnim metodama, na prime Sam,brook i dr. 1989, supra. Ćelije domaćini su gajene u LB medijumu.
Davanje proteina ili nosača
Za ove eksperimente je korišćen rekombinantan mišji polipeptid, obično u koncentraciji od oko 0,9 mg/ml fosfatno puferisanog slanog rastvora, pH 7,4, Sekvenca amino kiselina ( i DNK sekvenca) koja je korišćena, prikazana je napred. Protein ili nosač (posfatno puferovan slani rastvor, pH 7,4) davani su infuzijom pomoću osmotske pumpe. Alzet osmotske minipumpe (Alza, Palo Alto, CA, model No. 1007D) hirurški su usađene u svakog miša u jedan potkožni džep u supskapularnom području. Pumpe su bile kalibrisane da daju 0m5 ml proteina u rastvoru na čas da bi se dobila doza od 0,5 mg proteina/kg telesne mase/dan. Kontrolne životinje su dobijale infuziju fosfatno puferovanog slanog rastvora (pH 7,4) preko Slzet osmotske minipumpe.
Proces fermentacije. Tro-fazni protokol poznat kao proces dovođenja po partijama korišćen je za pripremanje proteina. Sastavi medijuma su sledeći.
Partija. Izvor azota i fosfata bili su sterilisani (povećanjem temperature na 122°C u toku 35 minuta, 10-20 psi) u posudi za fermentiranje (Biolafitte, zapremine 12 litara). Nakon hlađenja, aseptički su dodani ugljenik, magnezijum, vitamini i izvori metala u tragovima, Jedan preko noći obrazovana (16 ili iše časova) pomenutoih bakterija koje proizvode mišji protein, od 500 ml (gajene u LB supu) dodana je u fermentor.
Punjenje I. Nakon dostizanja između 4,0-6,0 O.D.600Punjenje I je dodano kulturama. Glukoza je dodavana ograničenom brzinom kako bi se kontrolisala brzina rašćenja (p). Programiran je jedan automatizovan sistem (nazvan Distribucioni kontrolni sistem) da reguliše brzinu rašćenja na 0,15 generacija"<1>.
Punjenje II. Kada je O.O. dostiglo 30, temperatura je lagano povećana na 42°C i punjenje promenjeno u Punjenje II, niže opisano. Pušteno je da se fermentacija nastavi još 10 časova, sa uzimenjem uzoraka svaka 2 časa. Posle 10 časova je sadržaj fermentora rashlađen na ispod 20°C i proizvof izdvojen centrifugiranjem.
Sastav medijuma
Vitarrmski rastvor (Partija, Punjenje I): 0.5 g biotina, 0.4 g folne kiseline, i 4.2 g riboflavina, rastvoreni su u 450 ml H20 i 3 ml 10 N NaOH, i dopunjeni do 500 ml sa H20. 14 g piridoksin-HCl i 61 g niacina rastvoreno je u 150 ml H20 i 50 ml 10 N NaOH, i dopunjeno do 250 ml sa H20. 54 g pantotenske kiseline rastvoreno je u 200 ml H20, i dopunjeno do 250 ml. Ova su tri rastvora kombinovana i dopunjena do ukupne zaprernine od 10 litara.
Rastvore metala u tragovima (Partija, Punjenje I):
Ferihlorid (FeCl36H20): 27 g/L
Cinkhlorid (ZnCl24H20): 2 g/L
Kobalt hlorid (CoCl2 6H20): 2 g/L
Natrijum molibdat (NaMo04 2H20): 2 g/L
Kalcijum hlorid (CaCl22H20): 1 g/L
Bakar sulfat (CuS04 5H20): 1.9 g/L
Borna kiselina (H3B03): 0.5 g/L
Mangan hlorid (MnCl24H20): 1.6 g/L
Natrijum citrat dihidrat: 73.5 g/L
Proces prečišćavanja mišjeg OB polipeptida
Prečišćavanje je izvršeno po sledećim stupnjevima (ukoliko nije drugačije naznačeno, sledeći stupnjevi su izvođeni na 4°C)Č
1. Ćelijska pasta. Ćelijska pasta E. colibila je suspendovana u petostrukoj zapremini 7mM EDTA, pH 7,0. Ćelije u EDT su dalje sitnjene u dva prolaza kroz jedan uređaj za mikrofluidiziranje. Isitnjene ćelije su centrifugirane na 4,2k m 1 tokom 1 časa u BeckmanJB-6 centrifugi sa 12-4.2 rotorom. 2. #1 pranje inkluzionog tela. Supernatant sa gornje strane je uklonjen a grudva je ponovo suspendovana sa petostrukom zapreminom 7 mM EDTA, pH 7,0 i homogenizovana. Ova je smeša centrifugirana kao u stupnju 1. 