BRPI9508596B1 - polipeptídeos de obesidade (ob), composição compreendendo os mesmos, bem como vetores para expressão dos referidos polipeptídeos - Google Patents

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Abstract

patente de invenção: "moduladores de peso de corpo, correspondentes ácidos nucléicos e proteínas, e usos diagnósticos e terapêuticos dos mesmos". a presente invenção se refere em geral ao controle de peso de corpo de animais incluindo mamíferos e seres humanos, e mais particularmente a materiais identificados aqui como moduladores de peso, e aos usos diagnósticos e terapêuticos nos quais tais moduladores podem ser usados. em seu aspecto mais amplo, a presente invenção se refere à elucidação e à revelação de sequências de nucleotídeo, e proteínas putativamente expressa por tais nucleotídeos ou suas variações degeneradas, que demonstram a capacidade de participar no controle de peso de corpo de mamífero. as sequências de nucleotídeos em questão representam os genes correspondentes ao gene de ob de ser humano e de camundongo, que foram postulados para desempenhar um papel crítico na regulação de peso de corpo e adiposidade. dados preliminares, apresentados aqui, sugerem que o produto de polipeptideo do gene em questão funciona como um hormônio. a presente invenção ulteriormente provê moléculas de ácido nucléico para uso como sondas moleculares, ou como iniciadores para a ampliação de reação de cadeia de polimerase (pcr), isto é, oligonuceotídeos naturais ou sintéticos, em outro aspectos, a presente invenção provê um vetor de clonagem, que compreende os ácidos nucléidos da invenção e um vetor de expressão bacteriano, de inseto ou de mamífero, que compreende as moléculas de ácido nucléido da invenção, operativamente associados com uma sequência de controle de expressão. correspondentemente, a invenção ulteriormente se refere a uma célula bacteriana ou de um mamífero transfectada ou transformada com uma vetor de expressão apropriado e, correspondentemente, ao uso dos construtos mencionados acima na preparação dos moduladores da invenção. também providos são anticorpos do polipeotídeo de ob. além do mais, um método para modulação de peso de corpo de um mamífero é provido. são providos, nos exemplos específicos, genes que codificam duas isoformas dos polipeptídeos de ob de camundondo e de ser humano.

Description

(54) Título: POLIPEPTÍDEOS DE OBESIDADE (OB), COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO OS MESMOS, BEM COMO VETORES PARA EXPRESSÃO DOS REFERIDOS POLIPEPTÍDEOS (73) Titular: THE ROCKEFELLER UNIVERSITY. Endereço: 1230 York Avenue, NY 10021-6399, New York, ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA(US) (72) Inventor: JEFFREY M. FRIEDMAN; YIYING ZHANG; RICARDO PROENÇA; MARGHERITA MAFFEI; JEFFREY L. HALAAS; KETAN GAJIWALA; STEPHEN K. BURLEY.
Código de Controle: 9978FA9FA65DC36D C9656EF08413C88E
Prazo de Validade: 20 (vinte) anos contados a partir de 17/08/1995, observadas as condições legais
Expedida em: 27/11/2018
Assinado digitalmente por:
Alexandre Gomes Ciancio
Diretor Substituto de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para POLIPEPTÍDEOS DE OBESIDADE (OB), COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO OS MESMOS, BEM COMO VETORES PARA EXPRESSÃO DOS REFERIDOS POLIPEPTÍDEOS.
CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se de um modo geral ao controle de peso de mamíferos incluindo animais e seres humanos, e mais particularmente a materiais identificados aqui como moduladores de peso, e aos usos diagnóstico e terapêutico para os quais tais moduladores podem ser postos. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Obesidade, definida como um excesso de gordura de corpo em relação à massa de corpo magra, está associada com importantes morbidades psicológicas e médicas, as últimas incluindo hipertensão, teor elevado de lipídios no sangue, e diabetes melitUs do Tipo II ou não-dependentes de insulina (NIDDM). Há 6 - 10 milhões de indivíduos com NIDDM nos E.U.A., incluindo 18% da população de 65 anos de idade [Harris e outros., Int. J. Obes., 11:275-283(1987)]. Cerca de 45% de homens e 70% das mulheres com NIDDM são obesos, e sua diabetes é substantialmente aperfeiçoada ou eliminada por redução de peso [Harris, Diabetes Care, 14(3):639-648 (1991)]. Como descrito abaixo, tanto a obesidade quanto a NIDDM são fortemente herdáveis, embora os genes de predisposição não tenham sido identificados. A base genética molecular desses distúrbios metabolicamente relacionados é um problema importante, pobremente entendido.
A assimilação, o armazenamento, e a utilização de energia nutriente constituem um complexo sistema homeostático central para a sobrevivência de metazoários. Entre mamíferos que vivem na terra, o armazenamento, em tecido adiposo, de grandes quantidades de combustível metabólico como triglicerídeos é crucial para a sobrevivência de períodos de privação de alimento. A necessidade de se manter um nível fixo de reservas de energia sem alterações contínuas no tamanho e na forma do organismo requer que se atinja um equilíbrio entre absorção e gasto de energia. No entanto, os mecanismos moleculares que regulam o equilíbrio de energia per2 manecem à espera de serem elucidados. O isolamento de moléculas que transduzem informação nutricional e controlam o equilíbrio de energia serão críticos para um entendimento da regulação de peso de corpo na saúde e na doença.
O nível de adiposidade de um indivíduo é, em uma grande extensão, geneticamente determinado. O exame das taxas de concordância de peso de corpo e adiposidade entre gêmeos mono- e dizigotos ou aceitáveis e seus pais biológicos tem sugerido que a hereditabilidade de obesidade (0,4 - 0,8) excede aquela de muitos outros traços que comumente se pensa que têm um componente genético substancial, tais como esquizofrenia, alcoolismo, e aterosclerose [Stunkard e outros, N. Engl. J. Med., 322 : 1483 1487 (1990)]. Similaridades familiares nas taxas de gasto de energia têm sido também relatadas [Bogardus e outros., Diabetes, 35 : 1 - 5 (1986)]. Análise genética em populações geograficamente delimitadas tem sugerido que um número relativamente pequeno de genes pode ser responsável pelos 30 - 50% de variância na composição de corpo [Moll e outros., Am. J. Hum. Genet., 49 : 1243 -1255 (1991)]. No entanto, nenhum dos genes responsáveis por obesidade na população em geral foi geneticamente mapeado para uma localização cromossomal definida.
Modelos de obesidade em roedores incluem sete mutações de aparentemente um único gene. As mutações de obesidade de murino mais intensamente estudadas são os genes de OB (obeso) e db (diabetes). Quando presentes na mesma base de cepa genética, OB e db resultam em indistinguíveis fenótipos metabólicos e comportamentais, sugerindo que esses genes podem funcionar na mesma trajetória fisiológica [Coleman e outros., Diabetologia, 14 : 141 - 148 (1978)]. Murinos homozigotos para qualquer mutação são hiperfágicos e hipometabólicos, levando a um fenótipo obeso que é notável a um mês de idade. O peso desses animais tende a se estabilizar em 60 - 70 g (comparado com 30 - 35 g em murinos de controle). Animais OB e db manifestam uma miríade de outras mudanças hormonais e metabólicas que tornaram difícil a identificação do defeito primário atribuível à mutação [Bray e outros., Am. J. Clin. Nutr., 50:891-902 (1989)].
Cada um dos modelos de obesidade em roedores é acompa nhado por alterações no metabolismo de carbohidratos semelhantes àquelas na diabetes Tipo II no ser humano. Em alguns casos, a severidade da diabetes depende em parte da cepa de murino de base [Leiter.Endocrinology, 124 : 912 - 922 (1989)]. Para ambos OB e db, murinos congênicos C57BL/Ks desenvolvem uma severa diabetes com necrose de célula beta final e atrofia de ilhota, resultando em uma relativa insulinopenia. Inversamente, murinos congênicos C57BL76J OB e db desenvolvem uma diabetes transiente insulina-resistente que é finalmente compensada por hipertrofia de célula beta que se assemelha a diabetes humana do Tipo II.
O fenótipo de murinos de OB e de db assemelha-se à obesidade humana em caminhos diferentes do desenvolvimento de diabetes - os murinos mutantes comem mais e gastam menos energia do que os controles (como o fazem os obesos seres humanos). Este fenótipo é também bastante similar àquele visto em animais com lesões do hipotálamo ventromedial, o que sugere que ambas as mutações podem interferir com a capacidade de adequadamente integrar ou responder à informação nutricional dentro do sistema nervoso central. Suporte para esta hipótese vem dos resultados de experiências de parabiose [Coleman, Diabetologia, 9 : 294 -298 (1973)] que sugerem que murinos de OB são deficientes em um fator de saciedade circulante e que murinos de db são resistentes aos efeitos do fator de OB (possivelmente devido a um defeito dó receptor de OB). Essas experiências levaram à conclusão de que a obesidade nesses murinos mutantes pode resultar de diferentes defeitos em um centro aferente de loop e/ou integrativo do postulado mecanismo de feedback que controla a composição de corpo.
Usando-se marcadores genéticos clássicos e moleculares, os genes de OB e genes de db foram mapeados para o cromossoma 6 proximal e midcromossoma 4, respectivamente [Bahary e outros., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 87 : 8642 - 8646 (1990); Friedman e outros., Genomics, 11 : 1054 - 1062 (1991)]. Em ambos os casos, as mutações mapeiam para regiões do genoma de murino que são sintênicas com seres humanos, sugerindo que, se há homólogos seres humanos de OB e db, eles provavelmente
Figure BRPI9508596B1_D0001
devem mapear, respectivamente, para os cromossomas seres humanos 7q e Ip. Defeitos no gene de db podem resultar em obesidade em outras espécies de mamíferos: em cruzamentos genéticos entre ratos Zucker fa/fa e ratos Brown Norway + / +, a mutação fa (cromossoma de rato 5) é flanqueada pelos mesmos locais que flanqueiam db em murinos [Truett e outros., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88 : 7806 - 7809 (1991)].
Devido à miríade de fatores que parecem impactar o peso de corpo, não tem sido possível predizer quais fatores e, mais particularmente, quais mecanismos homeostáticos, são principalmente determinativos de peso de corpo. Assim, o principal problema subjacente à presente invenção é prover moduladores de peso de corpo que permitam o controle de adiposidade e o teor de gordura de mamíferos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
De acordo com a presente invenção o problema de controle de adiposidade e teor de gordura de animais, particularmente mamíferos, foi resolvido através da provisão de polipeptídeos de obesidade (OB) e moléculas de ácido nucléico que codificam para esses polipeptídeos como descrito aqui. A presente invenção provê, pela primeira vez,fpõfipeptídeos1sòTãdõsjúteis para modulação, isto é, controle e regulação, de peso de corpo e adiposidade, bem como sequências de ácido nucléico que codificam tais polipeptídeos, que não só permitem a produçãolfê^rfibinante do¥ põlipeptídeosjde OB mas são elas mesmas úteis em modulação de peso de corpo. Polipeptídeos de obesidade (OB) da presente invenção têm cerca de 145 cerca de 167 aminoácidos, são capazes de modular peso de corpo em um animal, particularmente um mamífero, e incluem variantes alélicas ojjjanálogãs^incluindo fragmentos, dos mesmos tendo a mesma atividade biológica. Os polipeptídeos podem ser preparados por métodos sintéticos químicos ou recombinantes. Polipeptídeos de OB presentemente preferidos incluem aqueles tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N9S: 2, 4, 5 ou 6, ou variantes ou análogos, incluindo fragmentos, dos mesmos.
Fragmentos imunogênicos de polipeptídeos OB da invenção incluem: Val-Pro-lle-GIn-Lys-Val-GIn-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-lle-Lys-Thr (SEQ ID NQ: 18); Leu-His-Pro-lle-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-GIn-Thr5 >
Leu-Ala (SEQ ID N-: 19); Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-GlyLeu-Gln-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp (SEQ ID Ns: 20); e Ser-Arg-Leu-Gln-GlySer-Leu-GIn-Asp-lle-Leu-GIn-GIn-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-Glu-Cys (SEQ ID N-: 21).
Análogos de polipeptídeo de OB ser humano incluem aqueles tendo as seqüências de aminoácidos de SEQ ID N-S:4 e 6, em que um ou mais dos aminoácidos 53, 56, 71, 85, 89, 92, 95, 98, 110, 118, 121, 122, 126, 127, 128, 129, 132, 139, 157, 159, 163, e 166 (de acordo com a numeração de SEQ ID N9:4) estão substituídos com um outro aminoácido tal como o aminoácido divergente do polipeptídeo de OB de murino como indicado em SEQ ID Ne:2, ou uma alanina. Tais análogos incluem aqueles em que: (a) o resíduo de serina na posição 53 está substituído com glicina, alanina, valina, cisteína, metionina ou treonina; (b) o resíduo de serina na posição 98 está substituído com glicina, alanina, valina, cisteírátunetionina, ou treonina; e (c) o resíduo de arginina no número de posição 92 está substituído com asparagina, lisina, histidina, glutamina, ácido glutâmico. ácido aspártico, serina, treonina, metionina, ou cisteína. Um análogo de polipeptídeo de OB de acordo com a invenção de preferência tem uma homologia de seqüência de aminoácidos de 83 por cento ou mais para a seqüência de aminoácidos de polipeptídeo de OB indicada em SEQ ID N9:2, 4, 5, ou 6.
Análogos de polipeptídeo de OB ser humano adicionais de acordo com a invenção têm a seqüência de aminoácidos de SEQ ID N9S:4 e 6 e têm: (a) um ou mais resíduos de ácido aspártico substituídos com ácido glutâmico; (b) um ou mais resíduos de isoleucina substituídos com leucina; (c) um ou mais resíduos de glicina ou valina substituídos com alanina; (d) um ou mais resíduos de arginina substituídos com histidina; (e) um ou mais resíduos de tirosina ou fenilanilina substituídos com triptofano; (f) um ou mais de resíduos 121 até 128 (de acordo com a numeração de SEQ ID N9:4) substituídos com glicina ou alanina; e (g) um ou mais resíduos nas posições 54 até 60 ou 118 até 166 (de acordo com o número de SEQ ID N9:4) substituídos com lisina, ácido glutâmico, cisteína, ou prolina.
Análogos truncados de polipeptídeo de OB ser humano de acordo com a invenção presentemente preferidos incluem aqueles em que (de acordo com a numeração de SEQ ID N9:4): (a) um ou mais resíduos nas posições 121 a 128 são deletados; (b) resíduos 1-116 são deletados; (c) resíduos 1 - 21 e 54 a 167 são deletados; (d) resíduos 1 - 60 e 117 a 167 são deletados; (e) resíduos 1 - 60 são deletados; (f) resíduos 1 - 53 são de5 letados; e (g) um análogo de sub-parte (a) em que resíduos 1 - 21 são deletados. Análogos de polipeptídeo de OB e polipeptídeos de OB da invenção que carecem da sequência de “sinal de aminoácido 21 (por exemplo, aminoácidos 1 até 21 de SEQ ÍD Ne:4) podem ter um aminoácido terminal N ou sequência de aminoácidos tais como (1) metionina, (2) uma seqüência 10 de glicina-serina-histidina-metionina (SEQ ID Ne:38), (3) uma seqüência de metionina-glicina-serina-serina-histidina-histidina-histidina-histidina-
Figure BRPI9508596B1_D0002
histidina-histidina-serina-serina-gíicina-leucina-valina-prolina-argininaglicina-serina histidina-metionina (SEQ ID Ne:98), (4) uma seqüência de ácido leucina-ácido glutâmico-lisina-arginina-ácido glutâmico-alanina-ácido glutâmico-alanila (SEQ ID Ne:26), (5) ácido glutâmico-alanina-ácido glutâmico-alanina (SEQ ID N2:27), (6) uma seqüência de leucina-ácido glutâmicolisina-arginina (SEQ ID Ne:28); (7) uma seqüência de metionina-glicinaserina-serina-histidina-histidina-histidina-histidina-histidina-histidina-serina· serina-glicina-leucina-valina-prolina-arginina-glicina-serina-prolina (SEQ ID 20 Ns:99), e (8) uma seqüência de glicina-serina-prolina.
Derivados de um polipeptídeo de OB de acordo com a invenção têm uma ou mais porções ligadas aos mesmos incluindo polímeros solúveis em água tais como polietileno glicol. Derivados derivatizados de polietileno glicol podem ser mono-, di-, tri- ou tetrapegilados, por exemplo, N-terminal 25 monopegilados. Derivados de N-terminal monopegilados preferidos de polipeptídeos de OB da invenção incluem polipeptídeos de OB compreendendo os resíduos de aminoácidos 22 até 167 de SEQ ID N9:4 ou resíduos 22 até
166 d© SEQ ID N9:6, opcionalmente tendo uma metionina (pegilada) na posição 21.
Molécula de ácido nucléico (ísolada\provida pela presente invenção codifica um polipeptídeo de OB, jjrna variante alélrcg, ou análogo, incluindo fragmentos, como descrito acima. Específicadamente providas são moléculas de DNA para o uso em expressão de proteção de um polipeptí deo de OB tendo a atividade biológica de modulação de peso de corpo em um mamífero, e são selecionadas do grupo que consiste em: (a) as moléculas de DNA indicadas em SEQ ID N2S: 1 e 3 ou seus fragmentos; (b) moléculas de DNA que hibridizam as moléculas de DNA definidas em (a) ou seus fragmentos hibridizáveis; e (c) moléculas de DNA que codificam quando da expressão para a seqüência de aminoácidos codificadas por quaisquer das moléculas de DNA precedentes. Ilustrativa de tais moléculas é a molécula de DNA genômico ser humano de SEQ ID N2S: 22 e 24.
Moléculas de DNA preferidas de acordo com a invenção codificam um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos como indicada em: (a) SEQ ID N2: 2; (b) aminoácidos 22 até 167 de SEQ ID N2: 2; (c) SEQ ID N2: 4; (d) aminoácidos 22 até 167 de SEQ ID N2: 4; (e) SEQ ID N2: 5; (f) aminoácidos 22 até 166 de SEQ ID N2: 5; e (g) SEQ ID N2: 6; e (h) aminoácidos 22 até 166 de SEQ ID N2: 6, bem como polipeptídeos que têm uma seqüência de aminoácidos ou aminoácido N-terminal como anteriormente observado. Ilustrativamente, um molécula de DNA preferida tem a seqüência indicada como a proteína que codifica a seqüência de SEQ ID N2: 3 e particularmente tem a seqüência indicada como a seqüência que codifica os aminoácidos 22 até 167.
São também providas moléculas de ácido nucléico detectavelmente rotuladas, hibridizáveis a uma molécula de DNA da invenção e incluem moléculas de ácido nucléico hibridizável a uma região de nãocodificação de um ácido nucléico de OB, cuja região de não-codificação é selecionada do grupo que consiste em um íntron, um região de nãocodificação 5', e uma região de não-codificação 31. A presente invenção invenção também provê iniciadores de oligonucleotídeos para ampliação do DNA genômico ser humano que codifica um polipeptídeo de OB tais como oligonucleotídeos indicados em SEQ ID N2: 29 até 32.
Vetores providos pela invenção compreendem uma molécula de DNA de acordo com a invenção como descrito acima e de preferência têm a forma de um vetor de expressão que compreende a molécula de DNA, operativamente associada com uma seqüência de controle de expressão. Células de hospedeiro unicelular da invenção são transformadas ou são
Figure BRPI9508596B1_D0003
transfectadas com moléculas de DNA da invenção ou com um vetor como descrito acima. Células de hospedeiro preferidas incluem bactérias, leveduras, jceluías de^rnãmBé^â béTuías cíFpíãnfasJ|ce]uKs3Firweto^, e£céluTss ZEumanas' em cultura de tecido. Ilustrativamente, tais células de hospedeiro 5 são selecionadas do grupo que consiste em células de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, de levedura, CHO, R1.1, B-W, L-M, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, BMT10, e Sf9. Presentemente hospedeiros de levedura preferidos incluem Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula e Torulopsis. Também providas são células de mamíferos contendo um poli-
Figure BRPI9508596B1_D0004
peptídeo de OB que codifica seqüência de DNA e são modificadas in vitro para permitir expressão mais alta de polipeptídeo de OB por meio de um evento recombinacíonal homólogo que consiste em inserção de uma seqüência reguladora de expressão em proximidade funcional à seqüência que codifica polipeptídeo de OB. A seqüência reguladora de expressão pode ser uma expressão de polipeptídeo de OB ou não e pode substituir uma seqüência reguladora de polipeptídeo de OB mutante na célula.
A presente invenção provê métodos para a preparação de um polipeptídeo de OB compreendendo:
(a) cultivar uma célula como descrito acima sob condições que provêem expressão do polipeptídeo de OB; e (b) recuperar o polipeptídeo de OB expresso. Este procedimento pode também ser acompanhado pelas etapas de: (c) cromatografar o polipeptídeo sobre uma coluna de quelação de Ni; e (d) purificar o polipeptídeo por filtração com gel. Em uma modalidade preferida, depois da etapa (c) e antes da etapa (d), o método inclui cromatografar o polipeptídeo de OB sobre uma coluna de trocadores de cátions fortes.
A presente invenção também provê anticorpos monoclonais e policlonais marcados específicos para polipeptídeos OB da invenção e linhas de células imortais que produzem um anticorpo monoclonal da inven30 ção. A preparação de anticorpo de acordo com a invenção envolve: (a) a conjugação de um polipeptídeo de OB para uma proteína veículo; (b) a imunização de um animal hospedeiro com o conjugado de proteína veículo fragmento de polipeptídeo de OB da etapa (a) misturado com um auxiliar; e r
c) a obtenção de anticorpo a partir do animal hospedeiro imunizado.
A invenção provê métodos para a medição da presença de um polipeptídeo de OB em uma amostra, que compreende (a) a contatação de uma amostra suspeita de conter um polipeptídeo de OB com um anticorpo (de preferência ligado a um suporte sólido) que específicamente se liga ao polipeptídeo de OB sob condições que permitem a formação de complexos de reação que compreende o anticorpo e o polipeptídeo de OB; e (b) a detecção da formação de complexos de reação que compreendem o anticorpo e o polipeptídeo de OB na amostra, em que a detecção da formação de complexos de reação indica a presença de polipeptídeo de OB na amostra.
Correspondentemente, são providos métodos in vitro para a avaliação do nível de polipeptídeo de OB em uma amostra biológica, que compreendem:
(a) a detecção da formação de complexos de reação em uma amostra biológica de acordo com o método indicado acima; e (b) a avaliação da quantidade de complexos de reação formados, quantidade de complexos de reação essa que corresponde ao nível de polipeptídeo de OB na amostra biológica. Quando da detecção ou do diagnóstico da presença de uma doença associada com níveis elevados ou aumentados de polipeptídeo de OB de acordo com a invenção, uma avaliação como acima é feita e o nível detectado é comparado com um nível de polipeptídeo de OB presente em indivíduos normais ou no indivíduo em um tempo anterior. Um aumento no nível de polipeptídeo de OB quando comparado com níveis normais ou anteriores indica uma doença associada com níveis elevados de polipeptídeo de OB e um nível diminuído de polipeptídeo de OB quando comparado com níveis normais indica uma doença associada com níveis diminuídos de polipeptídeo de OB. Correspondentemente são providos métodos in vitro para a monitoração de tratamento terapêutico de uma doença associada com níveis elevados ou aumentados de polipeptídeo de OB em um indivíduo mamífero que compreende a avaliação, como descrita acima, dos níveis de polipeptídeo de OB em uma série de amostras biológicas obtidas em pontos de tempo diferentes a partir de um indivíduo mamífero sofrendo tal tratamento terapêutico.
II
Composições farmacêuticas de acordo com a invenção compreendem um polipeptídeo de OB como descrito acima juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável e são úteis em métodos terapêuticos para a redução do peso de corpo de um animal. Composições farmacêuticas adicionais da invenção para o uso em métodos terapêuticos para aumentar o peso de corpo de um animal compreendem um antagonista de um polipeptídeo de OB, de preferência selecionado do grupo que consiste em um anticorpo que se liga a e neutraliza a atividade do polipeptídeo de OB, um fragmento do polipeptídeo de OB que se liga ao, mas não ativa o, receptor de polipeptídeo de OB, e um antagonista de molécula pequena do polipeptídeo de OB. A presente invenção também provê composições cosméticas de aperfeiçoamento de aparência de corpo correspondentes para redução ou aumento de peso de corpo de um indivíduo, composições essas que são úteis em processos cosméticos para aperfeiçoar a aparência de corpo de um indivíduo. Tais composições cosméticas são administradas ao indivíduo em uma quantidade de dose suficiente para modular o peso de corpo do indivíduo em um nível desejado.
Também provido pela presente invenção é o uso de moles de ácido nucléico da invenção, bem como moléculas de ácido nucléico semsentido hibridizável a um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de OB de acordo com a invenção, para a produção de um medicamento para (por exemplo, terapia de gene) modificação de peso de corpo de um animal. Também é provido o uso de um polipeptídeo de OB ou antagonista de acordo com a invenção para a produção de um medicamento para modificação do peso de corpo de um animal. Medicamentos assim desenvolvidos podem ser empregados para a modificação do peso de corpo de um mamífero em tratamento de um distúrbio selecionado do grupo que consiste em diabetes, pressão sangüínea alta, e colesterol alto e como parte de terapia combinativa com um medicamento para o tratamento de tais distúrbios. Tais medicamentos podem ser empregados em métodos terapêuticos envolvendo sistemas de administração intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, nasal, oral ou pulmonar.
Dados apresentados aqui mostram que <õsZpõLípéptrdéõs ÕBda
Figure BRPI9508596B1_D0005
Hnyen.ç.ãoZerri süa fõrmaYão^secre.tád.Qg principalmente a partir de adipócitos de mamíferos e que polipeptídeos funcionam como hormônios.
Os exemplos aqui demonstram que o polipeptídeo de OB, alternativamente chamado aqui leptina, circula em plasma de murino, de rato e 5 de ser humano. Leptina está ausente em plasma de murinos de OB/OB, e está presente em concentrações 10 vezes maiores em plasma de murinos de db/db, e em concentrações 20 vezes maiores em ratos de fa/fa. Mais significativamente, injeções diárias de leptina recombinante reduzem dramaticamente a massa de corpo de murinos de OB/OB, afetam significativamente 10 o peso de corpo de murinos de tipo selvagem, e não têm efeito sobre murinos de db/db.
Figure BRPI9508596B1_D0006
Em um outro aspecto, o polipeptídeo de OB oriundo de uma espécie é biologicamente ativo em uma outra espécie. Em particular, o polipeptídeo de OB ser humano é ativo em murinos.
Em um primeiro exemplo, os moduladores da presente invenção compreendem moléculas de ácido nucléico, incluindo moléculas de DNA recombinante (por exemplo, cDNA ou um vetor contendo o cDNA ou o DNA genômico isolado) ou genes clonados (isto é, DNA genômico isolado), ou suas variantes degeneradas, que codificam os próprios polipeptídeos ser20 vindo como moduladores de controle de peso como aqui em seguida definidos, ou seus fragmentos ou variantes conservadas, particularmente tais fragmentos que carecem do peptídeo de sinal (alternativamente mencionado aqui como polipeptídeo de OB maduro), polipeptídeos esses que possuem seqüências de aminoácidos tais como indicadas na figura 1A até E (SEQ ID
Ne:2), na figura 3 (SEQ ID Ne:4), na figura 5 (SEQ ID Ne:5) e na figura 6 (SEQ ID N9:6). Em modalidades específicas, são providas seqüências de aminoácidos para duas variantes de polipeptídeos OB de ser humano e de murino. Ambos os polipeptídeos são encontrados em uma forma com glutamina 49 deletada, que pode resultar de uma anomalia de união de mRNA.
Os polipeptídeos OB de várias espécies podem ser altamente homólogos;
como mostrados na figura 4, polipeptídeo de OB de ser humano e de murino têm homologia de mais do que 80%.
As moléculas de ácido nucléico, as moléculas de DNA recombi
Figure BRPI9508596B1_D0007
nante ou os genes clonados, podem ter as sequências de nucleotídeos ou podem ser complementares para as sequências que codificam DNA mostradas na figura 1A até E (SEQ ID N-:1) e na figura 2A e B (SEQ ID Ne:3). Em particular, tais moléculas de DNA podem ser cDNA ou DNA genômico isola5 do4^ cromossoma. Moléculas de ácido nucléico da invenção podem também corresponder às sequências, de flanqueamento 5' e 31, das seqüências de DNA intrônicas e de DNA. Correspondentemente, a presente invenção também refere-se à identificação de um ácido nucléico tendo uma sequência de nucleotídeos selecionada das seqüências da figura 1A até E (SEQ ID 10 N9:1) e da figura 2A e B (SEQ ID N9:3) aqui, e variantes degeneradas, varia-
Figure BRPI9508596B1_D0008
ções alélicas e moléculas cognatas semelhantes.
Uma molécula de ácido nucléico da invenção pode ser DNA ou RNA, incluindo suas variantes sintéticas tendo fosfato ou análogo de fosfato, por exemplo, ligações de tiofosfato. Tanto seqüências de filamento único quanto seqüências de filamento duplo são contempladas aqui.
A presente invenção ulteriormente provê moléculas de ácido nucléico para o uso como sondas moleculares, ou como iniciadores para ampliação de reação de cadeia de polimerase (PCR), isto é, oligonucleotídeos sintéticos naturais/tendo uma seqüência correspondente a uma 20 porção das seqüências mostradas na figura 1A até E (SEQ ID Ne:1), na figura 2A e B (SEQ ID N-:3) e na figura 20A até C (SEQ ID NQS:22 e 24); ou as seqüências, de flanqueamento 5' e 3*, das seqüências de codificação; ou seqüências intrônicas do DNA genômico. Em particular, a invenção contempla uma molécula de ácido nucléico tendo pelo menos 10 nucleotídeos, em que uma seqüência da molécula de ácido nucléico corresponde a uma seqüência de nucleotídeos do mesmo número de nucleotídeos nas seqüências de nucleotídeos da figura 1A até E (SEQ ID N-:1), da figura 2A e B (SEQ ID
Ne:3) e da figura 20A até C (SEQ ID N2:22), ou uma seqüência complementar para a mesma. Mais de preferência, a seqüência de ácidos nucléicos da molécula tem pelo menos 15 nucleotídeos. Mais de preferência, a seqüência de ácidos nucléicos tem pelo menos 20 nucleotídeos. Em uma modalidade da invenção em que o oligonucleotídeo é uma sonda, 0 oligonucleotídeo é detectavelmente marcado, por exemplo, com um radionuclídeo (tal como |i^ 32 Ρ), ou uma enzima.
Em outro aspecto, a presente invenção provê um vetor de clonagem, que compreende os ácidos nucléicos da invenção que codificam o polipeptídeo de OB; e um vetor de expressão bacteriano, de inseto ou de um mamífero, que compreende as moléculas de ácido nucléico da invenção que codifica o polipeptídeo de OB, operativamente associado com uma sequência de controle de expressão. Correspondentemente, a invenção ulteriormente refere-se a uma célula de hospedeiro, tal como uma célula bacteriana, uma célula de levedura, uma ^elula de inset^ ou uma jceíulã^de mamífeny um transfectado ou um transformado com um vetor de expressão apropriado, e correspondentemente, ao uso dos contrutos mencionados acima na preparação dos moduladores da invenção.
Em ainda um outro aspecto, a presente invenção refere-se a anticorpos que se ligam ao polipeptídeo de OB. Tais anticorpos podem ser gerados contra o polipeptídeo de comprimento completo ou seus fragmentos antigênicos. Em um aspecto, tais anticorpos inibem a atividade funcional (isto é, modulação de peso de corpo e de composição de gordura) do polipeptídeo de OB. Em um outro aspecto, anticorpos podem ser usados para se determinar o nível de polipeptídeo de OB circulante em plasma ou soro. Em ainda um outro aspecto, anticorpos de região específicas, anticorpos particularmente monoclonais, podem ser usados como sondas de estrutura de polipeptídeo de OB.
Todos os materiais precedentes devem ser considerados aqui como moduladores de peso de corpo e de composição de gordura e como tais, podem ser usados em uma variedade de contextos. Específicamente, a invenção contempla tanto as aplicações de diagnóstico quanto terapêuticas, bem como certas aplicações de agricultura, todos os contigentes no uso dos moduladores definidos aqui, incluindo tanto moléculas de ácidos nucléicos e peptídeos. Além do mais, a modulação de peso de corpo carrega implicações e benefícios terapêuticos específicos, em que condições onde ou a obesidade ou, de modo inverso, a caquexia representa condições de corpo não-desejadas, podem ser remediadas pela administração de um ou mais moduladores da presente invenção.
Figure BRPI9508596B1_D0009
Assim, um método de modulação de peso de corpo de um ma mífero é proposto que compreende o controle da expressão da proteína co
Figure BRPI9508596B1_D0010
dificada por um ácido nucléico tendo uma seqüência de nucleotídeos selecionada da seqüência da figura 1A até E (SEQ ID Ne: 1), a seqüência da figura 2A e B (SEQ ID N-:3) degeneradas e suas variantes alélicas. Tal controle pode ser efetuado pela introdução dos nucleotídeos em questão por terapia de gene em células de gordura do paciente ou do hospedeiro para
J se controlar ou para se reduzir obesidade. De modo inverso, a preparação e
Figure BRPI9508596B1_D0011
a administração de antagonistas para os nucleotídeos, tais como molécula sem sentido, seriam indicadas e seriam procuradas no caso onde condições envolvendo perda de peso excessivo, tal como anorexia nervosa, câncer ou AIDS estão presentes e sob tratamento. Tais contrutos poderíam ser introduzidos em uma forma similar aos nucleotídeos, diretamente nas células de gordura para efetuar tais mudanças.
Correspondentemente, as proteínas definidas pelas figuras 1A até E, 3, 5 e 6 (SEQ ID N2:1, SEQ ID Ne:4, SEQ ID Ns:5 e SEQ ID Ne:6), variantes conservadas, seus fragmentos ativos, e moléculas pequenas cognatas poderíam ser formuladas para administração direta para as finalidades terapêuticas, para se efetuar a redução ou o controle de ganho de peso ou gordura de corpo excessiva. Correspondentemente, anticorpos e outros
Figure BRPI9508596B1_D0012
antagonistas para os materiais de proteína indicados, tais como seus fragmentos, poderíam ser preparados e similarmente administrados para se conseguir o efeito inverso. Correspondentemente, a invenção refere-se vantajosamente a uma composição farmacêutica que compreende um poli25 peptídeo de OB da invenção, ou alternativamente um seu antagonista, em uma mistura com um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
Além disso, o polipeptídeo de OB da invenção pode ser administrado para seus efeitos cosméticos, por exemplo, para aperfeiçoar a aparência de corpo por redução de depósitos de gordura. O polipeptídeo de OB 30 pode ser usado independentemente ou em combinação com outras estratégias cosméticas, por exemplo, cirurgia, para seus efeitos cosméticos.
Os usos diagnósticos dos presentes nucleotídeos e peptídeos correspondentes estendem-se ao uso dos ácidos nucléicos para identificar mutações de suas variações alélicas, de modo a desenvolver um repertório de materiais de nucleotídeos ativos úteis tanto em aplicações dignósticas quanto em aplicações terapêuticas. Em particular, poderíam ser identificadas tanto mutações heterozigotas quanto mutações homozigotas dos nucleotídeos em questão as quais seriam postuladas para quantificar mais precisamente as condições de pacientes, para se determinar o potencial de risco de indivíduos em relação à obesidade. Específicamente, mutações heterozigotas são presentemente vistas como associadas com a obesidade de suave a moderada, enquanto mutações homozigotas seriam associadas com uma condição obesa mais pronunciada ou severa. Testagem de DNA correspondente podería então ser conduzida utilizando-se os materiais determinados acima mencionados como marcas de níveis, para facilitar um prognóstico a longo prazo para tendências particulares, de modo a que se possam prescrever mudanças em hábitos de dieta ou outros hábitos pessoais, ou intervenção terapêutica direta, para evitar tais condições.
A utilidade de diagnóstico da presente invenção se estende a métodos para a medição da presença e extensão dos moduladores da invenção em amostras celulares ou extratos biológicos (ou amostras) tomadas a partir de materiais de teste, de modo que ambos os ácidos nucléicos (DNA ou mRNA genômico) e/ou os níveis de proteína em tais amostras de teste poderíam ser determinados. Dado que a atividade aumentada do nucleotídeo e a presença da proteína resultantes refletem a capacidade do indivíduo de inibir obesidade, o médico revisando tais resultados em um indivíduo obeso determinaria que um fator outro que não disfunção com relação à presença e à atividade dos nucleotídeos da presente invenção é uma causa da condição de obeso. De modo inverso, níveis diminuídos do nucleotídeo e/ou da proteína expressa sugeriría que tais níveis devem ser aumentados para tratar tal condição obesa, e um regime terapêutico apropriado podería então ser implementado.
Além disso, os nucleotídeos recuperados e apresentados nas figuras 1A até E e 2A e B representam cDNA que, como resumidamente afirmado acima, é útil na medição de RNA correspondente. Do mesmo modo, material de proteína recombinante correspondendo aos polipeptídeos das figuras figuras 1A até E e 3 podem ser preparados e apropriadamente marcados, para o uso, por exemplo, em radioimunoensaios, por exemplo, para a finalidade de medição de gordura e/ou níveis de plasma da proteína OB, ou para a detecção da presença e do nível de um receptor para OB sobre os tecidos, tal como o hipotálamo.
Ainda ulteriormente, a presente invenção contempla não apenas a identificação dos nucleotídeos e das proteínas correspondentes apresentadas aqui, mas também a elucidação do receptor a tais materiais. Em tal contexto, os polipeptídeos das Figuras 1A até E, 3, 5, e/ou 6 poderíam ser preparados e utilizados para fazer a separação de uma biblioteca de expressão apropriada para isolar receptores ativos. O receptor podería depois disso ser clonado, e o receptor sozinho ou em combinação com o ligando poderia depois disso ser utilizado para fazer a separação de moléculas pequenas que podem possuir atividade semelhante aos moduladores aqui.
Ainda ulteriormente, a presente invenção refere-se a composições farmacêuticas que incluem certos dos moduladores daqui, de preferência os polipeptídeos cujas seqüências são apresentadas em SEQ ID NQ:2, SEQ ID Ns: 4, SEQ ID Ne: 5 e SEQ ID Ns:6, seus anticorpos, agonistas de moléculas pequenas correspondentes ou seus antagonistas, ou fragmentos ativos preparados em formulações para uma variedade de modos de administração, onde tal terapia é apropriada. Tais formulações incluiríam veículos farmaceuticamente aceitáveis, ou outros auxiliares quando necessárias, e seriam preparadas em faixas de dosagem eficazes a ser determinadas pelo clínico ou pelo médico em cada caso.
Correspondentemente, é um principal objetivo da presente invenção prover moduladores de peso de corpo como definido aqui em forma purificada, que exibem certas características e atividades associadas com o controle e variação de teor de gordura de adiposidade de mamíferos.
É um outro objetivo da presente invenção prover métodos para a detecção e medição dos moduladores de controle de peso como indicado aqui, como um meio de diagnóstico e monitoração eficazes de condições patológicas em que a variação de nível de tais moduladores é ou pode ser uma característica de caracterização.
Figure BRPI9508596B1_D0013
É ainda um outro objetivo da presente invenção prover um método e um sistema de ensaio apropriado para a separação de substâncias, tais como drogas, agentes e semelhantes, que são potencialmente eficazes a ou imitam ou inibem a atividade dos moduladores da invenção em mamífe5 ros.
É ainda um outro objetivo da presente invenção prover um método para o tratamento de mamíferos para controlar peso de corpo e teor de gordura em mamíferos, e/ou para tratar certas condições patológicas das quais depressão ou elevação anormal de peso de corpo é uma característi-
Figure BRPI9508596B1_D0014
ca de caracterização.
É ainda um outro objetivo da presente invenção preparar construtos genéticos para o uso em protocolos terapêuticos genéticos e/ou composições farmacêuticas para métodos terapêuticos comparáveis, que compreendem ou são à base de um ou mais moduladores, pares de ligação ou agentes que podem controlar sua produção, ou que podem imitar ou antagonizar suas atividades.
Outros objetivos e vantagens torna-se-ão evidentes por aqueles versados na técnica a partir de uma revisão da seguinte descrição que se processa com referência aos seguintes desenhos ilustrativos.
Figure BRPI9508596B1_D0015
Figure BRPI9508596B1_D0016
Breve Descrição Dos desenhos
A figura 1 (A até E) mostra a sequência de ácido nucléico (SEQ ID N9:1) e seqüência de aminoácidos deduzidos (SEQ ID Nfi:2) derivado para cDNA de OB de murino. Um líder 5' de 39 pares de base foi seguido por um quadro de leitura aberto de aminoácido 167 previsto e uma seqüên25 cia não-traduzida 3' de aproximadamente 3,7 kb. (No pedido de patente anteriormente depositado n9 de série 08/347/563, depositado em 30 de novembro de 1994 e n9 de série 08/438.431, depositado em 10 de maio de 1995, uma seqüência de não-codificação 5' de 58 bases adicionais foi determinada, subseqüentemente, a ser um artefato de clonagem. Este artefato 30 não tem nenhuma conexão sobre a região de codificação, a região de nãocodificação 5' de 39 bases presentemente mostrada na figura 1, ou região de não-codificação 3' do gene). Um total de cerca de 2500 pares de base da seqüência não-traduzida 3' é mostrada. Análise da seqüência de proteínas
Figure BRPI9508596B1_D0017
previstas por observação e por uso do programa de computador SigSeq indica a presença de uma seqüência de sinais (sublinhado). Microheterogenidade do cDNA foi observado em que cerca de 70% do cDNAs tem um códon de glutamina no códon 49 e 30% não (ver as figuras 5 e 6, infra). Este ami5 noácido é sublinhado, como é o códon de arginina que é mutado em murinos de C57BL/6J de OB/OB (murinos de 1J).
A Figura 2 (A e B) mostra a seqüência de ácido nucléicos (SEQ ID Ne:3) derivada para o cDNA de OB ser humano. Os nucleotídeos são numerados a partir de 1 a 701 com um sítio incial no nucleotídeo 46 e uma terminação no nucleotídeo 550.
A Figura 3 mostra a seqüência de aminoácidos totaimente de
Figure BRPI9508596B1_D0018
duzida (SEQ ID N2:4) derivada do gene de OB ser humano correspondendo à seqüência de ácido nucléicos da figura 2A e B. Os aminoácidos são numerados de 1 a 167. Um sítio de divagem de seqüência de sinal é localiza15 do depois do aminoácido 21 (Ala) de modo que a proteína madura estende se a partir do aminoácido 22 (Vai) para o aminoácido 167 (Cys).
A figura 4 mostra a comparação entre as seqüências de aminoácidos de (SEQ ID N9:2) de murino e de (SEQ ID N2:4) ser humano. A seqüência da seqüência de aminoácidos deduzidos de OB ser humano era 20 altamente homóloga àquela de murino. Mudanças conservadoras são observadas por um hífen, e mudanças não conservadoras por um asterisco. O códon de glutamina variável é sublinhado, quando está na posição da mutação sem sentido em murinos de C57B1/6J de OB/OB (1J). Além de tudo, há 83% de identidade no nível de aminoácido, embora apenas oito substitui25 ções fossem encontradas entre a valina no códon 22 (imediatamente a jusante do excesso de seqüência de sinais) e a cisteína na posição 117.
A figura 5 mostra a seqüência de aminoácidos de comprimento completo (SEQ ID N9:5) derivada para o gene de OB de murino como mostrado na figura 3, mas faltando glutamina na posição 49. Os aminoácidos são numerados a partir de 1 a 166. Um sítio de divagem de seqüência de sinais é localizado depois do aminoácido 21 (Ala) (e assim, antes da deleção de glutamina 49) de modo que a proteína madura se estende a partir do aminoácido 22 (Vai) para o aminoácido 166 (Cys).
ο
A Figura 7 (A) mapa físico da localização de OB no cromossoma de murino, e os mapas de clonagem de YAC e de P1. M e N correspodem a sítios de restrição Mull ou Notl. Os números correspondem a animais individuais que eram recombinantes na região de OB das 1606 meioses que são contadas. Met, Pax 4, D6Rck39, D6Rck13, e Cpa referem-se a localizações na região de OB que se ligam às sondas de DNA. YACs foram isolados usando-se D6Rck13 e Pax-4 como sondas, e as extremidades foram recuperadas usando-se PCR vectorette e/ou resgate de extremidade de plasmídeo e usadas, por sua vez, para isolar novos YACS. (B) O contig de YAC resultante. Um dos YACs neste contig”, Y902A0925, era quimérico. Cada uma das sondas usadas para genotipar os animais recombinantes é indicada entre parênteses. (6) Corresponde a YAC 107; (5) corresponde a M16(+) (ou M16(pLUS)); (4) corresponde a adu(+); (3) corresponde a aad(plCL); (2) corresponde a 53(plCL); e (1) corresponde a 53(+). (c) O contig de P1 de bacteriófagos de clones P1 isolados com sondas de extremidade de YAC isoladas. O gene OB foi isolado em um clone P1 isolado usando-se a extremidade distai de YAC YB6S2F12 (extremidade (4)) (alternativamente designado aqui adu(+)).
A FIGURA 8 apresenta uma fotografia de uma cepa de brometo de etídeo de 192 isolados independentes da quarta experiência de captura de éxon que foram ampliados por PCR e foram caracterizados.
A FIGURA 9 é uma fotografia de uma cepa de brometo de etídeo de clones ampliados por PCR suspeitos de portar OB. Cada um dos 7 clones que não portava o artefato foi reampliado usando-se PCR e foi submetido a eletroforese sobre um gel de agarose a 1 % em TBE e foi manchado com brometo de etídeo. O tamanho dos marcadores (raia não-numerada na extrema esquerda) são os comercialmente disponíveis ladder 1 kB , Raia 1 -- clone 1D12, contendo uma seqüência de HIV . Raia 2 -- clone 1F1, um clone novo do lado de fora da região. Raia 3 - clone 1H3. Raia 4 clone 2B2, que é idêntico a 1F1. Raia 5 -- clone 2G7, que contém um éxon OB. Raia 6 -- clone 2G1 1, que é idêntico a 1F1. Raia 7 -- clone 2H1, que não contém um iserto.
A Figura 10 apresenta a seqüência de clone 2G7 (SEQ ID Ne:7),
Figure BRPI9508596B1_D0019
que inclui um éxon que codifica para uma parte do gene de OB. As sequências de iniciadores usadas para ampliar este éxon são colocadas em destaque na figura (SEQ ID Ne:8 e 9).
A Figura 11 (A) análise de transcrição de PCR reversa de mRNA a partir de tecidos diferentes do mesmo murino com os iniciadores de
2G7 e iniciadores de actina. As reações de RT-PCR foram realizadas usando-se 100 ng de RNA total reverso transcrito com oligo dT como um iniciador para o primeiro filamento de síntese de cDNA. Ampliação de PCR foi realizada por 35 ciclos com desnaturação a 94° para T; hibridização a 55° 10 para 1‘; e extensões a 72°C para 2' com uma segunda autoextensão de T por ciclo. Produtos de RT-PCR foram analisados em um gel de agarose de
Figure BRPI9508596B1_D0020
ponto de fusão baixo de 2% corrido em tampão 1 x TBE. (B) Northern blot de mRNA de diferentes órgãos do murino usando 2G7 marcado por PCR como uma sonda. Dez gg de RNA total de cada um dos tecidos foi submeti15 do a eletroforese sobre um gel de agarose com formaldeído. A sonda foi hibridizada a 65°C em Rapid Hybe (Amersham). Sinais auto-radiográficos eram evidentes depois de 1 hora de exposição; a experiência mostrada foi o resultado de uma exposição de 24 horas.
