RO138682A2 - Suprafeţe elastomerice microstructurate radiale poroase obţinute prin replicare folosind un strat sacrificial de sare pentru reducerea răspunsului inflamator şi al adeziunii bacteriene - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la un procedeu de obţinere a unor suprafeţe polimerice microtexturate utilizate ca model de interfaţă în învelişul siliconic al implanturilor mamare. Procedeul, conform invenţiei, constă în replicare în poli(dimetilsiloxan) (PDMS) folosind matriţe realizate prin ablaţie laser asistată de măşti cu nivel de gri, combinate cu un strat de sacrificiu constând în microcristale de sare dispersate pe suprafaţa matriţei şi îndepărtate ulterior prin spălare, rezultând suprafeţe polimerice cu suprafaţă poroasă cu unitate repetitivă de tip gradient radial cu rol dual în mimimizarea adeziunii de microorganisme şi de atenuare a profilului inflamator.

Description

OFICIUL DE STAT FEHTRU IHVEîIȚÎÎ Șl MĂRCI Cerere de brevet de invenție _Nr.......

Data depozit..........LOjL??!??.......

Descrierea invenției cu titlul: Suprafețe elastomerice microstructurate lineare poroase obținute prin replicare folosind un strat sacrificial de sare pentru reducerea răspunsului inflamator si al adeziunii bacteriene.

Inventatori: Dinca Valentina, Nistorescu Simona, Bonciu Anca, Dumitrescu Nicoleta, Rusen Laurentiu

Invenția se referă la obținerea prin replicare a unor noi biointerfete elastomerice din polidimetilsiloxan care au ca si caracteristica principala o microstructurare duala, bazata pe forma specifica de matrici lineare radiale cu suprafața semiporoasa, folosite pentru aplicatii in domeniul implanturilor mamare. Designul acestor structuri s-a bazat pe corelarea efectului topografiei cu răspunsul specific al macrofagelor si al microorganismelor (de ex. răspuns inflamator scăzut, adeziune redusa a bacteriilor) ca model de interfața in învelișul siliconic al implanturilor mamare. Problema pe care o rezolva invenția de fata este obținerea pe arie mare a unor noi suprafețe polimerice dual structurate care sa nu inducă un răspuns inflamator crescut si care sa minimizeze si adeziunea bacteriana la suprafața pe baza topografiei, ajutand astfel la o integrare mai buna si de durata a implanturilor in organismul uman. Noile biointerfete propuse sunt constituite din unitati micrometrice de tip “radial” si microporos obținute la temperatura camerei, prin metoda replicării asistate de un strat sacrificial de sare, pe suprafețe de minim 1 cm², dar care pot sa ajunga la 100 cm²

Soluția propusă pentru rezolvarea problemei legate de minimizarea răspunsului inflamator si a aderentei bacteriene este obținerea substraturilor microtexturate cu unitatea repetitiva de tip gradient radial (cu caracteristici laterale de la 1-70^Qm, înălțime pereți 5^m), realizate prin replicare in PDMS folosind matrite obținute prin ablatie laser asistata de masti de gri, acoperite cu un strat sacrificial de sare. Suprafețele obținute au fost testate folosind următoarele tipuri de celule: macrofage si microorganisme, determinandu-le astfel viabilitatea si evaluandu-le microscopic din punct de vedere al adeziunii pe microstructuri, rezultând un comportament diferit al celor doua tipuri de linii celulare fata de același tip de microstructura. Cantitatea de TNFa eliberata in cazul macrofagelor stimulate cu endotoxine bacteriene a scăzut in cazul suprafețelor structurate dual, comparativ cu cea eliberata in prezenta suprafețelor control ceea ce indica minimizarea unui potențial inflamator. Imaginile SEM ale bacteriilor atașate pe suprafața

demonstrează abilitatea acestor structuri de a inhiba aderenta bacteriana, implicit formarea de biofilm.