3. #2 pranje inkluzionog tela. Supernatant sa gornje strane je uklonjen a grudva je ponovo suspendovana u desetostrukoj zapremini 20 mM Tris, pH 8,5, 10 mM DTT i 1% deoksiholata, i homogenizovana. Ova je smeša centrifugirana kao u stupnju 1. 4. #3 pranje inkluzionog tela. Supernatant sa gornje strane je uklonjen a grudva je ponovo suspendovana u desetostrukoj zapremini destilisane vode, i homogenizovana. Ova je smeša centrifugirana kao u stupnju 1. 5 . Ponovno savijanje. Grudva je ponovo savijena sa 15 zapremina 10 mM HEPES, pH 8,5, 1% natrijum sarkosina (N-lauril sarkosin), na sobnoj temperaturi. Posle 60 minuta, rastvor je dopunjen da bude 60 mM bakar sulfat, a potom je mešan preko noći. 6. Uklanjanje sarkosina. Smeša koja se ponovo savija razblažena je u 5 zapremina 10 mM Tris pufera, pH 7,5 i centrifugirana kao u stupnju 1. Supernatant je prikuplje i uz mešanje pomešan u toku jednog časa sa Dowex 1-X4 smolom, 20-30 meša, hloridni oblik (u količini od 0,066% ukupne zapremine smeše koja se ponovo savija). Ova je smeša sipana na jednu kolonu i eluans je sakupljen. Uklanjanje sarkosina je potvrđeno pomoću HPLC. 7. Kiselinsko taloženje. Eluans iz prethodnog stupnja je sakupljen, a pH je podešen na pH 5,5, i inkubiran 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ova je smeša centrifugirana kao u stupnju 1. 8. Hromatografija izmenom katjona. pH supernatanta iz prethodnog stupnja podešen je na pH 4,2 i sipan na CM Sepharose Fast Flow. Dvadeset kolonskih zapremina slanog gradijenta bilo je korišćeno. pri 20 mM NaOAc, ph 4,2, 0 M do 1,0 M NaCl. 9. ITIC hromatografija. CM Sepharose smeša glavnih frakcija (potvrđenp analizom UV zrakovima) iz prethodnog stupnja podešena je da bude 0,2 M amonijum sulfat. 20-kolonska zapremina reverznog slanog gradijenta načinjena je pri 5 mM NaOAc, pH 4,2 sa 0,4 M do 0 M amonijum sulfata. Ovaj je materijal koncentrovan i diafiltriran u PBS.
Rezultati
U tabeli su prikazani procenti (%) razlika od osnovne mase kod C57B16J miševa (starosti 8 nedelja):
PRIMER 14: Kloniranje i izdržavanje jednog rekombinanta humanog OB polipeptida
Ovaj primer daje preparate i postupke za pripremanje jednog analoga jedne rekombinantne humane verzije OB polipetida.
Humana verzija OB DNK je načinjena od mišje OB DNK. kao u prethodnom primeru 13, zamenom područja između mesta Mlul i BamHl sa dupleksnom DNK (načinjenom od sintetičkih oligonukleotida) kod koje je projektovaba supstitocija 20 kodona. Kodoni za arfinin kod pozicije 35 mišjeg zrelog proteina i leucina kod mišjeg zrelog proteina 74 nisu menjani. MlulI mesto prikazano je ispod pune linije na sledećoj sekvenci. Ova DNK je stavljena u pCFM vektor 1656 (ATCC Association No. 69576), na isti načm kao i rekombinantni mišji protein, kako je napred opisano
Sekvenca rekombinantne humane met OB (dvolančane) DNK i amino kiselina
(SEQ.ID.NOS: 96 i 97)
Fermentacija
Fermentacija navedenih ćelija da bi proizvele rekombinantni humani OB polipetid izvršena je koristeći uslove i jedinejnja kako je napred opisano za rekombinantni mišji materijal. Rezultati su analizirani na prinos (g/l), prethodno prečišćavanje, rekombinantnog humanog OB materijala (i manjih količina bakterijskog proteina) i međusobno povezani da bi se analiziralo bakterijsko izražavanje:
Tabela 9
SkraćeniceČ Ind. + h označava broj časova posle indukcije izrađavanja proteina, kako je opisano u primeru 13 za rekombinantni mišji materijal koristeći pCEM 1656 O.D.: optička gustia, merena spektrofotometrom, miligrama po O.D. jedinici po litru mg/O.D.x L izraz u mg proteina po O.G. jedinici po litru