A Figura 12 (A) Uma mancha de brometo de etídeo de uma rea20 ção de RT-PCR sobre RNA de célula de gordura (tecido adiposo branco) de cada uma das cepas de murino listadas. RNA total (100 ng) para cada amostra foi reversamente transcrito usando oligo DT e transcriptase reversa, e o cDNA de filamento único resultante foi ampliado por PCR com os iniciadores 2G7 (faixas inferiores) ou iniciadores de actina (faixas superiores).
Tanto os iniciadores 2G7 quanto os iniciadores de actina foram incluídos na mesma reação de PCR. Os produtos foram corridos sobre um gel de agarose TBE a 1%. (B) Análise Northern correspondendo a (A). Dez gg de RNA de célula de gordura (tecido adiposo branco) de cada uma das cepas indicadas foram corridos e sondados com a sonda 2G7 marcada por PCR como 30 na Figura 11B, acima. Um aumento de cerca de 20 vezes no nível de mRNA de 2G7 era evidente em RNA de gordura branca da cepa C57BL/6J de OB/OB (1J) relativa a companheiros de ninhada magros. Tanto nas experiências de RT-PCR quanto nas experiências Northern não houve sinal de21 llí' tectável em RN A de 2G7 de murinos de SM/Ck^+^ob^/ob^ (2J) mesmo depois de uma exposição de 2 semanas. Uma exposição auto-radiográfica é mostrada. O mesmo filtro foi hibridizado para uma sonda de actina (porção de fundo do painel).
Figura 13 é uma análise Northern de animais 2J adicionais e animais de controle que confirma a ausência do mRNA OB de animais 2J. A análise Northern foi realizadas como nas Figuras 11 e 12. Nesse caso, o RNA de controle era ap2, um transcrito específico de gordura. Não houve significância para a densidade variável das faixas de ap2.
A Figura 14 compara a seqüência de DNA dos murinos de C57BL/6J (normais) e os murinos de C57BL/6J de OB/OB (1J) na região da mutação de ponto que leva à introdução de um códon de parada prematuro (mutação sem sentido) no cDNA de cepa mutante. Os murinos de OB/OB tinham uma mutação C->T que mudou um resíduo de arginina na posição 105. Essa mudança de base é mostrada como a produção do seqüenciador de DNA automatizado. RT-PCR foi realizado usando RNA de gordura branca de ambas as cepas (+/+ e OB/OB) usando-se iniciadores das regiões 5'e 3' não-traduzidas. Os produtos de reação de PCR foram purificados com gel e diretamente seqüenciados manualmente e usando um seqüenciador automatizado 373A da Applied Biosystems, Inc. com iniciadores ao longo de ambos os filamentos da seqüência de codificação.
Figura 15 (A) Southern blot de DNA genômico de cada uma das cepas de murino listadas. Cerca de 5 gg de DNA (derivado de DNA genômico preparado a partir de fígado, rim ou baço) foi digerido por restrição com a enzima de restrição indicada. O DNA foi então submetido a eletroforese em gel de agarose de TBE a 1% e sondado com 2G7 marcado por PCR. Digestão de restrição com Bglll revelou um aumento no tamanho de um fragmento de Bglll de cerca de 9kB (o maior) em DNA de SM/Ckc-+Dacob2/J/ob2/J (2J). RFLPs não eram detectáveis com qualquer outra enzima de restrição. Mapeamento de restrição preliminar de DNA genômico indicou que o sítio Bglll polimórfico está cerca de 7 kB a montante do sítio de partida de transcrição. Nenhuma das outras enzimas testadas estendeu-se além do sítio de partida de mRNA. (B) Segregação de polimorfismo de Bglll na cepa de
Figure BRPI9508596B1_D0021
SM/Ckc-+Dacob2/ob2. Seis proles obesas e cinco proles magras da mesma geração da colônia de SM/Ckc-+Dacob2/J/ob2/J (2J) coísogênica foram genotipadas por contagem do polimorfismo de Bglll como mostrado em (A). Todos os animais fenotipicamente obesos eram homozigotos para o alelo maior do 5 fragmento de Bglll polimórfico. O DNA da raia de controle foi preparado a partir de um murino de SM/Ckc-+Dac+/+, criado separadamente da colônia de SM/Ckc-+Dacob2/ob2.
A Figura 16 é uma Southern blot de DNA genômico digerido com EcoRI de espécies listadas, usando um cDNA OB como uma sonda (isto é, um zoo blot). Sinais de hibridização eram detectáveis em cada amostra de vertebrado, mesmo depois de uma hibridização de severidade
Figure BRPI9508596B1_D0022
moderada.
O DNA de gato nessa experiência estava levemente degradado.
O DNA restringido foi corrido em um gel de agarose TBE a 1 %, e transferido para uma membrana de tmobilona para sondagem. O filtro foi hibridizado a
65°C e lavado em 2X SSC/SDS a 0,2% a 65°C duas vezes por vinte minutos e exposto por 3 dias usando-se filme X-OMAT da Kodak (Rochester, N.Y.). A Figura 17 apresenta a região de clonagem de expressão de vetor pET-15b (Novagen) (SEQ ID N2S: 11 e 12).
A Figura 18 apresenta a análise do eluato de uma coluna de resina (Ni) de ligação de His para uma fusão de OB de murino maduro recombinante a um His-tag (A) e fusão de OB ser humano maduro a um Histag (B). Bactérias foram transformadas com vetores pETM9 e pETH14, respectivamente. Após indução com IPTG a 1 mM em condições ótimas, as 25 bactérias transformadas eram capazes de produzir 100 - 300 gg/ml de proteína de fusão de OB, principalmente nos corpos de inclusão. Os corpos de inclusão foram solubilizados com HCI-guanidina a 6M ou uréia, e proteína de fusão (presente no sobrenadante de lise) foi carregada sobre a coluna de resina de ligação de His (Ni) em 10 ml de 1 x tampão de ligação com uréia. A coluna foi eluída por etapas com alíquotas de 5 ml de imidazol a 20 μΜ, 60 μΜ e 300 μΜ, e finalmente com tampão de tira. As alíquotas foram analisadas quanto a presença de fusão de polipeptídeo de OB sobre um gel de acrilamida a 15%. Cada raia contém o equivalente de 100 μΙ de extrato
Figure BRPI9508596B1_D0023
bacteriano.
A Figura 19 (A) Tradução in vitro de RNA de OB. Um cDNA de OB foi subclonado para dentro do vetor de pGEM. O plasmídeo foi linearizado e mais RNA de filamento foi sintetizado usando polimerase de Sp6. O RNA sintetizado in vitro foi traduzido na presença ou ausência de membranas microssomais pancreáticas caninas. Um produto de tradução primária de 18 kD foi visto depois de tradução in vitro. A adição de membranas microssomais à reação levou ao aparecimento de um segundo produto de tradução cerca de 2 kD menor do que o produto de tradução primária. O tamanho do produto de tradução de RNA de interleucina-1alfa, que carece de uma sequência de sinal codificada, não foi mudado pela adição de membranas microssomais. Esses dados indicaram a presença de uma sequência de sinal funcional. (B) Tradução in vitro na presença ou ausência de proteínase K. Tratamento com protease resultou em completa proteólise do produto de tradução primária de 18 kD, enquanto que a forma de 16 kD processada não foi afetada. Permeabilização da microssoma com TRITON-X100 a 0,1% tornou sensível a protease a forma processada. Esses resultados indicam que o produto tinha se traduzido no lúmen do microssoma.
Figura 20 (A até E) A sequência do gene de OB ser humano (SEQ ID Nes: 22 e 24). (F) um diagrama esquemático do gene de OB de murino. (G) Um diagrama esquemático do gene de OB ser humano. Tanto em (F) quanto em (G) os códons de partida e de parada estão sublinhados. Não há evidência de um primeiro íntron homólogo para o primeiro íntron de murino no gene ser humano, mas sua existência não pode ser excluída.
A Figura 21 apresenta um desenho esquemático de uma das estratégias de clonagem empregada para atingir expressão recombinante de OB em levedura Pichia. (A) Vetor de expressão de OB com uma seqüência de sinal de fator de acasalamento alfa. (B) Desenho esquemático da estrutura da proteína de fusão recombinante, incluindo a sequência de aminoácidos (SEQ ID NQ:26) mostrando o sítio de Xhol e os sítios de divagem putativa KEX-2 e STE-13, e os aminoácidos em excesso N-terminais presentes depois de divagem de KEX-2 (SEQ ID Ns:27). (c) Uma estratégia alternativa para a produção de OB maduro envolve a preparação de uma seqüência de aminoácidos correspondente a um sítio de divagem de Xhol e um sítio de divagem de KEX-2 imediatamente a montante da seqüência de polipeptídeo de OB maduro (SEQ ID N-:28).
Figura 22 Estratégia de expressão alternativa em Pichia. (A) Vetor de expressão de uma fusão OB com um His-tag adotado a partir do sistema de expressão de pET sob controle da seqüência de sinal de fator de acasalamento alfa (SEQ ID NB:33). (B) Desenho esquemático da estrutura da proteína de fusão de OB recombinante contendo um His-tag, que inclui a seqüência de sinal de fator de acasalamento alfa, os sítios de divagem putativa de KEX-2 e STE-13, o His-tag, e um sítio de divagem de trombina, que forneceria OB com três resíduos de aminoácidos N-terminais em excesso.
Figura 23 (A) análise de PAGE de expressão de OB de murino (ambas as formas microheterogêneas, isto é contendo e carecendo de Gin 49) em levedura de pichia transformada. A tira esperada de cerca de 16 kD é visível no fluido de cultura de levedura (segunda e terceira raias), mas não em fluido de cultura de levedura não transformada (primeira raia). (B) análise de PAGE de polipeptídeo de OB recombinante parcialmente purificado sobre carboximetil celulose, um trocador de cátion fraco. Um tira de cerca de 16 kD é muito visível em frações de 3 e 4 a partir da coluna, que foi eluída com NaCI a 250 mM. Raia 1 ™ amostra carregada; raia 2 — fluxo passa; raia 3 - 5 - frações eluídas com NaCI a 250 mM.
Figura 24 mostra que a proteína de OB circula em plasma de murino. (A) Imunoprecipitações de sangue de murino. 0,5 ml de plasma de murino foi pré-depurado com sefarose conjugadas e foi incubada de uma dia para o outro com anticorpos de anti-OB imunopurificados conjugados para contas de 4B de sefarose. O imunoprecipitado foi separado em gel de SDSPAGE a 15%, foi transferido em Western blotted com um anticorpo de antiOB. A proteína migrada com um peso molecular de cerca de 16 kD, na mesma posição que a proteína de OB de murino maduro expressou em levedura. A proteína estava ausente no plasma de murinos de C57B1/6J de OB/OB e foi aumentada dez vezes no plasma de murinos de C57B1B/Ks de db/db em relação a murinos de tipo selvagem. Murinos de db foram sugeri dos a superprodução da proteína de OB, secundário a resistência de seus efeitos. (B) Níveis aumentados de OB em ratos gordurosos. O rato gordo é obeso como um resultado de uma mutação recessiva sobre o cromossoma 5 de rato. Dados genéticos têm sugeridos um defeito no mesmo gene mutado em murinos de db. Plasma de ratos gordurosos e companheiros de ninhada magros foi imunoprecipitado e foi corrido sobre Western blots. Um aumento de vinte vezes no nível de OB circulante é visto nos animais mutantes. (c) Quantificação da proteína de OB em plasma de murino. Quantidades aumentadas de proteína de murino recombinante foram adicionadas a 100 λ de plasma de murinos de OB e foram imunuoprecipitadas. A intensidade de sinal em Western blots foi comparada com aquela de 100 λ de plasma de murinos de tipo selvagem. Um aumento linear em intensidade de sinal foi visto com quantidades aumentando de proteína recombinantes demonstrando que as imunoprecipitações foram realizadas sobre condições de excesso de anticorpo. Sinais similares foram vistos em amostra de plasma de tipo selvagem e a amostra com 2 ng de uma proteína recombinante indicando o nível de circulação em plasma de murino é cerca de 20 ng/ml. (D) proteína OB em extratos de tecido adiposo. Extratos citoplasmáticos de tecido adiposo de murino foram preparados de murinos de tipo selvagem e de db. Western blots mostraram níveis aumentados de proteína de 16 kD em extratos preparados de murinos de db.
Figura 25 mostra que a proteína de OB circula em níveis variáveis em plasma ser humano. (A) Western blots de plasma ser humano. Amostras de plasma foram obtidas de 6 voluntários magros. Imunoprecipitação e Western blotting revelaram a presença de um proteína de 16 kD imunorreativa, idêntica em tamanho a uma proteína humana de 146 aminoácidos recombinante expressa em levedura. Níveis variáveis da proteína foram vistos em cada uma das seis amostras. (B) Um ELISA (Imunoensaio ligado com enzima) para OB ser humano. Placas de microtítulos foram revestidas com anticorpos de OB de anti-ser humano purificados. Quantidades conhecidas de proteína recombinante foram adicionadas às placas e foram detectadas usando-se anticorpos de anti-OB biotinilados, imunopurificados. Absorbância em 414 nm foi representada graficamente contra as concentrações conhecidas de OB para fornecer uma curva padrão. A curva padrão resultante mostrou que o ensaio foi capaz de dectar 1 ng/ml ou mais da proteína de OB humana. (C) Quantificação de proteína de OB em plasma ser humano. Um imunonensaio ELISA foi realizado usando 100 λ de plasma de seis voluntários magros e os padrões usados no painel B. Níveis da proteína de OB variando de 2 ng/ml em HP1 a 15 ng/ml em HP6 foram vistos. Esses dados correlacionaram-se com os dados de Western blot no painel A.
A Figura 26 mostra que a proteína de OB forma ligações de dissulfeto inter- e intramoleculares. (A) Western blots sob condições de redução e de não-redução. Os Western blots de plasma de murino e ser humano foram repetidos com e sem a adição de agentes de redução ao tampão de amostra. Quando β-mercaptoetanol é omitido do tampão de amostra, imunoprecipitado de plasma de db migra com uma massa molecular aparente de 16 kD e de 32 kD. Adição de β-mercaptoetanol ao tampão leva ao desaparecimento da porção de 32 kD (ver Figura 24). O resultado é recapitulado quando a proteína de murino é expressa na levedura, Pichia pastoris. Nesse caso, a proteína de OB de murino migra para a posição de um dímero. Sob condições de redução, a proteína de murino recombinante purificada migra com um peso molecular aparente de 16 kD, indicando que a forma molecular de 32 kD é o resultado de uma ou duas ligações de dissulfeto intermoleculares. A proteína humana expressa in vivo e em Pichia pastoris migra com uma massa molecular de 16 kD sob condições de redução e de não-redução (dados não-mostrados). (B) A proteína humana expressa em levedura contém uma ligação de dissulfeto intramolecular. Proteínas secretadas em geral assumem sua conformação correta quando expressas no sistema de expressão de Pichia pastoris. A proteína humana madura de 146 aminoácidos foi expressa em Pichia pastoris e foi purificada a partir dos meios de levedura por um protocolo de purificação de duas etapas envolvendo IMAC e filtração de gel. A proteína recombinante purificada foi submetida a espetrometria de massa antes e depois de divagem de brometo de cianogênio. Brometo de cianogênio cliva no terminal carbóxi dos resíduos de metionina. A massa molecular da proteína de levedura recombinante era de 16.024±3 Da (massa molecular calculada = 16.024 Da). Brometo de cianogênio cliva depois as três metioninas na seqüência de proteína nos aminoácidos 75, 89 e 157. O fragmento de brometo de cianogênio com massa medida de 8.435,6 Da corresponde aos aminoácidos 90 - 157 e 158 - 167 unidos por uma ligação de dissulfeto entre cys-117 e cys-167 (massa molecular calculada = 8.434,5 Da). N.D. = nota detectada.
A Figura 27 mostra a preparação da proteína recombinante bioativa. A seqüência de nucleotídeos correspondente à proteína de OB de murino de 145 aminoácidos foi clonada no vetor de expressão de 15b pET. O vetor pET insere um trato de polihistidina (His-tag) a montante da seqüência clonada que permite purificação eficiente usando Cromatografia de Afinidade de Metal Imobilizado (IMAC). A proteína bacteriana recombinante inicialmente separou-se na fração de membrana insolúvel depois de lise bacteriana. A fração de membrana foi solubilizada usando cloridrato de guanidínio e carregada sobre uma coluna de IMAC. A proteína foi eluída por etapas com concentrações crescentes de imidazol como mostrado. A proteína eluída foi redobrada e tratada com trombina para se remover o Histag, como descrito abaixo. O rendimento final de proteína solúvel foi de 45 ng/ml de cultura bacteriana.
A Figura 28 mostra os efeitos biológicos da proteína OB. O curso, no tempo, de ingestão de alimento (painéis A-C) e de peso de corpo (painéis D-F). Grupos de dez animais receberam ou diariamente injeções intraperitoniais da proteína de OB a uma dose de 5 mg/kg/dia (quadrados sólidos), injeções diárias de PBS(círcuIos sólidos) ou nenhum tratamento (triângulos sólidos). Os grupos de tratamento incluíam murinos de C57BI/6J de OB/OB (painéis A e D), murinos de C57BI/Ks de db/db (painéis B e E) e murinos de CBA/J +/+ (painéis C e F). A ingestão de alimento dos murinos foi medida diariamente e o peso de corpo foi registrado em intervalos de 3 a 4 dias como indicado. (A escala de peso de corpo em gramas é diferente para os murinos do tipo selvagem versus os murinos de OB e de db). A ingestão de alimento dos murinos de OB foi reduzida depois da primeira injeção e foi estabilizada depois do quarto dia em um nível de cerca de 40% daquele visto no grupo injetado simulado (p < 0,001). O peso do corpo des28
Figure BRPI9508596B1_D0024
ses animais diminuiu com uma média de 1,3 gramas/dia e estabilizou-se após três semanas a um nível aproximadamente 60% do peso inicial (p < 0,0001). Nenhum efeito da proteína foi demonstrável em murinos de db. Efeitos pequenos mas significativos sobre o peso de corpo foram observados em murinos de CBA/J em dois pontos de tempo anteriores (p < 0,02). O erro padrão de cada medida é indicado por uma barra e a significância estatística desses resultados é mostrada na Tabela 1.
A Figura 29 mostra os resultados de alimentação de murinos de OB. (A) Um grupo de quatro murinos de C57BI/6J de OB/OB foram alimentados com uma quantidade de alimento igual àquela consumida pelo grupo de murinos de OB recebendo proteína recombinante. A perda de peso para ambos os grupos foi calculada depois de cinco, oito e doze dias. Os murinos de alimentação restrita perdem (barra tracejada) menos peso do que os murinos de OB recebendo proteína (barra sólida) (p < 0,02). Este resultado indica que o efeito de redução de peso da proteína de OB é o resultado dos efeitos sobre tanto o alimento ingerido quanto o gasto de energia. (B) Fotografia de um murino de OB tratado. Mostrados são dois murinos de C57BI/6J de OB/OB. O murino da esquerda recebeu PBS e pesava 65 gramas, que era o peso inicial. O murino da direita recebeu injeções diárias da proteína de OB recombinante. O peso inicial deste animal era também de 65 gramas, e o peso depois de três semanas de tratamento de proteína era de 38 gramas, (c) Fígados de murinos de OB tratados e não-tratados. Mostrados são fígados de murinos de C57B1/6J de OB/OB tratados e não-tratados. O fígado do murino que recebeu PBS tinha a aparência gorda de um fígado gorduroso e pesava 5,04 gramas. O fígado do murino que recebeu a proteína de OB recombinante tinha uma aparência normal e pesava 2,23 gramas.
A Figura 30 mostra a hibridização in situ de OB para tecido adiposo. RNA de OB de sentido e de sem sentido foi marcado in vitro usandose polimerase de T7 e Sp6 e digoxigenina. Os RNAs marcados foram hibridizados para parafinar seções assentadas de tecido adiposo a partir de almofadas de gordura epididimal de murinos de C57BI/Ks de oito semanas de idade (tipo selvagem marcado) e murinos de C57BI/Ks de db/db (db marcado). Na figura, as gotículas de lipídios aparecem como vacúolos não29 n«7 manchados dentro das células. O citoplasma é um aro fino na periferia das células e é indistinguível a partir da membrana de célula. Hibridização de todos os adipócitos no campo foi dectada nas seções de tipo selvagem apenas usando-se a sonda sem sentido e níveis grandemente aumentados foram vistos nas seções de tecido de animais de db/db.
A Figura 31 mostra que RNA de OB é expresso em adipócitos in vivo e in vitro. RNA total (10 microgramas) de várias fontes diferentes foi eletroforado no blotted e hibridizado para uma sonda de OB. Primeiramente, diferenças em flutuabilidade depois da digestão de colagenase ter sido usada para purificar adipócitos. RNA de OB estava presente apenas na fração adipócita. Raia S indica a ração estromovascular e A indica a fração adipócita. Além disso, RNA de OB não foi expresso na raia U de células préadipócitas 3T3-442 não diferenciadas. Adipócitos diferenciados destas linhas de célula expressam níveis claramente detectáveis de mRNA de OB (raia D).
Figura 32 mostra que RNA de OB é expresso em todos os depósitos de tecido adiposo. Todos os depósitos de tecido adiposo testados expressaram RNA de OB. A almofada de gordura inguinal expressou quantidade de níveis de RNA menores, embora houvesse variabilidade no nível de sinais em experiências diferentes, (figura 31 A) Raias (1), almofadas de gordura epididimal (2) inguinal (3) abdominal (4) parametrial. Gordura marrom também expressou um baixo nível de RNA de OB. (figura 31B). O nível de expressão de OB em gordura marrom era inalterado em animais alojados a 4°C por uma semana enquanto a abundância do RNA de UPC específico de gordura marrom, conhecido como sendo induzível a frio, aumentou 5 vezes.
A Figura 33 mostra a expressão de RNA de OB em murinos tratados com tioglicose amarelo-ouro e db/db. RNA total das almofadas de gordura parametrial de murinos tratados com db/db e tioglicose amareloouro (GTG) foi eletroforado e Northern blotted. GTG administrado como uma dose única é conhecido causar obesidade por indução de lesões hipotalâmicas específicas. (A) murinos fêmeas de CBA de um mês de idade foram tratados com GTG (0,2 mg/g), com um aumento resultante de > 20 g em animais tratados em relação aos animais de controle (< 5 g). (B) hibridização de uma sonda de OB para RNA de murinos tratados com db/db e GTG revelaram um aumento de 20 vezes na abundância de RNA de OB em relação ao RNA de controle (actina ou GAPDH).
A Figura 34 representa uma análise de Northern blot de RNA ser humano, Northern blots contendo 10 mg de RNA total de tecido adiposo ser humano (FAT, painel A) e 2 mg de polyA + RNA de outros tecidos seres humanos (painel B) foram hibridizados para OB ser humano ou para sondas de β-actina humana como indicados. Um sinal intenso em cerca de 4,5 kb foi visto com o RNA total de tecido adiposo. Hibridização para o polyA + RNA revelou sinais detectáveis no coração (HE) e na placenta (PL), enquanto que RNA de OB não foi detectado no cérebro (BR), no pulmão (LU), no fígado (LI), no músculo esquelético (SM), mo rim (Kl) e no pâncreas (PA). Em cada caso, o comprimento da exposição autoradiográfica é indicado. Note-se que a origem das tiras moleculares menores vista no RNA de placenta (por exemplo, união alternada, degradação de RNA) não é conhecida.
A Figura 35 representa contig de YAC contendo o gene de OB ser humano e 8 marcadores de microssatélite. O mapa de teor de STS com base em YAC da região do cromossoma 7 contendo o gene de OB ser humano é mostrado, como deduzido por SEGMAP/Versão 3.29 [Green e outros, PCR Methods Applic., 1:77 - 90 (1991)]. Os 19 STSs exclusivamente ordenados (ver tabela 3) são listados ao longo do topo. Os 8 STSs de microssatélite específicos são indicados com estrelas (ver tabela 4). Também indicados são os STSs correspondendo aos genes de OB e de Pax4 bem como as posições previstas do centrômero (CEN) e 7q telômero (TEL) em relação ao contig. Cada um dos 43 clones de YAC é mostrado por uma barra horizontal, com seu nome dado à esquerda e o tamanho de YAC estimado (em kb, medido por eletroforese de gel de campo pulsado) provido entre parênteses. A presença de um STS em um YAC é indicado por um círculo escurecido na posição apropriada. Quando um STS corresponde à extremidade de inserto de um YAC, um quadrado é colocado em volta do círculo correspondente, tanto ao longo do topo (perto do nome de STS) quanto na extremidade do YAC a partir do qual ele foi derivado. Para os 5
Figure BRPI9508596B1_D0025
YACs no fundo (abaixo da linha de hífen horizontal), 1 ou mais STS(s) esperado(s) estar(em) presente(s) (com base na ordem de STS estabelecido) não foi detectado (como avaliado por testagem dos YACs individuais com o(s) ensaio(s) de PCR de STS específico(s) correspondente(s) em pelo me5 nos duas vezes), e estes são mostrados como círculos abertos nas posições apropriadas. A maior parte dos YACs foram isolados a partir de uma biblioteca de célula derivada de híbrido de hamster e de ser humano [Green e outros, Genomics, 25:170 - 183 (1985)], com seus nomes originais como indicados. Os YACs restantes foram isolados a partir de bibliotecas genômi-
Figure BRPI9508596B1_D0026
cas humanas totais, e suas localizações de biblioteca original são providas na tabela 3. Caixas são colocadas em volta dos nomes dos 3 YACs. (yWSS691, yWSS999, e yWSS2935) que foram encontrados por análise de FISH para mapear para 7q31.1. O contig é exibido em sua forma nãocomputada, onde tamanhos de STSs são portanto separados em uma for15 ma equidistante. Na forma computada, onde tamanhos de YAC são usados para estimar a separaração de distância em relação a cada par de
STSs adjacente bem como a extensão de clone sobreposto, o contig de
YAC total parece se estender só sobre 2 Mb.
Descrição Detalhada
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A presente invenção refere-se à elucidação e à revelação de uma proteína, chamada aqui de polipeptídeo de OB ou leptina, ácidos nucléicos que codificam a proteína, incluindo suas variações degeneradas, por exemplo, que incorporam ótimos códons para a expressão em uma sistema de expressão particular, cuja proteína demonstra a capacidade de participar no controle de peso de corpo de mamíferos. Os ácidos nucléicos em objeto
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representam as sequências que codificam correspondendo ao polipeptídeo de OB ser humano e de murino, que é postulado a demonstrar um papel crítico na regulação de peso de corpo e de adiposidade. Dados apresentados aqui indicam que o produto de polipeptídeo de um ácido nucléico da 30 invenção é secretado pelas células que o expressam e que as funções de polipeptídeo como um hormônio. Dados experimentais adicionais demonstram que o polipeptídeo de OB é muito eficaz no tratamento de obesidade em murinos portando uma mutação do gene de OB. Além disso, altas doses ll'”' de bólus ou doses contínuas moderadas de polipeptídeo de OB efetuam redução de peso em murinos (tipo selvagem) normais.
Além disso, os exemplos aqui demonstram que os polipeptídeo de OB, alternativamente chamados aqui leptina, circula no plasma de murino, de rato e de ser humano. Leptina está ausente no plasma de murinos de OB/OB, e está presente em concentrações 10 vezes maior no plasma de murinos de db/db, e concentrações 20 vezes maior em ratos de fa/fa. Mais significativamente, injeções diárias de leptina recombinante reduz dramaticamente a massa de corpo de murinos de OB/OB, significativamente afeta o peso de corpo de murinos de tipo selvagem, e não tem efeito sobre murinos de db/db.
Em um outro aspecto, o polipeptídeo de OB de uma espécie é biologicamente ativo em uma outra espécie. Em particular, o polipeptídeo de OB ser humano é ativo em murinos.
Em seu aspecto primário, a presente invenção refere-se à identificação de materiais que funcionam como moduladores de peso de corpo de mamíferos. Em particular, a invenção refere-se a isolamento, a purificação e a seqüenciação de certos ácidos nucléicos que correspondem ao gene de OB ou a sua região de codificação em tanto murinos quanto seres humanos, bem como aos polipeptídeos correspondentes expressos por estes ácidos nucléicos. A invenção assim compreende a revelação de ácidos nucléicos tendo as seqüências de nucleotídeos indicadas na figura 1A até E (SEQ ID Na:1) e na figura 2A e B (SEQ ID Ne:3), e para degenerar, variantes alelas e seus fragmentos, todos possuindo atividade de modulação de peso de corpo e adiposidade. A correspondência dos ácidos nucléicos presentes ao gene de OB faz um prognóstico de seu impacto significativo sobre condições tais como obesidade bem como outras enfermidades e disfunções onde anormalidade em peso de corpo são um fator contribuidor. A invenção estende-se as proteínas expressas pelos ácidos nucléicos da invenção, e particularmene àquelas proteínas indicadas na figura 1A até E (SEQ ID N9:2), na figura 3 (SEQ ID N2:4) na figura 5 (SEQ ID N2:5) e na figura 6 (SEQ ID NQ:6) bem como para variantes, fragmentos ativos e moléculas pequenas cognatas conservadas.
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Como discutido anteriormente, os peptídeos moduladores de controle de peso ou seus pares de ligação ou outros ligandos ou agentes exibindo ou mimestismo ou antagonismos a eles ou controle sobre sua produção, podem ser preparados em composições farmacêuticas, com um veí5 culo adequado e em resistência eficaz para a administração por vários meios a um paciente experienciando flutuações em peso de corpo ou adiposidade, ou sozinho ou como parte de uma condição médica adversa tal como câncer ou AIDS, para o seu tratamento. Uma variedade de técnicas administrativas podem ser utilizadas, entre elas administração oral, nasal e ou10 tras formas de administração transmucosal, técnicas parenterais, tais como injeções subcutânea, intravenosa e intraperitoneal, cateterizações e semelhantes. Quantidades médias dos fatores de reconhecimento ou suas subu-
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nidades podem variar e em particular devem ser com base nas recomendações e nas prescrição de um médico ou um veterinário qualificado.
De acordo com o acima, um sistema de ensaio para separação de drogas potenciais eficazes para imitar ou antagonizar a atividade do modulador de peso pode ser preparado. O modulador de peso pode ser introduzido para dentro de um sistema de teste, e a droga em prospectiva pode também ser introduzida para dentro da cultura de célula resultante, e a cul20 tura depois disso examinada, para se observar quaisquer mudanças na atividade das células, devido ou à adição da droga sozinha em prospectiva, ou devido ao efeito de quantidades adicionadas do modulador de peso conhecido.
Como anteriormente afirmado, a clonagem molecular do gene 25 de OB descrita aqui tem levado à identificação de uma classe de materiais que funciona no nível molecular para modular peso de corpo de mamíferos. A revelação dos moduladores da invenção tem importante implicações para o diagnóstico e tratamento de distúrbios nutricionais incluindo, mas não limitados a, obesidade, perda de peso associada com câncer e o tratamento 30 de doenças associadas com obesidade tais como hipertensão, doenças de coração, e diabetes do tipo II. Além disso, há usos agrícolas potenciais para o produto de gene em casos onde alguém pode desejar modular o peso de corpo de animais domésticos. Finalmente, na extensão em que um ou mais l^4 dos moduladores da invenção são moléculas secretadas, elas podem ser usadas bioquimicamente para isolar seu receptor usando-se a tecnologia de clonagem de expressão. A discussão que se segue com referência específica ao gene de OB traz aplicabilidade geral à classe de moduladores que compreendem uma parte da presente invenção, e deve portanto estar de acordo com tal latitude e escopo de interpretação.
Como observado acima, a atividade funcional do polipeptídeo de OB pode ser avaliada transgeneticamente. Neste aspecto, um modelo de murino transgênico pode ser usado. O gene de OB pode ser usado em estudos complementares empregando murinos transgênicos. Vetores transgênicos, incluindo vetores virais, ou clones de cosmídeo (ou clones de fago) correspondendo ao local de tipo selvagem de gene do candidato, pode ser construído usando-se o gene de OB isolado. Cosmídeos podem ser introduzidos para dentro do murinos transgênicos usando-se procedimentos publicados [Jaenisch, Science, 240:1468 -1474 (1988)]. Os construtos são introduzidos para dentro de ovos fertilizados derivados de um cruzamento entre progênia de F1 de um cruzamento de C57BU6J de OB/OB X DBA. Estes cruzamentos necessitam o uso de transplantes ovarianos de C57BL/6J de OB/OB para gerar os animais F1. Murinos de DBA/2J são usados como a contra-cepa uma vez que eles têm uma cor de revestimento nonagouti que é importante quando do uso dos transplantes ovarianos. Genótipo no local de OB em animais transgênicos de cosmídeos podem ser determinados por tipagem de animais com RFLPs fortemente ligados ou microssatélites que flanqueiam a mutação e que são polimórficas entre as cepas genitoras. Complementação será demonstrada quando um construto particular torna um animal de F2 geneticamente obeso (como registrado por análise de RFPL) em magro e não-diabético. Sob estas circunstâncias, prova final de complementação necessitará que o animal de OB/OB ou de db/db portando o transgene seja unido aos transplantes ovarianos de OB/OB ou de db/db. Nestes cruzamentos, todos os animais de N2 que não portam o transgene serão obesos e resistentes a insulina/diabéticos, enquanto aqueles que portam o transgene serão magros e terão concentrações de glicose e de insulina normais no plasma. Em um sentido genético, o transgene atua
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como uma mutação supressora.
Alternativamente, genes de OB podem ser testados por exame de seus efeitos fenotípicos quando expressos em orientação sem sentido em animais de tipo selvagem. Nesta abordagem, expressão do alelo de tipo 5 selvagem é suprimida, que leva a um fenótipo mutante. Formação de dúplex de RNA-RNA (sem sentido) previne manipulação normal de mRNA, resultando em eliminação completa ou parcial de efeito de gene de tipo selvagem. Esta técnica foi usada para inibir a síntese de TK em cultura de tecido e para produzir fenótipos da mutação de Kruppel em Drosophila, e a muta10 ção de Shiverer em murinos Izant e outros, Cell, 36:1007 - 1015 (1984);
Green e outros, Annu. Rev. Biochem., 55:569 - 597 (1986): Katsuki e outros,
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Science, 241: 593 - 595 (1988). Uma importante vantagem desta abordagem é que apenas uma pequena porção do gene necessita ser expresso para a inibição eficaz de expressão do mRNA cognato total. O transgene sem sentido será colocado sob controle de seu próprio promotor ou um outro promotor expresso no tipo de célula correta, e será colocado a montante do sítio SV40 polyA. Esta transgene será usada para produzir murinos transgênicos. Murinos transgênicos também serão unidos a transplantes ovarianos para testar se heterozigotos de OB são mais sensíveis aos efeitos do cons20 truto sem sentido.
A longo prazo, a elucidação da função bioquímica do produto de gene de OB (proteína e polipeptídeo de OB) é útil para a identificação de agonistas de molécula pequena e antagonistas que afetam sua atividade.
Vários termos usados através de todo este relatório deve ter as definições dadas aqui, por exemplo, abaixo.
O termo modulador de peso de corpo, modulador, moduladores, e quaisquer variantes não específicamente listadas, podem ser usadas aqui intercambeaveImente, e quando usado durante a presente invenção e reivindicações refere-se em um caso tanto a nucleotídeos quanto a 30 material proteináceo, o último incluindo ambas as proteínas únicas ou múltiplas. Mas específicamente, os termos acima mencionados estendem-se aos nucleotídeos e ao DNA tendo as seqüencias descritas aqui e apresentadas na figura 1 A até E (SEQ ID Ns:1) e na figura 2A e B (SEQ ID Ne:3). Do
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mesmo modo, as proteínas tendo dados de sequência de aminoácidos descritos aqui e apresentados na figura 1A até E (SEQ ID Νρ:2) e na figura 3 (SEQ ID N9:4) são do mesmo modo comtempladas, como são perfil de atividades indicadas com relação aos materiais tanto aqui quanto nas reivindi5 cações. Correspondentemente, nucleotídeos exibindo substancialmente atividade alterada ou equivalente são do mesmo modo contemplados, incluindo substancialmente análogos homólogos e variações alélicas. Do mesmo modo, proteínas exibindo substancialmente atividade alterada ou equivalente, incluindo proteínas deliberadamente modificadas, como por exemplo,
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por mutagênese de sítio dirigido ou acidental mente através de mutações em hospedeiros que produzem os moduladores são do mesmo modo comtemplados.
Uma composição que compreende A (onde A e uma proteína única, molécula de DNA, vetor, célula de hospedeiro recombinante, etc) está substancialmente livre de B11 (onde B compreende uma ou mais proteínas contaminantes, moléculas de DNA , vetores, etc., mas excluindo formas ra· cêmicas de A) quando pelo menos cerca de 75% em peso das proteínas, DNA, vetores (dependendo da categoria da espécie a qual A e B pertencem) na composição está A. De preferência, “A compreende pelo menos 20 cerca de 90% de peso das espécies A + B na composição, mais de preferência pelo menos cerca de 99% de peso. É também preferido que uma composição, que está substancial mente livre de contaminação, contenha apenas uma espécie de peso molecular tendo a atividade ou característica da espécie de interesse.
Os Polipeptídeos de OB
Os termos “proteína que refere-se à polipeptídeo de ocorrência natural, e polipeptídeo são usados aqui intercambeavelmente em relação ao produto de gene de OB e suas variantes. O termo proteína madura ou polipeptídeo maduro particularmente refere-se ao produto de gene de OB 30 com a sequência de sinal (ou um par de proteína de fusão) removida.
Como observado acima, em modalidades específicas polipeptídeos de OB da invenção incluem aqueles tendo seqüências de aminoácidos dadas aqui, por exemplo, SEQ ID NSS: 2, 4, 5, 6, etc., incluindo o polipeptí deo de OB modificado com substituições de aminoácidos conservadoras, bem como seus derivados, análogos e fragmentos biologicamente ativos. O termo biologicamente ativo, é usado aqui para se referir a um efeito específico do polipeptídeo, incluindo mas não limitado a ligação específica, por exemplo, a um receptor, a um anticorpo, ou a uma outra molécula de reconhecimento; ativação de trajetória de transdução de sinal sobre um nível molecular: e/ou indução (ou inibição por antagonistas) de efeitos fisiológicos mediados pelo polipeptídeo de OB natural in vivo. Polipeptídeos de OB, incluindo fragmentos, análogos e derivados podem ser preparados sinteticamente, por exemplo, usando-se as técnicas bem conhecidas de síntese de peptídeo de fase de solução ou de fase sólida. De preferência, técnicas sintéticas de fase sólida são empregadas. Alternativamente, polipeptídeos de OB da invenção podem ser preparados usando-se técnicas de engenheiramento genético bem conhecidas, como descrito infra. Em ainda uma outra modalidade, o polipeptídeo de OB pode ser purificado, por exemplo, por purificação de imunoafinidade, a partir de um fluido biológico, tal como mas não limitado a plasma, soro, ou urina, de preferência plasma, soro ou urina humana, e mais de preferência de um indivíduo que superexpressa o polipeptídeo, tal como uma pessoa obesa sofrendo de uma mutação no receptor de OB ou de obesidade relacionada com uma mutação correspondente a gorduroso.
Fragmentos do Polipeptídeo de OB
Em uma modalidade particular, a presente invenção contempla que fragmentos de ocorrência natural do polipeptídeo de OB podem ser importantes. A seqüência de peptídeos inclui numerosos sítios que são freqüentemente o alvo para a divagem proteolítica, por exemplo, resíduos de arginina. É possível que o polipeptídeo de comprimento completo possa ser clivado em um ou mais sítios para formar fragmentos biologicamente ativos. Tais fragmentos biologicamente ativos podem ou agonizar ou antagonizar a atividade funcional do polipeptídeo de OB para reduzir o peso de corpo. Análogos do Polipeptídeo de OB
A presente invenção específicamente contempla a preparação de análogos do peptídeo de OB, que são caracterizados por serem capazes de uma atividade biológica de polipeptídeo de OB, por exemplo, de ligar a um par de ligação específico de peptídeo de OB, tal como o receptor de OB. Em uma modalidade, o análago agoniza atividade de OB, isto é, funciona similarmente para o peptídeo de OB. De preferência, um agonista de OB é mais eficaz do que a proteína natural. Por exemplo, um análogo de agonista de OB pode se ligar ao receptor de OB com afinidade muito mais alta, ou demonstrar uma meia-vida mais longa in vivo, ou em ambos. No entanto, análogos de agonista de peptídeo que são menos eficazes do que a proteína natural são também comtemplados. Em uma outra modalidade, o análogo de antagoniza de atividade de OB. Por exemplo, um análogo de OB que se liga ao receptor de OB mas não induz transdução de sinal pode competitivamente inibir a ligação de OB natural ao receptor, assim diminuindo atividade de OB in vivo. Tal análogo de antagonista de OB pode também demonstrar propriedades diferentes a partir do peptídeo de OB, por exemplo, meia-vida mais longa (ou menor) in vivo, afinidade de ligação maior (ou menor) para o receptor de OB, ou ambos.
Em uma modalidade, um análogo de peptídeo de OB é o peptídeo de OB modificado por substituição de aminoácidos nas posições no polipeptídeo que não são essenciais para a etrutura ou função. Por exemplo, uma vez que é conhecido que peptídeo de OB ser humano é biologicamente ativo em murino, substituição de resíduos de aminoácidos divergentes na seqüência humana quando comparado com a seqüência de aminoácidos de murino fornecerá provavelmente análogos üteis de peptídeo de OB. Por exemplo, o resíduo de serina na posição 53 ou na posição 98, ou ambas (na seqüência de peptídeos não-processados mostrados na figura 4) ser humano pode não estar substituído, por exemplo, glicina, alanina, valina, cisteína, metionina, ou treonina. Similarmente, o resíduo de arginina no número de posição 92 (figura 4) pode estar substituído, por exemplo, com asparagina, lisina, histidina, glutamina, ácido glutâmico, ácido aspártico, serina, treonina, metionina ou cisteína. Referindo-se ainda à figura 4, outros aminoácidos no peptídeo de OB humano que parecem ser capazes de substituição são histadina na posição 118, triptofano na posição 121, alanina na posição 122, ácido glutâmico na posição 126, treonina na posição 127, leucina na
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posição 128, glicina na posição 132, glicina na posição 139, triptofano na posição 159, e glicina na posição 166. Em uma outra modalidade, pode ser possível substituir um ou mais resíduos 121 a 128 (como mostrado na figura 4), por exemplo, com glicinas ou alaninas, ou substituição de alguns dos 5 resíduos com as excessões de serina na posição 123, ou leucina na posição 125.
Em uma outra modalidade, um análogo de polipeptídeo de OB, de preferência o polipeptídeo de OB ser humano, é uma forma truncada do polipeptídeo. Por exemplo, já foi demontrado que a glutamina no resíduo 49 10 não é essencial, e pode ser deletada do peptídeo. Similarmente, pode ser possível deletar alguns ou todos os resíduos de aminoácidos divergentes
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nas posições 121 - 128. Além disso, a invenção contempla prover um análogo de OB tendo a seqüência de aminoácidos mínima necessária para uma atividade biológica. Isto pode ser prontamente determinado, por exemplo, por testar a atividade de fragmentos de OB quanto à capacidade de se ligar aos anticorpos de OB específicos, inibir a atividade do polipeptídeo de OB natural, ou agonizar a atividade do peptídeo de OB natural. Em uma modali dade, a invenção provê um polipeptídeo de OB truncado consistindo na estrutura de laço formada por ligação de dissulfeto que se forma entre os resí20 duos de cisteína 117, e 167 (como mostrado na figura 4). Em uma outra modalidade, o análogo truncado corresponde aos aminoácidos do resíduo 22 (que segue o sítio de divagem de peptídeo de sinal putativo) até 53 (o resíduo de aminoácido imediatamente precedendo a uma região de laço detectada com proteólise limitada seguida por análise espectrométrica de massa 25 do polipeptídeo de OB; ver Cohen e outros, Protein Science, 4:1088 (1985).
Em uma outra modalidade, o análogo truncado corresponde aos aminoácidos do resíduo 61 (o resíduo imediatamente após a região de laço flexível como detectado com a análise de espec. de proteólise/massa limitada do polipeptídeo de OB) até o resíduo de aminoácido 116 (o resíduo imediata· mente precedendo o primeiro resíduo de cisteína). Em ainda uma outra modalidade, o análogo truncado corresponde aos aminoácidos de resíduo 61 até o resíduo de aminoácido 167.
Além do mais, um ou mais resíduos do laço flexível putativo em
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resíduos números 54 a 60 estão substituídos. Por exemplo, uma ou mais dos resíduos podem estar substituídos com lisina, ácido glutâmico, ou cisteína (de preferência lisina) para a reticulação, por exemplo, a um polímero, uma vez que as estruturas de laço flexíveis são sítios preferidos para a deri5 vatização de uma proteína. Alternativamente, os resíduos nas posições de laço flexível podem estar substituídos com resíduos de aminoácidos que são mais resistentes à proteólise mas que retêm uma estrutura flexível, por exemplo, uma ou mais prolinas. Em ainda uma outra modalidade substituições com resíduos de aminoácidos que podem ser ulteriormente derivatiza10 dos para produzi-los mais resistentes à degradação, por exemplo, proteólise, é contemplada.
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Será apreciado por aqueles versados na técnica que o tamanho de fragmento precedente é aproximado, e que a partir de um a cerca de cinco aminoácidos podem ser incluídos ou deletados a partir de cada uma ou de ambas as extremidades, ou a partir do interior do polipeptídeo ou de seus fragmentos, dos análogos truncados recitados, com a exceção que nos análogos de laço ligados a dissulfeto, os resíduos de cisteína devem ser mantidos.
Verificou-se que peptídeo de OB de murino contém 50% de teor 20 α-helicoidal, e que o polipeptídeo de OB ser humano contém cerca de 60% de teor de α-helicoidal, como descrito por dicroismo circular dos peptídeos recombinantes sob condições proximamente fisiológicas. Correspondentemente, em uma outra modalidade, resíduos de aminoácidos podem estar substituídos com resíduos para formar análogos de polipeptídeo de OB que 25 demonstram tendência aumentada para a formação, ou que formam estruturas de α-hélice, mais estáveis. Por exemplo estrutura de α-hélice seria preferida se Glu, Ala, Leu, His, Trp fossem introduzidos como substituintes para resíduos de aminoácidos encontrados no polipeptídeo de OB nativo. De preferência substituições de aminoácidos conservadoras são empregadas, 30 por exemplo, substituições de resíduo(s) de aminoácido(s) 29, 30, 44, 61, 76, 100 e/ou 106 (como mostrado na figura 4) com ácido(s) glutâmico(s) (Glu); substituição de isoleucina(s) com leucina; substituição de glicina ou valina, ou qualquer aminoácido divergente, com alanina (por exemplo, seri41 na na posição 53 do polipeptídeo de OB ser humano com alanina), substituição de arginina ou lisina com histidina, e substituição de tirosina e/ou fenilalanina com triptofano. O aumento do grau, ou mais importantemente, a estabilidade de estrutura de α-hélice pode fornecer um análogo de OB com 5 atividade maior, afinidade de ligação aumentada, ou meia-vida mais longa.