Este cunoscut ca implanturile mamare sunt printre cele mai frecvent utilizate dispozitive medicale și prezintă de regulă învelișuri netede sau texturate, umplute cu soluție salină sau gel de silicon [1], Dintre implanturile pe bază de silicon, poli(dimetilsiloxanul) (PDMS) este cel mai frecvent utilizat silicon în implantologie mamară; datorită numeroaselor sale avantaje, inclusiv rezistență mecanică bună, flexibilitate și biocompatibilitate [2]. Chiar și cu aceste avantaje, efectele secundare cauzate de reacțiile de corpuri străine (FBR) sunt inevitabile, ducând la eșecul implantului [3], De exemplu, contractura capsulară este o complicație tipică care rezultă din FBR față de implanturile mamare pe bază de PDMS, care apare atunci când capsula fibroasă de colagen se micșorează, se strânge și comprimă implantul. Corectarea contracturi! capsulare necesită îndepărtarea chirurgicală (eliberarea) capsulei sau îndepărtarea și eventuala înlocuire a implantului [4,5], Cu toate acestea, pe lângă contractura capsulară, pacientele care aleg reconstrucția mamară/augmentare mamară, riscă să dezvolte limfom anaplazic cu celule mari (ALCL) associat implanturilor mamare (BIA-ALCL), primul caz identificat datând din 1997 [6], BIA-ALCL este o tumoră malignă neobișnuită care apare în capsula din jurul implanturilor mamare, indiferent de tipul de umplutură [7,8]. în ultimii ani, dovezile au arătat că riscul de a dezvolta BIA-ALCL este asociat predominant cu implanturile texturate [9,10]. Astfel, prin urmărirea pe termen lung a unui grup de 3.546 de femei cu implanturi texturate, a fost raportat un risc de BIA-ALCL de 1 din 350 de femei expuse [11], Momentul de debut al bolii variază, majoritatea cazurilor de BIA-ALCL fiind detectate de la 7 până la 10 ani după implantare, cazurile sporadice fiind depistate între 2 și 32 de ani după implantare [12,13]. Caracteristicile clinice evidente ale BIA-ALCL includ: umflarea sau durerea persistentă în zona implantului mamar, acumularea întârziată de lichid în jurul implantului (observată în 60% din cazuri), prezența unei mase celulare intracapsulare (observată la 17% din cazuri), și atât mase tumorale solide cât și serom în aproximativ 20% din cazuri [14], Simptomele mai puțin frecvente includ limfadenopatie, erupții cutanate și contracturi capsulare [15]. Cu toate acestea, s-a dovedit că majoritatea cazurilor de BIA-ALCL se manifestă ca un serom sau mai rar ca o tumoare solidă între 7 și 10 ani de la implantare [15-17]. O ipoteza emisa e legata de faptul că BIA-ALCL este cauzată de stimularea cronică a sistemului imunitar din cauza materialelor implantate și a biofilmelor microbiene, precum și a unei posibile predispoziții genetice; cauzele celulare și moleculare ale acesteia nu sunt pe deplin înțelese [18-23].

Cercetările recente au asociat dezvoltarea BIA-ALCL cu utilizarea implanturilor macrotexturate datorită caracteristicilor specifice ale suprafeței texturate și a unui mediu propice factorilor de promovare a bolii furnizați de astfel de implanturi [23]. De fapt, unele studii au sugerat că suprafața macrotexturată a implantului oferă mediul adecvat pentru colonizarea bacteriană, totuși sunt necesare studii suplimentare pentru a confirma astfel de asocieri [24]. în ciuda acestui fapt, una dintre cele mai importante ipoteze este legată de dezvoltarea unui biofilm bacterian asociat implantului. Biofilmul bacterian poate produce inflamație și are ca rezultat activarea cronică a limfocitelor [25-27].

Principalul dezavantaj e legat de faptul ca aceste implanturi induc stimularea antigenică cronică și un răspuns inflamator excesiv ca urmare a infecției bacteriene [25,26] . Intradevăr, o creștere a infiltrației celulelor T în implanturile texturate a fost raportată ca rezultat al suprafețelor colonizate de bacterii care înconjoară implantul, ducând la infecții care provoacă seroame și contracție capsulară [28], O ipoteză alternativă este că o componentă a implantului texturat acționează ca un declanșator al bolii, deoarece este recunoscută de sistemul imunitar ca un antigen străin. Mai mult, s-a indicat faptul că limfomul pare asociat exclusiv cu protezele texturate, riscul fiind mai mare pentru implanturile acoperite cu poliuretan sau cu o textură mai robustă [10,14,24], Unele studii au indicat, de asemenea, că siliconul (materialul cel mai frecvent utilizat în implanturile mamare [29]) induce o reacție imună locală specifică care implică celulele T-helper activate (Thl/Thl7) care provoacă fibroză. Datorită scăderii funcțiilor locale ale celulelor reglatoare T, se induce o creștere a producției de citokine profibrotice, favorizând astfel dezvoltarea unei astfel de fibroze [25,30], Deși majoritatea pacienților cu BIA-ALCL au o evoluție clinică, rapoartele de decese atribuite acestei boli subliniază importanța punerii în timp util a unui diagnostic și a unui tratament adecvat cu supraveghere adecvată [31-34],