Prečišćavanje rekombinantnog humanog ob polipeptida Rekombinantni humani protein se može prečistiti postupcima sličnim onima koji su korišćeni za prečišćavanje rekombinantnog mišjeg proteina, kao u prethodnom, primeru 13, Za pripremanje rekombinantnog humanog OB polipeptida, stupanja 8 je izvršen podešavanjem pH supernatanta iz stupnja 7 na pH 5,0 i sipanjem istod na jednu CM sefaroznu brzoprotočnu komom. Slani gradijent od 20 zapremina kolone izveden je pri 20 mM NaOAC, pH 5,5 , OM do 0,5 M NaCL. Stupanj 9 je izvedeb razblaživanjem CM Sefaroze četvotostruko vodom i podešavanjem pH na 7,5. Ta je smeša dopunjena do 0,7 M amonijum sulfata. Obrnuti slani gradijent je izveden sa 29Ž0 zaoremina kolone pn 5 mM NaOAc, pH 5,5, 0,2 M do OM amonijum sulfata. Inače su navedeni stupnjevi identični
PRIMER 15: Studije reagovanja na dozu
Jedna dodatna studija je pokazala da postoji reagovanje na dozu kod kontinualnog davanja OB proteina. U toj studiji su prirodni miševi (negojazni CD-1 miševi, mase 35040 g) dobijali rekombinovan mišji OB protein koristeći postupke slične onima u pnmenmma 12 i 13. Rezultati su sledeći (sa procentualnim gubitkom telesne mase poređenim sa jednim reperom, mereno kao napred):
Kao što se vidi, povećanje doze od 0,03 ,g/kg/dan do l mgčkog/dan povećalo je gubitak telesne mase od 3,5% na 7,5%. Takođe treba pnmetiti da na dan 14, doza od 1 mg.kg/dan daje 14% smanjenja telesne mase.
PRIMER 16: Delovanje leptina na telesni sastav ob/ob miševa
16 nedelja stan C57B1/6J miševi dobijali su 5 ug/g/dan mišjeg leptina, nosača ili nisu primali nikakav lek u toku 33 dana. Kod drugog eksperimenta, 7 nedelja stari ob/ob miševi dobijali su 10 pg/g/dan humanog leptina, ili nosača u toku 12 dana. Miševi su ubijeni i analizirani su ukipna telesna masa, sastav tela, nivoi insiilina i nivoi glukoze. Podaci iz tih eksperimenata prikazani su u tabeli 11.
Podaci o sastavu tela ukazuju delovanje leptina na tri odeljka tela; masa masti, masa mršavog tela i vodena masa. Podaci ukazuju da leptin značajno smanjuje masu telesne masti i ima minimalno dejstvo na mršavu telesnu masu. Međutim, delovanje na mršavu telesnu masu nije statistički značajno.
Poređenje nivoa insulina i glukoze lečenih i kontrolnih (nelečeni) miševa pokazalo je da leptin smanjuje nivoe šećerai insulina u krvi, pa zato ublažava te indikatore dijabetesa.
PRIMER 17: Uticaj velike doze leptina na obične miševe
Mršavim kontrolnim ob/ob miševima (C57B1/6J+/<9>) jednom dnevno je ubrizgavano i.p. 10 pg/g mišjeg leptina ili nosača (PBS) pa su mereni telesna masa i uzimanje hrane u toku sledeće dve nedelje. Pojavilose značajno smanjenje telesne mase od dana 4 i dalje i značajno smanjenje uzimanja hrane u toku prve nedelje. Međutim, posle jedne nedelje, nestala je razlika u uzimanju hrane između obe grupe miševa. Životinje su ubijene po isteku dve nedelje i određen je telesni sastav. Rezultati analize telesnog sastava prikazani su u Tabeli 12. Podaci pokazuju smanjenje telesne masnoće kod životinja koje su primale leptin u odnosu na životinje koje su primale PBS.
Drugi eksperimet je pokazao delovanje davanja i.p. injekcija dva puta na dan,
12,5umg/g mišjeg leptina na C57B1/6J miševe divljeg soja. Došlo je do znatnog smanjenja telesne mase i uzimanja hrane povezanog sa davanjem injekcija polipeptida dva puta na dan. Za ovaj ekspenmet, životinje su stavljene u metaboličke komore.
Hrana se sastojala od Purina #5001 obroka u prahu. Ova se hrana razlikovala od ranijih eksperimenata, koji su koristili obroke sa tapiokom i vodom. Na ovaj načinje hrana korišćena u metaboličkim komorama imala veću kaloričnu vrednost, što objašnjava zašto se količina utrošene hrane razlikuje od one kod životinja na hrani koja sadrži vodu.