Em uma modalidade específica, o pontencial formador de hélice da porção do peptídeo de OB correspondendo aos resíduos de aminoácidos 22 até 53 é aumentado. Em uma outra modalidade, o potencial de formador de hélice ou a estabilidade dos resíduos de aminoácidos 61 - 116 é aumentado. Em
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ainda uma outra modalidade, o potencial formador de hélice da estrutura de laço de dissulfeto correspondente aos aminoácidos 117 a 167 é aumentado. Também contemplados são análogos de OB contendo potencial de a-hélice aumentado ou estabilidade em mais do que um dos domínios precedentes. Em uma outra modalidade são gerados análogos de polipeptídeo de OB truncados que incorporam resíduos de aminoácidos formadores de estrutura, por exemplo, formadores de hélice, para compensar a tendência maior de fragmentos de polipeptídeo carecer de estrutura estável.
Análogos, tais como fragmentos, podem ser produzidos, por exemplo, por digestão de pepsina de material de peptídeo modulador de 20 peso. Outros análogos, tais como muteínas, podem ser produzidos por mu-
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tagênese de sítio dirigido padrão de sequências codificadoras de peptídeo modulador de peso. Análogos exibindo atividade moduladora de peso tais como pequenas moléculas, funcionando como promotoras ou inibidoras, podem ser identificadas por ensaios in vivo e/ou in vitro conhecidos.
Análogos de Moléculas Pequenas e Peptidomiméticos de Polipeptídeo de
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A estrutura do polipeptídeo de OB, de preferência polipeptídeo de OB ser humano, pode ser analisada por vários métodos conhecidos na técnica. A seqüência de proteínas pode ser caracterizada por uma análise de hidrofilicidade (por exemplo, Hopp e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78:3824 (1981)]. Um perfil de hidrofilicidade pode ser usado para identificar as regiões hidrofóbicas e hidrofílicas do polipeptídeo de OB, que pode indi car regiões enterradas no interior do polipeptídeo dobrado, e regiões aces-
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síveis no exterior do polipeptídeo. Além disso, análise estrutural secundária [por exemplo, Chou e outros, Biochem., 13:222 (1974)] pode também ser feita, para identificar regiões de polipeptídeo de OB que assumem estruturas secundárias específicas. Manipulação da estrutura determinada ou pre5 dita, pode ser realizada usando-se programas de software de computador disponíveis na técnica.
Por prover uma fonte abundante de polipeptídeo de OB recombinante, a presente invenção possibilita a determinação estrutural quantitativa do polipeptídeo. Em particular, bastante material é provido para resso-
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nância magnética nuclear (RMN), infravermelho (IV), Raman, e ultravioleta (UV), especialmente dicroísmo cicular (DC), análise espectroscópica. Em particular RMN provê análise estrutural muito poderosa de moléculas em solução, que mais proximamente se aproxima de seu ambiente natural [Marion e outros, Biochem. Biophys. Res. Comm., 113:967 - 974 (1983); Bar e outros, J. Magn. Reson., 65:355 - 360 (1985); Kimura e outros, Proc. Natl.
Acad. Sei. USA, 77:1681 - 1685 (1980)]. Outros métodos de análise estrutural podem também ser empregados. Estes incluem mas não são limitados à cristalografia de raios X [Engstom, Biochem. Exp. Biol, 11:7-13 (1974],
Em ainda uma outra modalidade, um análogo de polipeptídeo de
OB pode ser testado para se determinar se ele sofre reação cruzada com
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um anticorpo específico para o polipeptídeo de OB natural, ou seus fragmentos específicos. O grau de reatividade cruzada provê informação sobre homologia estrutural ou similaridade de proteínas, ou sobre a acessabilidade de regiões correspondendo a porções do polipeptídeo que foram usadas para gerar anticorpos de fragmento específicos.
Separação para Análogos de OB
Várias técnicas de separação são conhecidas na técnica para a separação de análogos de polipeptídeos. Várias bibliotecas de substâncias químicas estão disponíveis. Correspondentemente, a presente invenção contempla a separação de tais bibliotecas, por exemplo, bibliotecas de compostos sintéticos gerados durante anos de pesquisa, bibliotecas de compostos naturais, e bibliotecas combinatórias, como descritas em maiores detalhes, infra, para análogos de polipeptídeo de OB. Em uma modalidade,
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a invenção contempla separação de tais bibliotecas para compostos que se ligam aos anticorpos de polipeptídeo de anti-OB, de preferência anticorpos de polipeptídeo de OB anti-ser humano. Em um outro aspecto, uma vez que o receptor de OB é identificado (ver infra), qualquer separação de técnica 5 conhecida na técnica pode ser usada para antagonistas e agonistas de receptor de OB. A presente invenção contempla separações para imitadores e análogos de ligantes de moléculas pequenas, bem como separeções para ligantes naturais que se ligam a e agonizam ou antagonizam receptor de OB ativo in vivo.
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Conhecimento da seqüência primária do receptor, e a similaridade daquela seqüência com proteínas de função conhecida, pode prover um vestígio inicial sobre os agonistas ou os antagonistas da proteína. Identificação e separação de antagonistas são ulteriormente facilitadas por determinação de características estruturais, por exemplo, usando-se cristalo15 grafia de raios X, difração de nêutron, espectometria de ressonância magnética nuclear, e outras técnicas para a determinação de estrutura. Estas técnicas provêem a identificação ou o desenho apropriado de agonistas e
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de antagonistas.
Uma outra abordagem usa bacteriófago recombinante para produzir grandes bibliotecas. Usando-se o método de fago [Scott e outros, Science, 249:386 - 390 (1990); Cwirla e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87:6378 - 6382 (1990); Devlin e outros, Science, 249:404 - 406 (1990)], bibliotecas muito grandes podem ser construídas (106 - 10® entidades químicas). Uma segunda modalidade usa principalmente métodos químicos, dos quais o método de Geysen [Geysen e outros, Molecular Immunology, 23:709
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- 715 (1986); Geysen e outros, J. Immunologic Method, 102:259 - 274 (1987)] e o método recente de Fodor e outros, Science, 251:767 - 773 (1991) são exemplos. Furka e outros. 14th International Congress of Biochemistry, Volume 5, Abstract FR:013 (1988); Furka, Int. J. Peptide Protein
Res, 37:487 - 493 (1991)]; Houghton (a patente USA ne 4,631,211, issued
December 1986); e Rutter e outros, (patente U.S. ns 5.010.175, expedida em de abril de 1991) descrevem métodos para produzir uma mistura de peptídeos que podem ser testadas como agonistas ou antagonistas.
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Em um outro aspecto, bibliotecas sintéticas [Needels e outros,
Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:10700 - 10704 (1993); Lam e outros, publicação do pedido de patente internacional n2 WO 92/00252, cada um dos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade], e os semelhantes po5 dem ser usados para separar ligandos de receptor de OB de acordo com a presente invenção. Com tais bibliotecas, antagonistas de receptor podem ser detectados usando-se células que expressam o receptor sem realmente clonar o receptor de OB.
Alternativamente, ensaios para a ligação de ligando solúvel às
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células que expressam formas recombinantes do domínio de ligador de ligando de receptor de OB podem ser realizados. Os ligandos solúveis pode ser providos prontamente como polipeptídeo de OB sintético ou recombinante.
A separação pode ser realizada com células recombinantes que expressam o receptor de OB, ou alternativamente, usando-se proteína de receptor purificada, por exemplo, recombinamente produzida, como descrita acima. Por exemplo, a capacidade de receptor de OB marcado, solúvel ou solubilizado, que inclui a porção de ligante de ligação da molécula, para ligar ligando pode ser usada para separar bibliotecas, como descrito nas referências anteriores.
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Derivados de Polipeptídeos de OB
Em geral, a presente proteína (aqui o termo proteína é usado para incluir polipeptídeo a não ser que de outra maneira indicado) pode ser derivatizada pela fixação de uma ou mais porções químicas à porção de proteína. Os derivados quimicamente modificados podem ser ulteriormente formulados para intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subeutânea, intravenosa, oral, nasal, retal, bucal, sublingual, pulmonar, tópica, transdermal, ou outras rotas de administração. Modificação química de proteínas biologicamente ativas foram encontrads para prover vantagens adicionais sob certas circunstâncias, tal como aumentar o tempo de estabilidade e de circulação de proteína terapêutica e diminuição de imunogenecidade. Ver a patente U.S. nQ 4.179.337, Davis e outros, expedida em 18 de dezembro de 1979. Para uma revisão, ver Abuchowski e outros, Soluble Polymer-
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Enzyme Adducts, em Enzymes as Drugs, págs. 367 - 383, Holcenberg e Roberts, eds., Wiley-lnterscience, New York, NY (1981). Um artigo de revista descrevendo modificação de proteína e proteínas de fusão é Francis, Focus on Growth Factors, 3:4- 10 (1992).
Porções Químicas para Derivatização
As porções químicas adequadas para derivatização podem ser selecionadas dentre os polímeros solúveis em água. O polímero selecionado deve ser solúvel de modo que a proteína à qual ele está ligado não se precipita em uma ambiente aquoso, tal como ambiente fisiológico. De prefe10 rência, para o uso terapêutico da preparação de produto final, o polímero será farmaceuticamente aceitável. Aqueles versados na técnica serão capa-
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zes de selecionar o polímero desejado com base em tais considerações, quanto a se o conjugado de polímero/proteína será usado terapeuticamente, e, se for, a desejada dosagem, tempo de circulação, resistência a proteólise, e outras considerações. Para as presentes proteínas e peptídeos, estas podem ser determinadas usando-se os ensaios providos aqui.
Moléculas de Polímero
O polímero solúvel em água pode ser selecionado do grupo que consiste em, por exemplo, polietileno glicol, copolímeros de etileno gli20 col/propileno glicol, carboximetil celulose, dextrano, álcool polivinílico, poli vinil pirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anidrido maléico, poliaminoácidos (ou homopolímeros ou copolímeros aleatórios), e dextrano ou poli(n-vinil pirrolidona) polietileno glicol, homopolímeros de propileno glicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de 25 etileno, polióis polioxietilado e álcool polivinílico. Propionaldeído de polietileno glicol pode prover vantagens na produção devido à sua estabilidade em água.
O polímero pode ser de qualquer peso molecular, e pode ser ramificado ou não-ramíficado. Para polietileno glicol, o peso molecular pre30 ferido é entre cerca de 2 KDa e cerca de 100 kDa (o termo cerca de indicando que nas preparações de polietileno glicol, algumas moléculas pesarão mais, algumas menos, do que o peso molecular afirmado) para facilidade na manipulação e na produção. Outros tamanhos podem ser usados,
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dependendo do perfil terapêutico desejado (por exemplo, a duração de liberação sustentada desejada, os efeitos, se algum, sobre a atividade biológica, na facilidade na manipulação, no grau ou na falta de antigenicidade e nos outros efeitos conhecidos do polietileno glicol a uma proteína ou análo5 go terapêutico).
Razão de Polímero/Proteína
O número de moléculas de polímero assim ligadas podem variar, e aqueles versados na técnica serão capazes de determinar o efeito sobre a função. Pode-se mono-derivatizar, ou pode prover uma di-, tri-, tetraou alguma combinação de derivatização, com as mesmas ou porções químicas diferentes (por exemplo, polímeros tais como pesos diferentes de polietileno glicóis). A proporção de moléculas de polímero para moléculas de proteína (ou peptídeo) variará, como o farão suas concentrações na mistura de reação. Em geral, a razão ótima (em termos de eficácia de reação em que não há nenhum excesso de proteína ou de polímero não reagido) será determinada por fatores tal como o grau desejado de derivatização (por exemplo, mono, di-, tri-, etc.), o peso molecular do polímero selecionado, se o polímero é ramificado ou não-ramificado, e as condições de reação. Fixação da Porção Química à Proteína
As moléculas de polietileno glicol (outras porções químicas) devem estar ligadas à proteína sob consideração de efeitos sobre domínios antígênicos ou funcionais da proteína. Há numerosos métodos disponíveis para aqueles versados na técnica, por exemplo, EP 0 401 384 aqui incorporado aqui por referência (acoplamento de PEG para G-CSF). Ver também Malik e outros, Exp. Hematol, 20:1028 - 1035 (1992) (relatando pegilação de GM-CSF usando-se cloreto de tresila). Por exemplo, polietileno glicol pode ser covalentemente ligado através de resíduos de aminoácidos via um grupo reativo, tal como um grupo carboxila ou amino livre. Grupos reativos são aqueles aos quais uma molécula de polietileno glicol ativado pode ser ligada. Os resíduos de aminoácidos tendo um grupo amino livre pode incluir resíduos de lisina e os resíduos de aminoácidos terminal N, aqueles tendo um grupo carboxila livre podem incluir resíduos de ácido aspártico, resíduos de ácido glutâmico e o resíduo de aminoácido terminal C. Grupos sulfidrila
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podem também ser usados como um grupo reativo para a ligação da(s) molécula(s) de polietileno glicol. Preferida para finalidades terapêuticas é a fixação em um grupo amino, tal como fixação em terminal N ou em grupo lisina. Fixação em resíduos importantes para ligação de receptor deve ser 5 evitada se ligação de receptor é desejada.
Proteínas Quimicamente Modificadas N-Terminalmente
Pode-se específicamente desejar proteína quimicamente modificada N-terminalmente. Usando-se polietileno glicol como uma ilustração das presentes composições, pode-se selecionar a partir de uma variedade de moléculas de polietileno glicol (por peso molecular, por ramificação, etc.), a
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proporção de moléculas de polietileno glicol para moléculas proteína (ou peptídeo) na mistura de reação, o tipo de reação de pegilação a ser realizada, e o método de obtenção da proteína pegilada N-terminalmente. O método de obtenção da preparação de pegilado N-terminalmente (isto é, separa15 ção desta porção de outras porções monopegiladas se necessário) pode ser por purificação do material pegilado N-terminalmente a partir de uma população de moléculas de proteína pegiladas. Modificação química terminal N seletiva pode ser realizada por alquilação redutiva que explora reatividade de tipos diferentes de grupos amino primários (lisina versus terminal N) dis20 poníveis para derivatização em uma proteína particular. Sob as condições
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de reação apropriadas, derivatização substancialmente seletiva da proteína no terminal N com um grupo carboxila contendo polímero é conseguida. Por exemplo, pode-se substancial mente pegilar N-terminalmente a proteína por realização da reação em um pH que permite tirar vantagem das diferenças 25 de pKa entre os grupos ε-amino dos resíduos de lisina e aquele do grupo oc-
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amino do resíduo terminal N da proteína. Por tal derivação seletiva, fixação de um polímero solúvel em água a uma proteína é controlada: a conjugação com o polímero ocorre predominantemente no terminal N da proteína e nenhuma modificação significativa de outros grupos reativos, tais como grupos amino de cadeia lateral de lisina, ocorre. Usando-se alquilação redutiva, o polímero solúvel em água pode ser do tipo descrito acima, e deve ter um único aldeído reativo para acoplamento da proteína. Propionaldeído e polietileno glicol, contendo um único aldeído reativo, podem ser usados.
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Ácidos Nucléicos Associados com Polipeptídeo de OB
Como observado acima, a presente invenção refere-se a ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos de OB, bem como sequências de não-codificação genômicas 5', 31, e intrônicas ao gene de OB. Assim, de 5 acordo com a presente invenção podem ser empregadas técnicas de DNA recombinante, de biologia molecular e de microbiologia dentro da habilidade da técnica. Tais técnicas são explicadas totalmente na literatura. Ver, por exemplo, Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring, Harbor, 10 New York (1989); Glover ed., DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I e II, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. (1985); Gait ed., Oligonucleotide Synthe-
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sis, Oxford University Press (1984); Hames e outros, eds., Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag (1985); Hames e outros, eds. Transcriptíon And Translation, Oxford University Press (1984)]; Freshney ed., Animal Cell
Culture, Oxford University Press (1986)]; immobilized Cells And Enzymes,
IRL Press (1986)]; Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning, Wiley, New York (1984). De particular relevância para a presente invenção são estratégias para isolamento, clonagem, seqüenciação, análise e caracterização de um gene ou ácido nucléico com base nas técnicas de reação de polimerase bem conhecidas (PCR).
Um replicon é qualquer elemento genético (por exemplo, piasmídeo, cromossoma, vírus) que funciona como uma unidade autônoma de replicação de DNA in vivo, isto é, capaz de replicação sob seu próprio con trole.
Um vetor é um replicon, tais como um plasmídeo, um fago, ou um cosmídeo, ao qual um outro segmento de DNA pode estar ligado de modo a provocar a replicação do segmento ligado.
Um cassete refere-se a um segmento de DNA que pode ser inserido para dentro de um vetor em sítios de restrição específicos. O seg30 mento de DNA codifica um polipeptídeo de interesse, e o cassete e os sítios de restrição são destinados a assegurar a inserção do cassete no quadro de leitura adequado para transcrição e tradução.
DNA heterólogo refere-se a DNA não-naturalmente localizado
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na célula, ou em um sítio cromossomal da célula. De preferência, o DNA heterólogo inclui um gene estranho à célula.
Uma célula foi transfectada por DNA exógeno ou heterólogo quando tal DNA foi introduzido dentro da célula. Uma célula foi transforma5 da por DNA exógeno ou heterólogo quando o DNA transfectado efetua uma mudança fenotípica. De preferência, a transformação de DNA deve ser integrada (covalentemente ligada) no DNA cromossomal que produz o genoma da célula.
Um clone é uma população de células derivadas de uma única
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célula ou antepassado comum por mitose.
Uma molécula de ácido nucléico refere-se à forma polimérica de éster de fosfato de ribonucleosídeos (adenosina, guanosina, uridina ou citidina; moléculas de RNA) ou desoxirribonucleosídeos (desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxitimidina ou desoxicitidina; moléculas de DNA) ou em forma de filamento único, ou em uma forma de hélice dupla. Hélices de
DNA-DNA, de DNA-RNA e de RNA-RNA de filamentos duplos são possíveis. O termo molécula de ácido nucléico, e em particular molécula d© DNA ou de RNA, refere-se apenas à estrutura primária ou secundária da molécula, e não limita a quaisquer formas terciárias ou quaternárias particulares.
Assim, este termo inclui DNA de filamento duplo encontrado, entre outros,
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em moléculas de DNA circulares ou lineares (por exemplo, fragmentos de restrição), plasmídeos e cromossomas. Na discussão da estrutura de moléculas de DNA de filamento duplo particular, seqüências podem ser descritas aqui d© acordo com a convenção normal de dar apenas a seqüência na di
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reção 5' a 3' ao longo do filamento não-transcrito de DNA (isto é, o filamento tendo uma seqüência homóloga ao mRNA). Uma molécula de DNA recombinante é uma molécula de DNA que sofreu uma manipulação biológica molecular.
Uma molécula de ácido nucléico é hibridizável a uma outra molécula de ácido nucléico, tal como um cDNA, um DNA genômico, ou RNA, quando uma forma de filamento único da molécula de ácido nucléico pode se anelar à outra molécula de ácido nucléico sob as condições apropriadas de temperatura e concentração iônica de solução (ver Sambrook e outros,
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1989, supra). As condições de temperatura e concentração iônica determinam a severidade da hibridização. Para separação preliminar de ácidos nucléicos homólogos, condições de hibridização de baixa severidade, correspondendo a um Tm de 55°C, podem ser usadas, por exemplo, 5 x SSC, 5 0,1% de SDS, 0,25% de leite, e nenhuma formamida; ou 30% de formamida,
5x SSC, 0,5% de SDS). Condições de hibridização de severidade moderada correspondem a um Tm mais alto, por exemplo, 40% de formamida, com 5x ou 6x SCC. Condições de hibridização de severidade alta correspondem ao Tm mais alto, por exemplo, 50% de formamida, 5x ou 6x SCC. A hibridiza-
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ção exige que os dois ácidos nucléicos contenham sequências complementares, embora, dependendo da severidade de hibridização, do desemparelhamento entre as bases sejam possíveis. A severidade apropriada para a hibridização de ácidos nucléicos depende do comprimento dos ácidos nucléicos e do grau de complementação, das variáveis bem conhecidas na técnica. Quanto maior o grau de similaridade ou homologia entre duas seqüências de nucleotídeos, maior o valor de Tm para híbridos de ácidos nucléicos tendo aquelas seqüências. A estabilidade relativa (correspondendo a Tm mais alto) de hibridizações de ácido nucléico diminui na seguinte ordem: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Para híbridos de mais do que 100 nucleotídeos de comprimento, equações para o cálculo de Tm foram deriva-
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das (ver Sambrook e outros, 1989, supra 9.50 - 0,51). Para hibridização com ácidos nucléicos menores, isto é, oligonucleotídeos, a posição dos desemparelhamentos torna-se mais importante, e o comprimento do oligonucleotídeo determina sua especificidade (ver Sambrook e outros, 1989, supra 11.7
- 11.8). De preferência um comprimento mínimo para uma ácido nucléico htbridizável é de pelo menos cerca de 10 nucleotídeos; mais de preferência de pelo menos cerca de 15 nucleotídeos; mais de preferência o comprimento é de pelo menos cerca de 20 nucleotídeos.
Recombinação homóloga refere-se à inserção de uma se qüência de DNA estranho de um vetor em um cromossoma. De preferência, o vetor atinge um sítio cromossomial específico para recombinação homóloga. Para recombinação homóloga específica, o vetor conterá regiões suficientemente longas de homologia para com as seqüências do cromossoma μιΐ permitir a ligação complementar e a incorporação do vetor para dentro do cromossoma. Regiões mais longas de homologia, e graus maiores de similaridade de seqüência, podem aumentar a eficiência de recombinação de ho-
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mologia.
Uma seqüência que codifica DNA (ou seqüência de codificação de DNA) é uma seqüência de DNA de filamento duplo que é transcrita e é traduzida para dentro de um polipeptídeo em uma célula in vitro ou in vivo quando colocada sob o controle de seqüências reguladoras apropriadas. Os limites da seqüência que codifica são determinados por um códon 10 inicial no terminal 5' (amino) e um códon de parada de tradução no terminal 3' (carboxila). Uma seqüência que codifica pode incluir, mas não é limitada a, seqüências procarióticas, cDNA de mRNA eucariótico, seqüências de
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DNA genômicos oriundas de DNA eucariótico (por exemplo de mamífero), e mesmo seqüências de DNA sintéticos. Se a seqüência que codifica é desti15 nada a expressão em uma célula eucariótica, uma seqüência de terminação de transcrição e de sinal de poliadenilação usualmente serão localizadas 3* à seqüência que codifica.
Isolamento de Seqüências de Flanaueamento e de Codificação.
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Os ácidos nucléicos contemplados pela presente invenção es20 tendem-se como indicado, a outros ácidos nucléicos que codificam quando da expressão para peptídeos tais como aqueles indicados na figura 1A até D (SEQ ID N2:2), na figura 3 (SEQ ID Ne:4), na figura 5 (SEQ ID Ns:5) e na Figura (SEQ ID Ns:6) aqui. Correspondentemente, enquanto DNA específico foi isolado e foi seqüenciado em relação ao gene de OB, qualquer célula 25 animal potencialmente pode servir como fonte de ácido nucléico para a clonagem molecular de gene que codifica os peptídeos da invenção. O DNA pode ser obtido por procedimentos padrão conhecidos na técnica de DNA clonado (por exemplo, uma biblioteca de DNA), por síntese química, por clonagem de cDNA, ou pela clonagem de DNA genõmico, ou seus frag30 mentos, purificado a partir da célula desejada (ver, por exemplo, Sambrook e outros, 1989, supra; Glover, 1985, supra). Clones derivados a partir de DNA genõmico podem conter regiões de DNA intrônico e regulador além de regiões que codificam; clones derivados de cDNA não conterão seqüências
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de íntrons. Qualquer que seja a fonte, o gene deve ser molecularmente clonado para dentro de um vetor adequado para a propagação do gene.
Na clonagem molecular do gene de DNA genômico, o DNA genômico pode ser ampliado usando-se iniciadores selecionados das seqüên5 cias de DNA. Alternativamente, fragmentos de DNA são gerados, alguns dos quais codificarão o gene desejado. O DNA pode ser clivado em sítios específicos usando-se várias enzimas de restrição. Pode-se também usar DNase na presença de manganês para fragmentar o DNA, ou o DNA pode ser fisicamente cisalhado, como por exemplo, por sonicação. Os fragmentos 10 de DNA linear podem então ser separados de acordo com o tamanho por
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técnicas padrão, incluindo, mas não se limitando a, eletroforese de gel de poliacrílamida e de agarose e de cromatografia de coluna.
Uma vez que os fragmentos de DNA são gerados, a identificação do fragmento de DNA contendo o gene de OB ou o tipo de OB desejado pode ser realizada de numerosas maneiras. Por exemplo, se uma quantida de de uma porção de gene de tipo OB ou OB ou seu RNA específico, ou um seu fragmento, está disponível e pode ser purificado e marcado, os fragmentos de DNA gerados podem ser separados por hibridização de ácido nucléico para uma sonda rotulada [Benton e outros, Science, 196:180
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(1977); Grunstein e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 72:3961 (1975)]. A presente invenção provê tais sondas de ácido nucléico, que podem ser convenientemente preparadas a partir das seqüências específicas descritas aqui, por exemplo, uma sonda hibridizável tendo uma seqüência de nucleo tídeos correspondendo a pelo menos um fragmento de 10, e de preferência 15 nucleotídeos das seqüências mostradas na figura 1A até E (SEQ ID N2:1) ou na figura 2A e B (SEQ ID N9:3). De preferência, é selecionado um fragmento que é altamente único (altamente especial) para os peptídeos moduladores da invenção. Aqueles fragmentos de DNA com homologia substan ciai para com a sonda hibridizar-se-ão. Como observado acima, quanto maior o grau de homologia, mais rigorosa as condições de hibridização que podem ser usadas. Em uma modalidade, condições de hibridização de baixa severidade são usadas para identificar um peptídeo modulador homólogo. No entanto, em um aspecto preferido, e como demonstrado experimental-
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mente aqui, um ácido nucléico que codifica um peptídeo modulador da invenção hibridizará para um ácido nucléico tendo seqüências de nucleotídeos tais como mostradas na figura 1A até E (SEQ ID N2:1) ou na figura 2A e B (SEQ ID Ne:3), ou um seu fragmento hibridizável, sob condições mode5 radamente rigorosas; mais de preferência, hibridizará sob condições de alta severidade.
Alternativamente, a presença do gene pode ser detectada por ensaios com base nas propriedades físicas, químicas ou imunológicas do seu produto expresso. Por exemplo, podem ser selecionados clones de cDNA, ou clones de DNA que selecionam hibridamente os mRNAs adequados, que poduzem uma proteína que tem migração eletroforética similar ou
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idêntica, comportamento de focalização isoelétrica, mapas de digestão porteolítica, atividade de fosfatase alcalina ou propriedades antigênicas como conhecidos para os presentes peptídeos moduladores. Por exemplo, os an15 ticorpos da presente invenção podem convenientemente ser usados para fazer a separação de homólogos de peptídeos moduladores oriundos de outras fontes.
Um gene que codifica um peptídeo modulador da invenção pode ser identificado por seleção de mRNA, isto é, por hibridização de ácido nu20 cléico seguida por tradução in vitro. Nesse procedimento, fragmentos são usados para isolar mRNAs complementares por hibridização. Tais fragmentos de DNA podem representar DNA modulador purificado disponível. Análise de imunoprecipitação ou de ensaios funcionais (por exemplo, atividade de fosfatase alcalina) dos produtos de tradução in vitro dos produtos 25 dos mRNAs identifica o mRNA e, portanto, os fragmentos de DNA complementares, que contêm as seqüências desejadas. Além disso, mRNAs específicos podem ser selecionados de polissomas isolados a partir de células a anticorpos imobilizados específicamente direcionados contra um peptídeo modulador.
Um cDNA de peptídeo modulador radiormarcado pode ser sintetizado usando o mRNA selecionado (a partir de polissomas adsorvidos) como um modelo. O cDNA ou o mRNA radiormarcado pode então ser usado como uma sonda para identificação de fragmentos de DNA de peptídeo mo-
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dulador homólogo a partir dentre outros fragmentos de DNA genômico.
Como mencionado acima, uma seqüência de DNA que codifica peptídeos moduladores de peso como descrito aqui pode ser preparada sinteticamente ao invés de clonada. A seqüência de DNA pode ser projeta5 da com os códons adequados para as seqüências de aminoácido de peptídeo modulador de peso. Em geral, serão selecionados códons preferidos para o hospedeiro pretendido se a seqüência será usada para expressão. A seqüência completa é montada de nucleotídeos de superposição preparada por métodos padrão e são montados em uma seqüência de codificação 10 completa. Ver, por exemplo, Edge, Nature, 292:756 (1981); Nambair e outros, Science, 223:1299 (1984); Jay e outros, J. Biol. Chem., 259:6311
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(1984).
Seqüências de DNA sintéticas permitem construção conveniente de genes que expressarão análogos moduladores de peso, como descrito acima. Aíternativamente, análogos que codificam DNA podem ser produzidos por mutagênese de sítio direcionado de genes de OB naturais ou cDNAs, e análogos podem ser produzidos diretamente usando-se síntese de polipeptídeo convencional.
Um método geral para incorporação de sítio específico de ami20 noácidos não-naturais para dentro de proteínas é descrito em Noren e outros, Science, 244: 182 - 188 (1989). Este método pode ser usado para criar análogos do polipeptídeo de OB com aminoácidos não-naturais.
Ácidos Nucléicos de Não-codificacão
A presente invenção estende-se à preparação de nucleotídeos sem sentido e ribozimas que podem ser usados para interferir com a expressão das proteínas moduladoras de peso no nível traducional. Esta abordagem utiliza ácido nucléico sem sentido e ribozimas para bloquear a tradução de um mRNA específico, ou por mascarâmento que mRNA com um ácido nucléico sem sentido ou clivagem dele com uma ribozima.
Ácidos nucléicos sem sentido são moléculas de DNA ou de RNA que são complementares a pelo menos uma porção de uma molécula de mRNA específica [ver, Weintraub, Sei. Am., 162: 40 - 46 (1990); MarcusSekura, Anal. Biochem., 172:289 - 295 (1988)]. Na célula, eles hibridizam
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àquele mRNA, formando uma molécula de filamento duplo. A célula não traduz um mRNA complexo nesta forma de filamento duplo. Portanto, ácidos nucléicos sem sentido interferem com a expressão de mRNA na proteína.
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Oligômeros de cerca de quinze nucleotídeos e moléculas que hibridizam para o códon de iniciação de AUG serão particularmente eficientes, uma vez que eles são fáceis de sintetizar e são prováveis de apresentar menos problemas do que moléculas maiores quando da introdução delas em células produtoras de peptídeo modulador de peso. Métodos sem sentido foram usados para inibir a expressão de muitos genes in vitro [(Marcus-Sekura, 1988, supra; Hambor e outros, J. Exp. Med., 168:1237 -1245 (1988)].
Ribozimas são moléculas de RNA possuindo a capacidade para específicamente clivar outras moléculas de RNA de filamento único de uma maneira um tanto análoga para endonucleases de restrição de DNA. Ribozimas foram reveladas a partir da observação que que certos mRNAs têm a capacidade de extirpar seus próprios íntrons. Por modificação da seqüência de nucleotídeos destes RNAs, pesquisadores foram capazes de engenheirar moléculas que reconhecem seqüências de nucleotídeos específicas em um molécula de RNA e clivá-las [Cech. J. Am. Med. Assoe., 260:3030 - 3034 (1988)]. Uma vez que elas são específicas de seqüência, apenas mRNAs com seqüências particulares são inativados.
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Investigadores identificaram dois tipos de ribozimas, ribozimas de tipo tetrahimena e de tipo de cabeça de martelo. Ribozimas de tipo tetrahimena reconhecem seqüências de quatro bases, enquanto de tipo cabeça de martelo reconhecem seqüências de oito a onze bases. Quanto mais longa a seqüência de reconhecimento, mais provável é de ocorrer exclusivamente na especíe de mRNA alvo. Portanto, ribozimas de tipo cabeça de martelo são de preferência para ribozimas de tipo Tetrahimena para a inativação de uma espécie de mRNA específico, e dezoito seqüências de reconhecimento de bases são de preferência para seqüências de reconhe30 cimento menores.
As seqüências de DNA descritas aqui podem assim ser usadas para preparar moléculas sem sentido contra e ribozimas que clivam mRNAs para proteínas modeladores de peso e seus ligantes, assim a inbição de expressão do gene de OB, e levando à adiposidade e ao ganho de peso aumentado.
Em uma outra modalidade, oligonucleotídeos curtos complementares à codificação e filamentos complementares do ácido nucleico de OB, ou regiões de não-codificação do gene de OB 51, 3' ou interno (intrônico) à região de codificação são providos pela presente invenção. Tais ácidos nucléicos são úteis como sondas, ou como sondas de oligonucleotídeos diretamente marcados, ou como iniciadores para a reação de cadeia de polimerase, para avaliação da presença de mutações no gene de OB, ou o nível de expressão de mRNA de OB. De preferência, os ácidos nucléicos de não-codificação da invenção são a partir do gene de OB ser humano.
Em uma modalidade específica, os ácidos nucléicos de nãocodificação provêem para a recombinação homóloga para a integração de um gene ampliável e/ou outras seqüências reguladoras em proximidade ao gene de OB, por exemplo, para prover para níveis mais alto de expressão do polipeptídeo de OB, ou para superar uma mutação nas seqüências reguladoras de gene de OB que previnem níveis adequados de expressão do polipeptídeo de OB (ver Publicação de Pedido de Patente Internacional WO 91/06666, publicado em 16 de maio de 1991 por Skoultchi; Publicação de Pedido de Patente Internacional WO 91/09955, publicado em 11 de julho de 1991 por Chappel; ver também Publicação de Pedido de Patente Internacional WO 90/14092, publicado em 29 de novembro de 1990, por Kucherlapati e Campbell).
Produção de Polipetídeo de OB: Expressão e Síntese
Seqüências de controle traducionais e transcripcionais são seqüências reguladoras de DNA, tais como promotores, aumentadores, terminadores, e semelhantes, que provêem a expressão de uma seqüência que codifica em uma célula de hospedeiro. Em células eucarióticas, sinais de poliadenilação são seqüências de controle.
Uma seqüência de codificação está sob o controle de seqüências transcripcionais e traducionais em uma célula quando polimerase de RNA transcreve a seqüência de codificação para dar mRNA, que é então trans-RNA fatiado e traduzido na proteína codificada pela seqüência de codificação.
Uma seqüência de sinal é incluído no inicio da seqüência de codificação de uma proteína a ser expressa sobre a superfície de uma célula. Esta seqüência codifica um peptídeo de sinal, terminal-N ao polipeptídeo maduro, que dirige a célula de hospedeiro para transloca o polipeptídeo. O termo seqüência de translocação de sinal é também usado aqui para se referir a esta espécie de seqüência de sinal. Seqüências de translocação de sinal podem ser encontradas associadas com uma variedade de proteínas naturais para eucariótes e procariótes, e são freqüentemente funcionais em ambos os tipos de organismos.
Uma seqüência de DNA é operativamente ligada a uma seqüência de controle de expressão quando a seqüência de controle de expressão controla e regula a transcrição e tradução daquela seqüência de DNA. O termo operativamente ligado inclui tendo um sinal inicial apropriado (por exemplo, ATG) em frente da seqüência de DNA a ser expressa e mantendo o quadro de leitura correto para permitir expressão da seqüência de DNA sob o controle da seqüência de controle de expressão e produção do produto desejado pela seqüência de DNA. Se um gene que se deseja inserir em uma molécula de DNA recombinante não contém um sinal inicial apropriado, tal sinal inicial pode ser inserido a montante (5‘) de e em quadro de leitura com o gene.
Uma seqüência promotora é uma região reguladora de DNA capaz de ligar polimerase de RNA em uma célula e inciar transcrição de uma seqüência de codificação a jusante (direção 3'). Para finalidades de definição da presente invenção, a seqüência de promotor é ligada em seu terminal 3' pelo sítio de iniciação de transcrição e estende-se a montante (direção 51) para incluir o número mínimo de bases ou elementos necessários para iniciar trancrição em níveis detectáveis acima do fundo. Dentro da seqüência promotora será encontrada um sítio de iniciação de transcrição (convenientemente definido, por exemplo, por mapeamenteo com nuclease S1), bem como domínios de ligação de proteína (seqüências de consenso) responsável para a ligação de polimerase de RNA.
Uma outra característica desta invenção é a expressão das se-
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qüências de DNA descritas aqui. Como é bem conhecida na técnica, seqüências de DNA podem ser expressas por operativamente ligá-las a uma seqüência de controle de expressão em um vetor de expressão apropriado e empregando aquele vetor de expressão para transformar um hospedeiro 5 unicelular apropriado.
Tais ligações operativas de uma seqüência de DNA desta invenção a uma seqüência de controle, naturalmente, inclui, se já não é parte da seqüência de DNA, o fornecimento de um códon de iniciação, ATG, no quadro de leitura correto a montante da seqüência de DNA.
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Uma ampla variedade de combinações de vetor de hospedeiro/expressão podem/ ar empregados na expressão das seqüências de DNA desta invenção. Vetores de expressão úteis, por exemplo, podem consistir em segmentos de seqüências de DNA cromossomais, não cromossomais e sintéticos. Vetores adequados incluem derivados de SV40 e plasmídeos bacterianos conhecidos, por exemplo, plasmídeo de E. coli, col E1, pCR1, pBR322, pMB9, pUC ou derivados de plasmídeo pUC, por exemplo, vetores de pGEX, vetores de pET, pmal-c, pFLAG, etc., e seus derivados, plasmídeos tal como RP4; DNAs de fagos, por exemplo, os derivados numerosos de fago λ, por exemplo, NM989, e outro DNA de fago, por exemplo, DNA de 20 fago de filamento único e filamentoso e Ml 3; plasmídeos de levedura tais como o plasmídeo de 2 μ ou seus derivados: vetores úteis em células eucarióticas, tais como vetores úteis em células de mamíferos ou de insetos; vetores derivados a partir de combinações de plasmídeos e DNAs de fagos, tais como plasmídeos que foram modificados para empregar DNA de fago 25 ou outras seqüências de controle de expressão; e semelhantes. Em uma modalidade, expressão de OB é conseguida em levedura de metilotrófica, por exemplo, levedura Pichia pastoris (ver, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente Internacional WO 90/03431, publicada em 5 de abril de 1990, por Brierley e outros; Publicação de Pedido de Patente Internacional 30 WO 90/10697, publicado em 20 de setembro de 1990, por Siegel e outros).
Em uma modalidade específica, infra, um vetor de expressão é engenheirado para expressão de OB sob controle de seqüências de sinais de fator de acasalamento alfa.
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Qualquer de uma ampla variedade de seqüências de controle de expressão—seqüências que controlam a expressão de uma seqüência de DNA operativamente ligada a ela—pode ser usada nestes vetores para expressar as seqüências de DNA desta invenção. Tais seqüências de controle 5 de expressão úteis incluem, por exemplo, promotores prematuros ou tardios de SV40, CMV, vacínia, polioma ou adenovírus, o sistema de lac, o sistema de trp, o sistema de TAC, o sistema de TRC, o sistema de LTR, as principais regiões operadoras e promotoras de fago λ, as regiões de controle de proteína revestida de fd, o promotor para quinas© de 3-fosfoglicerato ou ou10 tras enzimas glicolíticas, os promotores de fosfatase de ácido (por exemplo,
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Pho5), o promotor de AOX 1 de levedura de metilotrófica, os promotores de fatores de acasalamento alfa de levedura, e outras seqüências conhecidas para controlar a expressão de genes de células eucarióticas ou procarióticas ou seus vírus, e suas várias combinações.
Uma ampla variedade de células de hospedeiro unicelulares são também úteis em expressão das seqüências de DNA desta invenção. Estes hospedeiros podem incluir hospedeiros procarióticos e eucarióticos, tais
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como cepas de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces; fungos tais como leveduras (Saccharomyces e levedura metilotrópica tais como Pichia,
Candida, Hansenula e Torulopsis); e células de animais, tais como CHO, células de R1.1, e B-W e células LM, células de rim de macacos verde africano (por exemplo, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, e BMT10), células de inseto (por exemplo, Sf9), e células humanas e células de plantas em cultura de tecido.
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Será entendido que nem todos os vetores, seqüências de controle de expressão e hospedeiros funcionaram igualmente bem para expressar as seqüências de DNA desta invenção. Tampouco todos os hospedeiros funcionarão igualmente bem com o mesmo sistema de expressão. No entanto, um versado na técnica será capaz de selecionar os vetores, seqüên30 cias de controle de expressão, e hospedeiros adequados sem experimentação imprópria para realizar a expressão desejada sem se afastar do escopo desta invenção. Por exemplo, na seleção de um vetor, o hospedeiro deve ser considerado uma vez que o vetor deve funcionar nele. O número de có60 pias do vetor, a capacidade de controlar aquele número de cópia, e a expressão de quaisquer outras proteínas codificadas pelo vetor, tais como marcadores de antibióticos serão considerados.
Na seleção de uma seqüência de controle de expressão, uma variedade de fatores normalmente serão considerados. Estes incluem, por exemplo, a concentração relativa do sistema, sua capacidade de controlar, e sua compatibilidade com a seqüência ou o gene de DNA particular a ser expresso, particularmente com relação as estruturas secundárias potenciais.
Hospedeiros unicelulares adequados serão selecionados por consideração de, por exemplo, sua compatibilidade com o vetor escolhido, suas caracte-
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rísticas de secreção, sua capacidade para dobrar proteínas corretamente, e suas necessidades de fermentação, bem como a toxicidade ao hospedeiro do produto codificado pelas seqüências de DNA expresso, e a facilidade de purificação dos produtos de expressão.
Considerando estes e outros fatores, uma pessoa versada na técnica será capaz de construir uma variedade de combinações de ve tor/seqüência de controle de expressao/hospedeiro que expressarão as seqüências de DNA desta invenção sobre fermentação ou em cultura de animal em grande escala.
Em uma modalidade específica, uma proteína de fusão de OB
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pode ser expressa. Uma proteína de fusão de OB compreende pelo menos uma porção funcionalmente ativa de uma proteína de não-OB unida via uma ligação de peptídeo a pelo menos uma porção funcionalmente ativa de um polipeptídeo de OB. As seqüências de não OB podem ser amino- ou carbóxi-terminal às seqüências de OB. Mais de preferência, para a expressão estável de uma proteína de fusão de OB proteoliticamente ativa, a porção da proteína de fusão de não OB é unida via uma ligação de peptídeo ao amino-terminal do proteína de OB. Uma molécula de DNA recombinante que codifica tal proteína de fusão compreende uma seqüência que codifica pelo menos uma porção funcionalmente ativa de uma proteína de não OB unida em quadro à seqüência de codificação de OB, e de preferência codifica um sítio de divagem para uma protease específica, por exemplo, trombina ou Fator Xa, de preferência na junta de OB e de não-OB. Em uma modalidade
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específica, a proteína de fusão é expressa em Escheríchia coli ou em P.
pastoris.
Em uma modalidade específica, infra, vetores foram preparados para expressar os genes de OB ser humano e de murino, com ou sem o có5 don para gen-49, em sistemas de expressão bacteriana e sistemas de expressão de levedura (Pichia) como proteínas de fusão. O gene de OB é preparado com um sítio de divagem de endonuclease, por exemplo, usando-se iniciadores novos e PCR. É desejável confirmar seqüências geradas por PCR, uma vez que a probabilidade de incluir uma mutação de ponto é 10 maior com esta técnica. Um plasmídeo contendo uma histidina tag (His-tag)
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e um sítio de divagem proteolítico é usado. A presença da histidina torna possível o isolamento seletivo de proteínas recombinantes sobre uma coluna de quelação de Ni, ou por purificação de afinidade. O sítio de divagem proteolítico, em uma modalidade específica, infra, um sítio de divagem de trombina, é engenheirado de modo que o tratamento com a protease, por exemplo, trombina, liberará o polipeptídeo de OB madura de comprimento completo (isto é, faltando uma seqüência de sinal).
Em um outro aspecto, o vetor de pGEX [Smith e outros, Gene
67:31 - 40 (1988)] pode ser usado. Este vetor funde o cDNA de S20 transferase de glutationina de schistosoma japonicum à seqüência de inte-
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resse. Proteínas bacterianas são cultivadas e proteínas recombinantes podem ser rapidamente purificadas sobre uma coluna de afinidade de glutationa reduzida. O veículo de GST pode subseqüentemente ser clivado de proteínas de fusão por digestão com proteases de sítio específico. Depois da divagem, o veículo e a proteína de fusão não-clivada podem ser removidos
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por absorção sobre agarose de glutationa. Dificuldade com o sistema ocasionalmente aumenta quando a proteína codificada é insolúvel em soluções aquosas.
Expressão de proteínas recombinantes em sistemas bacterianos podem resultar em dobramento da proteína expressa, necessitando de redobramento. A proteína recombinante pode ser redobrada antes ou depois da divagem para formar um polipeptídeo de OB funcionalmente ativo. O polipeptídeo de OB pode ser redobrado pelas etapas de (i) incubação da
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proteína em um tampão de desnaturação que contém um agente de redução, e então (ii) a incubação da proteína em um tampão que contém um agente de oxidação, e de preferência também contém um agente de solubilização de proteína ou um agente caotrópico, ou ambos. Pares de agente de 5 redóxi adequados (redução/oxidação) incluem, mas não são limitados a, glutationa/dissulfeto de glutationa, cistina/cisteina, cistamina/cisteamina, e 2-mercaptoetanol/2-hidroxietildissulfeto reduzidos. Em um aspecto particular, a proteína de fusão pode ser solubilizada em um desnaturante, tal como uréia, antes da troca no tampão de redução. Em uma modalidade preferida, a proteína é também purificada, por exemplo, por cromatografia de Ní-
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quel ação ou troca de íons, antes da troca no tampão de redução. Agentes de desnaturação incluem mas não são limitados a uréia e guanidina-HCI. A proteína recombinante é então diluída cerca de pelo menos 10 vezes, mais de preferência cerca de 100 vezes, em um tampão de oxidação que contém um agente oxidante, tais como mas não limitado a Tris-HCI a 0,1 mM, pH
8,0, EDTA a 0,1 M, NaCI a 0,15 M, glutationa oxidada a 0,3 Μ. A proteína de fusão é então incubada para cerca de 1 a cerca de 24 horas, de preferência cerca de 2 a cerca de 16 horas, à temperatura ambiente no tampão de oxi-
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dação. O tampão de oxidação pode compreender um agente de estabiliza20 ção de proteína, por exemplo, um açúcar, um álcool ou um sulfato de amônio. O tampão de oxidação pode ulteriormente compreender um agente caotrópico em concentração baixa, para desestabilizar interações intramoleculares incorretas e assim promover dobramento adequado. Agentes caotrópicos adequados incluem mas não são limitados a um detergente, um 25 poliol, uma L-arginina, um guanidina-HCI e um polietileno glicol (PEG). É
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importante usar uma concentração bastante baixa do agente caotrópico para evitar desnaturação da proteína. A proteína redobrada pode ser concentrada por pelo menos cerca de 10 vezes, mais de preferência pela quantidade que ela foi diluída no tampão de oxidação.