Prin urmare, se caută soluții pentru minimizarea riscului de apariție a BIA-ALCL prin modificări ale suprafețelor texturate care sa inducă o modulare a reacției corpului la suprafața implanturilor. Patentele cu numărul US20120277860A1, US20170049549A1, WO 2017/093528 si WO2020070694A1 [35-38] fac referire la implanturi mamare si corelarea caracteristicilor de suprafața cu optimizarea integrării sau a „personalizării” acestora, prin folosirea de materiale variate (ex. poliuretan, poliuretan/uree, acid poliglicoloc, policaproclactona sau un amestec al acestora, compuși naturali: agaroza, alginat, chitosan, colagen, fibrina, gelatina, acid hialuronic).

Texturarea specifica si permanentă a suprafeței ar putea fi benefică pentru atenuarea pe termen lung a infecțiilor microbiene si a răspunsului inflamator cronic. In acest context, folosirea de interfețe spicifc texturate de PDMS- poate reprezenta o varianta fiabila pentru obținerea de biointerfete adecvate cerințelor capsulelor siliconice ale implanturilor mamare. Brevetele US20120277860A1 si 10912636 descriu modalitati de obținere a suprafețelor texturate intr-un mod aleatoriu, vizând in același timp un răspuns celular imbunatatit comparativ cu cele netede sau texturate existente in comerț [35,36].

Printre metodele de obținere de suprafețe structurate de PDMS, replicarea utilizând diverse tipuri de matrite reprezintă una dintre opțiunile promițătoare pentru realizarea strategiei de biomimetism necesara in cazul majorității implanturilor. In contextul eforturilor făcute pentru evitarea sau minimizarea adeziunii microrganismelor, trebuie luat in considerare mecanismul de ucidere prin contact, unele dintre suprafețele bactericide obținute constând de obicei din caracteristici în aceeași ordine de mărire ca bacteriile, aceste topografii biomimetice, bazându-se pe designul inspirat de cicade, frunza de lotus, pielea de rechin, gecko, aripi de libelule, fluturi[39-42],

Scopul invenției este de a obține noi biointerfete elastomerice din polidimetilsiloxan avand ca si caracteristica principala o microstructurare duala. Aceasta microstructurare duala este bazata pe forma specifica de matrici lineare radiale cu suprafața poroasa, care vizeaza un răspuns inflamator scăzut, adeziune redusa a bacteriilor pentru a putea fi folosite ca model de interfața in învelișul siliconic al implanturilor mamare.

Problema pe care o rezolva invenția de fata este obținerea pe arie mare a unor noi suprafețe polimerice dual structurate care sa nu inducă un răspuns inflamator crescut si care sa minimizeze si adeziunea bacteriana la suprafața pe baza topografiei, ajutand astfel la o integrare mai buna si de durata a implanturilor in organismul uman. Noile biointerfete propuse sunt constituite din unitati micrometrice de tip “radial” si microporos obținute la temperatura camerei, prin metoda replicării asistate de un strat sacrificial de sare, pe suprafețe de minim 1 cm², dar care pot sa ajunga la 100 cm²

Soluția propusă pentru rezolvarea problemei legate de minimizarea răspunsului inflamator si a aderentei bacteriene este obținerea substraturilor microtexturate cu unitatea repetitiva de tip gradient radial (cu caracteristici laterale de la 1-70 pm, înălțime pereți 5 pm), realizate prin replicare in PDMS folosind matrite obținute prin ablatie laser asistata de masti de gri, acoperite cu un strat sacrificial de sare.

Eficienta microstructurilor a fost testata prin analiza răspunsului macrofagelor si bacteriilor la caracteristicile de suprafața.

Suprafețele texturate, conform invenției, prezintă următoarele avantaje:

• Se pot obține rapid, in mod reproductibil si in cantitati mari si pe suprafețe mari • împiedica aderenta microorganismelor, implicita formarii biofilmelor;

• in cazul macrofagelor stimulate cu endotoxine bacteriene, secreția de TNFa scade pe suprafețele dual structurate, ceea ce indica posibila modulare a unui potențial inflamator.

Problema tehnica pe care o rezolva prezenta invenția se refera la suprafețele neadecvate ale implanturilor mamare care pot produce un răspunsul inflamator acut. Abordarea acestui brevet pentru rezolvarea acestei probleme consta in obținerea de noi suprafețe polimerice, cu caracteristici topografice bine definite bazate pe forma specifica de matrici lineare radiale cu suprafața poroasa.