Ovaj se pronalazak može realizovati u drugim oblicima ili izvesti na neki drugi nači, a da se ne odstupi od njegovog duha ili bitnih karakteristika. Zbog toga se prikazani opis može smatrati u svim svojim aspektima kao ilustrativan a ne ograničavajući, pri čemu je obim pronalaska naznačen priloženim patentnim zahtevima, a sve izmene koje
spadaju u značenje i opseg ekvivalentnosti namenjene su da budu njime obuhvaćene,.
Kroz ceo opis je navođena literatura, i svi su ti spisi ovde uključeni li celini kao referenca.
Pronalazak kako se za njega traži zaštita ostvarijiv je prema prethodnom opisu i lako dostupnoj literaturi i polaznim materijalima. Ipak, prijavilac je 9. avgusta 1995
deponovao siedeće depozite kod Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive,
Rockville, MD. 20852-1178, U.S.A. u skladu sa oredbama Budimpeštanskog ugovora o Međunarodnom priznavanju depozita mikroorganizama za svrhe patentne procedure:E. coli cell Une harboring plasmid pETH14 koji je primljen kao accession number
69880; i
E. coli cell Une harboring plasmid pETM9 koji je primljen kao accession number
69879
U nastavku je dat spisak literature koja se odnosi na prethodno dat opis, a posebno na eksperimentalne procedure i diskusije.
Baharv etal.,Genomics,11:33-47(1991).
Baharyera./fGenomics,13:761-769 (1992).
Baharvet al,Molecular mapping of mouse chromosomes 4 and 6: Use of a flow-sorted Robeitsonian chromosome (1991).
Blanketal. Mammalian Genome,I:s51-s78 (1991).
Bogarduset a. I, Annals ofthe New York Academy of Sciences.,630:100-115
(1991).
Friedmanet al,<A>Mammalian Genome,1:130-144 (1991).
Harris, FASEB J., 4:3310-3318(1990).
Jacobowitzetal., N. Engl. J. Med.,315:96-100 (1986).
Kessev, inObesiiy,pp. 144-166, Stunkard ed Philadelphia, W.B. Sauders Co.
(1980).
Kesseyet ah, Ann.. Rev. Psychol.,37:109-133.22 (1986).
Leibelet al,"Genetic variation and nutrition in obesitv: Approaches to the molecular genetics of obesitv", inGenetic Variation and Nutrition,pp. 90-101.1,
Simopoulos and Childs eds., S. Karger, Basel (1990).
Siegeletal, Cytogenet Cell Genet.,61(3): 184-i85 (1992).

Claims (1)

1. OB polipeptid, naznačen time, što je odabran iz grupe koju čine: a) polipeptid čija je aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO. 2, 4, 5 ili 6; b) biološki aktivni fragment polipeptida iz (a) gde dati fragment modulira telesnu težinu životinje; c) polipeptid iz a) ili b) kod koga su izostavljene ili supstituisane aminokiseline na pozicijama koje ne utiču na strukturu ili funkciju polipeptida; d) OB polipeptid sposoban da modulira telesnu težinu, čija je sekvenca 83% ili više homologna sa OB polipeptidom čija je aminokiselinska sekvenca SEQ ID NOS.
2,4,5 ili 6; e) hemijski modifikovan polipeptid iz (a) do (d), tako što je za polipeptid vezana jedna ili više hemijskih grupa.
2. OB polipeptid prema zahtevu 1, naznačen time, stoje OB polipeptid čija je aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO.4, gde je jedna ili više amino kiselina odabrano iz grupe koju čine amino kiseline 53, 71, 85, 89,92, 98, 110, 118, 121, 122, 126, 127, 128,129, 132, 139, 157, 159, 163 i 166, supstituisano konzervativnom amino kiselinom.
3. OB polipeptid prema zahtevu 1, naznačen time, što je aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO. 6, gde je jedna ili više amino kiselina odabrano iz grupe koju čine amino kiseline 52, 55, 70, 84, 88, 91, 94, 97, 109, 117, 120, 121, 125, 126, 127, 128, 131, 138, 156, 158, 162 i 165, supstituisano konzervativnom amino kiselinom.
4. OB polipeptid prema zahtevu 2 ili zahtevu 3, naznačen time, što je jedna ili više datih amino kiselina supstiuisano divergentnom amino kiselinom mišijeg OB polipeptida kao što je dato u SEQ ID:2.
5. OB polipeptid prema zahtevu 2 ili zahtevu 3, naznačen time, što je jedna ili više datih amino kiselina supstiuisano alaninom.