Processos de fermentação bacteriana podem também resultar em uma preparação de proteína recombinante que contém níveis inaceitáveis de endotoxinas. Portanto, a invenção contempla a remoção de tais endotoxinas, por exemplo, por uso de anticorpos de endotoxinas específicas
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ou outras moléculas de ligação de endotoxina. A presença de endotoxinas podem ser determinada por técnicas padrão, tais como por emprego de Reagentes de E-TOXATE (Sigma, St. Louis, Missouri), ou com bioensaios.
Além do exemplo específico, os presentes inventores contem5 piam o uso de sistemas de expressão baculovírus, de mamíferos e de levedura para expressar a proteína de OB. Por exemplo, em sistemas de expressão de baculovírus, ambos os vetores de transferência de não-fusão, tais como mas não limitados a pVL941 (sítio de clonagem de BamH1; Summers), pVL1393 (sítio de clonagem de BamH1, Smal, Xbal, EcoR1, Notl,
Xmalll, Bglll, e Pstl; Invitrogen), pVL1392 (sito de clonagem de Bglll, Pstl,
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notll, Xmalll, EcoRI, Xbal, Smal, e BamH1; Summers e Invitrogen), e pBlueBaclll (sítio de clonagem de BamH1, Bglll, Pstl, Ncol e Hindlll, e com possível separação de recombinante azul/branco; Invitrogen), e vetores de transferência de fusão, tal como mas não limitado a pAc700 (sítio de clona15 gem de BamH1 e Kpnl, em que o sítio de reconhecimento de BamH1 se inicia com o códon de iniciação; Summers), pAc701 e pAc702 (mesmo que pAc700, com quadros de leitura diferentes), pAc360 (sítio de clonagem de
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BamH1 de 36 pares de bases a jusante de um códon de iniciação de polihedrina; Invitrogen (195)), e pBlueBacHisA, B, C (três quadros de leitura diferentes, com sítio de clonagem de BamHI, Bglll, Pstl, Ncol, e Hindlll, um peptídeo de N terminal para purificação de ProBond, e separação de recombinante de azul/branco de placas; Invitrogen (220)).
Vetores de expressão de mamíferos para o uso na invenção incluem vetores com promotores induzíveis, tal como promotor de redutase dihidrofolato (DHFR), por exemplo, qualquer vetor de expressão com um
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vetor de expressão de DHFR, ou um vetor de co-ampliação de DHFR/metotrexato, tal como pED (sítio de clonagem Pstl, Sall, Sbal, Smal, e EcoRI, com o vetor expressando tanto o gene clonado quanto o DHFR;
ver Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology, 16.12 (1991). Alterna30 tivamente, um vetor de co-ampliação de síntese glutamina/metionina sulfoximina, tal como pEE14 (sítio de clonagem de Hindlll, Xbal, Smal, Sbal,
EcoRI, and Bcll, em que o vetor expressa síntase de glutamina e o gene clonado; Celltech). Em uma outra modalidade, um vetor que dirige expres-
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são epissomal sob controle de Epsteín Barr Vírus (EBV) pode ser usado, tal como pREP4 (sítio de clonagem de BamH1, Sfil, Xhol, Notl, Nhel, Hindlll, Nhel, Pvull, e Kpnl, promotor de RSV-LTR constitutivo, marcador selecionável de higromicina; Invitrogen), pCEP4 (sítio de clonagem de BamH1, Sfil, 5 Xhol, Notl, Nhel, Hindlll, Nhel, Pvull, e Kpnl, gene precoce imediato de hCMV constitutivo, marcador selecionável de higromicina Invitrogen), pMEP4 (sítio de clonagem de Kpnl, Pvul, Nhel, Hindlll, Notl, Xhol, Sfil, BamH1, promotor de gene de metalotioneina lia induzível, marcador de selecionável higromicina; Invitrogen), pREP8 (sítio de clonagem de BamH1, 10 Xhol, Notl, Hindlll, Nhel e Kpnl, promotor de RSV-LTR, marcador selecioná-
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vel de histidinol; Invitrogen), pREP9 (sítio de clonagem de Kpnl, Nhel, Hindlll, Notl, Xhol, Sfil e BamHI, promotor de RSV-LTR, marcador selecionável de G418; Invitrogen), e pEBVHis (promotor de RSV-LTR, marcador selecionável de higromicina, peptídeo de N terminal purificável via resina ProBond e clivado por enteroquinase; Invitrogen). Vetores de expressão de mamíferos selecionáveis para o uso na invenção incluem pRc/CMV (sítio de clona-
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gem de Hindlll, BstXI, Notl, Sbal e Apal, seleção de G418; Invitrogen), pRc/RSV (sítio de clonagem de Hindlll, Spel, BstXI, Notl, Xbal, seleção de G418; Invitrogen), e outros. Vetores de expressão de mamíferos de vírus de vacínia (ver Kaufman, 1991, supra) para o uso de acordo com a invenção incluem mas não são limitados a pSC11 (sítio de clonagem de Smal, seleção de TK- e β-gal), pMJ601 (sítio de clonagem de Sall, Smal, Afll, NarI, BspMII, BamHI, Apal, Nhel, Sacll, Kpnl e Hindlll; seleção de TK- e β-gal), e pTKgFIS (sítio de clonagem de EcoRI, Pstl, Sall, Accl, Hindll, Sbal, BamHI, e Hpa, seleção de TK ou XPRT).
Sistemas de expressão de levedura podem ser usados de acordo com a invenção para expressar polipeptídeo de OB. Por exemplo, o vetor de pYES2 de não-fusão (sítio de clonagem de Xbal, Sphl, Shol, Notl, GstXI,
EcoRI, BstXI, BamHI, Saci, Kpnl e Hindlll; Invitrogen) ou o pYESHisA, B, C de fusão (Xbal, Sphl, Shol, Notl, BstXI, EcoRI, BamHI, Saci, Kpnl, e Hindlll, peptídeo de N terminal purificado com resina de ProBond e clivado com enteroquinase; Invitrogen), para mencionar apenas dois, podem ser empregados de acordo com a invenção.
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É ulteriormente pretendido que análogos de peptídeo modulador de peso de corpo pode ser preparado a partir de seqüências de nucleotídeos derivados dentro do escopo da presente invenção.
Além da expressão recombinante de polipeptídeo de OB, a pre5 sente invenção prevê e totalmente possibilita a preparação de polipeptídeo de OB, seus fragmentos, usando-se as técnicas altamente desenvolvidas e bem conhecidas de síntese de peptídeo de fase sólida. A invenção contem-
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pla usando-se tanto o popular Boc quanto o Fmoc, bem como outras estratégias de grupo de proteção, para a preparação de seus fragmentos ou polipeptídeo de OB. Várias técnicas para redobramento e oxidação das cadeias laterais de cisteína para formar uma ligação de dissulfeto são bem conhecidas na técnica.
Anticorpos ao Polipeptídeo de OB
De acordo com a invenção, polipeptídeo de OB produzido re15 combinamente ou por síntese química, e fragmentos ou outros derivados ou seus análogos, incluindo proteínas de fusão, podem ser usadas como um imunógeno para gerar anticorpos que reconhecem o polipeptídeo de OB.
Tais anticorpos incluem mas não são limitados a fragmentos policlonais, monoclonais, quiméricos, de cadeia única, Far, e uma biblioteca de expres20 são de Fab.
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Uma molécula é antigênica quando é capaz de específicamente interagir com uma molécula de reconhecimento de antígeno do sistema imune, tal como uma imunoglobulina (anticorpo) ou receptor de antígeno de célula T. Um polipeptídeo antigênico contém pelo menos cerca de 5 e de preferência pelo menos cerca de 10 aminoácidos. Uma porção antigênica de uma molécula pode ser aquela porção que é ímunodominante para o reconhecimento de receptor de célula T ou de anticorpo ou ela pode ser uma porção usada para gerar um anticorpo para a molécula por conjugação da porção antigênica a uma molécula de veículo para imunização. Uma 30 molécula que é antigênica não necessita ser por ela própria imunogênica, isto é, capaz de eliciar uma resposta imune sem um veículo.
Um anticorpo é qualquer imunoglobina, incluindo anticorpos e seus fragmentos, que liga um epítopo específico. O termo inclui anticorpos
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policonais, monoclonais e quiméricos, o último mencionado descrito em outros detalhes nas patentes U.S. nos. 4.816.397 e 4.816.567, bem como porções de antígeno de anticorpos, incluindo Fab, F(ab‘)2 e F(v) (incluindo anticorpos de cadeia única). Correspondentemente, a frase molécula de anti5 corpo em suas várias formas gramaticais como usada aqui contempla tanto uma molécula de imunoglubulina intacta quanto uma porção imunologicamente ativa de uma molécula de imunoglubulina contendo o sítio de combinação de anticorpo. Um sítio de combinação de anticorpo é aquela porção estrutural de uma molécula de anticorpo constituída de cadeia leve e pesa10 da variável e regiões hipervariáveis que específicamente liga o antígeno.
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Exemplarmente moléculas de anticorpo são moléculas de imunoglubulina intactas, substancialmente moléculas de imunoglubulina intactas e aquelas porções de uma molécula de imunoglobulina que contém o paratope, incluindo aquelas porções conhecidas na técnica como Fab, Fab1,
F(ab')2 e F(v), porções essas que são preferidas para o uso nos métodos terapêuticos descritos aqui.
Porções de Fab e F(ab')2 de molécula de anticorpos são preparadas pela reação proteolítica de papaína e pepsina, respectivamente, sobre moléculas de anticorpo substancialmente intactas por métodos que são
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bem conhecidos. Ver, por exemplo, a patente U.S. n9 4.342.566 por Theofilopolous e outros. Porções de molécula de anticorpo Fab' são bem conhecidos na técnica e são produzidos de porções de F(ab')2 seguidas por redução das ligações de dissulfeto ligando as duas porções de cadeia pesadas como com mercaptoetanol, e seguidas por alquilação do mercaptano de proteína resultante com um reagente tal como iodoacetamida. Um anticorpo contendo moléculas de anticorpo intactas é preferido aquí.
A frase anticorpo monoclonal em suas várias formas gramaticais refere-se a um anticorpo tendo apenas uma espécie de sítio de combinação de anticorpo capaz de imunorreagir com um antígeno particular. Um 30 anticorpo monoclonal assim tipicamente exibe uma afinidade de ligação única para qualquer antígeno com que ele imunorreage. Um anticorpo monoclonal pode conter uma molécula de anticorpo tendo uma pluralidade de sítios de combinação de anticorpo, cada imunoespecífico para um antígeno
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diferente; por exemplo, um anticorpo monoclonal bisespecífico (quimérico).
O termo auxiliar refere-se a um composto ou mistura que aumenta a resposta imune para um antígeno. Um auxiliar pode servir como um depósito de tecido que íentamente libera o antígeno e também como um 5 ativador de sistema linfóide que não específicamente aumenta a resposta imune [Hood e outros, em Immunology, p. 384, Second Ed., Benjamin/Cummings, Menlo Park, Califórnia (1984)]. Frequentemente, um desafio primário com um antígeno sozinho, na ausência de um auxiliar, fracassará para eliciar uma resposta imune celular ou humoral. Auxiliares incluem, mas 10 não são limitados a, auxiliar de Freund completo, auxiliar de Freund incom-
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pleto, saponina, géis minerais tal como hidróxido de alumínio, substâncias tensoativas tais como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões de óleo ou de hidrocarbonetos, hemocíaninas de lapa keyhole, dinitrofenol e auxiliares potencialmente úteis tal como BCG (bacille Calme15 tte-Guerin) e Corynebacterium parvum. De preferência, o auxiliar é farmaceuticamente aceitável.
Vários procedimentos conhecidos na técnica podem ser usados para a produção de anticorpos policlonais para polipeptídeo de OB, ou seu derivado análogo ou fragmento. Para a produção de anticorpo, vários ani-
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mais de hospedeiro podem ser imunizados por injeção com o polipeptídeo de OB, ou um seu derivado (por exemplo, fragmento ou proteína de fusão), incluindo mas não limitados a coelhos, murinos, ratos, carneiros, cabras, etc. Em uma modalidade, o seu fragmento ou polipeptídeo de OB podem ser conjugados a um veículo imunogênico, por exemplo, albumina de soro bovi no (BSA) ou hemocianina de lapa de keyhole (KLH). Vários auxiliares podem ser usados para aumentar a resposta imunológica, dependendo da espécie de hospedeiro, incluindo mas não limitado a geís minerais, de Freund (completo e incompleto) tal como hidróxido de alumínio, substâncias tensoativas tais como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emul sões de óleo, hemocíaninas de lapa de keyhole, dinitrofenol e auxiliares seres humanos potencialmente úteis tais como BCG (bacille Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum.
Para a preparação de anticorpos monoclonais empurrados em
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direção ao polipeptídeo de OB, ou seu derivado, fragmento, análogo, qualquer técnica que provê para a produção de moléculas de anticorpo por linhas de células contínuas podem ser usadas. Estas incluem mas não são limitadas à técnica de hibridoma originalmente desenvolvida por Kohler e 5 outros, Nature, 265:495 - 497 (1975), bem como a técnica de trioma, a técnica de hibridoma de B-célula [Kozbor e outros, Immunology Today, 4:72 (1983)], e a técnica de EBV-hibridoma para produzir anticorpos monoclonais seres humanos [Cole e outros, em Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, págs. 77 - 96, Alan R. Liss, Inc., (1985)]. Linhas de células de produ10 ção de anticorpos, imortais podem ser criados por técnicas outras que não·
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fusão, tais como transformação direta de linfócitos de B com DNA oncogênico, ou transfecção com vírus Epstein-Barr. Ver, por exemplo, M. Schreier e outros, Hybridoma Techniques (1980); Hammerling e outros, Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas (1981); Kennett e outros, Monoclonal
Antibodies11 (1980); ver também as patentes U.S. nos. 4.341.761; 4.399.121;
4.427.783; 4.444.887; 4.451.570; 4.466.917; 4.472.500; 4.491.632; e
4.493.890.
Em uma modalidade adicional da invenção, anticorpos monoclonais podem ser produzidos em animais livres de germe utilizando tecno-
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logia recente (PCT/US90/02545). De acordo com a invenção, anticorpos seres humanos podem ser usados e podem ser obtidos por uso de hibridomas seres humanos [Cote e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:2026 2030 (1983)] ou por transformação de células B com vírus de EBV in vitro (Cole e outros, 1985, supra). De fato, de acordo com a invenção, técnicas desenvolvidas para a produção de anticorpos quiméricos [Morrison e ou tros, J. Bacteriol. 159 - 870 (1984); Neuberger e outros, Nature, 312:604 608 (1984); Takeda e outros, Nature, 314:452 - 454 (1985)] por união dos genes a partir de uma molécula de anticorpo de murino específica por um polipeptídeo de OB juntamente com genes a partir de uma molécula de anti30 corpo ser humano de atividade biológica apropriada pode ser usada; tais anticorpos estão dentro do escopo da invenção. Tais anticorpos quiméricos seres humanos ou humanizados são preferidos para o uso em terapia de doenças ou distúrbios humanos (descritas infra), uma vez que os anticorpos
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seres humanos ou humanizados são muito menos prováveis do que anticorpos xenogênicos para induzir uma resposta imune, em particular uma própria resposta alérgica. De acordo com a invenção, técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia única (patente U.S. n2 4.946.778) podem 5 ser adaptados para produzir anticorpos de cadeia única de polipeptídeo de
OB específicos. Uma modalidade adicional da invenção utiliza as técnicas descritas para a contrução de bibliotecas de expressão de Fab [Huse e outros, Science, 246:1275 - 1281 (1989)] para permitir identificação fácil e rápida de fragmentos de Fab monoclonais com a especificidade desejada 10 para um polipeptídeo de OB, ou seus derivados ou análogos.
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Fragmentos de anticorpos que contêm o idiotipo da molécula de anticorpo pode ser gerada por técnicas conhecidas. Por exemplo, tais fragmentos incluem mas não são limitados à: fragmento F(ab')2 que pode ser produzido por digestão de pepsina da molécula de anticorpo; aos fragmen15 tos de Fab1 que podem ser gerados por redução das pontes de dissulfeto do fragmento de F(ab')2, e aos fragmentos de Fab que podem ser gerados por tratamento da molécula de anticorpo com papaína e um agente de redução.
Na produção de anticorpos, a separação para o anticorpo desejado pode ser realizada por técnicas conhecidas na técnica, por exemplo, 20 radioimunoensaio, ELISA (ensaio de imunossorvente ligado com enzima),
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imunoensaios de sanduíches, ensaios de imunorradiométricos, reações de precipitina de difusão por gel, ensaios de imunodifusão, imunoensaios in situ (usando-se marcas de amarelo-ouro coloidal, de enzima ou de radioisótopo, por exemplo), Western blots, reações de precipitação, ensaios de aglutinação (por exemplo, ensaios de aglutinação, ensaios de hemaglutinação), ensaios de fixação de complemento, ensaios de imunofluorescência, ensaios de proteína A, ensaios de iminoeletroforese, etc. Em uma modalidade, ligação de anticorpo é detectada por detecção de uma marca no anticorpo primário. Em uma outra modalidade, o anticorpo primário é detectado 30 por detecção de ligação de um anticorpo secundário ou reagente ao anticorpo primário. Em uma outra modalidade, o anticorpo secundário é marcado. Muitos meios são conhecidos na técnica por detecção de ligação de um imunoensaio e estão dentro do escopo da presente invenção. Por exemplo,
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selecionar anticorpos que reconhecem um epítopo específico de um polipeptídeo de OB, um pode-se analisar hibridomas gerados para um produto que se liga a um fragmento de polipeptídeo de OB contendo tal epítopo. Para seleção de um anticorpo específico a um polipeptídeo de OB a partir 5 de uma espécie particular de animal, pode-se selecionar na base de ligação positiva com polipeptídeo de OB expresso por ou isolado de células daquela espécie de animal.
Os anticorpos expostos acima podem ser usados em métodos conhecidos na técnica relativo à localização e à atividade do polipeptídeo 10 de OB, por exemplo, para Western blotting, imagem de polipeptídeo de OB in situ, seus níveis de medição em amostras fisiológicas apropriadas, etc.
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Em uma modalidade específica, anticorpos que agonizam ou antagonizam a atividade de polipeptídeo de OB podem ser gerados. Tais anticorpos podem ser testados usando-se os ensaios descritos infra para identificação de ligantes.
Em uma modalidade específica, anticorpos são desenvolvidos para imunizar coelhos com peptídeos sintéticos previstos pela seqüência de proteína ou com proteínas recombinantes produzidas usando-se vetores de expressão bacteriana. A escolha de peptídeos sintéticos é produzido depois 20 de análise cuidadosa da estrutura de proteína prevista, como descrita acima. Em particular, seqüências de peptídeos entre sítios de divagem putativos são escolhidos. Peptídeos sintéticos são conjugados a um veículo tal como hemocianina de KLH ou BSA usando-se carbodiimida e usado em auxiliar e Freunds para imunizar coelhos. A fim de preparar proteína recombi25 nante, o vetor de pGEX pode ser usado para expressar o polipeptídeo (Smith e outros, 1988, supra). Alternativamente, pode-se usar apenas domínios hidrofílicos para gerar a proteína de fusão. A proteína expressa será preparada em quantidade e usada para imunizar coelhos em auxiliares de Freunds.
Em uma outra modalidade específica, polipeptídeo de OB recombinante é usado para imunizar galinhas, e os anticorpos de anti-OB de galinha são recuperados a partir de gema de ovo, por exemplo, por purificação de afinidade sobre uma coluna de OB. De preferência, galinhas usadas
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em imunização são mantidas sob condições livres de patógenos específicos (SPF).
Em uma outra modalidade, anticorpos contra a leptina são gerados em murinos de OB/OB, que carecem de circulação de proteína de OB, e 5 assim são esperados serem capazes de gerar uma resposta de antipolipeptídeo de OB uma vez que eles não serão tolerados para o polipeptídeo, e murinos de tipo selvagem. Células de baço de ambos os grupos de murinos podem ser fundidas com células de mieloma para preparar hibridomas para anticorpos monoclonais.
Em uma outra modalidade, polipeptídeo de OB recombinante é
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usado para imunizar coelhos, e os anticorpos policlonais são imunopurificados antes de outro uso. Os anticorpos purificados são particularmente úteis para ensaios semiquantitativos, particularmente para a detecção da presença de circulação de polipeptídeo de OB em soro ou em plasma.
Painéis de anticorpos monoclonais produzidos contra os peptídeos moduladores podem ser separados para várias propriedades; isto é, isótipo, epítopo, afinidade etc. De particular interesse são anticorpos monoclonais que neutralizam a atividade dos peptídeos moduladores. Tais monoclonais podem ser prontamente identificados em ensaios de atividades para
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os moduladores de peso. Anticorpos de alta afinidade são também úteis quando purificação de imunoafinidade de modulador recombinante ou natural é possível.
De preferência, o anticorpo antimodulador usado nos métodos diagnósticos e terapêuticos desta invenção é um anticorpo policlonal purifi cado por afinidade. Mais de preferência, o anticorpo é um anticorpo monoclonal (mAB). Além disso, é preferível que as moléculas de anticorpo antimodulador usados aqui estejam na forma de porções de Fab, Fab', F(ab')2 ou F(v) de moléculas de anticorpo inteiras.
Implicações Diagnosticas
A presente invenção também refere-se a uma variedade de aplicações diagnosticas, incluindo métodos para a detecção da presença de condições e/ou estímulo que têm impacto sobre anormalidades em adiposidade ou peso de corpo, por referência a sua capacidade para eliciar as ati-
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vidades que são medidas pelos presentes moduladores de peso. Como mencionado anteriormente, os peptídeos moduladores de peso podem ser usados para produzir anticorpos para eles mesmos por uma variedade de técnicas conhecidas, e tais anticorpos poderíam então ser isolados e utiliza5 dos como em testes para a presença de atividade transcripcional particular em células alvos suspeitas. Alternativamente, os ácidos nucléicos da invenção podem ser empregados em diagnósticos.
Diagnósticos com base em Anticorpo
Como sugerido anteriormente, um método diagnóstico útil na presente invenção compreende o exame de uma amostra ou um meio celu-
Figure BRPI9508596B1_D0139
lar por meio de um ensaio incluindo uma quantidade eficaz de um antagonista para uma proteína moduladora, e mais de preferência um mAb. Além disso, é preferível que as moléculas de anticorpo de antimodulador usadas aqui estejam na forma de porções de Fab, Fab1, F(ab')2 ou F(v) ou molécu15 Ias de anticorpo inteiras. Como anteriormente discutido, pacientes capazes de se beneficiarem deste método incluem aqueles que sofrem de câncer,
AIDS, obesidade ou outras condições onde peso de corpo anormal é uma característica ou fator. Métodos para o isolamento do modulador e a indução de anticorpos antimoduladores para a determinação e a otimização da 20 capacidade de anticorpos antimoduladores auxiliar no exame das células
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alvos são bem conhecidos na técnica.
Também, anticorpos incluindo tanto anticorpos monoclonais quanto policlonais, e drogas que modulam a produção ou a atividade dos moduladores de controle de peso e outros fatores de reconhecimento e/ou suas sub-unidades podem possuir certas aplicações de diagnóstico e po-
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dem, por exemplo, ser utilizados para a finalidade de detectar e/ou medir condições onde anormalidades em peso de corpo são ou podem ser prováveis de desenvolver. Por exemplo, os peptídeos moduladores ou seus fragmentos ativos podem ser usados para produzir tanto anticorpos monoclo30 nais quanto policlonais por eles próprios em uma variedade de meios celulares, por técnicas conhecidas, tal como a técnica de hibridoma utilizando, por exemplo, células de mieloma e linfócitos de baço de murino. Estas técnicas são descritas em detalhes abaixo. Do mesmo modo, pequenas moléculas )233 que imitam ou antagonizam a(s) atividade(s) dos fatores de reconhecimento de receptor da invenção podem ser descobertas ou sintetizadas, e podem ser usadas em protocolos de diagnósticos e/ou terapêuticos.
A presença de moduladores de peso em células pode ser de5 terminada pelos procedimentos imunológicos usuais aplicáveis para tais determinações. Numerosos procedimentos úteis são conhecidos. Três tais procedimentos que são especialmente úteis utilizam ou o fator de reconhecimento de receptor rotulado com um rótulo detectável, anticorpo de Ab1 rotulado com um rótulo detectável, ou anticorpo de Ab2 marcado com uma marca detectável. Os procedimentos podem ser sumarizados pelas seguin-
Figure BRPI9508596B1_D0142
tes equações em que o asterisco indica que a partícula é rotulada, e filamentos de WM para o modulador de peso:
A. WM* + Abi = WM*Abi
B. WM + Ab*) = WMAbi*
C. WM + Abi + Ab2* = AbiWMAb2*
Os procedimentos e sua aplicação são todos familiares para aqueles versados na técnica e correspondentemente podem ser utilizados dentro do escopo da presente invenção. O procedimento competitivo, Procedimento A, é descrito nas patentes U.S. nos. 3.654.090 e 3.850.752. Pro cedimento B é representativo de técnicas de ensaio competitivos bem co-
Figure BRPI9508596B1_D0143
nhecidas. Procedimento C, o procedimento de sanduíche, é descrito nas patentes U.S. nos. RE31.006 e 4.016.043. Ainda outros procedimentos são conhecidos tal como o procedimento de anticorpo duplo ou DASP.
Em cada caso, os moduladores de peso a partir de complexos com um ou mais anticorpo(s) ou pares de ligação e um membro do comple-
Figure BRPI9508596B1_D0144
xo é rotulado com um rótulo detectável. O fato que um complexo se formou e, se desejado, a sua quantidade, pode ser determinada por métodos conhecidos aplicáveis à detecção de marcas.
Será visto a partir do exposto acima, que uma propriedade ca30 racterística de Ab2 é que ele reagirá com Abi. Isto se deve ao fato de que
Ab1, criado em uma espécie de mamífero, foi usado em uma outra espécie com um antígeno para criar o anticorpo, Ab2. Por exemplo, Ab2 pode ser criado em cabras usando-se anticorpos de coelho como antígenos. Ab2
Figure BRPI9508596B1_D0145
portanto seria anticorpo de anti-coelho criado em cabras. Para finalidades desta descrição e reivindicações, Ab1 será mencionado como um anticorpo modulador de antipeso ou primário, e Ab2 será mencionado como um anticorpo de anti-Ab1 ou secundário.
As marcas mais comumente empregadas para estes estudos são elementos radioativos, enzimas, produtos químicos que fluorescem quando expostos a luz ultravioleta, e outros.
Numerosos materiais fluorescentes são conhecidos e podem ser utilizados como rótulos. Estes incluem, por exemplo, fluoresceína, rodamína
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e auramina. Um material de detecção particular é anticorpo de anticoelho preparado em cabras e conjugados com fluoresceína através de um isotiocianato.
Os moduladores de peso ou seus pares de ligação podem também ser marcados com um elemento radioativo ou com uma enzima. A mar15 ca radioativa pode ser detectada por qualquer dos procedimentos de contagem atualmente disponíveis. O isótipo preferido pode ser selecionado de 3H, 14C, 32P, 35S, 36CI, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125l, 13T, e 186Re.
Rótulos de enzima são desse modo úteis, e podem ser detectados por quaisquer das presentemente técnicas colorimétricas, espectrofo-
Figure BRPI9508596B1_D0148
tométricas, fluorospectrofotométricas, amperométricas, ou gasométricas. A enzima é conjugada à partícula selecionada por reação com moléculas de ponte tais como carbodiimidas, diisocianatos, glutaraldeído e semelhantes.
Muitas enzimas que podem ser usadas nestes procedimentos são conhecidas e podem ser utilizadas. As preferidas são peroxidase, β-glucuronidase, β-D-glucosidase, β-D-galactosidase, urease, glicose oxidase mais peroxida-
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se e fosfatase alcalina. Nas patentes U.S. nos. 3.654.090; 3.850.752; e 4.016.043 são mencionados por meio de exemplo para sua revelação de material e método de rotulação substituta.
Em uma outra modalidade desta invenção, kits de teste para o uso por um especialista médico podem ser preparados para se determinar a presença ou a ausência de atividade transcripcional predeterminada ou capacidade de atividade transcripcional predeterminada em células alvos suspensas. De acordo com as técnicas de testagem discutidas acima, uma classe de tais kits conterá pelo menos um modulador de peso rotulado ou seu par de ligação, por exemplo, um anticorpo específico para o mesmo, e direções, naturalmente, dependendo do método selecionado, por exemplo, competitivo, sanduíche, DASP e semelhantes. Os kits podem também 5 conter reagentes periféricos tais como tampões, estabilizadores, etc.
Correspondentemente, o kit de teste pode ser preparado para a
Figure BRPI9508596B1_D0150
demonstração da presença ou capacidade de células para atividade transcripcional predeterminada, que compreende:
(a) uma quantidade predeterminada de pelo menos um componente imunoquimicamente reativo obtido pela fixação direta ou indireta do presente modulador de peso ou um par de ligação específico para o mesmo, para um rótulo detectável;
(b) outros reagentes; e (c) instruções para o uso do dito kit.
Mais específicamente, o kit de teste de diagnóstico pode compreender:
(a) • (b) (c) uma quantidade conhecida do modulador de peso como .descrita acima (ou um par de ligação) em geral ligado a uma fase sólida para formar um imunossorvente, ou na alternativa, ligada a uma etiqueta adequada, ou de mais de um de tais produtos finais, etc. (ou seus pares de ligação) um de cada;
se necessário, outros reagentes; e instruções para o uso do dito kit de teste.
Em uma outra variação, o kit de teste pode ser preparado e usado para as finalidades afirmadas acima, que opera de acordo com um
Figure BRPI9508596B1_D0151
protocolo predeterminado (por exemplo, competitivo, sanduíche, anticorpo duplo, etc.) e compreende:
(a) um componente rotulado que foi obtido por acoplamento do modulador de peso para um rótulo detectável;
(b) um ou mais reagentes imunoquímicos adicionais dos quais pelo menos um reagente é um ligante ou um ligante imobilizado, ligante esse que é selecionado do grupo que consiste em:
(i) um ligante capaz de ligar o componente rotulado (a);
)Α3£ (ii) um ligante capaz de se ligar com um par de ligação do componente rotulado (a);
(iii) um ligante capaz de se ligar com pelo menos um do(s) componente(s) a se determinar; e (iv) um ligante capaz de se ligar com pelo menos um dos pares de ligação ou pelo menos um do(s) componente(s) a serem determinados; e (c) instruções para o desempenho de um protocolo para a detecção e/ou determinação de um ou mais componentes de uma reação
Figure BRPI9508596B1_D0152
imunoquímica entre o modulador de peso e um par de ligação específico para o mesmo.
Diagnóstico Com Base de Ácido Nucléico
Como demonstrado nos exemplos, infra, ácidos nucléicos da invenção podem ser usados para detectar defeitos associados com defeitos no polipeptídeo de OB que resultam em fenótipos obesos. Por exemplo, sondas de ácido nucléico (por exemplo, em análise de Northern ou análise de RT-PCR) podem ser usadas para se determinar se um fenótipo é associado com a falta de expressão de mRNA de OB, ou expressão de mRNA de
OB não-funcional, por exemplo, como murinos de db/db (onde a deficiência resulta da falta de um receptor de OB) ou onde uma mutação fornece um
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mRNA não-transcrito. Além do mais, as técnicas de diagnósticos à base de ácido nucléico da invenção podem ser usadas em combinação com técnicas à base de anticorpos para ulteriormente desenvolver uma compreensão molecular de fenótipos anoréxicos ou obesos.
Os clones de cDNA ser humano que foram recentemente isolados, foram seqüenciados como apresentados aqui. Isto facilita a determinação da seqüência completa do gene ser humano (ver figura 20A até C; SEQ ID N9:22). Seqüências de DNA a partir dos ítrons do gene de OB foram obtidas (figura 20), e estas foram usadas para preparar iniciadores de PCR para ampliar por PCR a seqüência de codificação do gene de OB de DNA genômico ser humano de modo a identificar mutações ou variantes alélicas do gene de OB, todos de acordo com os protocolos descritos em detahes anteriores aqui. Iniciadores de PCR para aplificar OB genômico ser humano
Figure BRPI9508596B1_D0155
são descritos em um exemplo específico, infra.
A hipótese atual é que mutações heterozigotas no gene de OB serão associadas com obesidade suave/moderada enquanto mutações homozigotas seriam associadas com testes de diagnósticos com base na se5 qüência de DNA para obesidade. Se isto é verdadeiro, permitiría a determinação de pessoas em risco para o desenvolvimento e obesidade e tornaria possível a aplicação de tratamento de droga e/ou mudanças no estilo de vida antes que um peso de corpo aumentado seja totalmente desenvolvido.
Alternativamente, a presença de microssatélites que segregam com formas mutantes de OB ser humano podem ser usados para diagnose.
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Vários iniciadores de PCR, incluindo aqueles à base da seqüência de nucleotídeos providos na figura 20A até C, possam ser usados neste aspecto.
O gene de OB pode também ser útil diagnosticamente para medições de sua proteína e RNA codificado em distúrbios nutricionais particu15 lares, se RNA de OB e/ou sua proteína codificada está não-regulado ou regulado por baixo. Assim, se uma pessoa obesa têm níveis aumentados de
OB, parecería que o problema é a ajusante de OB, enquanto se OB é reduzido, parecería que níveis inapropriadamente baixos de OB poderiam ser a causa de obesidade (se ou não o defeito está no gene de OB). De modo inverso, se um paciente de câncer ou de AIDS cuja perda de peso tinha níveis elevados de OB, pode ser concluído que inapropriadamente alta expressão de OB é responsável para a perda de peso.
O cDNA ser humano clonado será de uso para a medição dos níveis de RNA de OB ser humano. Além disso, proteína humana recombi nante será preparada e usada para desenvolver imunoensaios para possibilitar a medição da gordura e talvez níveis de plasma da proteína de OB.
Implicações Terapêuticas
Os polipeptídeos, os ácidos nucléicos e os anticorpos da invenção têm potencial terapêutico significativo. De preferência, uma quantidade terapeuticamente eficaz dê tal agente é administrado em um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
A frase farmaceuticamente aceitável refere-se a composições e entidades moleculares que são fisiologicamente toleráveis e não típica
Figure BRPI9508596B1_D0159
mente produzem uma reação similarmente adversa ou alérgica, tais como distúrbio gástrico, vertigem, e semelhantes, quando administradas a um ser humano. De preferência, como usado aqui, o termo farmaceuticamente aceitável significa aprovado por uma agência reguladora do govêrno fede5 ral ou estadual ou listada na U.S. Pharmacopeia ou outras farmacópeias em geral reconhecidas para o uso em animais, e mais particularmente em seres humanos. O termo veículo refere-se a um diluente, auxiliar, excipiente ou veículo com o qual o composto é administrado. Tais veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos, incluindo aqueles de
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origem de petróleo, animal, vegetal ou sintético, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim, e semelhantes. Água ou soluções de salmoura em solução e dextrose aquosa e soluções de glicerol são de preferência empregadas como veículos, particularmente para soluções injetáveis. Veículos farmaceuticamente adequados são descritos em
Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed., Mack Publishing
Co., Easton, PA, (1990).
A frase quantidade terapeuticamente eficaz é usada aqui para significar uma quantidade suficiente para reduzir por pelo menos cerca de
15%, de preferência por pelo menos 50%, mais de preferência por pelo me20 nos 90%, e mais de preferência prevenir, um déficit clinicamente significati-
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vo na atividade, função e resposta do hospedeiro. Alternativamente, uma quantidade terapeuticamente eficaz é suficiente para causar melhora em uma condição clinicamente significativa no hospedeiro.
Administração de polipeptídeos de OB recombinante resulta em perda de peso, em particular, um diminuição em tecido de gordura. O poli peptídeo de OB pode ser preparado usando-se vetores de expressão bacterianos e/ou de mamíferos padrão, sinteticamente, ou purificados a partir do plasma ou do soro, todos como indicados em detalhes anteriormente aqui.
Alternativamente, expressão aumentada de polipeptídeo de OB natural pode ser induzida por técnicas de recombinação homóloga, como descritas supra.
Redução de atividade de polipeptídeo de OB (por desenvolvimento de antagonistas, inibidores, uso de anticorpos de neutralização, ou moléculas sem sentido) resultaria em ganho de peso como deve ser desejá
Figure BRPI9508596B1_D0163
vel para o tratamento da perda de peso associada com câncer, AIDS ou anorexia nervosa. Modulação de atividade de OB pode ser útil para a redução de peso de corpo (por aumento de sua atividade) ou aumentando peso de corpo (por diminuição de sua atividade).
Tratamento Terapêutico com Base em Polipeptídeo
Na análise mais simples, o gene de OB determina o peso de corpo em mamíferos, em particular murinos e homens. O produto de gene de OB, e, correspondentemente, moléculas cognatas, parecem ser parte de uma trajetória de sinalização pela qual o tecido adiposo se comunica com o cérebro e outros órgãos. Acredita-se que o polipeptídeo de OB é por ele
Figure BRPI9508596B1_D0164
próprio uma molécula de sinalização, isto é, um hormônio.
O polipeptídeo de OB, ou seu fragmento funcionalmente ativo, ou um seu antagonista, pode ser administrado oralmente ou parenteralmente, de preferência parenteralmente. Uma vez que homeostase metabóli15 ca é um processo contínuo, administração de liberação controlada de poli peptídeo de OB é preferida. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser administrado usando-se infusão intravenosa, uma bomba osmótica implantável, um emplastro transdermal, lipossomas, ou outros modos de administração. Em uma modalidade, um bomba pode ser usada [Langer e outros, eds., Medicai
Applications of Controlled Release, CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974);
Figure BRPI9508596B1_D0165
Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng., 14:201 (1987); Buchwald e outros.
Surgery. 88:507 (1980); Saudek e outros, N. Engl. J. Med., 321:574 (1989)].
Em uma outra modalidade, materiais poliméricos podem ser usados [Langer,
1974, supra; Sefton, 1987, supra; Smolen e outros, eds., Controlled Drug
Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Wiley, New York
Figure BRPI9508596B1_D0166
(1984); Ranger e outros, J. Macromol. Sei. Rev. Macromol. Chem., 23:61 (1983); ver também Levy e outros, Science, 228:190 (1985); During e outros, Ann. Neurol, 25:351 (1989); Howard e outros, J. Neurosurg., 71:105 (1989)]. Em ainda uma outra modalidade, um sistema de liberação controla30 da pode ser colocado em proximidade do alvo terapêutico, isto é, o cérebro, assim necessitando apenas uma fração da dose sistêmica [ver, por exemplo, Goodson, em Medicai Applications of Controlled Release, vol. 2, págs. 115 - 138 (1984)]. Outros sistemas de liberação controlada são discutidos
Figure BRPI9508596B1_D0167
na revisão por Langer, Science, 249:1527-1533 (1990). Em uma outra modalidade, o composto terapêutico pode ser fornecido em uma vesícula, em particular um lipossoma (ver Langer, 1990 supra); Treat e outros, em Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Câncer, Lopez-Berestein 5 and Fidler (eds.), Liss, New York, págs. 353 - 365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., págs. 317 - 327; ver em geral ibid.)
Em um outro aspecto, células recombinantes que foram transformadas com o gene de OB e que expressam altos níveis do polipeptídeo podem ser transplantadas em um indivíduo que necessita de polipeptídeo de OB. De preferência células autólogas transformadas com OB são trans-
Figure BRPI9508596B1_D0168
plantadas para evitar rejeição; alternativamente, a tecnologia está disponível para proteger células não-autólogas que produzem fatores solúveis dentro de uma matriz de polímero que previne rejeição e reconhecimento imune.
O polipeptídeo de OB pode ser fornecido por rotas intravenosas, intraarteriais, intraperitoniais, intramusculares ou subcutâneas de administração. Alternativamente, o polipeptídeo de OB, formulado adequadamente, pode ser administrado por administração nasal ou oral. Um fornecimento constante de OB pode ser assegurado por prover um dose terapeuticamente 20 eficaz (isto é, uma dose eficaz para induzir mudanças metabólicas em um
Figure BRPI9508596B1_D0169
indivíduo) nos intervalos necessários, por exemplo, diariamente, a cada 12 horas, etc. Estes parâmetros dependerão da severidade da condição de doença a ser tratada, de outras ações, tal como modificação de dieta, que são implementadas, do peso, da idade, e do sexo do indivíduo, e de outros crité rios, que possam ser protamente determinados de acordo com a boa prática
Figure BRPI9508596B1_D0170
médica por aqueles versados na técnica.
Composições Farmacêuticas
Em ainda um outro aspecto da presente invenção, são providos composições farmacêuticas dos materiais acima. Tais composições farma30 cêutícas podem ser para a administração por injeção, ou por formas orais, pulmonares, nasais ou outras formas de administração. Em geral, compreendido pela invenção são composições farmacêuticas que compreendem quantidades eficazes de produtos derivados ou proteína da invenção junta-
Figure BRPI9508596B1_D0171
mente com diluentes, conservantes, solubilizantes, emulsificantes, auxiliares e/ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. Tais composições incluem diluentes de vários conteúdos de tampão (por exemplo, Tris-HCI, acetato, fosfato), pH e concentração iônica; aditivos tais como detergentes e agentes 5 de solubilização (por exemplo, Tween 80, Polysorbate 80), anti-oxidantes (por exemplo, ácido ascórbico, metabissulfito de sódio), conservantes (por exemplo, timerosol, álcool benzílico) e substâncias de aumento de volume (por exemplo, lactose, manitol); incorporação do material para dar preparações em partículas de compostos poliméricos tais como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc. ou para dar lipossomas. Ácido hilaurônico pode tam-
Figure BRPI9508596B1_D0172
bém ser usado. Tais composições podem influenciar a taxa, estabilidade, estado físico de liberação in vivo, e a taxa de liberação in vivo das presentes proteínas e derivados. Ver, por exemplo, Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18- ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) págs.
1435 - 1712 que são incorporados aqui por referência. As composições podem ser preparadas em forma líquida, ou pode ser em pó seco, tal como a forma liofilizada.
Fornecimento Oral
Comtemplado para o uso aqui são formas de dosagem sólidas orais, que são descritas em geral em Martin, Remington's Pharmaceutical
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Sciences, 18- ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) em Chapter 89, que é incorporado aqui por referência. Formas de dosagem sólidas incluem comprimidos, cápsulas, pílulas, comprimidos ou pastilhas, hóstias ou péletes. Também, encapsulação proteinóide ou lipossomal pode ser usada para formular as presentes composições (como, por exemplo, mi-
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croesferas proteinóides relatadas na patente U.S. n2 4.925.673). Encapsulação lipossomal pode ser usada e os lipossomas podem ser derivados com vários polímeros (por exemplo, na patente U.S. n2 5.013.556). Uma descrição possível de formas de dosagem sólidas para a terapêutica é dada por 30 Marshall, em Modern Pharmaceutics, Chapter 10, Banker and Rhodes ed.
(1979), incorporado aqui por referência. Em geral, a formulação incluirá a proteína (ou proteína quimicamente modificada), e ingredientes inertes que permitem a proteção contra o ambiente estomocal, e liberção do material
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biologicamente ativo no intestino.
Também específicamente contemplado são formas de dosagem orais das proteínas derivadas. Proteína pode ser quimicamente modificada de modo que o fornecimento oral do derivado seja eficaz. Em geral, a modi5 ficação química contemplada é a fixação de pelo menos uma porção à própria molécula de proteína (ou peptídeo), onde a dita porção permite (a) inibição de proteólise; e (b) absorção para dentro da corrente sangüínea a partir do estômago ou do intestino. Também desejado é o aumento na estabilidade global da proteína e aumento no tempo de circulação no corpo.
Exemplos de tais porções incluem: polietileno glicol, copolímeros de etileno
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glicol e propileno glicol, carboximetil celulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona e poliprolina. Abuchowski e outros, 1981, supra; Newmark e outros, J. Appl. Biochem., 4:185 - 189 (1982). Outros polímeros que poderíam ser usados são poli-1,3-dioxolano e poli-1,3,6-tioxocano.
Preferido para o uso farmacêutico, como indicado acima, são porções de polietileno glicol.
Para a proteína (ou derivado) o local de liberação pode ser o estômago, o intestino delgado (o duodeno, o jejuno ou o íleo), ou o intestino grosso. Aquele versado na técnica tem formulações disponíveis que não se dissolverão no estômago, ainda liberarão o material no duodeno ou em outra parte no intestino. De preferência, a liberação evitará os efeitos nocivos do ambiente do estômago, ou por proteção da proteína (ou derivado) ou por liberação do material biologicamente ativo além do ambiente de estômago, tal como no intestino.
Para assegurar resistência gástrica, um revestimento impermeável para pelo menos pH 5,0 é essencial. Exemplos dos ingredientes inertes comuns que são usados com revestimento entéricos são trimetilato de acetato de celulose (CAT), ftalato de hidroxipropilmetilcelulose (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, ftalato de acetato de polivinila (PVAP), Eudragit 30 L30D, Aquateric, ftalato de acetato de celulose (CAP), Eudragit L, Eudragit
S, e Shellac. Estes revestimentos podem ser usados como películas mistas.
Um revestimento ou uma mistura de revestimentos podem tam-
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bém ser usados sobre comprimidos, os quais não têm a finalidade de proteção contra o estômago. Isto pode incluir revestimentos de açúcar, ou revestimentos que podem produzir o comprimido mais fácil para engolir. Cápsulas podem consistir em uma casca dura (tal como gelatina) para o fornecimento 5 de terapêutica seca, isto é, pó; para formas líquidas, uma casca de gelatina mole pode ser usada. O material de casca de hóstias poderia ser amido grosso ou outro papel comestível. Para pílulas, pastilhas, tabeletes moldados ou comprimidos triturados, técnica de massa úmida podem ser usados.
O terapêutico pode ser incluído na formulação como múltiplas 10 partículas finas na forma de grânulos ou péletes de tamanho de partícula de cerca de 1 mm. A formulação do material para a administração de cápsula
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poderia também ser como um pó, buchas levemente comprimidas ou mesmo como comprimidos. O terapêuctico poderia ser preprado por compressão.
Agentes aromatizantes e corantes podem todos serem incluídos.
Por exemplo, a proteína (ou derivado) pode ser formulada (tal como por encapsulação de lipossoma ou de microesfera) e então ulteriormente contida dentro de um produto comestível, tal como uma bebida refrigerada contendo agentes aromatizantes e corantes.
Pode-se diluir ou aumentar o volume do terapêutico com um material inerte. Estes diluentes poderíam incluir carbohidratos, especialmente manitol, α-lactose, lactose anidra, celulose, sacarose, dextranos e amidos modificados. Certos sais inorgânicos podem também ser usados como materiais de enchimento trífosfato de cálcio, carbonato de magnésio e cloreto de sódio. Alguns diluentes comercialmente disponíveis são Fast-Flo, 25 Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress e Avicell.