6. OB polipeptid prema zahtevu 1, izabran iz grupe koju čine polipeptidi: (i) gde su ostaci 1 do 21 izostavljeni; i (ii) polipeptidi iz tačke (i), gde je metionin na položaju 21; sekvenca glicin-serin-histidin-metionin (SEQ ID NO:38) je na položajim 18 do 21; sekvenca metionin-glicin-serin-serin-histidin-histidin-histidin-histidin-histidin-histidin-serin-serin-glicin-leucin-valin-prolin-aginin-glicin-serin-histidin-metionin (SEQ ID NO: 98) je na položaju 1 do 21; sekvenca leucin-glutaminska kiselina-lizin-arginin-glutaminksa kiselina-alanin-glutaminska kiselina-alanin (SEQ ID NO: 26) zauzima položaje 14 do 21; sekvenca glutaminska kiselina-alanin-glutaminska kiselina-alanin (SEQ ID NO: 27) je na položajima 18 do 21; leucin-glutaminska kiselina-lizin-arginin (SEQ ID NO: 28) je na položajima 18 do 21; sekvenca metionin-glicin-serin-serin-histidin-histidin-histidin-histidin-histidin-histidin-serin-serin-glicin-leucin-valin-prolin-arginin-glicin-serin-prolin (SEQ ID NO: 99) je na položajima 2 do 21; ili sekvenca glicin-serin-prolin je na položajima 18 do 21
7. Imunogenski fragment OB polipeptida izabran iz grupe koju čine: Val-Pro-Ile-Gln-Lys-VaI-Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-Ile-Lys-Thr (SEQ ID NO: 18); Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-Gln-Thr-Leu-Ala (SEQ IDNO.19); Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pi;o-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp (SEQ ID NO: 20); and Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-Glu-Cys (SEQ ID NO:21).
8. OB polipeptid prema zahtevu 2, naznačen time, što je izabran iz grupe koju čine polipeptidi gde je: (a) ostatak serina na položaju 53 supstituisan glicinom, valinom, cisteinom, metioniom ili treoninom; (b) ostatak serina na položaju 98 susptituisan glicinom, alaninom, valinom, cisteinom, metioninom ili treoninom; i (c) ostatak arginina na položaju broj 92 susptituisan asparaginom, lizinom, histidinom, glutaminom, glutaminskom kiselinom, asparaginskom kiselinom, serinom, treoninom, metioninom ili cisteinom.
9. OB polipeptid prema zahtevu 3, naznačen time, što je odabran iz grupe koju čine polipeptidi gde je: (a) ostatak serina na položaju 52 supstituisan glicinom, alaninom, valinom, cissteinom, metioninom, ili treoninom; (b) ostatak serina na položaju 97 je supstituisan glicinom, alaninom, valinom, cisteinom, metioninom, ili treoninom; i (c) ostatak arginina na položaju broj 91 je supstituisan asparaginom, lizinom, histidinom, glutaminom, glutaminskom kiselinom, asparaginskom kiselinom, serinom, treoninom, metioninom, ili cisteinom.
10. OB polipeptid prema zahtevu 2, naznačen time, što je odabran iz grupe koju čine polipeptidi gde: (a) izostavljen je jedan ili više ostataka na položajima 121 do 128; (b) izostavljeni su ostaci 1-116; (c) izostavljeni su ostaci 1-21 i 54 do 167; (d) izostavljeni su ostaci 1-60 i 117 do 167; (e) izostavljeni su ostaci 1-60; (f) izostavljeni su ostaci 1-53; (g) polipetid iz tačke (a) gde su izostavljeni ostaci 1-21; i (h) polipeptid iz tačke (a) do (g) koji ima N-terminalnu amino kiselinu ili aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od: (1) metionina (2) sekvence glicin-serin-histidin-metionin (SEQ ID No. 38) (3) sekvence metionin-glicin-serin-serin-histidin-histidin-histidin-histidin-histidin-histidin-serin-serin-glicin-leucin-valin-prolin-arginin-glicin-serin-histidin-metionin (SEQ ID No. 98), (4) sekvence leucin-glutaminska kiselina-lizin-arginin-glutaminska kiselina-alanin-glutaminska kiselina-alanin (SEQ ID No. 26), (5) sekvence glutaminska kiselina-alanin-glutaminska kiselina-alanin (SEQ ID No. 27), (6) sekvence leucin-glutaminska kiselina-lizin-arginin (SEQ ID No. 28), (7) sekvence metionin-glicin-serin-serin-histidin-histidin-histidin-histiđin-histiđin-histidin-serin-seri (SEQ ID No. 99), i (8) sekvence glicin-serin-prolin.
11. OB polipeptid prema zahtevu 3, naznačen time, što je odabran iz grupe koju čine polipeptidi gde : (a) izostavljen je jedan ili više ostataka na položajima 120 do 127, (b) izostvljeni su ostaci 1-115; (c) izostavljeni su ostaci 1-21 i 53 do 166; (d) izostavljeni su ostaci 1-59 i 116 do 166; (e) izostavljeni su ostaci 1-59; (0 izostavljeni su ostaci 1-52; (g) polipeptid iz tačke (a) gde su izostavljeni ostaci 1 -21; i (h) polipeptid iz tačke (a) do (g) sa N-terminalnom amino kiselinom ili amino kiselinskom sekvencom odabranom iz grupe koju čine: (1) metionin, (2) sekvenca glicin-serin-histidin-metionin (SEQ ID NO: 38), (3) sekvenca metionin-glicin-serin-serin-histidin-histidin-histidin-histidin-histidin-histidin-serin-serin-glicin-leucin-valin-prolin-arginin-glicin-serin-histidin-metionin (SEQ ID NO: 98), (4) sekvenca leucin-glutaminska kiselina-lizin-arginin-glutaminska kiselina -alanin-glutaminska kiseline-alanin (SEQ ID NO: 26), (5) sekvenca glutaminska kiselina-alanin-glutaminska kiselina-alanin (SEQ ID NO: 27), (6) sekvenca leucin-glutaminska kiselina-lizin-arginin (SEQ ID NO: 28), (7) sekvenca metionin-glicin-serin-serin-histidin-histidin-histidin-histidin-histidin-histidin-serin^^ serin-prolin (SEQ ID NO: 99), i (8) sekvenca glicin-serin-prolin.
12. OB polipeptid prema zahtevu l(e), naznačen time, što je hemijska grupa, polimer rastvoran uvodi.
13. OB polipeptid prema zahtevu 12, naznačen time, stoje polimer rastvoran u vodi, polietilen glikol.
14. OB polipeptid prema zahtevu 13, naznačen time, što je mono-, di-, tri- ili tetrapegilovan derivat.
15. OB polipeptid prema zahtevu 14, naznačen time, što je N- kraj, monopegilovan.
16. OB polipeptid prema zahtevu 15, naznačen time, što je to OB polpeptid čija je aminokiselinska sekvenca od ostataka 22 do 167 sekvence SEQ ID No. 4 ili ostataka 22 do 166 sekvence SEQ ID No. 6.
17. OB polipeptid prema zahtevu 16, naznačen time, što je to OB polipeptid čija je aminokiselinska sekvenca od ostataka 22 do 167 SEQ ID No. 4 ili ostataka 22 do 166 u SEQ ID No. 6 i ima metionin na položaju 21.
18. Izolovan molekul nukelinske kiseline koji kodira OB polipeptid prema jednom od zahteva 1 do 11.
19. Molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 18, naznačen time, što je humani genomski molekul nukleinske kiseline sa SEQ ID Nos. 22 i 24.
20. Molekul nukelinske kiseline prema zahtevu 18 ili zahtevu 19, naznačen time, što kodira polipeptid čija je kiselinska sekvenca odabrana iz grupe koja se sastoji od sekvence amino kiselina datih u: (a) SEQ ID No.2; (b) amino kiselinama 22 do 167 u SEQ ID No. 2; (c) SEQ ID No.4; (d) amino kiselinama 22 do 167 u SEQ ID No. 4; (e) SEQ ID No.5; (f) amino kiselinama 22 do 166 u SEQ ID No. 5; (g) SEQ ID No.6; (h) amino kiselinama 22 do 166 u SEQ ID No. 6; i (i) aminokiselniske sekvence u tačkama (b), (d), (f) ili (h) sa N-terminalnom amino kiselinom ili aminokiselinskom sekevncom odabranom iz grupe koju čine: (1) metionin (2) sekvenca glicin-serin-histidin-metionin (SEQ ID No. 38) i (3) sekvenca metionin-glicin-serin-serin-histidin-histidin-histidin-hisitidin-histidin-histidin-serin-serin-glicin-leucin-valin-prolin-arginin-glicin-serin-histidin-metionin (SEQ ID No, 98) (4) sekvenca leucin-glutaminska kiselina-lizin-arginin-glutaminska kiselina-alanin-glutaminska kiselina-alanin (SEQ IDNO: 26), (5) sekvenca glutaminska kiselin-alanin-glutaminska kiselina-alanin (SEQ IDNO: 27), (6) sekvenca leucin-glutaminska kiselina-lizin-arginin (SEQ ID NO:
28), (7) sekvenca metionin-glicin-serin-serin-histidin-histidin-histidin-histidin-histidin-histidin-serin-serin-glicin-leucin-valin-prolin-arginin-glicin-serin-prolin (SEQ ID NO: 99), i (8) sekvenca glicin-serin-prolin.