Desintegrantes podem ser incluídos na formulação da terapêutica em uma forma de dosagem sólida. Materiais usadas como desintegrantes incluem mas não são limitados a amido incluindo o desintegrante comercial com base em amido, Explotab. Glicolato de amido de sódio, Amberlite, car30 boximetilcelulose de sódio, ultramilopectina, alginato de sódio, gelatina, casca de laranja, carboximetil celulose de ácido, esponja natural, e bentonita podem ser usados. Uma outra forma dos desintegrantes são resinas de troca catiônicas insolúveis. Gomas em pó podem ser usadas como desinte
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grantes e como aglutinantes e estes podem incluir gomas em pó tal como ágar, Karaya ou tragacanto. Ácido algínico e seu sal de sódio são também úteis como desintegrantes.
Aglutinantes podem ser usados para se manter o agente tera5 pêutico juntos para formar um comprimido duro e incluem materiais a partir de produtos naturais tais como acácia, tragacanto, amido e gelatina. Outros incluem metil celulose (MC), etil celulose (EC) e carboximetil celulose (CMC). Polivinil pirrolidona (PVP) e hidroxipropilmetil celulose (HPMC) poderíam ser usados em soluções alcóolicas para granular o terapêutico.
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Um agente antifriccional pode ser incluído na formulação do terapêutico para prevenir agarramento durante o processo de formulação. Lubrificantes podem ser usados como uma camada entre o terapêutico e a parede de matriz, e estes podem incluir mas não são limitados ao: ácido esteárico incluindo seu sais de magnésio e de cálcio, politetrafluoroetileno (PTFE), parafina líquida, óleos e ceras vegetais. Lubrificantes solúveis podem também ser usados tais como lauril sulfato de sódio, lauril sulfato de magnésio, polietíleno glicol de vários pesos moleculares, e Carbowax 4000 e 6000.
Deslizantes que devem aperfeiçoar as propriedades de fluxo da droga durante a formulação e auxiliar a redisposição durante a compressão
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devem ser adicionados. Os deslizantes podem incluir amido, talco, sílica pirogênica e silicoaluminato hidratado.
Para auxiliar a dissolução do terapêutico no ambiente aquoso, um tensoativo deve ser adicionado como um agente umectante. Tensoativos podem incluir detergentes aniônicos tais como lauril sulfato de sódio, sulfossuccinato de sódio de dioctila e sulfonato de sódio de dioctila. Detergentes catiônicos devem ser usados e poderíam incluir cloreto de benzalcônio ou cloreto de benzetômio, A lista de detergente não iônicos potenciais que poderíam ser incluídos na formulação com tensoativos são lauromacrogol 400, 30 estearato de polioxila 40, óleo de rícino hidrogenado de polioxietileno 10, 50 e 60, monoestearato de glicerol, polissorbato 40, 60, 65 e 80, éster de ácido graxo de sacarose, metil celulose, e carboximetil celulose. Estes tensoativos poderíam estar presentes na formulação da proteína ou do derivado ou so-
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zinho ou como uma mistura em razões diferentes.
Aditivos que potencialmente aumentam a absorção de proteína (ou derivado) são, por exemplo, os ácidos graxos, ácido oléico, ácido linoléico e ácido linolênico.
Formulação de liberação controlada pode ser desejável. A droga podería ser incorporada em uma matriz inerte que permite liberação por ou mecanismos de difusão ou de lixiviação, isto é, gomas. Matrizes de degeneração lenta podem também ser incorporadas na formulação. Uma outra forma de uma liberação controlada deste terapêutica é por um método com 10 base no sistema terapêuticos de Oros (Alza Corp.), isto é, a droga é encerrada em uma membrana semipermeável que permite a água entrar e empur-
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rar a droga para fora através de uma única abertura pequena devido a efeitos osmóticos. Alguns revestimento entéricos também têm efeito de liberação retardada.
Outros revestimentos podem ser usados para a formulação.
Estes incluem uma variedade de açúcares que poderíam ser aplicados em uma panela de revestimento. O agente terapêutico poderia também ser dado em um comprimido de película revestida; os materiais usados neste caso são divididos em 2 grupos. O primeiro são os materiais não entéricos e incluem metil celulose, etil celulose, hidroxietil celulose, metilhidróxi-etil celulose, hidroxipropil celulose, hidroxipropil-metil celulose, carbóxi-metil celulose de sódio, providona e polietileno glicóis. O segundo grupo consiste nos materiais entéricos que são comumente ésteres de ácido ftálico.
Uma mistura de materiais devem ser usados para prover o ótimo 25 revestimento de película.
Revestimento de película pode ser realizado em um revestidor de panela ou em um leito fluidizado ou por revestimento de compressão. Fornecimento Pulmonar
Também contemplado aqui é o fornecimento pulmonar da pre30 sente proteína (ou seus derivados). A proteína (ou derivado) é fornecida aos pulmões de um mamífero enquanto inalando e passagens através do revestimento epitelial do pulmão para a corrente sangüínea. Outros relatos desta incluem Adjei e outros, Pharmaceutical Research, 7(6):565-569 (1990); Adjei e outros, International Journal of Pharmaceutics, 63:135 -144 (1990) (acetato de leuprolida); Braquet e outros, Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13(suppl. 5):143 - 146 (1989) (endotelina-1); Hubbard e outros, Annals of Internai Medicine, 3(3):206 - 212 (1989) (a1 -antitripsina); Smith e outros, J. Clin. Invest., 84:1145-1146 (1989) (a1-proteinase); Oswein e outros, Aerosolization of Proteins, Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, (março de 1990) (hormônio de crescimento ser humano recombinante); Debs e outros, J. Immunol., 140:3482 - 3488 (1988) e Platz e outros, na patente U.S. n2 5.284.656 (fator de estimulação de colônia de granulócito). Contemplado para o uso na prática desta invenção são uma ampla faixa de dispositivos mecânicos destinados para fornecimento pulmonar de produtos terapêuticos, incluindo mas não limitados a nebulizadores, inaladores de dose medida, e inaladores em pó, todos dos quais são familiares por aqueles versados na técnica.
Alguns exemplos específicos de dispositivos comercialmente disponíveis para a prática desta invenção são o nebulizador Ultravent, produzido por Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; e o nebulizador Acorn II, produzido por Marquest Medicai Products, Englewood, Colorado; o inalador de dose medida Ventolin, produzido por Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina; e o inalador de pó Spinhaler, produzido por Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.
Todos os tais dispositivos de uso de formulações adequadas para a distribuição de proteína (derivado). Tipicamente, cada formulação é específica ao tipo de dispositivo empregado e pode envolver o uso de um material propelente apropriado, além dos diluentes auxiliares e/ou veículos usuais úteis na terapia. Também, o uso de lipossomas, microcápsulas ou microesferas, complexos de inclusão, ou outros tipos de veículos são contemplados. Proteína quimicamente modificada pode ser também preparada em formulações diferentes dependendo do tipo de modificação química ou do tipo de dispositivo empregado.
Formulações adequadas para o uso com um nebulizador, ou a jato ou ultra-sônica, tipicamente compreenderão proteína (ou derivado) dissolvidos em água em uma concentração de cerca de 0,1 a 25 mg de proteí-
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na biologicamente ativa por ml de solução. A formulação pode também incluir tampão e um simples açúcar (por exemplo, para estabilização e regulação de proteína de pressão osmótica). A formulação de nebulizador pode também conter um tensoativo, para reduzir ou prevenir agregação de super5 fície induzida da proteína causada por atomização da solução na formação do aerosol.
Formulações para o uso com um dispositivo inalador medido por dose em geral compreenderão um pó finamente dividido contendo a proteína (ou derivado) suspenso em um propelente com o auxílio de um tensoati-
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vo. O propelente pode ser qualquer material convencional empregado para esta finalidade, tais como um clorofluorocarbono, um hidroclorofluorocarbono, um hidrofluorocarbono, ou um hidrocarboneto, incluindo triclorofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol, e 1,1,1,2tetrafluoroetano, ou suas combinações. Tensoativos adequados incluem triolato de sorbitano e lecitina de soja. Ácido oléico também pode ser útil como um tensoativo.
Formulações para dispersão a partir de um dispositivo inalador de pó compreenderão um pó seco dividido contendo proteína (ou derivado) e podem também incluir um agente de aumento de volume, tal como lactose, 20 sorbitol, sacarose ou manitol em quantidades que facilitam a dispersão do
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pó a partir do dispositivo, por exemplo, 50 a 90% em peso da formulação. A proteína (ou derivado) deve mais vantajosamente ser preparada em forma de partículas com um tamanho médio de partícula de menos do que 10 μητι (ou micra), mais de preferência 0,5 a 5 gm, para fornecimento mais eficaz ao pulmão distai.
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Fornecimento Nasal
Fornecimento nasal da proteína (ou derivado) é também contemplado. Fornecimento nasal permite a passagem da proteína para a corrente sangüínea diretamente depois da administração do produto terapêuti30 co ao nariz, sem a necessidade de deposição do produto no pulmão. Formulações para o fornecimento nasal incluem aquelas com dextrano ou ciclodextrano.
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Métodos de Tratamento, Métodos de Preparação de um Medicamento
Em ainda um outro aspecto da presente invenção, são providos métodos de tratamento e produção de um medicamento. Condições aliviadas por ou modulado pela administração dos presentes derivados são aqueles indicados acima.
Dosaqens
Para todas as moléculas acima, como ulteriores estudos são conduzidos, informação emergirão com referência aos níveis de dosagens apropriados para o tratamento de várias condições em vários pacientes, e o trabalhador normalmente versado, considerando o contexto terapêutico, a idade e a saúde geral do receptor, serão capazes de determinar a dosagem adequada. Em geral, para injeção ou infusão, a dosagem será entre 0,01 gg de proteína biologicamente ativa/kg de peso de corpo, (o cálculo da massa da proteína sozinha, sem modificação química), e 10 mg/kg (com base na mesma). A escala de dosagem pode variar, dependendo da meia-vida de circulação da proteína ou do derivado usado, se o polipeptídeo é derivado por dose de bólus ou infusão contínua, e a formulação usada. Administração com Outros Compostos
Para terapia associada com obesidade, pode-se administrar a presente proteína (ou derivados) em combinação com uma ou mais composições farmacêuticas usadas para o tratamento de outras complicações clínicas de obesidade, tais como aquelas usados para o tratamento de diabetes (por exemplo, insulina), pressão sangüínea alta, colesterol alto, e outras condições adversas incidentes à obesidade. Também, outros supressores de apetite podem ser co-adminitrados, por exemplo, anfetaminas. Administração pode ser simultânea (por exemplo, administração de uma mistura da presente proteína e insulina) ou pode ser em série.
Tratamento Terapêutico com Base de Ácido Nucléico
O gene de OB poderia ser introduzido para dentro de células de gordura humana para desenvolver terapia de gene para a obesidade. Tal terapia seria esperada diminuir o peso de corpo. De modo inverso, a introdução de construtos sem sentidos em células de gordura humana reduzem os níveis de polipeptídeo de OB ativo e seria previsto aumentar adiposidade
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do corpo.
Em uma modalidade, um gene que codifica um polipeptídeo de
OB é introduzido in vivo em um vetor viral. Tais vetores incluem um vírus de
DNA defeituoso ou atenuado, tais como mas não limitados a vírus de herpes simplex (HSV), papillomavírus, vírus Epstein Barr (EBV), adenovírus, vírus adeno-associado (AAV), e semelhantes. Vírus defeituosos, que totalmente ou quase totalmente carecem de genes virais, são preferidos. Vírus defeituoso não é contagioso depois da introdução para dentro de uma célula. Uso de vetores virais defeituosos permite a administração a células em uma área
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localizada específica, sem preocupação que o vetor pode infectar outras células. Assim, tecido adiposo pode ser específicamente visado. Exemplos de vetores particulares incluem, mas não são limitados a, um vetor de vírus de herpes defeituoso 1 (HSV1) [Kaplitt e outros, Molec. Cell. Neurosci. 2:320 - 330 (1991)], um vetor de adenovírus atenuado, tal como o vetor des15 crito por Stratford-Perricaudet e outros, J. Clin. Invest. 90:626 - 630 (1992), e um vetor de vírus de adeno-associado defeituoso [Samulski e outros, J.
Virol., 61:3096 - 3101 (1987); Samulski e outros, J. Virol., 63:3822 - 3828 (1989)].
Em uma outra modalidade, o gene pode se introduzido em um vetor retroviral, por exemplo, como descrito por Anderson e outros, a pa-
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tente U.S. n2 5.399.346; Mann e outros, Cell, 33:153 (1983); Temin e outros, a patente U.S. n2 4.650.764; Temin e outros, a patente U.S. n2 4.980.289;
Markowitz e outros, J. Virol., 62:1120 (1988); Temin e outros, a patente U.S.
n2 5.124.263; Publicação de Pedido de Patente Internacional n2 WO
95/07358, publicado em 16 de março de 1995, por Dougherty e outros; and
Kuo e outros, Blood, 82:845 (1993).
Alternativamente, o vetor pode ser introduzido in vivo por lipofecção. Nas últimas décadas, houve um aumento de uso de lipossomas para a encapsulação de transfecção de ácidos nucléicos in vitro. Lipídios catiôni30 cos sintéticos para limitar as dificuldades e perigos encontrados com transfecção mediada por lipossoma pode ser usada para preparar lipossomas para transfecção in vivo de um gene codificando um marcador [Felgner e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84:7413 - 7417 (1987); ver Mackey e
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outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85:8027-8031 (1988)]. O uso de lipídios catiônicos podem promover encapsulação de ácido nucléicos negativamente carregados, e também promovem fusão com membranas de célula negativamente carregadas [Felgner e outros, Science 337:387 - 388 (1989)].
O uso de lipofecção para introduzir genes exógenos em organismos específicos in vivo tem certas vantagens. O alvo molecular de lipossomas para células específicas representa uma área de benefício. É claro que a direção de transfecção para tipos de células particulares seria particularmente vantajosa em um tecido com heterogeneidade celular, tais como pâncreas, fíga-
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do, rim e cérebro. Lipídios pode ser quimicamente acoplados a outras moléculas para a finalidade de alvo (ver Mackey e outros, 1988, supra). Peptídeos visados, por exemplo, hormônios, neurotransmissores, e proteínas tais como anticorpos, ou moléculas de não-peptídeos poderíam ser acoplados a lipossomas quimicamente.
É também possível introduzir o vetor in vivo como um plasmídeo de DNA exposto. Vetores de DNA expostos para a terapia de gene podem ser introzudidos dentro das células de hospedeiros desejadas por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, transfecção, eletroporação, microinjeção, transdução, fusão de célula, DEAE dextrano, precipitação de fosfato de 20 cálcio, uso de uma goma de gene, ou uso de um transportador de vetor de
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DNA (ver, por exemplo, Wu e outros, J. Biol. Chem., 267:963 - 967); Wu e outros, J. Biol. Chem. 263:14621 - 14624 (1988); Hartmunt e outros, no pedido de patente canadense n9 2.012.311, depositado em 15 de março de 1990).
Aplicações Agrícolas
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O gene de OB pode também ser isolado de animais domésticos, e o polipeptídeo de OB correspondente obtido desse modo. Em um exemplo específico, infra, a sonda derivada de gene de ÕB de murino hibridiza as seqüências de codificação homólogas correspondentes de numerosas es30 pécies de animais. Como discutido para terapias humanas, proteínas recombinantes podem também ser preparadas e administradas a animais domésticos. Administração do polipeptídeo pode ser implementada para produzir animais alimentícios mais magros, tais como gado de corte, suíno, aves domésticas, carneiro, etc. De preferência, um polipeptídeo de OB autólogo é administrado embora a invenção contempla a administração também de polipeptídeo anti-autólogo. Uma vez que o polipeptídeo de OB consiste em cerca de resíduos de 160 aminoácidos, ele pode não ser altamente imunogênico. Assim, a administração de polipeptídeo não-autólogo pode não resultar em uma resposta imune.
Alternativamente, a introdução dos genes clonados em animais domésticos transgênicos permitiría diminuir potencialmente adiposidade e peso de corpo por superexpressão de um transgene de OB. O meio mais simples de conseguir isto seria visar um transgene de OB por uso de sua própria gordura ou um outro promotor de gordura específico.
De modo inverso, aumentos em gordura de corpo devem ser desejáveis em outras circunstâncias para o desenvolvimento de carne kobe ou fígado gorduroso para produzir foie gras. Isto poderia ser realizado por visar um transgene sem sentido para engordar, ou por uso de tecnologia de inativação de gene. Alternativamente, onde um aumento em peso de corpo em percentagem de gordura é desejado, um inibidor ou um antagonista do polipeptídeo de OB pode ser administrado. Tais inibidores ou antagonistas incluem mas não são limitados a, anticorpos reativos com o polipeptídeo, e fragmentos do polipeptídeo que se ligam mas não ativam o receptor de OB, isto é, antagonistas do polipeptídeo de OB.
Implicações Cosméticas
O polipeptídeo de OB tem valor significativo para o uso cosméstico, além dos benefícios de saúde. Em particular, uma vez que os polipeptídeos de OB da invenção, incluindo derivados e seus agonistas análogos, são úteis para a modulação da taxa e quantidade de deposição de célula no animal, eles são úteis para a redução de tecido de gordura disforme, por exemplo, depósitos de gordura no abdomem, no quadril, nas coxas, no pescoço, e no queixo que não necessariamente equivalem a uma condição obesa, mas que no entanto depreciam uma aparência individual. O efeito de redução de gordura é pensado ser realizado, em parte, por uma redução no apetite, isto é, uma redução em ingestão de alimento, por um aumento no metabolismo basal, ou ambos. Assim, o presente polipeptídeo de OB, ou
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seus derivados, ou análogos antagonistas, são úteis para a administração a um indivíduo para efetuar mudanças cosméticas em depósitos de tecido de gordura, se por modulação da deposição de gordura, redução de apetite, ou ambas.
Além disso, as presentes composições e métodos podem ser usados em combinação com vários procedimentos, tais como cirurgias cosméticas destinadas a alterar a aparência global de um corpo (por exemplo, cirurgias de lipossucção ou a laser destinadas a reduzir a massa de corpo por aspiração ou a remoção de tecido de gordura), exercícios (especial-
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mente corrrida e treinamento com peso), dieta de baixa gordura, hipnose, biofeedback, como exemplos de meios que podem tentar diminuir a percentagem de tecido de gordura em melhorar a aparência do corpo.
Correspondentemente, a presente invenção refere-se a um método de efetuar modulação de tecido de gordura cosmética em um indivíduo que compreende a administração de uma quantidade moduladora de gordura de um polipeptídeo de OB, ou seu agonista análogo ou deriviado, a um indivíduo que deseja modulação de tecido de gordura cosmética para melhorar a aparência de corpo global. Em um aspecto particular, a modulação de tecido de gordura é uma conseqüência de supressão de apetite. De pre20 ferência, a modulação de tecido de gordura é uma redução em tecido de
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gordura.
Em uma outra modalidade, a invenção refere-se a um método de efetuar perda de tecido de gordura cosmética compreendendo a combinação de um procedimento para a mudança de aparência de corpo com administração de uma quantidade de modulador de gordura de um polipeptídeo de OB, ou seu agonista análogo ou derivado, a um indivíduo que deseja modulação de tecido de gordura cosmética para melhorar a aparência global de corpo.
O receptor de OB
Desenvolvimento de pequenas moléculas agonistas e antagonistas do fator de OB serão grandemente facilitadas pelo isolamento de seu receptor. Isto pode ser realizado por preparação de polipeptídeo de OB ativo e o uso dele para separar uma biblioteca de expressão usando-se meto-
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logia padrão. Ligação de receptor na biblioteca de expressão pode ser testada por administração de polipeptídeo recombinante preparado usando-se ou vetores de expressão bacteriano ou de mamíferos, e observação dos efeitos da administração contínua e de curto prazo do polipeptídeo recombí5 nante sobre as células da biblioteca de expressão, ou por diretamente detectar ligação de polipeptídeo de OB às células.
Como recentemente, acredita-se que o receptor de OB é provável ser localizado no hipotálamo e talvez no fígado, de preferência bibliotecas de cDNA a partir destes tecidos serão construídas em vetores de clona-
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gem de expressão padrão. Estes clones de cDNA logo seriam introduzidos em células de COS como misturas e os transformantes resultantes seriam separados com ligante ativo para identificar as células de COS expressando o receptor de OB. Clones positivos podem então ser isolados de modo a recuperar o receptor clonado. O receptor clonado pode ser usado em com binação com o ligante de OB (admitindo-se que ele é um hormônio) para desenvolver a necessidade de componentes para separação de moduladores de moléculas pequenas de OB.
Um sistema de ensaio particular que deve ser utilizado de acordo com a presente invenção, é conhecido como um ensaio de receptor. Em um ensaio de receptor, o material a ser analisado é apropriadamente rotula-
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do e então certas colônias de teste celular são inoculadas com uma quantidade tanto de material rotulado quanto de não-rotulado depois que estudos de ligação são conduzidos para se determinar a extensão a qual o material rotulado se liga aos receptores de célula. Deste modo, diferenças em afini25 dade entre os materiais podem ser determinadas.
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Correspondentemente, uma quantidade purificada do modulador de peso pode ser radiorrotulado e combinada, por exemplo, com anticorpos ou outros inibidores para os mesmos, depois que estudos de ligação forem realizados. Soluções seriam então preparadas que continham várias quanti30 dades de modulador de peso não-combinado rotulado e não-rotulado, e amostras de células seriam então inoculada e depois disso incubadas. As monocamadas de células resultantes são então lavadas, são solubilizadas e então são contadas em um contador gama por um comprimento de tempo suficiente para fornecer um erro padrão de < 5%. Estes dados são então submetidos à análise de Scarchard depois que observações e conclusões referentes à atividade de material pode ser tirada. Embora o exposto acima seja exemplar, ele ilustra a maneira em que um ensaio de receptor pode ser 5 realizado e utilizado no caso onde a capacidade de ligação celular do material analisado pode servir como uma característica de distinção. Por sua vez, um ensaio de receptor será particularmente útil na identificação dos receptores específicos para os presentes moduladores, tal como o receptor de db.
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Um outro ensaio útil e contemplado de acordo com a presente invenção é conhecido como um ensaio “cis/trans11. Resumidamente, este ensaio emprega dois construtos genéticos, um dos quais é tipicamente um plasmídeo que contínuamente expressa um receptor particular de interesse quando transfectado para dentro de uma linha de célula apropriada e o se15 gundo dos quais é um plasmídeo que expressa um receptor tal como luciferase, sob o controle de um complexo de receptor/ligante. Assim, por exemplo, se é desejado avaliar um composto como um lígantes para um receptor particular, um dos plasmídeos seria um construto que resulta em expressão do receptor na linha de célula escolhida, enquanto que o segundo plasmí20 deo possuiría um promotor ligado ao gene de luciferase em que o elemento
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de resposta ao receptor particular é inserido. Se o composto sob teste é um agonista para o receptor, o ligante complexará com o receptor, e o complexo resultante ligará o elemento de resposta e iniciará transcrição do gene de luciferase. A quemiluminescência resultante é então medida fotometrica25 mente, e curvas de resposta de dose são obtidas e são comparadas com aqueles de lígantes conhecidos. O protocolo exposto acima é descrito em detalhes na patente U.S. n- 4.981.784 e na publicação de pedido de patente internacional PCT ne WO 88/03168, para cuja finalidade do especialista é referida.
Logo que um recombinante que expressa a seqüência de gene de receptor de OB é identificado, o receptor de OB recombinante pode ser analisado. Isto é conseguidò por ensaios com base nas propriedas físicas ou funcionais do receptor de OB, incluindo rotulação radioativa do receptor
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seguida por análise por eletroforese de gel, ligação de ligante de imunoensaio, etc. Além do mais, anticorpos para o receptor de OB poderíam ser gerados como descrito acima.
A estrutura do receptor de OB pode ser analisada por vários métodos conhecidos na técnica. De preferência, a estrutura dos vários domínios, particularmente o sítio de ligação de OB, é analisado. Análise estrutural pode ser realizada por identificação de similaridade de seqüência com outras proteínas conhecidas, receptores de proteína e hormônio particular. O grau de similaridade (ou homologia) pode prover uma base para 10 prever a estrutura e funcção do receptor de OB, ou um seu domínio. Em uma modalidade específica, comparações de seqüências podem ser reali-
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zadas com seqüências encontradas em GenBank, usando-se, por exemplo, os programas FASTA e FASTP [Pearson e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85:2444-48 (1988)].
A seqüência de proteínas pode ser ulteriormente caracterizadas por uma análise de hidrofílicídade (por exemplo, Hopp e outros, 1981, supra). Um perfil de hidrofilicidade pode ser usado para identificar as regiões hidrofóbicas e hidrofílicas da proteína de receptor de OB, que pode por sua vez indicar regiões extracitoplásmicas, de ligação de membrana e intracito20 plásmicas.
Análise estrutural secundária (por exemplo, Chou e outros, 1974, supra) pode ser feita, para identificar regiões do receptor de OB que assumem estruturas secundárias específicas.
Manipulação, tradução e prognóstico de estrutura secundária, bem como prognóstico e representação gráfica de quadro de leitura aberto, podem também ser realizados usando-se os programas de software disponíveis na técnica.
Por prover uma fonte abundante de polipeptídeo de OB recombinante, e a oportunidade de isolar o receptor de OB (isto é, o produto de 30 gene de db), a presente invenção possibilita a determinação estrutural quantitativa da conformação ativa do polipeptídeo de OB e do receptor de OB, ou seus domínios. Em particular material suficiente é provido para ressonância magnética nuclear (RMN), para infravermelho (IR), para Raman, e
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para ultravioleta (UV), especialmente dicroísmo circular (CD), análise espectroscópica. Em particular RMN provê análise estrutural muito poderosa de moléculas em solução, que mais proximamente se aproxima de seu ambiente natural (Marion e outros, 1983, supra, Bar e outros, 1985, supra; Ki5 mura e outros, 1980, supra). Outros métodos de análise estrutural podem também ser empregados. Estes incluem mas não são limitados à cristalografia de raios X (Engstom, 1974, supra).
Mais de preferência, co-cristais de polipeptídeo de OB e de receptor de OB podem ser estudados. Análise de co-cristais provê informação detalhada sobre ligação, que por sua vez permite o projeto apropriado de
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agonistas e antagonistas de ligante. Modelação por computador pode também ser usada, especialmente em combinação com RMN ou métodos de raios X [Fletterick e outros, eds., Computer Graphics and Molecular Modeling, em Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor,
Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1986)].
Identificação e isolamento de um gene que codifica um receptor de OB da invenção provê para expressão do receptor em quantidades maiores do que podem ser isoladas das fontes naturais, ou em células indicadoras que são especialmente engenheiradas para indicar a atividade de um receptor expresso depois da transfecção e da transformação das células.
Correspondentemente, além do projeto apropriado de agonistas e antagonistas com base na estrutura do polipeptídeo de OB, a presente invenção contempla um método alternativo para identificação de ligantes específicos de receptor de OB usando-se vários ensaios de separação conhecidos na técnica.
A invenção pode ser melhor compreendida por referência aos seguintes exemplos, que têm a finalidade de exemplificar a invenção e não de limitá-la.
Seção de Exemplo
O que se segue descreve o método usado para identificar o material genético que é exemplar da presente invenção. Este eforço compreende quatro etapas sequenciais:
A) Mapeamento genético, B) Mapeamento físico, C) Isolamento de gene de candidato, e D) Detecção de mutação. A seguir confirmação que o gene de murino em objetivo foi isolado (etapa D), o gene ser humano homólogo foi procurado, e tanto os genes de murino quanto seres humanos e proteínas putativas são caracterizados. As etapas são sumarizadas em maior detalhes, abaixo.
A. Mapeamento Genético
A mutação de OB foi segregada em cruzamentos genéticos, e análise de ligação padrão foi usado para posicionar a mutação em relação ao RFLPs (polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição). Estes dados colocaram o gene de OB em um intervalo de ~ 5cM sobre o cromossoam 6 de murino proximal. (5cM é uma medição de distância genética correspondendo aos 5 cruzamentos genéticos aparentes por 100 animais). Um total de 771 meioses informativas foram geradas e foram usadas em mapeamento genético subsequente (Friedman e outros, 1991, supra). Os locais genéticos que são mapeados em relação ao OB foram anteriormente publicados. Os dois RFLPs mais próximos descritos foram definidos por sondas derivadas dos genes de met oncogene e de carboxipeptidase.
A resolução genética das experiências descritas acima foi inadequada para clonar OB, principalmente uma vez que nove dos marcadores genéticos estavam em ligação firme. A fim de se identificar a necessidade de RFLPs firmemente ligado, sondas adicionais foram isoladas e o cruzamento genético foi expandido. Um método conhecido como microdissecação de cromossoma foi usado para isolar peças aleatórias de DNA de cromossoma 6 de murino proximal [Bahary e outros, Mammalian Genome, 4:511 515 (1993)]. Sondas clonadas individuais, D6Rck13, também chamada psd3, foi selecionada para ulterior análise devido a sua proximidade genética para OB.
Esta sonda foi usada para genotipar uma ninhada (progenia) de OB 835 de cruzamentos intersubespecíficos e interespecíficos, que indicaram que D6Rck13 é não recombinante em todos os 835 animais como relatado em Bahary e outros. No curso do mapeamento físico, um novo marcador polimórfico foi identificado a partir de um subclone cosmídeo derivado de YAC 53A6. Este novo marcador foi posicionado entre D6Rck13 e o gene
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de OB e foi usado para genotipar as meioses informativas adicionais 771 recruzamentos e intercruzamentos intraespecíficos. Um único animal ne 167 foi identificado por trazer uma passagem de recombinação entre o OB e o D6Rck39. Estes estudos indicaram que D6Rcd39/D6RcK13 é ~ 0,06 cM de 5 OB. Uma sonda adicional, Pax4, foi identificado que era de 0,12 cM proximal para OB. Pax4 era recombinante em dois animais; n- 111 e n5 420.
Pax4 é um pseudogene que foi anteriormente mapeado para o cromossoma 6 de murino proximal por Gruss e co-trabalhadores [Gruss e outros, Genomics, 11:424 - 434 (1991)]. Nesta base, foi determinada que os resíduos de
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gene de OB intervalo de ~ 0,2cM entre Pax4 e D6Rck13. Isto levou a esforços para clonar a interposição de DNA em um esforço para isolar OB.
B. Mapeamento Físico
A clonagem de DNA neste intervalo produziu o uso de cromossomas artificiais de levedura (YACs), um vetor de clonagem relativamente novo que permite a clonagem de estiramentos longos de DNA contíguo frequentemente mais do que um milhão de pares de base de comprimento.
Cromossomas artificiais de levedura foram isoladas usando-se
D6Rck13 e Pax4. Isto foi realizada por preparação de sondas de DNA purificadas e usando-as para isolar os YACs correspondentes. Estes YACs ( ne 20 8, ns 16, n9 107 e nQ 24) foram isolados e inicialmente caracterizados, e na
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base das análises resultantes foi concluído que YAC 16 foi o YAC que se estendeu distalmente mais afastado, isto é, mais próximo a OB. O código final de YAC ne 16 foi então recuperado, e foi determinado que esta extremidade era mais próxima a OB do que Pax4. Esta extremidade foi chamada
16M(+). Esta conclusão foi conseguida uma vez que foi mostrado que esta sonda não era recombinante em animal n- 420 (como era Pax4). Esta extremidade foi seqüenciada e usada para desenvolver um ensaio de PCR.
Este ensaio de PCR foi usado para separar um biblioteca de YAC. Quatro clones positivos foram isolados. Caracterização subseqüente destes YACs por resgate terminal, mapeamento de restrição, eletroforese de gel de campo de pulso, e Southern blots com os cruzamentos genéticos determinou que dois destes YACs, adu e aad, foram críticos para os estudos subsequentes. YAC aad é um YAC não-quimérico de 550 kB que se estendeu
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distai mente mais afastado. Portanto, a extremidade distai deste YAC, aad(plCL) foi usado para completar o mapa físico. YAC adu é YAC nãoquimérico e 370 kb e sua extremidade distai, adu(+), foi determinado ser não recombinante em toda a progenia de OB dos cruzamentos genéticos 5 incluindo animais n9 111 e ne 167 sugerindo que o gene de OB deve residir neste YAC.
Um ensaio de PCR para estas duas extremidades aad(plCL) e adu(+) foi desenvolvido e foi usado para o isolamento de mais clones de P1 e YACs para continuar o mapeamento físico. Os clones de P1 importantes isolados por este esforço incluiram 498, 499, 500 (isolados usando-se uma
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sonda derivada de aad(plCL) e 322, 323 e 324 (usando-se uma sonda de adu(+)).
Entretanto, YACs isolados por D6Rck13 (53A6, 25A8, 25A9, 25A10) foram caracterizados. Estes estudos determinaram que 53A6 esten15 deu-se proximamente mais afastado em direção à aad YAC. O tamanho do intervalo entre 53A6 e aad foi determinado ser ~70 kB. O código final de
53A6, 53(plLC) foi então usado para separar três bibliotecas de YAC disponíveis e um biblioteca de P1. Um clone de P1 crítico, 325, foi isolado. Assim clone de P1 sobreposto com os clones de P1 isolados por aad(plCL) como descrito acima, e portanto serviu para fechar o intervalo entre 53(plLC) e o aad(plCL) como um resultado, o contig” total, contendo clones de P1 e
YACs, de ~ 2,5 milhões de pares de base de comprimento, e alcançando Pax4, 16M(+), adu(+), aad(plCL), 53(plCL), D6Rck39 e D6Rck13 foi clonado. Por mapeamento cuidadoso dos sítios de recombinação aparente em animal n-111 e n9 167, foi concluído que OB foi situado em um intervalo de
400 kB. Para prover um trabalho de fonte de DNA para isolamento do gene de OB, cerca de 500 kB cobrindo esta região de não-recombinação foi isolada em um total de 14 clones de P1. Estes clones de P1, incluindo 322 e
323, que mais tarde demonstraram serem clones úteis, foram usados para 30 aprisionamento de éxon.
O mapa físico da porção do cromossoma portanto OB é mostrado na figura 7A. A figura 7B representa o contig de YAC. A figura 7C representa o contig” de P1.
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100
C. Isolamento de Genes de Candidatos
O método usado para isolar genes neste intervalo foi o aprisionamento de éxon. Este método usou um vetor comercial para identificar
DNA de éxon (isto é, seqüências de codificação) por seleção de seqüências 5 doadoras e receptoras de união funcional em DNA genômico introduzido em um construto de teste. O DNA a partir destes clones de P1 foram desenvolvidos e foram subclonados em um vetor de aprisionamento de éxon. Estes clones eram insertos curtos clonados em um vetor Bluescript. Cada clone foi ampliado por PCR com iniciadores de PCR correspondendo a seqüências de plasmídeos que flanquearam o inserto. A ampliação de PCR foi realizada
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diretamente sobre as bactérias que portavam o plasmídeo. As reações foram estabelecidas usando-se um robô Biomek. Os produtos de PCR foram eletroforados sobre um gel de agarose a 1% em tampão de TBE que continha brometo de etídeo. A técnica de aprisionamento de éxon foi modificada para eliminar DNA de E. coli contaminante a partir dos clones de P1, e para separar por separação dos éxons arificiais abundantes, que se excederam a 80 - 90% dos éxons putativos aprisionados. O vetor aprisionando éxon inclui seqüências de HIV; um segmento curto destas seqüências de vetor corresponde a este artefato.
A experiência aprisionamento de éxon foi realizada usando-se clones de P1. Produtos de aprisionamento de éxon foram ampliados por PCR, foram selecionados, e foram seqüenciados. Seqüências de éxons putativos foram comparadas com aqueles em Genbank usando-se o programa de computador de Blast. Cerca de quinze éxons foram selecionados para ulteríor exame por análise de Northern, RT-PCR, e zoo blot quanto à presença de RNA correspondente ou seqüências conservadas. Sete dos quinze éxons putativos, 325-2, 323-9, 322-5, D1-F7, 1H3, e 2G7, demonstraram codificar um RNA transcrito. 325-2 é um gene específico de testículo;
323-8 e 323-9 são dois éxons prováveis do mesmo gene expresso princi palmente no cérebro e no rim. IH3 e 322-5 representam dois transcritos de baixo nível. D1-FT é um éxon de um gene anteriormente clonado, inosina monofosfato desidrogenase (IMPDH), que tem padrão de expressão ubíquo. Nove destes genes pareceram codificar OB. 2G7, que é o éxon de OB, é |lí'
101 discutido ulteriormente abaixo.
Depois de três esforços mal sucedidos para aprisionar o gene de OB, uma outra tentativa foi feita por combinação de DNA a partir do P1s da região de OB crítica. Estes incluiram P1s: 258, 259, 322, 323, 324, 325, 5 498, 499, 500, 653, 654 e outros. Depois disso P1s 258, 260, 322, 498 e
499 foram subclonados no vetor de aprisionamento de éxon, e subseqüentemente várias placas foram preparadas com clones bacterianos, cada uma das quais portou um éxon putativo. Cerca de 192 clones representando candidatos de OB putativos foram obtidos. Como observado acima, um ar-
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tefato consistente tal que muito dos isolados continham dois éxons aprisionados derivados a partir do vetor foi observado. Assim, clones foram identificados tanto por seu tamanho quanto pelo fato que hibridização de sondas de DNA correspondennte a este artefato hibridizou às tiras correspondentes sobre um Southern blot do gel. Deste modo, 185 de 192 clones foram ex15 cluídos a partir de ulterior avaliação. Exclusão dos artefatos na base de tamanho apenas não foi possível, como isto poderia ter, na extremidade, levaram a exclusão do éxon correspondendo a OB.
Assim, dos 192 éxons, um total de sete éxons foram selecionados para ulterior estudo. Modelos para seqüenciação dos sete éxons foram preparados, e a seqüenciação foi realizada. As seqüências para os sete
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éxons foram analisadas e verificou-se que sete eram idênticas e uma era um artefato aparente. Em particular, clone de 1D12 continha a seqüência de HIV isto é, a tira de artefato. Isto deixou três éxons para ulterior análise:
1F1,2G7 e 1H3. 1F1 foi eliminado uma vez que ele mapeou o lado de fora da região crítica. Iniciadores de PCR para tanto 1H3 quanto 2GT foram selecionados e foram sintetizados.
A seqüência do éxon em 2G7 foi determinada, e é mostrada na figura 10 (SEQ ID N2:7). Iniciadores de PCR para 2G7 foram selecionados e foram sintetizados. As porções da seqüência correspondendo aos iniciado30 res de PCR são sublinhadas. Os iniciadores usados foram:
5' CCA GGG CAG GAA AAT GTG (Tm = 60,0°C) (SEQ ID N9:8)
3'CAT CCT GGA CTT TCT GGA TAG G (Tm = 60,0°C) (SEQ ID N9:9)
Estes iniciadores ampliaram DNA de genoma com condições de
102
PCR como se segue: 25 - 30 ciclos a 55°C anelando para 2’, 72° extrusão para 21, 94°C desnaturação para 1' em tampão de PCR padrão. Estes inciadores foram também usados para gerar um sonda rotulada por incluir 32PdCTP na reação de PCR com uma redução correspondente na quantidade 5 de dCTP frio.
Um RT-PCR foi realizado em uma variedade de RNAs de tecido e foi concluído que 2G7 foi expresso exclusivamente em gordura branca entre os tecidos examinados (figura 11 A). Depois disso, 2G7 de 32Pmarcado foi hibridizado para um Nothern blot de RNAs de tecido (figura
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11B) e foi mostrado que seu RNA foi expresso em alto nível em tecido de gordura mas foi não-expresso ou expresso em vários níveis baixos em todos os outros tecidos (onde os sinais podem ser o resultado de gordura contaminando as preparações de tecido). Dez gg de RNA total a partir de cada um dos tecidos listados foi eletroforado sobre um gel de agarose com for15 maldeído. A sonda foi hibridizada ao blot a 65°C em tampão de hibridização, Rapid Hybe (Amersham). O tamanho do RNA foi cerca de 4,9 kB. Neste ponto 2G7 foi considerado ser um gene de candidato viável para OB e foi ulteriormente analisado.
D. Detecção de Mutação
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A fim de confirmar que 2G7 codificou o gene de OB, foi necessário demonstrar diferenças nos níveis de expressão de RNA da seqüência de DNA deste gene em mutante quando comparado com animais de tipo selvagem. Duas mutações separadas do gene de OB estão disponíveis para estudo, C57BI/6J de OB/OB (1J) e Ckc/Smj de OB/OB (2J). Esses serão referidos aqui em seguida como 1J e 2J, respectivamente. (Nomenclatura informal é usada para se referir às cepas de murino estudadas. Através de todo esse relatório descritivo e nos desenhos, será entendido que C57BI/6J refere-se a C57BI/6J +/+; Ckc/smj refere-se a SM/Ckc-+Dac- +/+; CKC/smj OB/OB refere-se a SM/Ckc-+Dac-ob2J/ob2J). RNA foi preparado a partir de tecido de gordura que tinha sido isolado a partir de 1J, 2J, e animais de controle. RNA total para cada amostra foi tratado com DNase e então reversamente transcrito usando oligo-dT como um iniciador e transcriptase reversa. O cDNA de filamento único resultante foi então ampliado por PCR ou
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103 com os iniciadores 2G7 (condições mostradas acima) para a tira ou faixa inferior ou com iniciadores de actina comercialmente disponíveis para a faixa ou tira superior. Os produtos de RT-PCR foram corridos sobre um gel de agarose a 1% que foi manchado com brometo de et ideo (Figura 12A).
Usando RT-PCR verificou-se que enquanto mRNA de 2G7 foi expresso em 1J e todos os outros murinos de controle, ele estava faltando completamente no murino 2J. Nenhum sinal foi detectado depois de 30 ciclos de ampliação. Essa experiência proveu evidência direta de que 2G7 correspondia a um éxon do gene de OB.
Figure BRPI9508596B1_D0237
Uma vez que a mutação 2J é relativamente recente e é mantida como uma cepa coisogênica, esse resultado foi a primeira evidência disponível que indicou que 2G7 é um éxon do gene de OB. A mutação é provavelmente localizada na região promotora que leva ao abortamento da síntese de mRNA. A presença de um sinal em murino de 1J nesta experiência de
RT-PCR sugeriu que 1J podería portar um ponto de mutação em uma grande mudança no tamanho da amostra de RNA. Além disso, mRNA de 2G7 estava ausente, quando testado por RT-PCR, a partir de quatro animais de
2J adicionais.
Este resultado foi confirmado sobre uma Northen blot (Figura
12B). RNA de célula gorda foi preparado a partir de cada uma das cepas
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(C57BI/6J, 1J, CKC/smj, e 2J). Dez pg de RNAs foram corridos e foram (blotted). O blot foi sondado com a sonda de 2G7 que estava rotulada por PCR, por ampliação do material (isto é, faixa ou tira, na Figura 11 usando 32P-dCTP na reação de PCR. Actina é controlada para a quantidade de
RNA carregado. O sinal de actina é fracamente similar em todas as amostras. O sinal de OB está ausente no cérebro porque o mRNA é específico para células de gordura.
Os resultados da análise Northern confirmam que o RNA espe cífico de 2G7 está ausente em murinos de 2J. O RNA de OB está ausente em murinos de CKC/smj de OB/OB porque nessa cepa mutante obesa o gene é rompido de modo que não é produzido nenhum RNA. Além disso, o nível de RNA de 2G7 foi aumentado -10 a 20 vezes em 1J bem como gordura de db/db. Esses resultados são compatíveis com a hipótese de que OB
104 ou codifica hormônio circulante ou é responsável pela geração de um sinal de células de gordura que modula peso de corpo. Esses resultados suportaram a conclusão de que 2G7 é o gene de OB e predisseram que murinos de 1J têm um ponto de mutação, provalmente uma mutação de não sentido que leva a um término de tradução prematuro.
Esses resultados de Northern foram replicados usando preparações de RN A de célula de gordura a partir de quatro diferentes animais de 2J (Figura 13). Neste ensaio, ap2 é um transcrito específico de gordura que foi usado como um controle da mesma maneira que actina na Figura 12B.
Não há qualquer significância para a densidade variável da faixa ap2. ap2 foi rotulada por designação dos iniciadores de PCR da seqüência de ap2
Figure BRPI9508596B1_D0240
publicada. Os produtos de RT-PCR de RNA de célula de gordura foram então re-rotulados usando o mesmo protocolo para a rotulação de PCR. Essa análise demonstra a presença de mRNA de OB em animais normais homozigotos ou heterozigotos, e sua ausência de animais mutantes de 2J.
A mutação foi indicada em murinos de 1J. A mutação é uma mudança de base de C para T que resulta em uma mudança de uma arginina para um códon de parada prematura aparente nos 108 aminoácidos, e tem toda a probabilidade de responder pela mutação de 1J (Figura 14) ape20 sar da expressão de alto nível do mRNA de OB (ver as Figuras 12 e 13, raias de C57BI/6J de OB/OB).
Mais recentemente, Southern blots foram usados para concluir que a mutação de 2J é o resultado de uma mudança de DNA detectável na extremidade 5'de OB que parece abolir completamente a expressão de 25 RNA. A natureza exata desse possível rearranjo permanece sem determinação.
Um Southern blot genômico de DNA a partir de murinos de CKC/smj (SM/Ckc-+Dac) e de C57BI/6J usando quatro diferentes endonucleases de restrição foi realizado a fim de se determinar se o OB mutante for30 necia um padrão de fragmento único (Figura 15A). Cerca de 10 gg de DNA (derivado de DNA genômico preparado a partir de fígado, rim, ou baço) foram digeridos com a enzima de restrição indicada. O DNA foi então submetido a eletroforese em um gel de agarose TBE a 1%. O DNA foi transferido
Figure BRPI9508596B1_D0241
105 para uma membrana de imobilon e foi hibridizado para a sonda de 2G7 rotulada por PCR. A faixa chave é a faixa mais alta no digerido de Bglll para o DNA de CKC/smj de OB/OB (SM/Ckc-+Dac ob2J/ob2J). Essa faixa é de peso molecular maior do que na outra cepa, indicando uma mutação nessa cepa.
A Figura 15B é uma Southern blot de um digerido de Bglll de
DNA genômico da progenia de um cuzamento de ob2J/+x ob2J/+. Alguns dos DNAs têm só a faixa superior, alguns só a faixa inferior, e alguns têm amabas as faixas. Os animais com só a faixa superior são halo-obesos, isto é, ob2J/ob2J. Esses dados mostram que o polimorfismo (isto é, mutação) mos-
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trada na Figura 15A segrega em um sentido genético.
EXEMPLO 1: Clonagem de cDNA e Determinação de Seqüência de OB
Usando-se a sonda de PCR 2G7 rotulada, um total de cinqüenta clones de cDNA de murino a partir de uma biblioteca de cDNA de Xgt11 de célula de gordura de murino (cDNA de 5'-STRETCH de Clonetech oriundo de almofadas de gordura testicular de murinos suíço, n2 ML3005b) e trinta clones de cDNA ser humano de hibridização cruzada a partir uma biblioteca de cDNA de Àgt10 de célula de gordura humana (cDNA de 5'-STRETCH de
Clonetech oriundo de abdomem n2 HL1108a) foram isolados. Separação de biblioteca foi realizada usando-se um procedimento de elevação de placa.