21. Molekul nukelinske kiseline prema zahtevu 18, naznačen time, što sadrži sekvencu datu kao sekvenca SEQ ID NOJ.
22. Molekul nukelinske kiseline prema zahtevu 21, naznačen time, što sadrži sekvencu datu kao sekvenca koja kodira amino kiseline 22 do 167 u SEQ ID NO. 3.
23. Oligonukelotid koji je odabran iz grupe koju čine:
24. Vektor , naznačen time, što sadrži izolovani molekul nukleinske kiseline prema jednom od zahteva 18 do 23.
25. Vektor prema zahtevu 24 , naznačen time, što sadrži izolovanu nuklinsku kiselinu operativno povezanu sa kontolnom sekvencom ekspresije.
26. Jednoćelijski domaćin tranformisan ili transfektovan sa molekulom nukelinske kiseline iz zahteva 18 ili ekspresionim vektorom prema jednom od zahteva 24 do 25.
27. Jednoćelijski domaćin prema zahtevu 26, naznačen time, što je jednoćelijski domaćin odabran iz grupe koju čine bakterije, kvasac, izolovane ćelije sisara, ćelije biljaka, ćelije insekata i humane ćelije u kulturi tkiva.
28. Jednoćelijski domaćin prema zahtevu 26, naznačen time, što je jednoćelijski domaćin odabran iz grupe kojučine E. coli, Pseudonomonas, Bacillus, Streptomyces,kvasac, CHO, Rl.l, B-W, LM, COS 1. COS 7, BSC1, BSC40, BMT10 i Sf9 ćelije.
29. Jednoćelijski domaćin prema zahtevu 26, naznačen time, što je jednoćelijski domaćin, kvasac odabran iz grupe koju čine:Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula i Torulopsis.
30. Postupak za dobijanje OB polipeptida prema jednom od zahteva 1 do 11, naznačen time, što se sastoji od: (a) gajenja ćelija prema jednom od zahteva 26 do 29 pod uslovima koji obezbeđuju ekpresiju OB polipeptida; i (b) regeneracije eksprimovanog OB polipetida.
31. Postupak prema zahtevu 30, naznačen time, što je ćelija, bakterija ili kvasac.
32. Postupak prema zahtevu 30 ili 31, naznačen time, što obuhvata još i: (c) hromatografisanje OB polipeptida na Ni-helacionoj koloni: i (d) prečišćavanje OB polipeptida, gel filtracijom.
33. Postupak prema zahtevu 32, naznačen time, što dalje obuhvata posle koraka (c), a pre koraka (d), hromatografisanje OB polipeptida na katjonskoj jonoizmenjivačkoj koloni.
34. Poliklonalno antitelo specifično za OB polipeptid prema jednom od zahteva 1 do 11.
35. Antitelo prema zahtevu 34, naznačeno time, što je obeleženo oznakom koja se može detektovati.
36. Postupak za pripremanje antitela specifičnog za OB polipeptid prema jednom od zahteva 1 do 11, naznačen time, što obuhvata: (a) konjugaciju OB polipeptida prema jednom od zahteva 1 do 11, za protein nosač; (b) imunizacije životinje domaćina konjugatom OB polipeptid- protein nosač iz koraka (a) pomešanog sa adjuvansom; i (c) dobijanje antitela iz imunizirane životinje domaćina.
37. Postupak za merenje prisustva OB polipeptida prema jednom od zahteva 1 do 11 u uzorku, naznačen time, što obuhvata: (a) stupanje u vezu uzorka za koji se pretpostavlja sadrži OB polipeptid sa antitelom koje se specifično vezuje za OB polipeptid pod uslovima koji omogućavaju stvaranje reakcionih kompleksa koji sadrže antitelo i OB polipeptid; i (b) detektovanje stvaranja reakcionih kompleksa koji sadrže antitelo i OB polipeptid u uzorku, pri čemu detekcija stvaranja reakcionih kompleksa ukazuje na prisustvo OB polipeptida u uzorku.
38. Postupak prema zahtevu 37, naznačen time, što je antitelo vezano za nosač čvrste faze.
39. Postupakin vitroprocene nivoa OB polipeptida u biološkom uzorku, naznačen time, što obuhvata: (a) detektovanje stvaranja reakcionih kompleksa u biološkom uzorku prema postupku iz zahteva 37 ili 38; i (b) procenjivanje količine formiranih reakcionih kompleksa, pri čemu količina reakcionih kompleksa odgovara nivou OB polipeptida u biološkom uzorku.
40. Postupakin vitrodetekcije ili dijagnoziranja prisusutva oboljenja povezanog sa povišenim ili smanjenim nivoima OB polipeptida kod sisara, naznačen time, što obuhvata: (a) procenu nivoa OB polipeptida u biološkom uzorku sisara prema zahtevu 39, i (b) poređenja nivoa određenih u koraku (a) sa nivoom OB polipeptida prisutnog kod normalnih subjekata ili subjekata od ranije, pri čemu povećanje nivoa OB polipeptida kada se poredi sa normalnim vrednostima, ukazuje na oboljenja povezana sa povišenim nivoima OB polipeptida, a smanjeni nivo OB polipeptida kada se poredi sa normalnim vrednostima ukazuje na oboljenja povezana sa sniženjem nivoa OB polipeptida.
41. Metodin vitroraonitoringa terapeutskog lečenja oboljenja povezanih sa povišenim ili smanjenim nivoima OB polipeptida kod sisara, koji obuhvata procenu nivoa OB polipeptida u serijama bioloških uzoraka dobijenih u različitim vremenskim intervalima od sisara koji je podvrgnut terapeutskom lečenju oboljenja povezanog sa povišenim ili sniženim nivoima OB polipeptida prema postupku iz zahteva 37.
42. Farmaceutska kompozicija, naznačena time, što sadrži OB polipeptid prema jednom od zahteva 1 do 11 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
43. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 42, naznačena time, što je formulisana kao intavenozna, intraarterijska, intraperitonealna, intramuskularna, subkutana injekcija ili nazalna, oralna ili pulmonalna kompozicija.
44. Kozmetička kompozicija, naznačena time, što sadrži OB polipeptid prema jednom od zahteva 1 do 11 i prihvatljiv nosač.
45. Upotreba OB polipeptida prema jednom od zahteva 1 do 11 za proizvodnju leka za modifikaciju telesne težine životinje.
YU54995A 1994-08-17 1995-08-17 Ob polipeptid i njegova dijagnostička i terapeutska primena RS50274B (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/292,345 US6001968A (en) 1994-08-17 1994-08-17 OB polypeptides, modified forms and compositions
US08/347,563 US5935810A (en) 1994-08-17 1994-11-30 Mammalian ob polypeptides capable of modulating body weight, corresponding nucleic acids, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US08/438,431 US6429290B1 (en) 1994-08-17 1995-05-10 OB polypeptides, modified forms and derivatives
US08/483,211 US6309853B1 (en) 1994-08-17 1995-06-07 Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
YU54995A YU54995A (sh) 1998-05-15
RS50274B true RS50274B (sr) 2009-07-15

Family

ID=46507740

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YU54995A RS50274B (sr) 1994-08-17 1995-08-17 Ob polipeptid i njegova dijagnostička i terapeutska primena

Country Status (5)

Country Link
KR (1) KR100584177B1 (sr)
BR (1) BRPI9508596B1 (sr)
PE (1) PE47396A1 (sr)
RS (1) RS50274B (sr)
UA (1) UA70911C2 (sr)

Also Published As

Publication number Publication date
KR970705631A (ko) 1997-10-09
YU54995A (sh) 1998-05-15
PE47396A1 (es) 1996-12-02
KR100584177B1 (ko) 2006-10-24
BRPI9508596B1 (pt) 2018-11-27
UA70911C2 (uk) 2004-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3479080B2 (ja) 体重のモジュレーター、対応する核酸およびタンパク質、ならびにそれらの診断および治療用途
US8173793B2 (en) Nucleic acids encoding modulators of body weight
US6124439A (en) OB polypeptide antibodies and method of making
US7063958B1 (en) Nucleic acids db, the receptor for leptin
US20040213763A1 (en) Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US6350730B1 (en) OB polypeptides and modified forms as modulators of body weight
US6471956B1 (en) Ob polypeptides, modified forms and compositions thereto
RU2273645C9 (ru) Полипептид ожирения (ов)(варианты), его аналог (варианты) и слитый белок (варианты), изолированная молекула нуклеиновой кислоты, молекула днк, рекомбинантный вектор клонирования, рекомбинантный вектор экспрессии, фармацевтическая композиция, моноклональное и поликлональное антитело
JP3816737B2 (ja) 体重のモジュレーター、対応する核酸およびタンパク質、ならびにそれらの診断および治療用途
RS50274B (sr) Ob polipeptid i njegova dijagnostička i terapeutska primena
US7084252B1 (en) DB, the receptor for leptin
AU738966B2 (en) Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US6821945B1 (en) Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US7619079B2 (en) Db, the receptor for leptin, nucleic acids encoding the receptor, and uses thereof