Os filtros a partir da elevação de placa foram desnaturados usando-se o
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Figure BRPI9508596B1_D0245
método de autoclave. Os filtros foram hibridizados em duplicata com a sonda 2G7 rotulada por PCR (tampão de Rapid Hybe, 65°C, de um dia para o outro). Depois de uma pré-hibridização de 1 - 4 horas, os filtros foram lava dos em 2x SSC, SDS a 2%, duas vezes por 30 minutos a 65°C e foram ex postos a película de raios X. Positivos em duplicatas foram purificados em placa. Fago purificado em placa foram ampliados por PCR usando-se iniciadores de vetor comercialmente disponíveis, por exemplo, Xgt 10 e Xgt 11. Os produtos de PCR resultantes corresponderam ao inserto de cDNA para cada fago com uma pequena quantidade de seqüência de vetor em cada extremi30 dade. As tiras foram seqüenciadas e purificadas por gel usando-se o seqüenciador automatizado ABI e os iniciadores de vetor para investigar a polimerase de DNA.
Os dados de seqüenciação bruta foram então manualmente
Figure BRPI9508596B1_D0246
106 examinados base por base para corrigir mishearing do programa de computador. Quando a seqüência correta tornou-se disponível, os iniciadores a jusante foram sintetizados e foram usados para continuar a seqüenciação. Tais experiências foram repetidas até que cada clone de cDNA disponível 5 fosse seqüenciado e fosse sintetizado em um contig. Para contar, ~ 3000 pares de base da extremidade de 5' do mRNA foi compilado. Um dos clones de cDNA estendeu-se para a extremidade de 5' do mRNA como sua seqüência era idêntica àquela do produto RACE 5' de RNA de tecido de gordura (dados não-mostrados).
Figure BRPI9508596B1_D0247
Os dados de seqüência revelados que é um quadro de leitura aberto de 167 aminoácidos (figura 1). Uma seqüência de consenso de iniciação de tradução de Kozak estava presente com um resíduo de adenosina de três bases a montante do ATG. Duas clases de cDNA foram encontradas se diferenciando por inclusão ou por exclusão de um único códon de gluta15 mina. Este resíduo é encontrado em uma posição imediatamente 3' ao aceitador de união do éxon de 2G7. Uma vez que o códon de CAG de glutamina inclui uma seqüência aceitante de união possível, parece que há deslizamento no sítio de aceitante de união com uma deleção de 3 pares de base aparentes em uma sub-série do cDNA, como mostrado abaixo.
Figure BRPI9508596B1_D0248
gin ser vai ag CAG TCG GTA t
(sítio aceitante de união) ser vai ag CAG TCG GTA
Figure BRPI9508596B1_D0249
(com glutamina) (SEQIDNe:17) (sem glutamina) (sítio aceitante de união)
O ag nas seqüências acima corresponde à seqüência de ín tron admitida a montante do códon de glutamina, e AG é o sítio alternativo putativo. Este resíduo de glutamina é localizado em uma região altamente conservada da molécula e sua importância para a atividade biológica é ainda desconhecida.
Uma seqüência de sinal N-terminal foi detectada, o sítio de cli
Figure BRPI9508596B1_D0250
107 vagem de sinal do qual é previsto ser carbóxi-terminal ao resíduo de alarina na posição 21 de aminoácido. Esta seqüência de sinal putativo foi confirmada por aplicação de um algoritmo ao método de von Heijne. Usando-se esta técnica, a seqüência de sinal mais provável foi identificada na região de co5 dificação de polipeptídeo aos aminoácidos 1 - 23 tendo a seqüência:
MCWRPLCRFLWLWSYLSYVQA T VP (SEQ ID Ns:10) em que a seta indica o sítio de divagem de seqüência de sinal putativo. O resto da seqüência de aminoácidos era grandemente hidrofílica não tinha quaisquer pedaços ou membrana estruturais observáveis alcançando domí-
Figure BRPI9508596B1_D0251
Figure BRPI9508596B1_D0252
nios outros que não a seqüência de sinal N-terminal. Específicamente, não encontraram seqüências de consenso para as seqüências de aminoácidos dibásicos ou glicolisação N-ligada indicativos de divagem de proteína na proteína processada prevista (Sabatini etal, The metaboiic basis of inherited disease, págs. 177 - 223, C. V. Scriver e outros, ed., McGraw-HilI, New
York). Pesquisas de base de dados usando-se programas de Blast e de
Block não identificaram quaisquer seqüências homólogas.
RNA de tecido de gordura ser humano foi analisado em Nor· thern blots, espécie de RNA de um tamanho similar ao gene de OB de murino foi detectado. Seqüenciação e análise de clones de cDNA revelaram que
OB ser humano também codifica um polipeptídeo de 167 aminoácidos (figu
Figure BRPI9508596B1_D0253
Figure BRPI9508596B1_D0254
ra 2A e B e figura 3). Duas classes de cDNA, com ou sem deleções de três pares de base, foram também encontradas em ser humano (figura 6). Os genes de OB de murino e ser humano eram altamente homólogos na região de codificação prevista, mas tinham apenas 30% de homologia nas regiões não-traduzidas 3' e 5' disponíveis. Uma seqüência de sinal N-terminal estava também presente no polipeptídeo de OB. Comparação das seqüências de polipeptídeos de OB de murino e ser humano mostraram que as duas moléculas compartilham uma identidade de 83% total ao nível de aminoácidos (figura 4). Os terminais N das proteínas maduras de ambas as espécies compartilham ainda homologia mais alta, com apenas seis substituições de aminoácidos conservadoras e três não conservadoras entre os 100 resíduos de aminoácidos N-terminais.
DNA genômico foi isolado a partir de murino, de rato, de coelho,
Figure BRPI9508596B1_D0255
108 de rato silvestre, de gato, de vaca, de carneiro, de porco, de ser humano, de galinha, de enguia, e de Drosophila, e foi digerido por restrição com EcoR1.
Os digeridos foram eletroforados sobre gel de TBE de agarose a 1%. DNA foi então transferido para uma membrana de immobilon e foi sondado com 5 a sonda 2G7 rotulada por PCR. O filtro foi hibridizado a 65°C e foi lavado com 2x SSC, SDS a 0,2% a 65°C duas vezes por 20 minutos a cada lavagem, isto é, houve duas mudanças de tampão. Os dados indicam que OB é conservado entre os vertebrados (figura 16). Observação a este respeito é uma sinal 2+ no DNA de enguia; enguia é um peixe.
Figure BRPI9508596B1_D0256
Em resumo, evidência disponível sugere que peso de corpo e adiposidade são fisiologicamente controladas. Há sete anos esforços começaram a identificar dois dos componentes chave deste sistema; Os genes de OB e de DB. Como mostrado neste exemplo, o gene de OB foi agora identificado como um gene específico de gordura que desempenha um papel na regulação de peso de corpo. O produto deste gene, que é mais provavelmente um hormônio secretado, terá importantes implicações para o dia gnóstico e o tratamento de distúrbios nutricionais em animais não-humanos e seres humanos.
Exemplo 2: Expressão de OB em Bactérias
Figure BRPI9508596B1_D0257
Figure BRPI9508596B1_D0258
Tanto cDNAs seres humanos quanto de murino codificando OB foram clonados em um vetor de expressão de pET-15b (Novagen). Este vetor contém um promotor de T7 em combinação com um operador de lac, e expressa uma proteína de fusão contendo uma etiqueta de histidina (His tag) e um sítio de divagem de trombina imediatamente a montante do sítio de inserção de seqüência de codificação (figura 17) (SEQ ID N-: 11 e 12).
Os cDNAs de murino e ser humano foram modificados de modo que a alanina na extremidade da seqüência de sinal foi transformada em um sítio de Ndel, como o foi uma seqüência separada na região 3'. Inserção do sítio de Ndel foi realizada usando-se PCR com novos iniciadores:
Mnde-51- (iniciador de início cinco de murino)
CTTATGTTCA TATGGTGCCG ATCCAGAAAG TC (SEQ ID N2:13)
Mnde-31- (iniciador de início três de murino)
TCCCTCTACATATGTCTTGG GAGCCTGGTG GC (SEQ ID Ns:14)
Figure BRPI9508596B1_D0259
109
Hnde-51- (iniciador de início cinco de ser humano)
TCTATGTCCA TATGGTGCCG ATCCAAAAAG TC (SEQ ID N9:15)
Hnde-31- (iniciador de início três de ser humano)
TTCCTTCCCA TATGGTACTC CTTGCAGGAA GA (SEQ ID N2:16)
Os iniciadores contêm um desemparelhamento de 6 pares de base no meio que introduz sítios de restrição de Ndel em cada extremidade do fragmento de PCR. Fago portando ou cDNA de murino ou ser humano foram ampliados por PCR usando-se aqueles iniciadores. O produto de PCR foi digerido com Ndel e purificado por gel em um gel de agarose de 10 ponto de fusão baixo a 1%. As tiras purificadas por gel foram subclonadas no vetor de pET. Os plasmídeos resultantes foram seqüenciados para asse-
Figure BRPI9508596B1_D0260
gurar que mutações não foram introduzidas durante a etapa de ampliação de PCR de clonagem. Construtos para o cDNA de murino e ser humano que codificam e que carecem de glutamina 49 foram preparados. Em particular, construtos de pET 15 b contendo ou a seqüência de codificação de OB ser humano ou de murino, a menos seqüência de sinal e fundidos para um Histag, foram produzidos usando-se um método de clonagem de PCR. Os construtos foram seqüenciados para assegurar que nenhum erro de seqüência fosse introduzido na região de codificação do gene de OB durante 20 a etapa de ampliação de PCR.
Dois construtos de plasmídeo resultante, pETM9 e pETH14, foram selecionados para transformar um hospedeiro de expressão bacteriana. Na indução com IPTG a 1 mM sob condições ótimas, as bactérias transformadas eram capazes de produzir 100 - 300 gg/ml da fusão de OB. A maioria
Figure BRPI9508596B1_D0261
da proteína de fusão de OB foi encontrada no corpo de inclusão. Depois da solubilização com guanidina-HCI a 6 M ou uréia, a proteína de fusão foi purificada através de uma coluna de resina de ligação de His (Ni-quelação).
As condições para purificação de coluna da proteína de fusão de OB (in cluindo ligação, lavagem, e eluição) foram estabelecidas experimentalmen30 te. A proteína de fusão de OB se liga à resina em imidazol a 20 mM/guanidina-HCI a 6 Μ. A proteína pode ser eluída a partir da resina em imidazol a 60 mM/guanidina a 6M (figura 18A,B). Tanto as proteínas de fu são de OB de ser humano quanto de murino foram ulteriormente dialisadas
Figure BRPI9508596B1_D0262
110 em PBS para se remover guanidina-HCI a partir da preparação, então foram usadas para criar anticorpos policlonais.
A fim de testar a atividade biológica dos produtos de proteína de fusão, as condições de redobramento para a proteína purificada foram tes5 tadas e foram desenvolvidas. Isto envolve diálise inicial da proteína de fusão em uma solução de guanidina a 1 M, seguida por diluição com uma solução de arginina a 0,4 Μ. O His-tag foi removido a partir das proteínas de fusão antes da análise quanto à função biológica. A remoção da etiqueta foi conseguida por tratamento da proteína de fusão com trombina da placenta
Figure BRPI9508596B1_D0263
Figure BRPI9508596B1_D0264
humana.
Além disso, seqüências de codificação de gene de OB de murino e ser humano menos a seqüência de sinal são cada uma sendo inserida em um vetor de pET 12c usando-se método de clonagem de PCR. Estes construtos podem dirigir as proteínas de fusão de OB sintetizadas no espa15 ço periplásmico da célula de hospedeiro bacteriana. A proteína de fusão de
OB recuperada a partir do espaço periplásmico pode apenas necessitar uma filtração de gel simples para ser purificada a partir de outras proteínas de hospedeiro e não será desnaturada durante tal processo.
Exemplo 3: Preparação de Anticorpos para o Polipeptídeo de OB
Figure BRPI9508596B1_D0265
Figure BRPI9508596B1_D0266
Além do uso da proteína recombinante para gerar anticorpos policlonais, um conjunto de quatro seqüências de peptídeos a partir da seqüência de OB de murino deduzida foi identificado usando-se software de plotagem de imunogenicidade (Pacote de GCG). Os quatros fragmentos de peptídeos terminais em carboxila são:
(SEQIDN9:18)
Val-Pro-lle-GIn-Lys-Val-GIn-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-lle-Lys-Thr (SEQIDN9:19)
Leu-His-Pro-lle-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-GIn-Thr-Leu-Ala (SEQ ID N9:20)
Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro-Glu-SerLeu-Asp (SEQ ID N-:21)
Ser-Arg-Leu-GIn-Gly-Ser-Leu-GIn-Asp-lle-Leu-Gln-GIn-Leu-Asp-Val-Ser111
Pro-Glu-Cys
Estes peptídeos foram conjugados para KLH, e os conjugados de peptídeo-KLH foram usados para imunizar coelhos usando-se técnicas padrão. Anti-soros policonais específicos para cada peptídeo é recuperado a partir dos coelhos.
Exemplo 4: Translocação In Vitro de um Polipeptídeo de OB
A fim de confirmar a presença de uma sequência de sinal funcional, um cDNA ser humano que incluiu o quadro de leitura aberto total foi subclonado no vetor de pGEM. Apenas o cDNA ser humano foi usado nesta
Figure BRPI9508596B1_D0267
Figure BRPI9508596B1_D0268
experiência uma vez que subclones de camungongo adequados não foram recuperados. RNA de OB ser humano de filamento positivo foi transcrito usando-se polimerase de Sp6 e foi usado em uma reação de tradução in vitro com ou sem membranas microssomais pancreáticas de canino. O produto de tradução primário migrou com um peso molecular evidente de - 18 kD, que é consistenete com aquele previsto pela seqüência de cDNA. Inclusão das membranas microssomais na reação inibiu a eficiência global de tradução - 5 vezes. Não obstante, cerca de 50 - 70% do produto de tradução primário de OB foi truncado por cerca de 2 kD na presença da preparação de membrana sugerindo que a seqüência de sinal é funcional (figura
19A). O tamanho do produto de tradução primário de RNA de interleucina-
Figure BRPI9508596B1_D0269
Figure BRPI9508596B1_D0270
1alfa, que não-codifica uma seqüência de sinal, ficou inalterada quando membranas microssomais foram incluídas na reação. A fim de confirmar que translocação da proteína de OB tinha ocorrido, os produtos de tradução in vitro foram tratados com Proteinase-K. Tratamento por protease resultou na proteólise completa do produto de tradução primário de 18 kD enquanto a forma processada de 16 kD não foi afetada pelo tratamento de enzima, indicando que ele tinha se translocado para dentro do lúmen dos microssomas (figura 19B). Estes dados são compatíveis com a hipótese que OB é uma molécula secretada.
Depois da divagem de seqüência de sinal, resíduos de duas cisteínas permaneceríam dentro da proteína prevista criando a possibilidade que a molécula contém uma ligação de dissulfeto característica de outros polipeptídeos secretados [Shen e outros, Science, 224:168 -171 (1984)].
Figure BRPI9508596B1_D0271
112
Exemplo 5: Caracterização do Gene de OB
Para estabelecer a relação entre obesidade e alterações genéticas no gene de OB em seres humanos, a seqüência do gene de OB ser humano foi determinada (figura 20A até C) (SEQ ID Ne:22 e 24). Iniciadores 5 específicos a partir da seqüência de codificação ser humana foram usados para separar uma biblioteca de P1 ser humano. Três clones de P1 diferentes foram obtidos, foram desenvolvidos, e PCR ampliados usando-se iniciadores flanqueando o sítio de união entre o primeiro e segundo éxons de condificação. A região de íntron total, por volta de 2 kb, foi ampliada e par-
Figure BRPI9508596B1_D0272
cialmente seqüenciada (ver figura 20A; e como indicado em SEQ ID N9:22 e 24).
A estrutura de gene de tanto os genes de murino quanto ser humano foi caracterizada usando-se ensaios de PCR e outras técnicas padrão. O gene de OB de murino foi demonstrado consistir em três éxons, o segundo e o terceiro dos quais representam a seqüência de codificação (figura 20D). A região de codificação do gene de OB ser humano partilha a mesma estrutura; no entanto, o gene ser humano carece de um íntron e éxon de 5' (figura 20E).
Dois conjuntos de iniciadores gerados a partir das seqüências intrônicas do gene ser humano foram preprados (figura 20A até C). As se-
Figure BRPI9508596B1_D0273
qüências dos iniciadores se seguem (F e R referem-se a direção para frente e reverso, respectivamente):
HOB 1gF 5'-CCCAAGAAGCCCATCCTG-3*
HOB 1gR 5-GACTATCTGGGTCCAGTGCC-31 (SEQ ID NQ:29) (SEQ ID Ne:30)
Figure BRPI9508596B1_D0274
HOB 2gF S^CCACATGCTGAGCACTTGTT-S1
HOB 2gR 5-CTTCAATCCTGGAGATACCTGG-31 (SEQIDN9:31) (SEQ ID Nõ:32)
Amostras de DNA foram obtidas de várias fontes, e estes con juntos de iniciadores estão sendo usados para ampliar DNA genõmico ser humano de pessoas severamente obesas. Os produtos de PCR foram reali30 zados sobre um gel de agarose de baixo ponto de fusão, e as tiras foram cortadas e foram digeridas com agarase. As seqüências foram obtidas usando-se o seqüenciador de DNA ABI 373A e kit terminador de dideóxi Taq (ABI, Perkin-Elmer). Uma mutação de ponto em um gene de OB a partir
Figure BRPI9508596B1_D0275
113 de uma amostra de paciente foi detectada para começar. Esta mutação é o primeiro éxon e não muda a seqüência de aminoácidos. Dados preliminares indicam que uma seqüência de inserção pode estar presente no primeiro éxon de um outro paciente.
Um método de seqüenciação automatizado diferente usando-se
Sequenase em vez de polimerase de DNA de Taq pode ser empregado para fornecer seqüências mais facilmente legíveis para detecção de mutação.
Exemplo 6: Expressão de OB em Levedura
Depois da clonagem posicionai de OB, tornou-se importane para
Figure BRPI9508596B1_D0276
não cobrir o mecanismo fisiológico pelo qual a proteína de OB reduz a ingestão de alimento e o peso de corpo. A primeira etapa nesta direção foi produzir recombinantemente uma proteína funcional usando-se um sistema de expressão. Além do sistema de expressão bacteriana bem sucedido, um sistema de expressão de levedura foi também selecionado. Expressão de levedura tem várias características atrativas para expressão de OB. O mais importante é que proteína eucariótica biologicamente ativa são mais prováveis de serem produzidas. O polipeptídeo de OB é secretado por células de mamífero. Secreção de proteína é muito similar para todos os eucariótes, o que significa que o aparelho secretório de levedura é muito mais similar ao caminho secretório de mamífero do que aos caminhos secretórios bacteria-
Figure BRPI9508596B1_D0277
Figure BRPI9508596B1_D0278
nos seriam. Em particular, modificações de proteína de OB visto em células de mamífero prováveis também de seriam vistas na expressão através do sistema secretório de levedura. Além disso, dobramento de proteína é realizado na passagem através do aparelho secretório e assim, fornecendo OB através do aparelho secretório de levedura é provável dar uma proteína adequadamente dobrada com atividade biológica natual. Isto é significativo para OB uma vez que os dois resíduos de cisteína podem formar uma ponte de dissulfeto. Em contraste a caminhos secretórios, a redução de ambiente do citoplasma de célula previne a formação de pontes de dissulfeto; e por30 tanto, é essencial que OB passe através do caminho secretório na ordem para esta ligação de dissulfeto para formar in vivo. Outras vantagens têm a ver com a facilidade e rapidez de manipulação de levedura, a disponibilidade de vetores e de cepas, e a vasta experiência em tecnologia recombi
Figure BRPI9508596B1_D0279
114 nante de levedura.
Um sistema de expressão Pichia pastoris foi escolhido por quatro razões: (1) tem níveis maiores de expressão de proteína heteróloga do que outros sistemas de levedura tal como S. cerevlsiae; (2) glicolisação de 5 proteína é mais similar ao sistema de mamíferos em P. pastoris do que em S. cerevisiae (embora sítios de glicolisação não fossem detectados em OB usando-se uma pesquisa de computador, ainda permaneceu a possibilidade de glicolisação em sítios desconhecidos): (3) P. pastoris secreta naturalmente muitas proteínas, e assim é em geral direta para purificar a proteína
Figure BRPI9508596B1_D0280
estranha expressa: e (4) os vetores e cepas de levedura estão comercialmente disponíveis (de Invitrogen). Duas estratégias para gerar vetores de expressão de levedura são conhecidos nas figuras 21 e 22.
O vetor escolhido foi pPIC.9. Este vetor contém um sítio de clonagem exatamente a jusante da seqüência de codificação prepro de fator de acasalamento alfa que dirige a proteína codificada pelo gene clonado no sítio de clonagem para ser secretado pelo caminho secretório. A outra ca racterística importante do vetor é um gene de HIS4 que permite a seleção para absorção do vetor usando-se uma cepa auxotrófica de levedura des envolvida em meio de histidina deficiente seguindo transformação da leve20 dura com o vetor. A estratégia de clonagem foi como se segue: ampliar por
Figure BRPI9508596B1_D0281
Figure BRPI9508596B1_D0282
PCR cDNA de OB usando-se um iniciador de 5' que contém em sua extremidade 3', seqüência complementar à seqüência de OB exatamente seguinte ao sítio de divagem de peptídeo líder previsto, e em sua extremidade
5' máxima, uma seqüência complementar à extremidade 3' da seqüência de fator de acasalamento alfa do vetor. O iniciador de 5' também contém um sítio de Xhol. O iniciador 3' foi projetado para ter em sua extremidade 3’ uma seqüência complementar aos últimos poucos aminoácidos de OB e um sítio de EcoRI em sua extremidade 51. Depois de ampliação de PCR, o produto de PCR foi digerido com Xhol e EcoRI e foi clonado em pPIC.9 similarmente digerido. Depois da clonagem de tanto cDNAs de OB ser humano quanto de murino, cada um com e sem a glutamina no códon 49, clones individuais foram isolados para todos os quatros construtos e foram seqüenciados para verificar que os contrutos foram clonados na orientação correta, e no qua-
Figure BRPI9508596B1_D0283
115 dro, e não cotinham mutações a partir da etapa de ampliação de PCR. Depois da identificação de clones com a seqüência correta, estes foram transformados em cepa GS115 de P. pastoris, uma histidina auxótrofo.
Para os dois construtos de OB de murino, clones de levedura transformados foram separados para expressão de proteína. Como evidência de que a levedura transformada contém OB, um ensaio de dot-blot de DNA e uma colônia de hibridização de ensaio foram feitos os quais ambos mostraram seqüência de OB dentro da levedura transformada, mas não dentro da levedura não transformada. Além do mais, a levedura transforma-
Figure BRPI9508596B1_D0284
Figure BRPI9508596B1_D0285
da agora secretada uma proteína de 16 kDa nos meios de cultura, enquanto que a levedura não transformada não secreta uma proteína deste tamanho (figura 23A). Isto é o tamanho previsto de OB. Clones individuais para ambos os construtos de murino foram identificados que são altos expressores para OB, e atualmente uma estratégia de purificação está sendo desenvol vidos para purificar OB até homogeneidade. Uma estratégia foi para purifi car OB sobre uma coluna trocadora de cátion (figura 23B); dados preliminares sugerem que um trocador de cátions fortes pode ser útil. No entanto, depois da cromatografia de troca de cátions, o produto de OB putativo é perdido. Isto indica a presença de uma protease na amostra.
Uma estratégia para superar este problema é preparar fusões
Figure BRPI9508596B1_D0286
Figure BRPI9508596B1_D0287
de OB-His-tag para expressão em levedura (figura 22). Outra avaliação demostrou que OB sem um His-tag associa firmemente com uma coluna de Ni quilação. Purificação do polipeptídeo de OB por Ni-quelação, seguido por filtração com gel, fornecido um produto de pureza suficiente para análise espectral de massa. Spectometria de massa confirma que o peso molecular da proteína expresso é idêntico ao peso molecular esperado que fortemente confirma que OB foi expresso com sucesso em Pichia.
No entanto, a purificação de protocolo de filtração de Niquelação/gel não fornece um polipeptídeo de OB em forma suficientemente pura. Moléculas pequenas adicionais estão presentes. Parece que a atividade proteolítica elui a partir da coluna de Ni-quelação no volume vazio. Correspondentemente, um processo de purificação de três etapas é planejado: Ni-quelação, seguido por troca de cátions (que elimina os contami
Figure BRPI9508596B1_D0288
116 nantes de molécula pequena) seguido porfiltração de gel.
Avaliação do nível de expressão por manchamento de Coomassie blue de géis de SDS-PAGE revela cerca de 10 mg/l quando levedura são desenvolvidas em frascos agitadores. Estes níveis são esperados au5 mentar em recipientes de fermentação, e está prestes a inciar fermentação com as esperanças de obter quantidades maiores de proteína. Referente a construtos de OB ser humano, clones de levedura transformados contendo altos números de cópias do gene de OB foram identificados, e estes são esperados expressar a proteína de OB. Como anticorpos são desenvolvi-
Figure BRPI9508596B1_D0289
Figure BRPI9508596B1_D0290
dos, estes serão usados para cofirmar a identidade da proteína de 16 kDa secretada.
Exemplo 7: Alta Expressão de Nível de um Peptídeo de OB em Bactérias
Preparação de estoques de congelador:
Para cada um das duas alíquotas de 4 ml de meios de M9ZB esterilizados sem a fonte de carbono, 40 μΙ de dextrose em estoque (0,4 g/ml, esterilizado por filtro) 10 μΙ de estoque ampicilina (200 mg/ml, e 5 μΙ de estoque cloranfenicol (34 mg/ml, em etanol) foram adicionado. Uma única colônia cada uma de E. coli com DNA de OB1 de ser humano e de murino clonado em um vetor de Novagen pET-14 b foi usado para incular estes. Os tubos foram inocubados em 37°C de um dia para o outro.
Figure BRPI9508596B1_D0291
Figure BRPI9508596B1_D0292
0,5 ml das culturas de um dia para o outro foi usado para inocular 50 ml de meios de M9ZB com dextrose, ampicilina e cloranfenicol. Estes foram incubados a 30°C e a absorbância em 600 nm (A600) foi perio dicamente monitorada. Em A600 de cerca de 1 -1,2, alíquotas de 175 μΙ da cultura foram misturadas com 25 μΙ de glicerol a 60% em tubos eppendorf de 2 ml, congelados a jato com nitrogênio líquido e foram armazenados a -80°C.
Desenvolvimento de Cultura ml de meios de M9ZB com 0,5 ml de dextrose a 40%, 125 μΙ de estoque de ampicilina e 50 μΙ de estoque de cloranfenicol foram incoculados com 1 ml de estoque de geladeira e foram incubados a 30°C. Em
A600 de 1 - 1,2, 10 ml desta cultura foram usadas para inocular cada um dos quatro frascos com 500 ml de meios de M9ZB com dextrose, ampicilina
117 e cloranfenicol. Estes foram incubados a 30°C até a indução em A600 de cerca de 1 -1,2 com uma concentração final de IPTG a 0,5 mM. As culturas foram incubadas de um dia para o outro. As células foram cultivadas por centrifugação em 4000 rpm por 20 minutos. Esta sistema de expressão for5 nece um polipeptídeo de OB recombinante como uma percentagem razoavelmente alta de proteína total; na ordem de grama/litro de E. coli.
Lise de célula e ressuspensão de corpos de inclusão:
Pasta de célula foi ressuspensa em um volume mínimo de HEPES a 20 mM, pH 7,2, glicerol a 10%, KCI a 0,1 M, MgCI2 a 5 mM, aprotini-
Figure BRPI9508596B1_D0293
na a 1%, PMSF a 1 mM, 5 pg/ml de leupeptina e 50 gg/ml de DNase I. A suspensão foi congelada e descongelada 3 vezes usando-se nitrogênio líquido e água morna. Células lisadas foram centrifugadas em 18000 rpm por minutos e foram ressuspensas em HEPES a 20 mM, pH 7,5, NaCI a 0,1
Μ. A suspensão foi sonicada e Triton X100 foi adicionado a uma concentra15 ção final de 2%. Esta foi centrifugada por 15 minutos em 18000 rpm. Depois de mais dois tais ciclos, três ciclos de lavagens livres de Triton foram dados.
Finalmente, o pélete foi dissolvido em GdHCI a 6 M (guanidina-HCI), HEPES a 20 mM, pH 7,5 por sonicação seguido por centrifugação. O sobrenadante foi usada para ulterior purificação.
Figure BRPI9508596B1_D0294
Figure BRPI9508596B1_D0295
A proteína de OB foi purificada no estado não dobrado por afinidade de íon de metal imobilizado (IMAC). A solução foi aplicada a uma coluna de 40 ml de sefarose de fluxo rápido de quelação de Farmácia carre gada por 5 volumes de coluna de N1SO4 a 50 mM e foi equilibrada em
GdHCI a 6 M, HEPES a 20 mM, pH 7,5. A coluna foi lavada com GdHCI a 6
M, imidazol a 30 mM, HEPES a 20 mM, pH 7,5. Finalmente, a proteína foi eluída com o mesmo tampão contendo imidazol a 0,2 M. Proteína não dobrada em GdHCI a 6 M foi armazenada a 4°C depois da adição de acetato de sódio (NaAc) a 10 mM e ajustar 0 pH para cerca de 4,5 com ácido acético.
Redobramento e a purificação da proteína:
Solução de GdHCI a 6 M contendo 100 mg de proteína foi tratada com 67 μΙ de ditiotreitol (DTT) a 1 M e foi diluída para cerca de 67 ml com GdHCI a 6 M, NaAc a 10 mM, pH 4,5. Ela foi deixada se agitar à tempe118 ratura ambiente por cerca de uma hora. Ela foi então diluída em 4 L de glicerol a 20%, CaCI2 a 2,5 mM, Tris a 20 mM, tampão pH 8,4 com agitação. Depois da misturação adequada, a solução foi deixada à temperatura ambiente por cerca de 8 horas sem outra agitação. Então 2000 unidades de trombina bovina purificada (a partir de trombostato, um produto da ParkeDavis) foram adicionadas, e a solução foi deixada com agitação suave. Depois de 2,5 horas ela foi redosada com 2000 unidades de trombina e a divagem da histidina-tag foi continuada por mais 3 horas. A divagem de trombina foi controlada por adição de PMSF a uma concentração final de 0,1 mM. A solução foi filtrada e foi armazenada a 4°C.
A proteína clivada foi ulteriormente puf içada sobre a mesma
Figure BRPI9508596B1_D0296
coluna de IMAC como acima, foi equilibrada em KCI a 1 M, glicerol a 20%, HEPES a 20 mM, tampão de pH 8,4. Depois do carregamento da solução de proteína, ela foi lavada com o mesmo tampão e a proteína clivada foi eluída com KCI a 1 M, glicerol a 20%, imidazol a 40 mM, HEPES a 20 mM, pH 8,4.
Proteína não-clivada eluída em imidazol 0,2 M.
Proteína clivada purificada foi concentrada, foi tratada com EDTA a 50 - 100 mM, ferricianeto de potássio a 10 mM (para completar qualquer oxidação incompleta) e gel foi filtrado sobre uma coluna 16/60 su20 perdex 75. Rendimentos usando-se este procedimento aproximaram-se 50% do peptídeo de partida.
Uma vez purificada, a proteína expressa foi caracterizada por vários métodos. Caracterização física inclui dispersão de luz dinâmica para se determinar homogeneidade de estrutura e é usada como uma medição 25 de dobramento adequado. Dados de dispersão de luz indicam que o polipeptídeo de OB ser humano é expresso predominantemente ou exclusivamente como um monômero, enquanto o polipeptídeo de OB de murino pode ser formado como um dímero bem como um monômero.
Ensaios com reagente de Ellman e análise espectroscópica de massa confirmam que os resíduos de cisteína formam uma ligação de dissulfeto na proteína. Esta forma oxidada do polipeptídeo foi administrada a murinos, como descrita infra, e demonstrou atividade biológica.
Dicronismo circular foi usado para grosseiramente se determinar
Figure BRPI9508596B1_D0297
119 a geometria estrutural da proteína. Espectro de CD em um tampão fisiológico (pH cerca de 8, aproximadamente concentração iônica fisiológica) indica que o polipeptídeo de OB tem cerca de 60% de estrutura alfa-helicoidal e cerca de 40% de estrutura de espiral aleatória. O polipeptídeo de OB de murino foi encontrado ter cerca de 50% de alfa-hélice e 50% de espiral aleatória por espectroscopia de CD.
Proteólise limitada, seguida por espectrometria de massa (Co· hen e outros, 1995, supra) foi empregada para identificar porções do poli-
Figure BRPI9508596B1_D0298
Figure BRPI9508596B1_D0299
peptídeo de OB que são acessíveis à proteólise. Esta análise tem domonstrado a presença de uma estrutura de alça flexível de resíduos de aminoácidos 54 a 60 (como mostrado na figura 4). É provável que esta alça flexível ligue dois domínios de estrutura de 2o definidos, por exemplo, alfa-hélice.
Importantemente, como mostrado nos seguintes exemplos, bio atividade da proteína purificada foi analisada por administração da proteína tanto a roedores magros quanto a roedores obesos via uma bomba osmótica (por exemplo uma bomba osmótica ALZET da Alza Corporation, Paio
Alto, CA) ou por uma dose diária de bólus i.p. por um período de pelo menos duas semanas e efeitos sobre o comportamento de alimentação e sobre o peso de corpo foram observados.
Exemplo 8: Efeitos de Redução de Peso do Polipeptídeo de OB (Leptina)
Figure BRPI9508596B1_D0300
Figure BRPI9508596B1_D0301
O produto de gene do locus de OB de murino desempenha um importante papel na regulação de peso de corpo. O presente exemplo estabelece que a proteína de OB circula em plasma de murino, de rato e de ser humano. A forma circulante em todas as três espécies tem um peso mole cular idêntico por SDA-PAGE para a seqüência de polipeptídeo deduzida sem a seqüência de sinal, sugerindo que, in vivo, a proteína não é processada após divagem da seqüência de sinal. A proteína de OB estava ausente em plasma de murinos de C57/B16J de OB/OB e presente em con centrações dez vezes superiores em plasma de murinos de db/db e níveis vinte vezes superiores em plasma de ratos de fa/fa com relação a controles.
Sugere-se que esses mutantes de animais obesos são resistentes aos efeitos de OB. Houve diferenças de sete vezes em níveis de plasma da proteína de OB dentro de um grupo de seis indivíduos seres humanos magros. Inje-
Figure BRPI9508596B1_D0302
120 ções diárias da proteína de OB de murino recombinante reduziram dramaticamente a massa de corpo em murinos de OB/OB, tiveram efeitos significativos sobre peso de corpo de murinos do tipo selvagem e não tiveram qualquer efeito sobre os murinos de db/db. Esses dados sugerem que o produto 5 de gene do locus de OB serve a uma função endócrina para regular peso de corpo.
Materiais e Métodos
Coelhos foram imunizados com proteína recombinante em adjuvante de Freund (HRP, Inc.). Anticorpos de OB de anti-murino imunopurifi-
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Figure BRPI9508596B1_D0304
cados foram prepardos por passagem de anti-soro sobre uma coluna de sefarose 4B conjugada para a proteína recombinante como descrito [Harlow e outros., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)]. Imunoprecipitação de plasma de murino foi realizada como se segue: 0,5 ml de plasma de murino, rato e ser humano contendo EDTA a cerca de 2,5 mM foi pré-clarificado com sefarose
4B não conjugada à temperatura ambiente com oscilação por 2 horas. A sefarose foi removida por rotação e 50 ml de uma pasta fluida a 50% de sefarose conjugada a anticorpo contendo anticorpo purificado por afinidade a uma concentração de 1 mg/ml de sefarose condensada foram adiciona20 dos. Meio ml de um tampão de RIPA 2x foi adicionado para dar condições
Figure BRPI9508596B1_D0305
Figure BRPI9508596B1_D0306
de ligação final como se segue: Tris HCI a50 mM, pH 7,5, NaCI a 100 mM, NP-40 a 1%, SDS a 0,1% desoxicolato de sódio a 0,5% e 0,025% de azida de sódio. A reação foi realizada por toda a noite a 4°C com oscilação. A sefarose conjugada a anticorpo foi lavada 8 vezes usando tampão de RIPA, seguida por enxaguamento três vezes com PBS, e corrida sobre um SDSPAGE a 15%. As proteínas foram transferidas para nitrocelulose e submetidas a Western blotting com um anticorpo imunopurificado, biotinilado, contra a proteína recombinante. O anticorpo secundário usado foi HRP estreptavidina e usou-se ECL para detecção.
Para quantificar a quantidade de OB em soro de murino, quantidades crescentes da proteína de OB de murino recombinante redobrada (0,01, 0,1, 0,5, 2,0, 15,0 ng) foram adicionadas a 100 λ de plasma de C57BL/6J OB/OB e incubadas a 4°C por 3 horas dentro do anticorpo conju-
Figure BRPI9508596B1_D0307
121 gado a sefarose de proteína A. Após extensiva lavagem com tampão A (tampão de fosfato de sódio a 10mM, pH 7,4; NaCI a 100 mM; Triton X-100 a 1%, EDTA a 5 mM, PMSF a 1 mM), amostras foram ressuspensas em tampão de amostra, foram carregadas sobre um SDS-PAGE a 15% e foram 5 transferidas para uma membrana de nitrocelulose. Western blotting foi realizada usando um anticorpo de terminal de antíamino imunopurificado, biotinilado, como um anticorpo primário e HRP-estreptavidina como um anticorpo secundário, seguida por deteção de ECL.
Extratos citoplásmicos foram preparados por homogeneização
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Figure BRPI9508596B1_D0309
de tecido adiposo em tampão de NDS (Tris a 10mM, pH 7,5 NaCI a 10 mM, ICCI a 60 mM, espermina a 0,15 mM, espermidina a 0,5 mM, β mercaptoetanol a 14 mM, EGTA a a 0,5 m, EDTA a 2 mM, NP-40 a 0,5%) por politron e homogeneização dounce, e remoção de núcleos foi realizada por centrifugação a 700 g.
Imunoprecipitações foram realizadas como descrito acima exceto que foram usados anticorpos de OB de anti-ser humano imunopurificados. Para o ELISA, 100 ml de uma solução a 1mg/ml de anticorpo de OB de anti-ser humano imunopurificado foram dissolvidos em uma solução de PBS tamponada com borato e foram aplicados durante toda noite a placas de 20 microtitulação (Corning cat. ne 2595) a 4°C. As placas foram então lavadas
Figure BRPI9508596B1_D0310
Figure BRPI9508596B1_D0311
com solução salina de borato contendo 0,05% de Tween 20 e removeu-se líquido em excesso. Placas foram bloqueadas por incubação à temperatura ambiente por 2 horas com 240 ml por cavidade de tampão salino de borato contendo 0,3% de gelatina e então foram lavadas e foram secas. Ou quanti dades conhecidas de uma proteína de OB humana redobrada ou amostras de plasma em um volume de 100 ml foram incubadas em cavidades individuais por toda noite a 4°C. Depois de lavagem, as placas foram incubadas com 100 ml de um anticorpo de anti-ser humano imunopurificado, biotinilado (0,1 mg/ml em uma solução tamponada com gelatina-borato) por 4 horas à temperatura ambiente. Depois de lavagem, peroxidase de rábano silvestre (HRP)- estreptavidina foi adicionada às placas (0,1 mg/ml em tampão de borato, gelatina a 0,3%). Solução de substrato de HRP (ABTS, 0,3 mg/ml e H2O2, 0,01% em ácido cítrico) foi então usada para detecção e o O.D. foi
122 medido a 414 nM para quantificar a ligação de anticorpo.
As seqüências de codificação de gene de OB ser humano e de muríno foram apliadas por PCR a partir de plasmídeos contendo seqüências de cDNA de OB e foram subclonadas no plasmídeo pPIC.9 (Invitrogen).
O iniciador 5' ser humano usado era 5'GTATCTCTCGAGAAAAGAGTGCCCATCCAAAAAGTCCAAG 3' (SEQ ID Ne:34) no iniciador 3'era
5' GCGCGAATTCTCAGCACCCAGGGCTGAGGTC 3' (SEQ ID Ne:35).
Para murino, o iniciador 5'era
5* GTATCTCTCGAGAAAAGAGTGCCTATCCAGAAAGTCCAGG 3' (SEQ ID N2:36) e o iniciador 3' era
5' GCGCGAATTCTCAGCATTCAGGGCTAACATC 3' (SEQ ID N2:37).
O iniciador 5' tanto para murino quanto para o ser humano contém um sítio Xhol na extremidade de 5' e as seqüências de codificação para os últimos 4 aminoácidos da seqüência de sinal de fatores de acasalamento alfa presentes no vetor de pPIC.9. O vetor dirige secreção de genes heterologamente expresso a partir da célula nos meios de cultura. O iniciador de PCR de 5' também inclui os primeiros 19 nucleotídeos do quadro de leitura aberto de gene de OB depois do sítio de divagem de seqüência, antes da alanina na posição 21 de aminoácido. O iniciador 3' contém um sítio de EcoRI na sua extremidade 5', que é imediatamente seguido por seqüências complementares ao códon de parada de OB putativo. As condições de PCR foram como se segue: desnaturação por 1 min. a 94°C, cozimento por 1 min. a 55°C e extensão por 2,5 minutos a 72°C. PCR de baixo ciclo (15 ciclos) e PFU de polimerase de leitura de prova (Stratagene) foram usados para limitar numerosas mutação geradas por PCR. Os produtos de PCR foram digeridos com Xhol e EcoRI e foram clonados em vetor similarmente digerido, pPIC.9. Todos os construtos foram seqüenciados sobre ambos os filamentos para assegurar a ausência de quaisquer mutações geradas por PCR . Clones foram transformados em Pichia pastoris (His) pelo método esferoplasto e foram selecionados em meios deficientes de histidina. Cerca de 200 cio-
Figure BRPI9508596B1_D0312
123 nes seres humanos e de murinos foram separados para integração de alto número de cópias por um ensaio de hibridização de colônia. Os clones de alto número de cópias foram então analisados para a expressão de OB, inicialmente, por manchamento de Coomassie mostrando a presença de uma 5 nova proteína 16 kD presente nos meios de cultura de levedura transformada. A tira de 16 kD foi confirmada ser OB usando-se anticorpos criados contra a proteína de OB bacterialmente expressa. As proteínas recombinantes foram purificadas por um método de purificação de duas etapas descrito abaixo. Espectrometria de massa e tratamento de brometo de cianogê-
Figure BRPI9508596B1_D0313
nio foram realizados como descrito em Beavis e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87:6873 - 6877 (1990).
A seqüência de codificação de OB total dos genes de murino e ser humano C-terminal para a seqüência de sinal foi subclonada no vetor de expressão de pET15b (Novagen) e superexpressa em Escheríchia coli [BL21 (DE3)plYsS] usando-se o sistema de polimerase de RNA de T7 [Studier e outros, Meth. Enzymology, 185:80 - 89 (1990)]. Células desenvolvidas a 30°C para uma absorbência de 0,7 a 595 nM e induzidas com isopropil-βD-tiogalacto-piranosídeo a 0,5 mM de uma dia para o outro foram coletadas por centrifugação de baixa velocidade. Lise foi realizada por três ciclos de 20 congelamento e descongelamento e digestão de DNA foi realizada com
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Figure BRPI9508596B1_D0315
DNasel. Extração de membrana foi realizada por sonicação e solubilização de detergente, o pélete de corpo de inclusão final foi dissolvido em guanidina-HCI a 6 M, HEPES a 20 mM, pH 8,4. Proteínas de OB recombinantes foram purificadas sob condições de desnaturação por IMAC usando-se uma coluna de afinidade de íon de Ni e lavagem com aumento de quantidades de imidazol. Proteína de OB desnaturada, purificada foi então armazenada em guanidina-HCI a 6 M, acetato de sódio a 10 mM (NaAc), pH 5, e reduzida usando-se DTT a 1 mM à temperatura ambiente por 1 hora. Desnaturação foi realizada por diluição da proteína reduzida em glicerol a 20%, CaCI2 30 a 5 mM, NaAc a 5 mM, pH 5, através de misturação e de incubação à temperatura ambiente por 8-12 horas. Depois da desnaturação o pH foi ajustado para 8,4 por adição de Tris a 10 mM, e a etiqueta de hexa-histidina foi removida por divagem de trombina. Proteína clivada, renaturada foi repurifi-
Figure BRPI9508596B1_D0316
124 cada por IMAC para separar o produto a partir de proteína de fusão nãoclivada e trombina. Proteína renaturada, clivada elui a partir da coluna de afinidade de íon de Ni em imidazol a 40 mM, enquanto que trombina nãoretida e proteína de fusão não-clivada elui em imidazol a 0,2 mM. O produto 5 foi então concentrado, foi tratado com EDTA a 100 mM e ferricianeto de potássio a 10 mM e ulteriormente foi purificado por filtração de gel usandose coluna de Pharmacia superdex 75 16/16.
Um ensaio de Ellman foi conduzido como descrito em Ellman,
Arch, Biochem, Biophys, 82:70 - 77 (1959). Reagente de Ellman foi prepa rado por dissolução de 39,6 mg de 5,5'-ditio-bis(ácido 2-nitrobenzóico)
Figure BRPI9508596B1_D0317
(DTNB) em 10 ml de fosfato a 0,05 M, pH 8. Uma curva de calibração foi construída na faixa de concentração de 10 - 120 mM de sulfidrila livre a 412 nm (usando-se uma solução de estoque a 1 mM de DTT reduzido). Cada ensaio foi realizado usando-se 0,02 ml de reagente de Ellman e uma mistu15 ra reação total de 0,5 ml. Um coeficiente de extinção medido era de 12974 M'1 cm'1 para grupo de sulfidrila livre (coeficiente de correlação 0,99987), que está dentro de 5% do valor relatado anteriormente de 13600 M'1 cm'1.
Cinqüenta ml de 2 mg/ml de proteína filtrada de gel puro, correspondendo a uma possível concentração sulfidrila livre de cerca de 24 mM 20 na mistura de reação final, foi submetida a ensaio de Ellman. A solução resultante deu A412 de cerca de 0,02, sugerindo que os dois resíduos de cisteína na proteína estão em um estado oxidado formando cistina ou que seus grupos de sulfidrila livres estão completamente enterrados dentro do núcleo inacessível da proteína dobrada. Resultados idênticos foram obtidos por 25 condução do mesmo ensaio sobre proteína redobrada na presença de guanidina-HCI a 6 M.
Camundongos foram individualmente engaiolados em um ambiente livre de patógeno e foram aclimatados a uma dieta contendo 35% (p/p) de Laboratory Rodent Diet 5001 (PMP Feeds, Inc.), 5,9% (p/p) de mistura de 30 pudim de tapioca (General Foods) e 59,1% de água, que tem um teor de energia de 1,30 kcal/g. A dieta foi esterilizada por autoclave e foi embalada em pratos de plástico de 60 mm, que foram fixados aos topos de placas petri. A tapioca deu a dieta uma textura pastosa tornado-a difícil para o animal
Figure BRPI9508596B1_D0318
125 espalhar na gaiola. A tampa de 100 mm recupera a pequena quantidade de alimento espalhada pelo animal. Um prato novo de alimento foi colocado dentro da gaiola a cada manhã e o prato do dia anterior foi removido e foi pesado. A diferença em peso proveu uma medida de consumo de alimento 5 diário. Efeitos de proteína recombinante em ingestão de alimento e peso de corpo foram medidos em três cepas de camundogongos; C57BI/6J de OB/OB, C57 Bl/Ks de db/db e CBA/J +/+, adquiridas da Jackson Laboratory.
Trinta murinos de cada cepa foram divididos em grupos de 10. Um grupo de cada cepa recebeu diariamente injeções intraperítoniais (i.p.) da proteína de
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OB bacteriana redobrada em uma dose de 5 mg/g/dia em 300 μΙ de PBS. Um segundo grupo recebeu injeções i.p. do mesmo volume de PBS. Estes murinos de controle receberam injeções do dialisado de PBS da proteína recombinante. O PBS foi depurado de endotoxina usando-se uma coluna de
Acticlena ETOX. Um terceiro grupo de animais não recebeu injeções. A in15 gestão de alimento foi registrada diariamente e medições de peso corpo foram registradas regularmente durante um intervalo 3,5 semanas. Para experiência de alimentação aos pares, a ingestão de alimento de um grupo separado de murinos de OB foi comparada em uma base diária com aquela consumida pelos murinos que receberam proteína.
Resultados
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A Proteína de OB Circula em Plasma de Murino, de Rato e de Ser humano.
Proteína de OB humana e de murino recombinante foi preparada usando-se o vetor de expressão bacteriano pET 15b (Novagen) e por clonagem em Pichia pastoris, um sistema de expressão de levedura que secreta proteínas recombinantes diretamente dentro dos meios de cultura. A proteína de OB expressa em levedura inclui os 146 aminoácidos carbóxiterminais à seqüência de sinal. Coelhos foram imunizados com as proteínas bacterianas (HPR, Inc.). Anticorpos foram imunopurificados (Research Genetics) e foram usados para imunoprecipitações e Western blots de proteína de plasma e de tecido adiposo.
A proteína de OB de plasma de murino migra com um peso molecular aparente de 16 kD por SDS-PAGE. A mobilidade eletroforética é idêntica à proteína de OB recombinante secretada por levedura depois da
126 remoção de seqüência de sinal (figura 24A). A proteína não foi detectada em plasma de murinos C57BI/6J de OB/OB que têm mutação sem sentido no códon 105. Vários anti-soros diferentes falharam para identificar a cadeia de polipeptídeo de resíduo truncado 105 prevista pela seqüência de cDNA.
Um aumento de dez vezes no nível de proteína ciruclante foi observado em murinos de db/db em relação a um animal de controle (figura 24A). Imunoprecipitação de plasma de ratos de tipo selvagem e de fa/fa revelaram um aumento de 20 vezes no nível de proteína de OB no rato mutante em comparação com o tipo selvagem (figura 24B). Os resultados de
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mutação de db em um fenótipo obeso idêntico àquele visto em murinos de OB (Bahary e outros, 1990, supra). Ratos gordos são obesos como um resultado de uma mutação recessiva em um gene homólogo para db (Truett e outros, 1991, supra). A fim de quantificar o nível de OB em plasma de murino, aumentando quantidades de proteína recombinante foram adicionadas ao soro e foram imunoprecipitadas (figura 24C). Um aumento linear da intensidade de sinal em Western blot foi visto com o aumento de quantidades de proteína recombinante. Comparação da intensidade de sinal da proteína natural em plasma de murino para os padrões indicaram que o nível de proteína circulante de OB em murinos de tipo selvagem é cerca de 20 ng/ml.
Esses dados demonstram que as imunoprecipitações e os Western blots
Figure BRPI9508596B1_D0323
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foram realizados sob condições de excesso de anticorpo. Níveis aumentados da proteína de OB foram também vistos em extratos de proteína de tecido adiposo de murinos de db/db em relação a controles (Figura 24D). Como esperado para uma proteína secretada, a proteína do tecido adiposo se fracionou com a fração de membrana bruta (dados não-mostrados).
Amostras de plasma de seis indivíduos magros com um índice de Massa de Corpo de menos do que 25 (BMI = peso/comprimento2) foram imunoprecipitados usando-se anticorpos imunopurificados para a proteína humana. O material imunoprecipitado migrou com uma mobilidade eletrofo rética idêntica àquela vista para a proteína humana de 146 aminoácidos expressa em levedura. A intensidade dos sinais variou significativamente entre as seis amostras (Figura 25A). Densitometria da audio-radiografia revelou uma diferença de cerca de cinco vezes nos níveis em indivíduos de HP1 e
Figure BRPI9508596B1_D0325
127 de HP6, com níveis intermediários nos outros indivíduos. Um imunoensaio ligado a enzima (ELISA) foi desenvolvido usando o anticorpo imunopurificado e a proteína bacteriana redobrada como um padrão (ver abaixo). A curva padrão resultante está mostrada na Figura 25B. Usando este ensaio, os ní5 veis de plasma da proteína de OB nas seis amostras de plasma humano variaram entre 2-15 ng/ml (Figura 25C). O nível da proteína de OB de HP6 estava fora da faixa linear do imunoensaio e é igual ou inferior a 15 ng/ml. Essas diferenças quantitativas correlacionaram-se com aquelas vistas em Western blots.
Dados preliminares sugerem que leptina pode circular, pelo menos em parte, complexado a outra proteína ou proteínas. Essa conclusão foi
Figure BRPI9508596B1_D0326
baseada na heterogeneidade da forma da curva de titulação para soro comparada com padrão recombinante. Análise de uma grande quantidade de leptina imunopurificada sobre uma coluna de anti-OB de coelho por HPLC de filtração de gel sobre condições de desnaturação e de nãodesnaturação, com monitoração por ELISA e SDS-PAGE sugeriu que o polipeptídeo de OB comporta-se como um complexo de alto peso molecular. No entanto, esses dados permanecem preliminares; a proteína de ligação de OB, se existente, tem, no entanto, de ser caracterizada.
Características Estruturais da Proteína de OB
Uma vez que a proteína de OB tem dois resíduos de cisteína, ela pode formar ligações de dissulfeto ou intra- ou intermoleculares sob condições de oxidação in vivo. Western blots foram repetidos com e sem a adição de agentes de redução ao tampão de amostra. Sob ambas as condi25 ções, a proteína de OB em soro ser humano migrou como um monômero (dados não-mostrados). Sob condições de não-redução, proteína imunoprecipitada a partir de soro de murino de OB foi detectada em posições consistentes com aquela de tanto um monômero de 16 kD quanto de um dímero de cerca de 32 kD (Figura 26A). A porção de peso molecular superior desa30 pareceu sob condições de redução sugerindo que uma fração de OB de murino circula como uma espécie de peso molecular superior via formação de uma ligação de dissulfeto intermolecular. Cerca de 80% de OB de murino circula como a proteína de cerca de 16 kD e 20% como a forma de cerca de
Figure BRPI9508596B1_D0327
128 kD.
As mesmas formas moleculares são vistas quando as proteínas de murino e de ser humano são expressas em Pichia pastoris {Abrams e outros., Immunol. Rev., :5 - 24 (1992)}. Nesses estudos, a seqüência de
DNA correspondente à proteína de OB madura de 146 aminoácidos foi clonada a jusante da seqüência de sinal de fator de acasalamento alfa no vetor de pPIC.9 (Invitrogen). A proteína de OB foi purificada a partir dos meios de levedura de cepas que expressam as proteínas de murino e de ser humano e foi submetida a eletroforese sob condições de redução e de não-redução
Figure BRPI9508596B1_D0328
(Figura 26A). A proteína de murino foi expressa em levedura como um dímero sob condições de não-redução, e só como um monômero na presença de agentes de redução. A proteína humana recombinante migrou para a posição de um monômero sob ambas as condições (dados não-mostrados).
A proteína de ser humano não-purificada expressa em Pichia tinha uma massa molecular de 16.024 ± 3 Da como determinada por espectrometria de massa 1990 (Beavis, 1990, supra). Esse valor está de acordo com a massa calculada a partir da seqüência de aminoácidos da proteína contendo uma única ponte de dissulfeto intramolecular (16.024 Da). Análise, espectrométrica de massa de desabsorção a laser auxiliada por matriz, de 20 produtos de divagem de brometo de cianogênio a proteína indica que cis-
Figure BRPI9508596B1_D0329
Figure BRPI9508596B1_D0330
teínas 117 e 167 estão ligadas através de uma ponte de dissulfeto intramolecular (Figura 26B). Brometo de cianogênio cliva carboxiterminal a resíduos de metionina.
Preparação e Caracterização de Proteína Recombinante Bioativa
Proteína de OB de murino foi expressa em E. coli a partir de um plasmídeo de pET 15b como uma proteína de fusão insolúvel, com uma etiqueta de hexa-histidina, N-terminal, de 20 resíduos, etiqueta de N-terminal hexa-histidina), contendo um sítio de divagem de trombina. Corpos de inclusão bacteriana foram solubilizados usando guanidina - HCI e foram puri ficados sob condições de desnaturação usando cromatografia de afinidade de íon de metal imobilizado (IMAC) (Figura 27). Proteína de fusão desnaturada, purificada, foi reduzida, foi diluída e foi permitida se redobrar em solução aquosa à temperatura ambiente. Após divagem de trombina, proteína
Figure BRPI9508596B1_D0331
129 de OB de murino renaturada contendo quatro resíduos N-terminais adicionais (Gly-Ser-His-Met; SEQ ID NQ:38) foi repurificada por IMAC para homogeneidade superior a 98%, como julgado por SDS-PAGE e espectrometria de massa. Espectrometria de massa de dessorção a laser assistida por ma5 triz deu uma massa medida de 16.414±3 Da (massa estimada = 16.415 Da).
Tanto géis de SDS-PAGE de redução quanto de não-redução demonstraram uma única espécie molecular com peso molecular e aparente de 16 kD (dados não-mostrados).
Dispersão de luz dinâmica usando um Detetor de Tamanho
Figure BRPI9508596B1_D0332
Molecular DP801 (Protein Solutions, Inc.) demonstrou que a proteína de OB de murino renaturada era grandemente monomérica, com alguns agregados de ordem superior. A proteína foi tratada com EDTA e foi quimicamente oxidada. Espécies de peso molecular superior foram então removidas por filtração de gel. Ulterior dispersão de luz dinâmica confirmou que a proteína de OB de murino recombinante renaturada estava monodispersa. Após diálise contra salmoura tamponada por fosfato (PBS), endotoxina bacteriana foi removida usando uma coluna Acticlean ETOX (Sterogene Bioseparations,
Inc.). O rendimento final de proteína foi de 45 mg/l.
Ensaio de Ellman foi realizado sobre a proteína de OB de muri20 no recombinante renaturada, purificada, para avaliar seu estado de oxida-
Figure BRPI9508596B1_D0333
Figure BRPI9508596B1_D0334
ção (Ellman, 1959, supra). Tanto proteína renaturada quanto proteína não dobrada por HCI - guanidina a 6M demonstraram teor de sulfidrila livre infe rior a 0,5%, demonstrando que o produto monomérico contém uma ligação de dissulfeto intramolecular. Isso foi confirmado por espectrometria de mas sa dos produtos de divagem de brometo de cianogênio da proteína bacteriana redobrada (dados não-mostrados).
Bioatividade da Proteína de OB. A proteína de OB de murino recombinante renaturada, purificada, foi administrada como uma injeção intraperitoneal diária de 5 mg/kg/dia a grupos de murinos C57BI/6J de
OB/OB (idade, 16 semanas), C57BI/Ks de db/db (idade, 12 semanas) e CBA/J +/+ (idade, 8 semanas). Um número igual de animais receberam PBS como uma injeção diária. A PBS usada para controlar as injeções era derivada do dialisado depois de equilíbrio da proteína. Dez animais adicionais
130 oriundos das três cepas de murinos não recebram injeções. A ingestão de alimento de animais individuais foi monitorada diariamente e os pesos dos animais foram registrados em intervalos de três ou quatro dias. Os resultados cumulativos para ingestão de alimento e peso de corpo a partir de cada 5 um dos 9 grupos de murinos estão mostrados nas Figuras 28A até F, e a significância estatística dos dados está mostrada na Tabela 1. A ingestão de alimento dos murinos C57BI/6J de OB/OB injetados com proteína foi significativamente diminuída após a primeira injeção e continuou a diminuir até o quinto dia, quando ele se estabilizou em um nível igual a cerca de 40% da 10 ingestão dos animais que recebram injeções de PBS (p < 0,001). Os murinos de OB injetados com simulado não perderam peso durante o período de
Figure BRPI9508596B1_D0335
estudo de três semanas. Os murinos C57BI/6J de OB/OB que receberam proteína perderam cerca de 10% de peso de corpo depois de cinco dias (p <
0,001). Esses animais continuaram a perder peso durante o tratamento de três semanas em cujo ponto o peso dos animais de OB que receberam proteína tinha diminuído para uma média de 60% do seu peso de corpo inicial (p < 0,0001). Um grupo separado de murinos de OB foi alimentado aos pares para os murinos de OB que receberam proteína. Os dados na Figura 29B mostram que os murinos alimentados aos pares perderam significati20 vamente menos peso do que os animais que receberam a proteína recombinante (p < 0,02). Uma fotografia de dois murinos que receberam injeção ou de proteína ou de veículo mostra a grande diferença na aparência resultante do tratamento com proteína (Figura 29B). A fim de se determinar ulteriormente os efeitos da proteína, autópsias de dois murinos em cada um dos
Figure BRPI9508596B1_D0336
grupos foram realizadas. Inspeção grosseira dos murinos de OB que recebram proteína revelou uma diminuição dramática na gordura de corpo bem como no tamanho do fígado. Os pesos de fígado dos murinos de db e de murinos do tipo selvagem não foram alterados com o tratamento. Os fígados dos murinos de OB que receberam injeções de PBS pesaram 5,04 e 5,02 gramas versus 2,23 e 2,03 gramas nos animais que reberam a proteína recombinante. Em contraste com o fígado gordo pálido característico dos murinos de OB, o fígado dos murinos de OB que receberam proteína adquiriram a cor mais escura característica do fígado normal (Figura 29C). Seções
Figure BRPI9508596B1_D0337
131 histológicas do fígado indicam que os animais não-tratados tinham um fígado gordo que estava marcado melhorado em animais tratados com proteína (dados não-mostrados).
Em contraste com os murinos de OB, não houve diferenças si5 gnificativas no peso de corpo ou na ingestão de alimento nos murinos C57BL/Ks que receberam proteína em relação ao grupo de controle que recebeu veículo (Figuras 28A até F, Tabela 1). Todos os três grupos de murinos de db/db perderam entre 2 a 5 gramas durante o período de tratamento. A glicose média no sangue dos murinos de db foi medida usando um 10 glucômetro, e era superior ou igual a 500 mg/dl em todos os murinos indicando que esses animais tinham desenvolvido diabetes secundária à obesidade. As injeções dos murinos de db foram terminadas depois de duas se-
Figure BRPI9508596B1_D0338
Em murinos de tipo selvagem houve uma diminuição pequena 15 mas significativa no peso de corpo após a administração de proteína de OB recombinante (Figuras 28A - F, Tabela 1). Depois de cinco dias de injeção de proteína, os murinos tratados perderam uma média de 0,5 grama enquanto que os murinos de controle ganharam 0,4 grama (p < 0,02). Em dois pontos de tempo subseqüentes os animais que receberam proteína pesa20 vam significativamente menos do que os murinos que receberam injeções diárias de PBS. A significância de mudança de peso foi reduzida nos pontos de tempo posteriores. Nos animais que perderam peso, a ingestão de alimento não era significativamente diferente dos animais de controle. As injeções de PBS tiveram um efeito pequeno mas significativo sobre a ingestão
Figure BRPI9508596B1_D0339
de alimento e sobre o peso de corpo em murinos de OB, de db e do tipo selvagem quando comparados com murinos que não recebram injeções (p < 0,05).
132
Figure BRPI9508596B1_D0340
Tabela 1
Grupo de animal Grupo de tratamento Mudança de peso
Dias n Médio Erro padrão P
OB/OB veículo de proteína 1-5 10 9 -6,38000000 -0,14444444 0,47628190 0,24444444 <0,001
veículo de proteína 1-12 10 9 -14,4500000 0,988888889 0,70793126 0,38058597 <0,001
veículo de proteína 1-27 6 5 -24,2833333 4,300000000 0,69924563 0,79874902 <0,0001
db/db veículo de proteína 1-5 10 10 -,470000000 -2,00000000 0,36939891 0,23142073 0,240
veículo de proteína 1-12 10 10 -3,75000000 -4,19000000 0,77348418 0,34655447 0,610
CBA/J veículo de proteína 1-5 10 10 -0,48000000 0,380000000 0,17876117 0,21489015 0,006
veículo de proteína 1-12 10 10 0,120000000 1,200000000 0,45748103 0,18378832 0,015
veículo de proteína 1-27 5 6 1,980000000 2,233333333 0,48723711 0,20763215 <0,651
Discussão
Uma função endócrina para o produto de proteína do local de
OB foi sugerido por Coleman, o qual mostrou que o peso de corpo de muri5 nos de OB/OB foi reduzido depois de união parabiótica para murinos de db ou normais (Coleman e outros, 1978, supra). Os resultados indicados acima suportam esta hipótese por mostrar que a proteína de OB circula na corrente sanguínea e que injeções de proteína recombinante reduzem o peso de corpo. O peso molecular do produto gene codificado pela gene de OB é 10 cerca de 16 kD, que é igual as 146 seqüências de aminoácidos carbóxiterminais para a seqüência de sinal. A proteína recombinante de OB não é modificada quando expressa em Pichia pastoris. Expressão de genes de mamíferos em Pichia em geral resulta na formação da estrutura de proteína correta [Cregg e outros, Bio/Technology, 11:905 - 914 (1993)]. Estas cons-
Figure BRPI9508596B1_D0341
133 tatações sugerem que a proteína de OB não é glicosilada e não é póstraducionalmente processada in vivo. Os dados não excluem a possibilidade que a proteína de OB é não covalentemente ligada por ela própria ou por outras proteínas em plasma ou em tecido adiposo. Embora divagem proteo5 lítica da proteína não tenha sido excluída, formas de peso molecular mais baixos da proteína de OB não foram detectados por quaisquer dos antisoros usados, incluindo quatro anticorpos de antipeptídeo.
A proteína de OB tem dois resíduos de cisteína e circula como um monômero em ser humano, e como um monômero e um dímero em mu-
Figure BRPI9508596B1_D0342
rino. Uma ligação de dissulfeto intramolecular típica de moléculas secretadas é demonstrada quando a proteína humana é expressa em Pichia pastoris sugerindo que deve provavelmente estar presente in vivo. Isto é suportado pela bioatividade do proteína bacteriana recombinante, que tem uma ligação de dissulfeto intramolecular. A proteína de OB de murino pode ser encontrada em plasma como um monômero e como um dímero. O monômero e o dímero são vistos quando a proteína de OB de murino é expressa em levedura mostrando que a tendência da proteína de murino para formar um dímero é o resultado de diferenças na seqüência primária em relação ao homem. Embora esteja claro que o monômero tem bioatividade, a atividade funcional do dímero é desconhecida.
Figure BRPI9508596B1_D0343
Figure BRPI9508596B1_D0344
O efeito da proteína de OB sobre ingestão de alimento e peso de corpo em mu ri nos de OB é dramático. Depois de três semanas de tratamento, os murinos de OB que receberam injeções diárias de proteína recombinante tinham perdido 40% do seu peso e estavam consumindo 40% da quantidade de alimento os animais de controle. Além do mais, o peso dos murinos de OB tratados não tinha ainda equilibrado na época que a experiência terminou. Os resultados do par de experiência de alimentação indicam que a perda de peso é um resultado de efeitos sobre tanto a ingestão de alimento quanto de energia gasta. Assim, um grupo separado de murinos de OB cuja ingestão calórica foi restrita àqueles murinos de OB recebendo proteína, perderam significativamente menos peso do que os animais recebendo proteína. A redução na ingestão de alimento em murinos de OB/OB para um nível menor do que de murinos de tipo selvagem, dentro de um dia
134
It de recebendo a proteína de OB, indica que eles são especialmente sensíveis aos seus efeitos. De fato, o receptor de OB pode ser regulado para cima nestes animais. Ingestão de alimento de murinos de OB tratados tornou-se relativamente constante depois de cinco dias de tratamento. Se isto 5 é o resultado da proteína ter atingido níveis de estado constante, seria sugerido que a proteína tem uma meia-vida relativamente longa [The Pharmacological Basis of Therapeutics, págs. 19-45, Goodman e Gilman, eds., Pergamon Press, New York, (1990)]. Esta conclusão é consistente com os dados das experiências de parabiose [Coleman e outros, 1978, supra, Wei-
Figure BRPI9508596B1_D0345
gle, Int. J. Obesity, 12:567 - 578 (1988)].
Efeitos de proteína recombinante no peso de corpo de murinos de tipo selvagem foram pequenos mas estatisticamente significativos durante as primeiras duas semanas do estudo. Enquanto a diferença em peso entre os murinos de tipo selvagem recebendo proteína versus PBS foi sus tentado em pontos de tempo posteriores, a significância estatística dos dados grandemente diminuídos depois de três semanas. A perda de peso prematura podería não ser explicada por uma diferença em ingestão de alimento. Presumidamente, a medição de ingestão de alimento não foi precisa o bastante para detectar uma diminuição resultante em uma diferença de um grama em peso de corpo durante o tratamento. Estas observações diferem
Figure BRPI9508596B1_D0346
Figure BRPI9508596B1_D0347
se a partir dos resultados de experiências anteriores em que roedores foram unidos por união parabiótica para murinos de db, ratos de fa, ratos com le sões hipotalâmicas e ratos tornados obesos por uma dieta de alta caloria [Coleman e outros, 1978, supra; Harris e outros, 1978, supra, Harris e ou tros Physiological and metabolic changes in parabiotic partners of obese rats, em Hormones, Thermogenesis and Obesity, Lardy and Straatman, eds., Elsevier Science Publishing Co., New York (1989); Hervey, J. Physicol., 145:336 - 352 (1959]. Em cada caso os animais de tipo selvagem tornaram-se anoréticos e perderam quantidades copiosas de peso. Quando os níveis de proteína de OB são aumentados em murinos de db e em ratos de fa e o nível de RNA de OB é aumentado em murinos com lesões hipotalâmicas, é provável que murinos de tipo selvagem possam responder a OB quando ele circula em plasma e um nível suficientemente alto. As constata
Figure BRPI9508596B1_D0348
135 ções relatadas aqui são consistentes com a possibilidade que os níveis da proteína administrada eram abaixo dos níveis endôgenos, levando ao equilíbrio de um peso de corpo levemente menor. Quantificação dos níveis de circulação da proteína de OB nos murinos tratados resolverá esta questão.
Embora um imunoensaio da proteína de murino não esteja ainda disponível, imunoprecipitações sugeriram que os níveis da proteína circulante de OB não eram substancialmente elevados nos murinos de tipo selvagem recebendo proteína.
O menor efeito da proteína em murinos de tipo selvagem e au-
Figure BRPI9508596B1_D0349
sência de uma resposta em murinos de db torna-se improvável que o tratamento tenha efeitos não-específicos ou adversos. Todos os murinos de db perderam uma quantidade pequena de peso durante o período de tratamento, se ou não eles estivessem recebendo a proteína de OB. Os animais de db eram marcadamente hiperglicêmicos e a perda de peso deve prova velmente ser o resultado de diabetes e não o protocolo experimental. Muri nos de C57BL/Ks de db/db freqüentemente desenvolvem diabetes e começam a perder quantidades pequenas de peso quando tem a idade dos ani mais usados neste estudo (Coleman e outros, e outros, 1978, supra). Murinos de C57BL/Ks de OB/OB de uma idade similar não desenvolveram hi perglicemia significativa. Estas diferenças fenotípicas são pensadas serem
Figure BRPI9508596B1_D0350
Figure BRPI9508596B1_D0351
o resultado de diferenças genéticas nas cepas (C57BIJ versus C57BI/Ks) portanto as mutações (Coleman e outros, 1978, supra).
A falha para detectar a proteína de 105 de aminoácidos truncada prevista pela seqüência de cDNA do gene de OB em murinos de
C57BI/Ks de OB/OB sugere que a proteína mutante é ou degradada ou não é traduzida. No entanto, a posibilidade que os anti-soros usados para nãodetectar esta proteína truncada não pode ser excluída. O aumento dez vezes observado nos níveis da proteína de OB em murinos de db em comparação com tipo selvagem sugere que a proteína de OB é superproduzida quando há resistência a seus efeitos. Estes dados correlacionam-se com estudos do mRNA de OB. Como mencionado, experiências anteriores têm mostrado que mutações dos genes de db de murino e de fa de rato, que mapeam as regiões cromossomiais homólogas, resultam em superprodução
136 de um fator de plasma que suprime peso de corpo (Truett e outros, 1991, supra: Coleman, 1978, supra, Hervey, 1959, supra). Em ambos os casos, foram sugeridos que os animais mutantes são resistentes aos efeitos da proteína de OB. Isto possivelmente é confirmado pela observação que a 5 proteína de OB não tem efeito sobre o peso de corpo ou sobre a ingestão de alimento quando administrada a murinos de db.
Obesidade em seres humanos podería estar associada com níveis aumentados da proteína de OB em plasma em indivíduos que são relativamente não-responsivos ao hormônio. Por outro lado, expressão reduzida
Figure BRPI9508596B1_D0352
de OB podería também levar a obesidade caso esse em que níveis normais (isto é, inapropriadamente baixo) da proteína devem ser encontrados. Assim, os níveis de proteína de OB em plasma ser humano poderia ser um marcador para diferentes formas de obesidade. Em um pequeno grupo de indivíduos magros com BMI < 25, níveis baixos de nanograma de circulação de proteína de OB são detectáveis por ELISA. Significativamente, concentrações variáveis foram observadas sugerindo que o nível de expressão e/ou sensibilidade à proteína pode desempenhar um papel na determinação de peso de corpo.
O sítio de ação da proteína de OB é desconhecido. A proteína afeta tanto a ingestão de alimento quanto a energia gasta, uma constatação
Figure BRPI9508596B1_D0353
Figure BRPI9508596B1_D0354
consistente com estudos clínicos indicando que alterações de ambos os sistemas atuam para regular peso de corpo [Leibel e outros, N. Engl. J.
Med., 332:621 - 628 (1995); Keesey e outros, Metabolic defense of the body weight set-point, em Association for Research in Nervous and Mental
Disease, págs. 87 - 96, Stunkard and Stellar, eds., Raven Press, New York. (1984)]. O hipotálamo deve provavelmente ser a justante de OB na trajetória que controla peso de corpo, embora efeitos diretos sobre uma variedade de órgãos sejam possíveis.
Exemplo 9: Expressão Aumentada em Adipócitos de RNA de OB em Muri nos com Lesões do Hipotálamo e com Mutações no Local de db
O produto de gene do gene de obeso de murino recentemente clonado (OB) desempenha um papel importante na regulação da massa de tecido adiposo. RNA de OB é expresso específicamente por adipócitos e
Figure BRPI9508596B1_D0355
137 murino in vivo em cada um dos diferentes depósitos de células préadipócitas que foram induzidas a diferenciar. Murinos com lesões do hipotálamo, bem com murinos mutantes no local de db, expressam um nível vinte vezes maior de RNA de OB em tecido adiposo. Estes dados sugerem que tanto o gene de db quando o hipotálamo são a jusante do gene de OB na trajetória que regula a massa de tecido adiposo e são consistentes com as experiências anteriores sugerindo que o local de db codifica o receptor de OB. Nos murinos de db/db e lesionados, diferenças quantitativas no nível de expressão de RNA de OB correlacionadas com o teor de lipídio de adi10 pócitos. As moléculas que regulam o nível de expressão do gene de OB em adipócitos são prováveis a desempenhar um papel importante na determi-
Figure BRPI9508596B1_D0356
nação de peso de corpo, como são as moléculas que mediam os efeitos de OB em seu sítio de ação.
Materiais e Métodos
Hibridizacão in situ
Tecidos de gordura branca de regiões abdominais idênticas de murinos de tipo selvagem e de db foram processados simultaneamente de acordo com o método modificado descrito por Richardson e outros, Growth, Development & Aging, 56:149 - 157 (1992). Resumidamente, tecidos foram 20 fixados em solução de Bouin por 2 horas a 4°C. Eles foram então hibridizados por tratamento em série de aumentar concentrações de etanol de 10% para 100%, cada um por 5 min. a 4°C. Outra incubação de tecidos com xileno (1 h) e parafina (2 h) foram realizadas a 65°C. Tecidos de gordura de db/db e de wt assentados foram seccionados e foram montados pelas mes25 mas condições anteriores. Seções foram cozidas a 65°C por 1 hora e foram tratadas com xileno e diluições em série de etanol de 100% para 50%, cada uma por 3 min. à temperatura ambiente. Uma sonda de RNA de sem sentido de gene de OB foi sintetizada por transcrição in vitro de sequência de codificação de gene de OB llnearizado a montante de um promotor de polimera30 se de RNA de Sp6. Hibridização in situ foi realizada exatamente de acordo com Schaeren-Wiemers e outros., Histochemistry, 100: 431 - 440 (1993). Preparação de RNA e Cultura de Células
RNA total e Northern blots foram preparados como descrito.
138
Células vasculares estromais e adipócitos foram preparadas de acordo com Rodbell, e RNA de ambas as frações foram preparadas de acordo com Dani e outros., Mol. Cell. Endocrinol., 63: 199 - 208 (1989); Rodbell, J. Biol. Chem. 239: 375 - 380 (19 ). Depois de subclonagem, células de 3T3-F442 5 foram desenvolvidas em meio de Eagle modificado contendo soro bovino fetal a 10% (definido como meio padrão) [Dani e outros., Molecular biology techniques in the study of adipocyte differentiation, em Obseity in Europe, vol. 88, págs. 371 - 376, Bjorntorp and Rossner, Eds., John Libbey Company
Ltd., Londres, Inglaterra) (1989)]. Em confluência, células foram tratadas em
Figure BRPI9508596B1_D0357
meio padrão suplementado com triiodotironina (T3) a 2 nM e insulina a 17 nM. Doze dias depois, RNA foi preparado como acima.
Tratamento de Tioglicose de Ouro
Murinos de CBA/J fêmeas com dois meses de idade foram tratados com uma única injeção intraperitoneal de aurotioglicose (Sigma Catalog 15 ne A0632) em uma dose de 0,2 mg/g em salmoura normal. Animais de controle foram injetados com salmoura normal. Murinos foram pesados um mês depois do tratamento. RNA de tecido adiposo foi isolado a partir daqueles animais tratados cujo peso tinha aumentado mais do que 20 gramas póstratamento de GTG.
Resultados
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O gene de OB recentemente demonstrou ser expresso em tecido adiposo [Zhang e outros., Nature, 372: 425 - 432 (1994)]. Uma vez que o tecido adiposo é composto de muitos tipos de célula incluindo adipócitos, preadipócitos, fibroblastos e células vasculares, hibridização in situ foi realizada para seções de almofadas de gordura epidimal oriundas de animais normais com ribossondas de OB de sentido e de sem sentido [Richardson e outros., 1992, supra; Wasserman, “The concept of the fat organ em Rodahl,
Issekutz, fat as a tissue, págs. 22 - 92, McGraw Hill, Nova Iorque (1964)].
Quando do uso da sonda de sem sentido, sinais positivos eram detectáveis em todos os adipócitos na seção (Figura 30 - rotulado Wt). Sinais não eram notados quando a sonda sem sentido foi hibridizada para seções de cérebro (dados não-mostrados). Hibridização da sonda de sem sentido para seções de tecido adiposo de murinos de C57BI/Ks de db/db foi grandemente au139 mentada, confirmando a expressão de RNA de OB e demonstrando um grande aumento no nível de RNA de OB por adipócito nesses animais (Figura 30 - marcado de db/db). Murinos mutantes no local de db são maciçamente obesos como parte de uma síndrome que é fenotipicamente idêntica 5 àquela vista em murinos de C57BI/6J de OB/OB (Bahary e outros., 1990, supra).
RNA de OB não foi sintetizado por células estromais de tecido adiposo separadas a partir de adipócitos. Como esperado, células na fração de adipócito expressou RNA de OB usando Northern blots (Figura 31). O
Figure BRPI9508596B1_D0360
mesmo resultado foi obtido usando-se RT-PCR (dados não-mostrados). Esses dados suportam a conclusão de que apenas adipócitos expressam o gene de OB. Dados de adipócitos cultivados confirmam essa conclusão. Nesses estudos, células de 3T3-F442A foram cultivadas usando condições que levam à acumulação de lipídio, como parte de um programa celular que leva à diferenciação em adipócitos. RNA de OB não foi expresso em células de crescimento exponencial, nem em células de pré-adipócito de 3T3F442A, que expressam marcadores precoces, enquanto que diferenciação dessas células levou à expressão de níveis detectáveis de RNA de OB (Figura 31). [Dani e outros., J. Biol. Chem., 264: 10119- 10125 (1989). O nível 20 de RNA de OB é extremamente sensível às condições de cultura, uma vez
Figure BRPI9508596B1_D0361
Figure BRPI9508596B1_D0362
que nenhuma mensagem foi observada tardiamente, células pósconfluentes não expostas à insulina.
Estudos de hibridização mostraram que o RNA de OB é expresso in vivo em diversos depósitos de gordura diferentes incluindo as almofadas de gordura epididimais, parametriais, abdominais, peri-renais e inguinais (Figura 32A). O nível preciso de expressão em cada um dos depósitos foi um pouco variável, com gordura inguinal e parametrial expressando níveis inferiores de RNA de OB. RNA de OB é também expresso em tecido adiposo marrom, embora o nível de expressão seja cerca de 50 vezes infe30 rior em gordura marrom em relação aos outros depósitos de tecido adiposo. Essas diferenças quantitativas correlacionam-se soltamente com diferenças anteriormente relatadas em tamanho de célula entre diferentes depósitos de célula de gordura [Johnson e outros., J. Lipid Res., 13: 2 - 11 (1972)]. A
140 quantidade de RNA de OB em gordura marrom não é afetada por exposição a frio (Figura 32B). Nessa experiência, o nível de RNA de proteína de OB (UCP) aumentou em gordura marrom depois de exposição a frio ao passo que o nível de RNA de OB não mudou [Jacobson e outros., J. Biol. Chem., 5 260: 16250 - 16254 (1985)]. Em agregado, esses dados confirmam que todos os adipócitos são capazes de produzir RNA de OB e demonstram um nível variável de expressão em diferentes depósitos de gordura. Esses dados suportam a possibilidade de que o nível de proteína codificada correlaciona-se com a massa de tecido adiposo total.
Figure BRPI9508596B1_D0363
Níveis de RNA de OB em murinos de db/db e murinos com lesões do hipotálamo foram medidos. Lesões do hipotálamo ventromediais (VMH) resultam em obesidade como parte de uma síndrome semelhante àquela vista em murinos de OB/OB e de db/db [Bray e outros., Metabolism,
24: 99 - 117 (1975)]. Experiências de parabiose sugerem que lesões resul tam em superexpressão de um fator de origem sangüínea que suprime in gestão de alimento e peso de corpo (Hervey, 1959, supra}. Resultados similares são notados quando murinos mutantes no local de db são parabiosados para murinos normais, sugerindo que o receptor de OB pode ser codificado pelo local de db (Coleman e outros, 1978, supra}. Assim; obesidade resultante de lesões de VMH e a mutação de db pode ser o resultado de
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Figure BRPI9508596B1_D0365
resistência aos efeitos da proteína de OB. Se assim for, um aumento secun dário nos níveis de RNA de OB em tecido adiposo seria previsto.
Lesões do hipotálamo foram induzidas em murinos de CBA fêmeas usando a tioglicose de ouro (GTG) [Debons e outros., Fed. Proc., 36: 143- 147 (1977)]. Esse tratamento resulta em lesões do hipotálamo específicas, principalmente no hipotálamo ventromedial (VMH) com o subseqüente desenvolvimento de obesidade dentro de diversas semanas. Usualmente, uma única injeção intraperitoneal de GTG de 0,2 mg/g de peso de corpo resulta no desenvolvimento de obesidade dentro de quatro semanas. Muri30 nos de CBA/J fêmeas de um mês de idade (20 - 25 gramas) foram tratados com GTG e o subseqüente ganho de peso de animais tratados e animais de controle é mostrado (Tabela 2). RNA de tecido adiposo foi preparado a partir de murinos de db/db e a partir daqueles animais tratados com GTG que
Figure BRPI9508596B1_D0366
141 ganharam mais de 20 gm. Northern blots mostraram um aumento de 20 vezes no nível de RNA de OB em murinos tratados com GTG e murinos db/db de dois meses de idade em comparação com animais normais (Figura 33).
Tabela 2. Ganho de peso em murinos tratados com tioglicose de ouro
Controle ín = 41) GTG ín = 93)
< 10g 41, (100%) 4, (4%)
10g-20g 0, (0%) 15, (16%)
>20g 0, (0%) 74, (80%)
Murinos de CBA/J fêmeas de dois meses de idade foram trata10 dos com tioglicose de amarelo-ouro (GTG). Tioglicose de ouro (Sigma
Figure BRPI9508596B1_D0367
A0632) foi administrada intraperitonealmente em solução de salmoura normal a uma dosagem de 2,0 mg/g. Peso de corpo de animais de controle e de animais injetados foi registrado antes e depois de um mês depois da injeção. Animais foram alojados em cinco em uma gaiola e foram alimentados ad libitum. A quantidade de peso ganho um mês depois da injeção está mostrada na tabela 2. Animais com um ganho de peso de corpo superior a g um mês depois da injeção foram selecionados para ulterior estudo.
Discussão
O produto de gene de OB de murino circula em plasma de muri no e em plasma ser humano onde ele pode agir para regular a massa de tecido adiposo. Estudos ulteriores sobre a regulação de expressão e mecanismo de ação de OB terão importantes implicações para o nosso entendimento do caminho fisiológico que regula o peso de corpo.
O presente Exemplo mostra que o produto de gene de OB é ex-
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presso exclusivamente por adipócitos em todos os depósitos de tecido adiposo. Esse resultado é consistente com a possibilidade de que o produto de proteína do gene de OB correlaciona-se com as reservas de lipídio do corpo. Além do mais, RNA de OB é regulado para cima 20 vezes em murinos de db e murinos com lesões de hipotálamo. Nesses animais, o aumento real no nível de RNA de OB por célula é provável de ser ainda superior a vinte vezes uma vez que o tamanho de célula de adipócito é aumentado de cerca de 5 vezes nesses animais (ver Figura 30) (Debons e outros., 1977, supra). Esses dados posicionam o gene de db e o hipotálamo a jusante de OB no
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142 caminho que controla o peso de corpo e é consistente com a hipótese de que o receptor de OB está codificado no local de db [Coleman e outros., Diabetología 14: 141 - 148 (1978)]. A clonagem molecular do receptor de OB e/ou do gene de db resolverão esta questão. O aumento do nível de 5 RNA de OB em murinos de db/db e tratados com GTG também sugere uma função não-autônoma de célula do gene de OB em células de gordura [Ashwell e outros., Proc. R. Soc. Lond., 195: 343 - 353 (1977); Ashwell e outros., Diabetología, 15: 465 - 470]. Assim, se a proteína codificada atuou diretamente sobre células de gordura para inibir crescimento ou diferencia10 ção, a ultra-expressão do gene de OB do tipo selvagem em murinos tratados com GTG resultaria em um fenótipo magro.
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A explicação mais parcimoniosa desses dados é de que a proteína de OB funciona como molécula sinalizadora endócrina que é secretada por adipócitos e age, direta ou indiretamente, sobre o hipotálamo. Efeitos diretos sobre o hipotálamo requeririam que existissem mecanismos para perimitir a passagem do produto de gene de OB através da barreira de cérebro ao sangue. Mecanismos envolvendo o órgão circunventricular e/ou transportadores específicos o acesso ao cérebro de uma molécula do tamanho daquela codificada pelo gene de OB [Johnson e outros., FASEB J., 7:
678 - 686 (1983); Baura e outros., J. Clin. Invest., 92: 1824 - 1830 (1993);
Pardridge, Endocrine Reviews, 7: 314 - 330 (1986)]. No entanto, a hipótese precisa ser considerada com cuidado até que tenha sido identificado o meio pelo qual a proteína possa cruzar a barreira de cérebro ao sangue. Além do mais, possíveis efeitos sobre os outros órgãos alvos precisarão ser avalia25 dos.
Os sinais (sinal) de célula de gordura que são responsáveis pela variação quantitativa no nível de expressão do gene de OB não são ainda conhecidos mas se correlacionam com diferenças no tamanho de célula de adipócito. Adipócitos a partir de murinos de db/db são cinco vezes 30 tão grandes quanto aqueles a partir de murinos normais, com um tamanho de célula de cerca de 1,0 gg de lipídio/célula (Johnson e outros, 1972, supra). Evidência anterior indicou que o teor e/ou o tamanho de célula de gordura é um importante parâmetro na determinação de peso de corpo [Faust e
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143 outros, Am. J. Physiol., 235: 279 - 286 (1978); Faust e outros., Science, 197: 393 - 396 (1977)]. Poderia ser que cada célula de gordura expresse um baixo nível de RNA de OB que ulteriormente aumenta em proporção com o tamanho de célula. É também possível que o tamanho de célula não seja o 5 parâmtero sentido mas sim meramente se correlacione com o sinal intracelular que aumenta a expressão do gene de OB em adipócitos de murinos de db/db e lesados em VMH. Em qualquer caso, os componentes do caminho de transdução de sinal que regula a síntese de RNA de OB são prováveis de ser importantes na determinação de peso de corpo. Influências genéticas
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e ambientais que reduzem o nível de expressão de OB agiríam para aumentar o peso de corpo, como o fariam influências que diminuíssem a sensibilidade à proteína codificada. As moléculas específicas que regulam o nível de expressa do gene de OB são até agora desconhecidas, e esperam uma determinação do(s) nível (níveis) de controle de gene que leva à varia15 ção quantitativa no nível de RNA de OB, e um exame dos elementos reguladores do gene de OB. A identificação das moléculas que regulam a expressão do gene de OB em adipócitos, e daquelas que mediam os efeitos da proteína codificada em seu(s) sítio(s) de ação, aumentarão grandemente o nosso entendimento dos mecanismos fisiológicos que regulam o peso de
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corpo.
Exemplo 10: Padrão de Expressão de RNA e Mapeamento sobre os Mapas Físicos, Citoqenéticos e Genéticos do Cromossoma 7
RNA de OB é expresso em altos níveis em tecido adi poso ser humano, e em níveis substancial mente inferiores em placenta e coração. O gene de OB ser humano mapeia para um grande contig de cromossoma artificial de levedura (YAC) derivado de cromossoma 7q31.3. Além de confirmar a localização relativa do gene com base no mapeamento comparativo de murino - ser humano, este estudo identificou 8 marcadores microssatélites estabelecidos em íntima proximidade física com o gene de OB ser hu30 mano. Uma vez que mutações em OB de murino podem resultar em uma síndrome que se assemelha intimamente com a obesidade mórbida em seres humanos, esses marcadores genéticos representam importantes ferramentas para o estudo do possível papel do gene de OB em formas herda144 das de obesidade humana.
Materiais e Métodos
Análise de Northern blot
RNA total foi preparado a partir de tecido adiposo usando o método de Chirgwin e outros., Biochem., 18: 5294 - 5299 (1979). Northern blots, radiorrotulação, e hibridizações foram realizadas como descrito (Zhang e outros., 1994, supra). Northern blots de RNA dé polyA+ (MTN ser humano, MTN ser humano II, e MTN fetal ser humano II) foram obtidos a partir de CLONETECH (Paio Alto, CA), como o foram iniciadores de PCR usados para gerar a sonda de actina humana radiorrotulação. Desenvolvimento de STS
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Ensaios de PCR específicos de sítio etiquetado por seqüência (STS) foram desenvolvidos e otimizados essencialmente como descrito [(Green e outros., PCR Methods Applic., 1991; Green e outros., Genomics ,
11: 548 - 564 (1991); Green, Physical mapping of human chromosomes:
generation of chromosome-specific sequence-tagged sites, em Methods in
Molecular Genetics Vol. 1, Gene and Chromosome Analysis (Part A), págs.
192 - 210, Adolph ed., Academic Press, Inc., San Diego (1993); Green e outros., Hum. Mol. Genet., 3: 489 - 501 (1994)]. Cada STS é nomeado usando o prefixo 'sWSS' seguido por um único número. Detalhado acerca dos 19 STSs reportados aqui são providos na Tabela 3, com informação adicional (por exemplo, condições de reação de PCR, seqüência de DNA completa) disponíveis em GenBank e/ou Genome Data Base (GDB). Para os STSs específicos de microssatélite, os iniciadores de oligonucleotídeos 25 usados nos ensaios de PCR (Tabela 3) correspondiam ou àqueles empregados para análise de genótipo (Tabela 4) ou àqueles projetados (a maior parte freqüentemente com o programa de computador OSP) [Hillier e outros,
PCR Methods Applic., 1: 124 - 128 (1991)] usando a seqüência de DNA disponível em GenBank. A tabela 3 ilustra STSs no contig de YAC contendo o gene de OB ser humano.
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146
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SWSS1751 D7S2186 Extremi- CCAAAATCAGAATTGTCA- 186 55 G00-455-238
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147
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148
Os 19 STSs específicos de cromossoma 7 mapeados para o contig de YAC contendo o gene de OB ser humano (figura 35) são listados. Em cada caso, o nome de sWSS designado, pseudônimo relevante, nome de local determinado por GBD, fonte de STS, seqüências de iniciado5 res de PCR, tamanho de STS, e número de identificação de GDB são indicados. As fontes de STSs são como se segue: Extremidade de YAC (extremidade de inserto isolado de um YAC) (Green, 1993, supra), Clone lambda (clone lambda de específico cromossoma 7 aleatório) (Green e outros, 1991 supra; Green, 1993, supra), Marcador genético) (marcador de 10 microssatélite, ver tabela 2) (Green e outros, 1994, supra), Inserto de YAC
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(segmento aleatório de inserto de YAC), e Gene (STS de específicogene ). Observe-se, que para alguns STSs específicos de marcador genético, os iniciadores de PCR usados para a identificação de YACs (listados nesta tabela) são diferentes daqueles usados para realizar análise de genótipo (tabela 4), uma vez que a detecção de YACs contendo um marcador genético não necessita de ampliação do próprio trato polimórfico. Todos os ensaio de PCR indicados utilizaram uma temperatura de anelamento de 55°C, exceto para sWSS1174, sWSS883, sWSS1529, e sWSS2619 (que usaram
50°C), SWSS999 e sWSS1174 (que usado a 60°C), e sWSS808 (que usado a 65°C). Detalhes adicionais referentes aos esaios de PCR de STS específicos estão disponíveis em GDB.
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149
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Tabela 4
Marcadores de microssatélites no contig de YAC contendo o gene de OB ser humano.
Nome de mar- Tipo Local Iniciadores SEQ ID Ne: GDB ID NQ cador
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150
Oito marcadores de microssatélites mapeados ao contig de
YAc contendo o gene de OB ser humano (figura 35) são listados. Em cada caso, o nome de marcador (indicado como o pseudônimo na tabela 3), tipo de pedaço de mícrossatélite (tetranucleotídeo-Tetra1 repetição ou (CA)n 5 repetição), nome de local atribuído a GDB, seqüências de iniciadores utilizadas para análise de genótipo com base em PCR, e número de identificação de GDB são indicados. Detalhes adicionais referentes a ensaios de PCR e os polimorfismos estão disponíveis em GDB.
O STS específico de OB ser humano (sWSS2619) foi projetado
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usando-se a seqüência de DNA obtida a partir da região 3' não-traduzida do cDNA. O STS específico de Pax4 de ser humano (sWSS808) foi desenvolvido usando-se a seguinte estratégia. Iniciadores de oligonucleotídeos específicos para o gene de Pax4 de murino (GGCTGTGTGAGCAAGATCCTAGGA) (SEQ ID Ne:63) e (GGGAGCCTTGTCCTGGGTACAAAG (SEQ ID Ne:93) [Walther e outros, Genomics 11:424 - 434) (1991)] foram usados para ampliar um fragmento de 204 bp de DNA genômico ser humano (que era o mesmo produto de tamanho que aquele gerado de DNA genômico de murino). Este ensaio de PCR não era adequado para identificar YACs correspondentes, uma vez que um produto de similaridade de tamanho (200 bp) foi também amplificado a partir de DNA de levedura. No entanto, análise
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Figure BRPI9508596B1_D0477
de seqüência de DNA do produto de PCR gerado de DNA ser humano revelou substituições em 20 posições entre as 156 bases analisadas (dados não-mostrados). Usando-se esta seqüência humana não específica, um novo iniciador (TTGCCAGGCAAAGAGGGGTGGAC) (SEQ ID N2:64) foi projetado e usado como o primeiro dos iniciadores de pax4 específico acima (ver tabela 3). O ensaio de PCR de Pax4 específico ser humano não ampliou um produto significativo de DNA de levedura e foi assim usado para identificar YACs correspondentes.
Identificação de YACs por separação com base em PCR
A maior parte de YACs mostrados na figura 35 foram derivados de uma coleção de clones altamente enriquecidos para DNA de cromossoma 7 ser humano (recurso de YAC de cromossoma 7) (Green e outros, 1995, supra) usando-se estratégia de separação com base em PCR [Green
151 e outros, 1995, supra; Greena e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87:1213 - 1217 (1990)]. Em poucos casos, clones foram isolados por separação com base em PCR (Greena e outros, 1990, supra) de bibliotecas de YAC genômicos ser humano totais disponíveis contruídos em CEPH [Dausset e ou5 tros, Behring Inst. Mitt, 91:13 - 20 (1992); Albertsen e outros, Proc. Natl.
Acad. Sei. USA, 87:4256 - 4260 (1990)] ou ICI [Anand e outros, Nucl. Acids. Res., 17:3425 - 3433 (1989); Anand e outros, Nucl. Acids Res. 18:1951 1956 (1990)]. Cada YAC é chamado usando-se o prefixo “yWSS seguido por um único número.
Resultados e Discussão
Exame da expressão de tecido do gene de OB por análise de Northern blot revelou que RNA de OB é expresso em um alto nível em tecido adiposo ser humano e níveis muito baixos na placenta e no coração (figura 34). O tamanho do RNA (cerca de 4,5 kb) era equivalente em ser hu15 mano e em murino bem como em cada um dos tecidos de expressão. Nestes estudos, sinais cinco vezes maiores foram vistos em 10 gg de RNA de tecido adiposo total, como em 2 gg de RNA placental de poliA+. Um sinal cinco vezes menor foi visto em RNA de poliA+ de coração em comparação com a placenta. É estimado que o nível de RNA de OB é cerca de 250 ve20 zes menor na placenta do que no tecido adiposo. Nesta experiência, RNA de OB não foi detectado em quaisquer dos tecidos analisados, incluindo cérebro, pulmão, fígado, músculo esquelético, rim, e pâncreas. Experiências adicionais não revelaram RNA de OB no baço, timo, próstata, testículo, ovário, intestino delgado, cólon, leucócitos de sangue periférico ou no cérebro 25 fetal, fígado ou rins (dados não-mostrados. É possível que OB seja expresso em um nível não-detectável (por análise de Northern blot) nestes últimos tecidos ou em outros tecidos que não foram estudados. O padrão observado de expressão em ser humano difere um tanto de murino, em que RNA de OB é detectado quase exclusivamente em tecido adiposo.
Mapeamento comparativo da região de gene de OB nos qenomornas ser humano e de murino. O gene de OB de camundongo é localizado no cromossoma 6 proximal em uma região homóloga com uma porção de cromossoma 7q ser humano. Genes dentro deste segmento incluem (de
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152 proximal para distai): protooncogene de Met, regulador de condutância de transmembrana de fibrose cística (Cftr), gene 4 contendo caixa emparelhada (Pax4), de OB, e de carboxipeptidase A (Cpa) (Zhang e outros, 1994, supra, Friedman e outros, 1991, supra). No murino, mapeamento genético foi usa5 do para demonstrar que Pax4 é fortemente ligado a OB [Walther e outros, 1991, supra, Zhang e outros, 1994, supra]. A distância física entre OB e Pax4 demonstrou ser cerca de um par de megabase (Mb) (Zhang e outros, 1994, supra). Com base nestes estudos de mapeamento comparativos, era esperado que o gene de OB ser humano residiría entre Pax4 e CPA no cro10 mossoma 7q. Além do mais, uma vez que CFTR ser humano [Heng e outros,
Cell Genet., 62:108 - 109 (1993)] e Pax4 [Tamura e outros, Cytogenet. Cell Genet., 66:132 - 134 (1994)] foram mapeados por fluorescência de hibridízação in situ (FISH) para 7q31,3 e 7q32, respectivamente, a posição citogênica mais provável do gene de OB ser humano seria na proximidade do li15 mite de 7q31.3-q32.
Mapeamento de gene de OB no cromossoma ser humano 7
Um STS (sWSS2619) ampliando um pequeno segmento da região 3' não-traduzido do gene de OB ser humano foi usado para separar uma coleção de clones de YAC que é altamente enriquecida para DNA de 20 cromossoma ser humano 7 (Green e outros, 1995a, Genomics 25:170 183), e 9 YACs foram identificados (yWSS691, yWSS1332, yWSS1998, yWSS2087, yWSS3319, yWSS3512, yWSS4875, yWSS4970 E yWSS5004). Para verificar que estes YACs contêm o gene de OB ser humano autentico, duas experiências foram realizadas. Primeiro, cada um dos 25 YACs foi testado com um segundo ensaio de PCR de OB específico ser humano, e todos demostraram ser positivos (dados não-mostrados). Segundo, o DNA de levdura de cada clone foi digerido com EcoRI e foi analisado por hibridização de transferência de gel, usando-se uma sonda derivada de cDNA de OB. Em todos os exemplos, uma tira de hibridização única foi vis30 ta; e esta tira era do mesmo tamanho nos YACs e um clone de P1 conhecido conter o gene de OB ser humano (dados não-mostrados).
Usando-se um programa de computador SEGMAP (Green and Green, 1991, supra e outros dados de teor de STS com base em YAC que
153 foi gerado para o cromossoma 7 (Green e outros, 1991, supra; Green e outros 1994, supra; Green e outros, 1995, supra), o gene de OB ser humano foi encontrado por residir dentro do contig de YAC mostrado na figura 35. Específicamente, este contig consiste em 43 YACs em sobreposição e 19 5 STSs igualmente ordenados. Detalhes sobre cada um dos 19 STSs são providos na tabela 3. Além do STS de OB específico, o contig” também contém um STS (sWSS808) específico para o gene de Pax4 (Tamura e outros, 1994, supra, Stapleton e outros, 1993, Nature Genet. 3:292 - 298), 7 STSs derivado de YACs de cromossoma 7 específico, 2 STSs derivado de 10 clones lambda de cromossoma 7 específico, e, importantemente, 8 STSs de microssatétilite específico. Detalhes adicionais sobre estes 8 marcadores genéticos, incluindo as seqüências de iniciadores usados para análise de genótipo são providos na tabela 2. Notavelmente, há conectividade com base em YAC redundante através de todo o contig (isto é, há 2 ou mais 15 YACs ligando cada par adjacente de STSs), dando forte suporte para a ordem relativa de STSs mostrado na figura 35.
Como mostrado na figura 35, a orientação prevista do contig de YAC contendo OB ser humano é tal que sWSS1734 é o STS mais centromérico (isto é, mais próximo a CFTR) enquanto que sWSS2367 é o STS 20 mais telomérico (isto é, mais próximo a CPA ). Esta orientação é predominantemente baseados dados de mapeamento comparativo, que coloca Pax4 proximal e OB distai dentro do bloco sintético presente em DNA de murino e ser humano (Zhang e outros, 1994, supra). O gene de OB mapeia perto da extremidade telomérica do contig, na colocação do STS de específico OB 25 (SWSS2619).
Enquanto o contig” mostrado na figura 35 foi deduzido por SEGMAP sem consideração de tamanhos de YAC (desse modo exibindo STSs equidistante uns dos outros), uma análise similar dos dados para SEGMAP que representaram tamanhos de YAC indicaram que o tamanho 30 total da região coberta pelo contig é quase cerca de 2 Mb (dados nãomostrados). Assim, enquanto todos os 8 STSs específicos de microssatélite (Tabela 4) são contidos dentro de um intervalo genômico alcançando grosseiramente 2 Mb, o 3 mais próximo à extremidade telomérica do contig
Figure BRPI9508596B1_D0479
154 (sWSS1392, sWSS1148, e sWSS2367) são particularmente perto do próprio gene de OB (talvez dentro de um intervalo tão pequeno quanto cerca de 500 kb). De fato, todos os 3 dos últimos STSs estão presentes em pelo menos 1 do YACs contendo OB ser humano. Notavelmente, o intervalo en5 tre Pax4 (sWSS808) e OB (sWSS2619) ser humano é estimado ser cerca de 400 kb, enquanto que esta região foi prevista para alcançar cerca de 1
Mb em murino (Zhang e outros, 1994, supra). Finalmente, 3 dos YACs dentro do contig (yWSS691, yWSS999, e yWSS2935) foi também analisado por FISH, e cada um foi encontrado para hibridizar exclusivamente para
7q31,3. Um destes YACs (yWSS691) contém o STS específico de OB, en-
Figure BRPI9508596B1_D0480
quanto os outros 2 clones contêm o STS específico de Pax4 .
Os últimos resultados são em geral consistentes com a designação citogenética anterior de Pax4 ser humano para 7q32 (Tamura e outros, 1994, supra). Com base nos dados, o gene de OB ser humano pode ser atribuído à tira citogenética 7q31.3.
Exemplo 11: Polipeptídeo de OB Ser humano é Biologicamente Ativo em
Murinos
Grupos de 10 murinos de OB/OB foram tratados por injeção i.p. com 10 gg/g/dia de polipeptídeo de OB de murino e ser humano (bacteria20 no) recombinante ou salmoura. Depois de 4 dias, o grupo recebendo sal-
Figure BRPI9508596B1_D0481
moura ganhou 0,3 g. O grupo recebendo OB de murino perdeu 3,2 g. O grupo recebendo OB ser humano perdeu 2 g (p < 0,01 em comparação com os controles de salmoura). Estes grupos foram também testados quanto à ingestão de alimento. Os dados para ingestão de alimento são mostrados na tabela 5; os dados para massa de corpo são mostrados na tabela 6.
Figure BRPI9508596B1_D0482
Figure BRPI9508596B1_D0483
155
Tabela 5
Ingestão de alimento/dia (g) de murinos de OB/OB tratados(valor +/- desvio padrão)
Tratamento Dia 0 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7
Salmoura 13,4± 2,6 12,8 12,8 13,1 14,0 12,3 12,4 8,3
OB de murino 14,9 3,7 4,4 5,1 8,9 8,1 8,7 3,5
OB de ser hu- mano 14,3 10,3 8,7 7,0 8,9 5,3 3,8 13,0
Tabela 6
Figure BRPI9508596B1_D0484
Peso de corpo e mudança de peso nos murinos de OB/OB tratados (valor +/- desvio padrão)
T ratamento Peso de corpo (dia 0) Peso de corpo (dia 4) Mudança em percentagem (dia 0 a 4) Peso de corpo (dia 6) Mudança em percentagem (dia 0 a 6)
Salmoura 39,9± 1,8 40,7± 1,6 0,8±0,5 41,1± 2,2 1,2±1,1
OB de murino 39,5± 2,1 36,2± 2,0 -3,3±1,2 36,3± 2,2 -3,1±1,2
OB de ser hu- mano 39,5± 2,0 37,6± 1,7 -2,0±1,0 36,1± 1,3 -3,5±1,3
Estes dados demonstram que OB ser humano é biologicamente ativo em murinos.
Exemplo 12: Uma Alta Dose de OB Afeta Murinos de Tipo Selvagem
Murinos de tipo selvagem (C57BI6J +/?) foram tratados com 10 gg/g/dia i.p. de OB de murinos recombinantes, e massa de corpo foi medida todos os quatro dias. Os resultados são mostrados na tabela 7.
Tabela 7
Massa de Corpo (g) de murinos normais recebendo OB
T ratamento Dia 0 Dia 4 Dia 8 Dia 12 Dia 16
Salmoura 22,6±1,4 22,2±1,2 22,5±1,3 23 22,5
OB de murino 22,4±1,5 20,6±1,5 20,8±1,3 20,8 21,8
156
Estes dados demonstram que OB afeta a massa de corpo de tipo selvagem bem como murinos obesos (OB/OB), embora para um grau muito menor.
Exemplo 13: Polipeptídeo de OB Administrado por Infusão de Bomba Contí5 nua
Este exemplo demonstra que infusão contínua de polipeptídeo de OB resulta em perda de peso em murinos normais. Murinos normais (não obesos) foram administrados polipeptídeo de OB de murinos via infusão de bomba osmótica. Uma dosagem de 0,5 mg de proteína/kg de peso de cor10 po/dia resultou em uma perda de 4,62% (+/- 1,34%) de peso de linha de base pelo sexto dia de infusão.
Figure BRPI9508596B1_D0485
Materiais e Métodos
Animais
Murinos de C57B16 (+/+) de tipo selvagem foram usados neste exemplo. Murinos foram alojados sozinhos, e foram mantidos sob condições humanas. A idade dos murinos no ponto de tempo inicial era de 8 semanas, e os animais tinham peso estabilizados. Dez murinos foram usados para cada grupo (veículo versus proteína).
Alimentação e Medição de Peso
A murinos foi dada comida moída para roedores (PM! Feeds,
Inc.) em alimentadores de alimento em pó (Allentown Caging and Equipament), que permitiam uma medição mais correta e sensível de ingestão de alimento do que o uso de comida regular de blocos. Peso foi medido na mesma hora a cada dia (2:00 da tarde), por um período de 6 dias. Peso de corpo no dia anterior da infusão foi definido como peso de linha de base.
Clonagem de DNA de OB de murinos
A clonagem de DNA de OB de murinos para expressão de E. coli foi realizada como se segue. A seqüência de DNA como deduzida a partir da seqüência de peptídeos que apareceu em (Zhang e outros, 1994, 30 supra, isto é, exemplo 1, surpra) foi traduzida de modo reverso usando códons ótimos de E. coli. Os sítios de clonagem terminais eram Xbal a BamHI. Um aumentador de ligação ribossomal e um sítio de ligação ribossomal forte foram incluídos em frente da região de codificação. A seqüência de DNA
Figure BRPI9508596B1_D0486
157 dúplex foi sintetizada usando-se técnicas padrão. Clones corretos foram confirmados por demonstração de expressão da proteína recombinante da presença da seqüência de DNA de OB correta no plasmídeo residente. A seqüência de aminoácidos (e seqüência de DNA) é como se segue:
DNA de OB de met de murino recombinante e seqüência de
Figure BRPI9508596B1_D0487
aminoácidos (SEQ ID NeS:94 e 95):
TCTAGATITGAGTTTTAACTTTTAGAAGGAGGAATAACATATGGTACCGATCCAGAAAGT
- +.........+ -....... +---------+---------+68
AGATCTAAACTCAAAATrGAAAATCTTCCTCCTTATTGTATACCATGGCTAGGTCTTTCA
MVPIQKVTCAGGACGACACCAAAACCTTAATTAAAACGATCGTTACGCGTATCAACGACATCAGTCA 69 -+........-+---------+ ----·- +------·--♦ 128
AGTCCTGCTGTGGTTTTGGAATTAATTTTGCTAGCAATGCGCATAGITGCTGTAGTCAGT
QDDTKTLIKTIVTRIND1SHCACCCAGTCGGTCTCCGCTAAACAGCGTGTTACCGGTCTGGACTTCATCCCGGGTCTGCA 129 ·+...... +.........+........-+188
GTGGGTCAGCCAGAGGCOATTTGTCGCACAATGGCCAGACCTGAAGTAGGGCCCAGACGT
TQSVSAKQRVTGLDFIPGLHCCCGATCCTAAGCTTGTCCAAAATGGACCAGACCCTGGCTGTATACCAGCAGGTGTTAAC
189 -+-----------------------------+.........+.........+248
GGGCTAGGATTCGAACAGGTTTTACCTGGTCTGGGACCGACATATGGTCGTCCAGAAITO PILSLS KMDQTLA VYQQVLT CTCCCTGCCGTCCCAGAACGTTCTTCAGATCGCTAACGACCTCGAGAACCTTCGCGACCT
249 -+.........+... +--------------+..... _+---3Q3
GAQGGACGGCAGGGTCTTGCAAGAAGTCTAGCGATTGCTGGAGCTCTTGGAAGCGCTGGA
S L P s Q NVLQIANDLENLRDL -
GCTGCACCTGCTGGCATTCTCCAAATCCTGCTCCCTGCCGCAGACCTCAGGTCrrCAGAA
309 - + -----+.........+ -....... +--·368
CGACGTGGACGACCGTAAGAGGTTTAGGACGAGGGACGGCGTCTGGAOTCCAGAAGTCTT
L H L L A FSK. SCSLPQTSGLQK-
ACCGGAATCCCTGGACGGGGTCCTGGAAGCATCCCTGTACAGCACCGAAGTTGTTGCTCT
369 -+---...............-+ 428
TGGCCTTAGGGACCTGCCCCAGGACCTTCGTAGGGACATGTCGTGGCTTCAACAACGAGA
P B S L D GVLEASLYSTEVVAL -
GTCCCGTCTGCAGGGTTCCCTrCAGGACATCCTTCAGCAGCTGGACGTTTCTCCGOAATG
429 - +---------+--------- ----------+---------+---------+ - 488
CAGGGCAGACGTCCCAAGGGAAGTCCTGTAGGAAGTCGTCGACCTGCAAAGAGGCCTTAC
S R L Q G SLQDILQQLDVSPEC-
TTAATGGATCC
489 -+.........
AATTACCTAGG
Vetor de Expressão e Cepa de Hospedeiro
O vetor de expressão de plasmídeo usado para produzir a proteína foi pCFM1656, American Type Culture Collection (ATCC) número de
Figure BRPI9508596B1_D0488
158 acesso 69576. O DNA acima foi ligado no vetor de expressão pCFM1656, que foi linearizado com Xbal e BamHI, e foi transformado na cepa de hospedeiro de E. coli, Fm5, células de FM5 de E. coli foram derivadas em
Amgen Inc., Thousand Oaks, CA de cepas de K-12 de E. coli [Bachmann e 5 outros, Bacteriol, Rev. 40:116 - 167 (1976)] e contêm o gene repressor de fago de lambda integrado, cl857 [Sussman e outros, C.R. Acad. Sei., 254:1517 - 1579 (1962)]. Produção de vetor, transformação de célula, e seleção de colônia foram realizadas por métodos padrão, por exemplo, Sambrook e outros, 1989, supra. Células de hospedeiro foram desenvolvidas em meio de LB.
Figure BRPI9508596B1_D0489
Administração de Proteína ou Veículo
Polipeptídeo de OB de murino recombinante foi usado para as presentes experiências, em geral em uma concentração de 0,9 mg/ml de salmoura tamponada por fosfato, pH 7,4. A seqüência de aminoácidos (e seqüência de DNA ) usada é indicada imediatamente acima. Proteína e veículo (salmoura tamponada por fosfato, pH 7,4) foram administrados por infusão de bomba osmótica. Minibombas osmóticas de Alzet (Alza, Paio Alto, CA, modelo ne 1007D) foram cirurgicamente colocadas em cada murino em uma bolsa subeutânea na área subescapular. As bombas foram calibradas para administrar 0,5 ml de proteína em solução por hora para um dosagem
Figure BRPI9508596B1_D0490
de 0,5 mg de proteína/kg de peso de corpo/dia. Animais de controle foram infundidos com salmoura tamponada por fosfato (pH 7,4) via uma minibomba osmótica de Alzet.
Processo de Fermentação. Um protocolo de fermentação de três fases conhecido com um processo de batelada alimentada foi usado para
Figure BRPI9508596B1_D0491
preparar a proteína. Composições médias são indicadas abaixo.
Batelada. Uma fonte de fosfato e de nitrogênio foi esterilizada (por aumento da temperatura para 122°C por 35 minutos, 1,26 - 1,4 kg/cm2 (18-20 psi)) no recipiente de fermentação (Biolafitte, capacidade de 12 li30 tros). Depois de resfriamento, fontes de carbono, de magnésio, de vitaminas e de metal em traços foram adicionadas assepticamente. Uma cultura de um dia para o outro (16 horas ou mais) das bactérias produzindo proteína de murino recombinante de 500 ml (desenvolvida em caldo de LB) foi adiciona-
Figure BRPI9508596B1_D0492
159 da ao fermentador.
Alimentação I. Depois de se atingir entre 4,0 - 6,0 de O.D.eoo, Alimentação I foi adicionada às culturas. A glicose foi adicionada em uma taxa de limitação a fim de se controlar a taxa de desenvolvimento (μ). Um 5 sistema automatizado (chamado de Sistema de Controle Distribuitivo) foi programado para se controlar a taxa de desenvolvimento em 0,15 gerações hr'1.
Alimentação II. Quando o O.D. atingiu 30, a temperatura foi lentamente aumentada para 42°C e a alimentação foi mudada para a Ali10 mentação II, descrita abaixo. A fermentação foi então permitida continuar
Figure BRPI9508596B1_D0493
por 10 horas com amostragem a cada 2 horas. Depois de 10 horas, o conteúdo do fermentador foi resfriado para abaixo de 20°C e foi colhido por centrifugação.
Composição dos Meios
15 Batelada: 10 g/l
5,25 g/l 3,5 g/l 4,0 g/l 5,0 g/l
• 20 1,0 g/l 2,0 ml/l 2,0 ml/l 1,0 ml/l
Alimentação I: 50 g/l
• 25 50 g/l 450 g/l 8,75 g/l 10 ml/l 10 ml/l
30 Alimentação II: 200 g/l
100 g/l
110 g/r extrato de levedura (NH4)2SO4 K2HPO4
KH2PO4 glicose
MgSO4.7H2O
Solução de vitamina
Solução de Metal em Traços
Antiespuma P2000 Bacto-triptona Extrato de levedura
Glicose
MgSO4.7H2O
Solução de vitamina
Solução de metal em traço Bacto-triptona
Extrato de levedura
Glicose
Solução de vitamina (Batelada, Alimentação I): 0,5 g de biotina,
Figure BRPI9508596B1_D0494
160
0,4 g de ácido fólico, e 4,2 g de riboflavina, foi dissolvida em 450 ml de água e 3 ml de NaOH a 10 N, e foi levada para 500 ml com H2O. Quatorze gramas de piridoxina-HCI e 61 gramas de niacina foram dissolvidos 150 ml de água e 50 ml de NaOH a 10 N, e foram levados para 250 ml com água. Qua5 renta gramas de ácido pantotênico foram dissolvidos em 200 ml com água, e foram levados para 250 ml. As três soluções foram combinadas e foram levadas para 10 litros de volume total.
Solução de Metal em Traços (Batelada, Alimentação I):
Cloreto férrico (FeCI3.6H2O): 27 g/l
Cloreto de Zinco (ZnCI2.4H2O): 2 g/l
Cloreto de cobalto (CoCI2.6H2O): 2 g/l
Molibdato de sódio (NaMo04.2H20): 2 g/l
Cloreto de cálcio (CaCI2.2H2O): 1 g/l
Sulfato cúprico (CuSO4.5H2O): 1,9 g/l
Ácido bórico (H3BO3): 0,5 g/l
Cloreto de manganês (MnCI2.4H2O): 1,6 g/l
Dihidrato de citrato de sódio: 73,5 g/l
Processo de purificação para polipeptídeo de OB de murino
Purificação foi realizada pelas seguintes etapas (a não ser que de outra maneira observado, as seguintes etapas foram realizadas a 4°C):
Figure BRPI9508596B1_D0495
Figure BRPI9508596B1_D0496
1. Pasta de célula. Pasta de célula de E. coli foi suspensa em volume de 5 vezes de 7 mM de EDTA, pH 7,0. As células no EDTA foram ulteriormente quebradas por duas passagens através de um microfluidizador. As células quebradas foram centrifugadas em 4,2 rpm por 1 hora em um centrífuga de Beckman JB-6 com um rotor de J5-4.2.
2. Lavagem de corpo de inclusão ne 1. O sobrenadante de acima p. 155 foi removido, e o pélete foi ressuspenso com volume de 5 vezes de EDTA a 7 mM, pH 7,0, e foi homogeneizado. Esta mistura foi centrifugada como na etapa 1.
3. Lavagem de corpo de inclusão n2 2. O sobrenadante de cima foi removido, e o pélete foi ressuspenso em volume de 10 vezes de Tris a mM, pH 8,5, DTT a 10 mM, e desoxicolato a 1%, e foi homogeneizado. Esta mistura foi centrifugada como na etapa 1.
Figure BRPI9508596B1_D0497
161
4. Lavagem de corpo de inclusão n- 3. O sobrenadante de cima foi removido, e o pélete foi ressuspenso em volume de 10 vezes de água destilada, e foi homogeneizado. Esta mistura foi centrifugada como na etapa 1.
5. Redobramento. O pélete foi redobrado com 15 volumes de
HEPES a 10 mM, pH 8,5, sarcosina de sódio a 1% (N-lauril sarcosina), à temperatura ambiente. Depois de 60 minutos, a solução foi produzida para ser sulfato de cobre a 60 mM, e então foi agitada de um dia para o outro.
6. Remoção de sarcosina. A mistura de redobramento foi diluída com 5 volumes de tampão de Tris a 10 mM, pH 7,5, e foi centrifugada como
Figure BRPI9508596B1_D0498
na etapa 1. O sobrenadante foi coletado, e foi misturado com agitação por uma hora com resina Dowex 1-X4, 20 - 50 mesh, forma de cloreto (em volume total de 0,066% de mistura de redobramento diluída). Esta mistura foi despejada em uma coluna e o eluente foi coletado. Remoção de sarcosina foi determinada por HPLC.
7. Preparação de ácido. O eluente da etapa anterior foi coleta- do, e o pH foi ajustado para 5,5, e foi incubado por 30 minutos à temperatu ra ambiente. Esta mistura foi centrifugada como na etapa 1.
8. Cromatografia de troca de íons. O pH do sobrenadante da etapa anterior foi ajustado para 4,2, e foi carregado sobre Fluxo Rápido de
Figure BRPI9508596B1_D0499
sefarose CM (CM Sepharose Fast Flow). Vinte volumes de coluna de gradiente de sal foram usados em NaOAc a 20 mM, pH 4,2, NaCI a 0 M até 1,0
M.
9. Cromatografia de HIC. A combinação de CM sefarose de fra- ções de pico (determinada a partir de análise de ultravioleta) da etapa aci-
Figure BRPI9508596B1_D0500
ma foi ajustada a ser sulfato de amônio a 0,2 M. Um gradiente de sal reverso de 20 volumes de coluna foi feito em NaOAc a 5 mM, pH 4,2, com sulfato de amônio a 0,4 M a 0 M. Este material foi concentrado e foi díafíltrado em
PBS.
Resultados
Apresentados abaixo são as diferenças em por cento (%) do peso de linha de base em murinos C57BI6J (8 semanas de idade)
Tabela 8
Figure BRPI9508596B1_D0501
162
Perda de Peso na Infusão Contínua
Tempo (dias) Veículo (PBS) Polipeptídeo de OB re-
combinante
dias 1-2 3,24+/-1,13 1,68+/- 1,4
dias 3-4 4,3 +/- 0,97 -2,12+/- 0,79
dias 5-6 4,64 +/- 0,96 -4,62+/- 1,3
Figure BRPI9508596B1_D0502
Como pode ser visto, no final de um regime de infusão contínua de 6 dias, animais recebendo o polipeptídeo de OB perderam acima de 4% de seu peso de corpo, quando comparado com a linha de base. Isto é uma perda de peso substancialmente mais rápida do que foi observado com injeção intraperitoneal (i.p.). Perda de peso de apenas 2,6 - 3,0% foi vista no final de um período de injeção de 32 dias, em murinos de tipo selvagem (normais), com injeções de i.p. diárias de polipeptídeo de OB de murino recombinante em uma dose de 10 mg/kg, e não tinham mais do que 4% em qualquer tempo durante a escala de dosagem (dados não-mostrados). Os dados presentes indicam que com infusão contínua, uma dosagem 20 vezes menor (0,5 mg/kg versus 10 mg/kg) consegue mais perda de peso em um período mais curto.
Os resultados vistos aqui são estatisticamente significativos, por exemplo, -4,62% com p < 0,0001.
Exemplo 14: Clonagem e Expressão de um Análogo de Polipeptídeo de OB ser humano Recombinante
Este exemplo provê composições e métodos para a preparação de um análogo de versão recombinante ser humana do polipeptídeo de OB.
A versão humana de DNA de OB foi construído do DNA de murinos, como no exemplo 13, acima, por substituição da região entre os sítios de Mlul e BamHI com DNA dúplex (produzido de oligonucleotídeos sintéticos) em que 20 substituições de códon tinham sido projetadas. Códons para arginina em posição madura de murino 35 e leucina em posição madura de murino 74, foram inalterados. O sítio de Mlul é mostrado sob a linha sólida na sequência abaixo. Este DNA foi posto dentro do vetor pCFM 1656 (ATCC ne de acesso 69576), na mesma forma que a proteína de murino recombinante, como descrito abaixo.
Figure BRPI9508596B1_D0503
163
Sequência de DNA (filamento duplo) de OB de met ser humano recombinante e de aminoácidos(SEQ ID NeS: 96 e 97)
CATATGGTACCGATCCAGAAAGTTCAGGACGACACCAAAACCTTAATrAAAACGATCGTT
------+_ -----ψ, ....... .4.. ....... .ψ. .......-4.. ....... .φ gQ
GTATACCATGGCTAGGTCTTTCAAGTCCTGCTGIGGTTTTGGAATTAATTTTGCrAGCAA
MVPIQKVQDDTKTLIKTIV
Figure BRPI9508596B1_D0504
acgcgtatcaacgacatcagtcacacccagtcggtgagctctaaacagcgtgttacaggc
TGCGCATAGTTGCTGTAGTCAGTGTGGGTCAGCCACTCGAGATTTGTCGCACAATGTCCG TRINDISHTQSVSSKQRVTG CTGGACTTCATCCCGGGTCTGCACCCGATCCTGACCTTGTCCAAAATGGACCAGACCCTG
121...................♦..............................+ 180
GACCTGAAGTAGGGCCCAGACGTGGGCTAGGACTGGAACAGGTITTACCTGGTCTGGGAC LDFIPGLHP ILTLSKMDQT1 GCTGTATACCAGCAGA.TCTTAACCTCCATGCCGTCCCGTAACGTTCTTCAGATCTCTAAC
181.........+.........+.........+.........+.........+.........+240
CGACATATGGTCGTCTAGAATTGGAGGTACGGCAGGGCATTGCAAGAAGTCTAGAGATTG avyqq.iltsmpsrnvlqisn GACCTCGAGAACCTTCGCGACCTGCTGCACGTGCTGGCATTCTCCAAATCCTGCCACCTG
241 ......... .--+........-+--.......+.........+.........+300
CTGGAGCTCTTGGAAGCGCTGGACGACGTGCACGACCGTAAGAGGTTTAGGACGGTGGAC DLENLRDLLHVLAFSKSCHL CCATGGGCTTCAGGTCTTGAGACTCTGGACTCTCTGGGCGGGGTCCTGGAAGCATCCGGT
301 -........+---------+------ +------------+ -------.»+ 36Q
GGTACCCGAAGTCCAGAACTCTGAGACCTGAGAGACCCGCCCCAGGACCTTCGTAGGCCA PWASGLETLDSLGGVLEASG TACAGCACCGAAGTrGTTGCTCTGTCCCGTCTGCAGGGTTCCCTTCAGGACATGCTTTGG
361 -......-- + -..------- ----------+.... .-+---------+ 42Q
ATGTCGTGGCTTCAACAACGAGACAGGGCAGACGTCCCAAGGGAAGTCCTGTACGAAACC
YSTEVVALSRLQGSLQDMLW CAGCTGGACCTGTCTCCGGGITGTTAATGGATCC
421......... +.........+-... 454
GTCGACCTGGACAGAGGCCCAACAATTACCTAGG
QLDLSPGC*
Fermentação
Figure BRPI9508596B1_D0505
A fermentação das células de hospedeiro acima para produzir polipeptídeo de OB ser humano foi realizada usando-se as condições e as composições como descritas acima para material de murino recombinante. Os resultados foram analisados para fornecer (gramas/litro), pré-purificação, do material de OB ser humano recombinante (e quantidades menores de 10 proteína bacteriana), e foram correlacionados para analisar expressão bacteriana:
Figure BRPI9508596B1_D0506
164
Tabela 9
Análise de Expressão de Polipeptídeo de OB Ser humano
Ponto de tempo OD (@600 nm) Rendimento Expressão
(g/D (mg/OD-L)
Ind. + 2 horas 47 1,91 41
Ind. + 4 horas 79 9,48 120
Ind. + 6 horas 95 13,01 137
Ind. + 8 horas 94 13,24 141
Ind. + 10 horas 98 14,65 149
abreviações:
Ind + - horas significa as horas depois da indução de expressão de proteína,
Figure BRPI9508596B1_D0507
como descrito no exemplo 13 para o material de murino recombinante usando-se pCFM 1656;
O.D.: densidade ótica, como medida por espectrofotômetro, miligramas por unidade de O.D. por litro;
mg/O.D. .L: expressão em termos de mg de proteína por unidade de O.D.
por litro.
Purificação do polipeptídeo de OB ser humano recombinante
Proteína humana recombinante pode ser purificda usando-se método similar àquele usado para purificação de proteína de murino recombinante, como no exemplo 13, acima. Para a preparação de polipeptídeo de 15 OB ser humano recombinante, a etapa 8 foi realizada por ajustamento do pH do sobrenadante a partir da etapa 7 para pH 5,0, e carregamento deste sobre a coluna de fluxo rápido de sefarose CM. O gradiente de sal de 20
Figure BRPI9508596B1_D0508
volumes de coluna foi realizado em NaOAC a 20 mM, pH 5,5, em NaCI a 0 M a 0,5 Μ. A etapa 9 foi realizada por diluição da mistura de sefarose CM quatro vezes com água, e ajustamento do pH para 7,5. Esta mistura foi pro duzida para sulfato de amônio a 0,7 M. Um gradiente de sal reverso de 20 volumes de coluna foi feito em NaOAc a 5 mM, pH 5,5, sulfato de amônio a
0,2 M até 0 M. Em outras circunstâncias, as etapas acima eram idênticas.
Exemplo 15: Estudos de Resposta de Dose
Um estudo adicional demonstrou que houve uma resposta de
Figure BRPI9508596B1_D0509
165 dose para a administração contínua de proteína de OB. Neste estudo, murinos de tipo selvagem (não obeso, murinos de CD-1, pesando 35 - 40 g) foram administrados proteína de OB de murino recombinante usando-se métodos similares aos exemplos 12 e 13. Os resultados foram como se segue 5 (com perda de peso em por cento quando comparada com a linha de base, medida como acima):
Figure BRPI9508596B1_D0510
Tabela 10
Resposta de Dose com Administração Contínua
Dose Tempo % de redução em peso de corpo
0,03 mg/kg/dia dia 2 3,5%
1 mg/kg/dia dia 2 7,5%
1 mg/kg/dia dia 4 14%
Como pode ser visto, aumentando a dose de 0,03 mg/kg/dia para 1 mg/kg/dia aumentou a perda de peso de 3,5% a 7,5%. É também notável que no dia 14, a dosagem de 1 mg/kg/dia resultou em 14% de redução de peso de corpo.
Exemplo 16: Efeitos de Leptina sobre a Composição de Corpo de Murinos de OB/OB
Murinos de 16 semanas de idade de C57I/6J de OB/OB foram tratados com 5 gg/g/dia de leptina de murino, veículo, ou não receberam nenhum tratamento por 33 dias. Em uma segunda experiência, murinos OB/OB de 7 semanas de idade foram tratados com 10 gg/g/dia de leptina humana, leptina de murino, ou veículo por 12 dias. Os murinos foram sacri20 ficados e peso de corpo, composição de corpo, níveis de insulina, e níveis de glicose totais foram avaliados. Os dados a partir destas experiências são relatados na tabela 11.
166
Figure BRPI9508596B1_D0511
Figure BRPI9508596B1_D0512
Figure BRPI9508596B1_D0513
Figure BRPI9508596B1_D0514
167
Os dados de composição de corpo de demonstraram o efeito de leptina sobre três compartimento do corpo: massa de gordura, e massa de água. Os dados indicam que leptina significativamente diminui massa de gordura de corpo e tem um efeito marginal sobre a massa de corpo magra.
No entanto, os efeitos sobre a massa de corpo magra não foram estatisticamente significativos.
Comparação dos níveis de glicose e de insulina em murinos de controle (não-tratados) e tratados com leptina indica que leptina reduz níveis de açúcar e insulina no sangue, e assim melhora estes indícios de dia10 bete.
Figure BRPI9508596B1_D0515
Exemplo 17: Efeitos de Altas doses de Leptina em Camundoqos de Tipo Selvagem
Controles magros dos murinos de OB/OB (C57BI/6J +/?) foram injetados uma vez por dia i.p. com 10 gg/g de leptina de murino ou veículo (PBS), e peso de corpo e ingestão de alimento foram medidos durante as próximas duas semanas. Houve uma diminuição significativa em peso de corpo a partir do dia 4 para a frente e uma diminuição significativa em ingestão de alimento para a primeira semana. No entanto, depois de uma semana, o níveis de ingestão de alimento tornaram-se indistinguíveis entre 20 ambos os grupo de murinos. Os animais foram sacrificados no fim das duas semanas e a composição de corpo foi determinada. Os resultados da análise de composição de corpo são mostrados na tabela 12. Os dados mostram em gordura de corpo dos animais recebendo leptina versus os animais recebendo PBS.
Figure BRPI9508596B1_D0516
168
Figure BRPI9508596B1_D0517
CO O (Ü D
Figure BRPI9508596B1_D0518
Figure BRPI9508596B1_D0519
Figure BRPI9508596B1_D0520
Tabela 12
Composição e Peso de Corpo de Murinos de Tipo Selvagem (+/?)
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CD co CD CD co CD co b- CD co
Figure BRPI9508596B1_D0521
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Figure BRPI9508596B1_D0523
Figure BRPI9508596B1_D0524
Figure BRPI9508596B1_D0525
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Figure BRPI9508596B1_D0529
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Figure BRPI9508596B1_D0539
169
Figure BRPI9508596B1_D0540
Figure BRPI9508596B1_D0541
vP νΡ χΡ νΡ '^Ρ χΡ χΡ 'Ρ χΡ ocohxM-coco-M-cocooo -sTOCOt-COM-COCOCMO cd’ Α τ- Κ τ- c\T cd’ ιη r< co' CDCDCDLOCDCDCDLOCDCD 62,45% 3,83%
oooooooooo LOCDt-OJLOCOOLOCDCO CM ο v-’ Y Y O CM γ T- CM 11,66 0,72
xO xp *^ρ xP xp xp xO xP xp Ο·* Q^* 0^ (j* Q** Q*' O^· COCOOiCMCMlOM-COM· LOh^LOLOLOCMOOCD CD LO LO CO 10 co’ CD co’ CD CMCMCMCMCMCMCMCMCM 25,54% 1,10%
OCOi-i-lOM-CMM-CM olocdcoi^looo) Lf) Tf Tf <í Tf LO Tf 4,75 0,20
xp χθ χθ χθ χθ χθ o ν' O^* v O^* λ o^M-Tj-TfLDOJo^oò^ COCOI^COCDCOCM-i-CO cm cm σ> cm Ύ T o T CDi-T-T-f-1-NCMCD 12,09% 5,08%
Or*.OCJ>lOCDCOCDOO COi-CMI^COOCO.T-O T- cm cm CO cm’ 1-’ 1— Ύ T- CO N CM O cm t-’
COCDOCDCOCTCOCDl·* LO co i< co’ oi oo’ K aí ο Κ σ> co Ύ 1—
T-CMcoM-iocor^coajo Desvio padrão médio
Veículo
Figure BRPI9508596B1_D0542
170
Uma segunda experiência mostrou os efeitos de duas vezes ao dia de injeções i.p. de 12,5 gg/g de leptina de murino sobre murinos de C57BI/6J de tipo selvagem. Houve uma diminuição significativa em peso de corpo e ingestão de alimento associada com injeções duas vezes diaria5 mente do polipeptídeo. Para esta experiência, os animais foram colocados em câmaras metabólicas. O alimento consistiu de uma dieta de comida Purina n2 5001 em pó. Esta dieta diferenciou-se de experiências anteriores, que usaram a dieta consistindo em dieta de comida, tapioca e água. Assim o alimento usado nas câmaras metabólicas tinha um teor calórico mais alto, 10 que explica porque a quantidade de alimento consumida difere daqueles
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Figure BRPI9508596B1_D0545
animais sobre a dieta contendo água.
A seguir tem-se uma lista de referências relacionadas com a revelação acima e particularmente aos procedimentos e discussões experimentais.
Bahary e outros, Genomics, 11:33-47 (1991).
Bahary e outros, Genomics, 13:761 - 769 (1992).
Bahary e outros, Molecular mapping of mouse chromosomes 4 and 6: Use of a flow - sorted Robertsonian chromosome (1991).
Blank e outros, Mammalian Genome, 1: s51 - s78 (1991).
Bogardus e outros, Annals of the New York Academy of Sciences, 630:100
115(1991).
Friedman e outros, Mammalian Genome, 1:130 -144 (1991).
Harris, FASEB J„ 4:3310 - 3318 (1990).
Jacobowitz e outros, N. Engl. J. Med., 315:96 -100 (1986).
Kessey, in Obesity, págs. 144 - 166, Stunkard ed., Philadelphia, W.B. Sauders Co. (1980).
Kessey e outros, Ann. Rev. Psychol., 37:109 - 133.22 (1986).
Leibel e outros, “Genetic variation and nutrition in obesity: Approaches to the molecular genetics of obesity, in Genetic Variation and Nutrition, págs.
90 - 101.1, Simopulos and Childs eds., S. Karger, Basel (1990).
Siegel e outros, Cytogenet. Cell Genet., 61(3): 184- 185 (1992).
Esta invenção pode ser concretizada em outras formas ou reali zada de outras maneiras sem se afastar de seu espírito ou de suas caracte-
Figure BRPI9508596B1_D0546
171 rísticas essenciais. A presente descrição deve, portanto, ser considerada, sob todos os pontos de vista, como ilustrativa e não como restritiva, o escopo da invenção sendo indicado pelas reivindicações anexas, e pretende-se que todas as mudanças que ocorrem dentro do significado e faixa de equi5 valência estejam incluídas na mesma.
Várias referências são citadas neste relatório, cada uma das quais é incorporada aqui por referência em sua totalidade.
A invenção como reivindicada é habilitada de acordo com o relatório acima e referências e materiais de partida prontamente disponíveis. 10 No entanto, as requerentes fizeram, em 9 de agosto de 1995, os seguintes depósitos com a American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive,
Figure BRPI9508596B1_D0547
Rockville, MD, 20852-1178, USA, de acordo com os regulamentos do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para as Finalidades de Procedimento de Patentes: E. coli
H14 abrigando plasmídeo pETH14, n2 de acesso 69.880; e E. coli M9 abrigando plasmídeo pETM9, n2 de acesso 69879.

Claims (7)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Polipeptídeo de obesidade (OB), caracterizado pelo fato de que compreende os resíduos de aminoácido 22 a 167 de SEQ ID NO:4 ou os resíduos de aminoácido 22 a 166 de SEQ ID NO:6 possuindo uma metionina na posição 21.
  2. 2. Polipeptídeo OB de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende os resíduos de aminoácido 22 a 167 de SEQ ID NO:4 e uma metionina na posição 21.
  3. 3. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende:
    (a) um polipeptídeo de obesidade (OB) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 4, 5 ou 6 ou um polipeptídeo de obesidade (OB) como definido na reivindicação 1 ou 2; e (b) um veículo farmaceuticamente aceitável.
  4. 4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo de obesidade (OB) possui uma ou mais frações químicas solúveis em água.
  5. 5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a fração é um polímero solúvel em água.
  6. 6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o polímero solúvel em água é polietileno glicol.
  7. 7. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo em:
    (a) SEQIDNO:1;
    (b) SEQ ID NO:3; e (c) uma sequência de nucleotídeos como definida em SEQ ID NO:3 codificando os aminoácidos 22 a 167;
    em que a referida sequência de nucleotídeos é operacionalmente ligada a uma sequência de controle de expressão heteróloga.
    1/67
    GGATCCCTGCTCCAGCAGCTGCAAGGTGCAÃGAAGAAGAAGATCCCAGGGAGGAAAATGTG 61
    1-4 04 r4 0J rH 04 »-4 04 v-4 04 rHOJ CO OCQ IO O 04 04 0O<T i-4 04 CO CO t-4 <3- 1-4 <3* 1-4 6a- g- 5 LU O CJ O < Hc_> o Sq hOU So o b^ C/> o CP <c O h- U> o o CP< Ídq O oo. ?s>. o O CP b- CP o <Ξ> C5 cpcd O—J U-l t b— b— O O <c CJ O o o o 51- 3* Í500 o b- i— cp o < b— CP> e>O <*-4 b-O CD«X CP CD o CP O
    <
    CD
    LL
    2/67
    AGAGGTGGTGGCTTTGAGCAGGCTGCAGGGCTCTCTGCAGGACATTCTTCAACAGnGGA 54J
    CM rH fx t-4 vo οςο vo r-4 kOrd vo
    O o δ δ t o $3 δ p <C ο P P ρ O o δ p *3 δ δ Ρ o P ο o O ο P O O P δ δ δ Ρ p ο ο ρ < ο o ο ο o ο C o ο ο p C3 ο p Ο Ο δ 5 ο CD o o t ρ P ο < ο o o t Ρ p ο ο δ ο ο δ «e ο δ s & £ C0 ο Ρ S δ Ο ο ο ο 3 G) ϋ ο p ο Η δ t Ο E ο % 3 t S p Ρ ο «C ο ο P ο ο O C0 Ρ
BRPI9508596A 1994-08-17 1995-08-17 polipeptídeos de obesidade (ob), composição compreendendo os mesmos, bem como vetores para expressão dos referidos polipeptídeos BRPI9508596B1 (pt)

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