Conform metodei de obținere a substraturilor microtexturate dual cu unitatea repetitiva radiala cu 5 pm adâncime, acestea au fost realizate prin replicare in PDMS asistata de un strat sacrificial de sare si folosind matrite obținute prin ablatie laser cu masti. Eficienta microstructurilor a fost testata analizand adeziunea macrofagelor si a microorganismelor pe suprafețele texturate.

In urma testelor putem concluziona:

- substraturi microtexturate specific au fost obținute prin metoda replicării folosind matrite obținute prin ablatie laser asistata de masti cu nivel de gri, combinate cu un strat de sacrificiu constând in microcristale dde sare dispersate pe suprafața matriței si îndepărtate ulteririor prin spalare;

-substraturile polimerice obținute au potențial inflamator scăzut comparativ cu controlul, si inhiba adeziunea bacteriana.

Se da in continuare, un exemplu de realizare a substraturilor microtexturate dual:

Metoda de obținere a substraturilor microtexturate de tip linear microporos descrisa in Desenul 1 (Desenul 1: Schema sistemului de obținere de substraturi de PDMS microstructurat sub forma lineara microporoasa), presupune următoarele etape:

1. Obținerea de matrite de replicare a fost realizata prin ablatie laser asistata de masti cu nivel de gri. Setup-ul experimental conține un laser cu excimer KrF (Exitech, PPM60IE Gen 6 Instrument)(l), ( 20ns puls, 248nm lungimea de unda si rata de repetiție de 50Hz). Fasciculul laser a fost directionat către masca (2), si printr-un sistem de lentile (3) a fost focalizat pe un substrat de policarbonat (4). A fost folosita o fluenta de 450 mJ/cm², un număr de 30 de pulsuri micro-modele lineare fiind generate pe substratul de policarbonat folosit ca matrita (4).

2. Probele de policarbonat au fost curatate in baia cu ultrasunete timp de 10 minute, secvențial, în alcool izopropilic (IPA) si apa ultrapura, urmata de uscare. Sare (cu dimensiuni cristale de 20-100 microni) a fost depusa pe suprafețele texturate. Excesul a fost îndepărtat prin presare ușoara cu o banda adeziva de hârtie.

3. Suprafețele finale texturate (11) s-au obtinut prin turnarea PDMS-ului (lO)-(Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit; Dow Corning) (1:10) pe matrita de policarbonat (4), respectiv matrita de policarbonat acoperita de un strat de sare (5) si pastrarea acestuia timp de 48h la temperatura camerei.

4. O data finalizat procesul de polimerizare, replicile au fost desprinse si spalate timp de 2 h in baia de ultrasunete.

După finalizarea protocolului de lucru, probele de PDMS obținute au fost vizualizate prin microscopie electronică de baleiaj (SEM) pentru a confirma replicarea matriței (desen 2), dar si a porozitatii induse de cristalele de sare. Analiza SEM detaliata a probelor structurate s-a efectuat cu ajutorul unui microscop electronic de baleiaj JSM-531, folosind 5 kV, putandu-se observa obținerea de microstructuri cu forme bine definite, pe arie mare, fara prezenta defectelor pe suprafața. Suprafețele obținute folosind matrițele texturate cu laser respecta design-ul acestora, fara a prezenta defecte pe suprafața, asa cum se poate observa in Desenul 2-(Desen 2: Imagini de microscopie electronică de baleiaj ale structurilor de suprafață PDMS structurat cu si fara strat sacrificial de sare.

Desenul 3 ( Desen 3; Curbe forță vs. distanță înregistrate folosind modul de contact AFM pe replici PDMS; Testele au fost efectuate în cinci zone diferite fiind analizate pe: PDMS neted, PDMS structurat radiat, PDMS structurat radial poros) prezintă datele forță versus distanță folosite pentru a estima elasticitatea eșantioanelor. Toate investigațiile AFM au fost efectuate folosind un AFM XE100 de la Park Systems, Suwon, Coreea de Sud, în condiții ambientale. Flexibilitatea elastică a probelor PDMS și aderența vârfului AFM la suprafețele PDMS au fost determinate prin măsurători de forță versus distanță, în cinci puncte diferite, toate alese aleatoriu. Au fost folosite vârfuri de siliciu cu o frecvență de rezonanță de aproximativ 70 kHz și o constantă elastică de 2 N-m'¹. Se știe că manipularea elasticității sau topografiei substratului ar putea fi utilizată pentru a promova proliferarea și diferențierea celulară controlată [43-44], Studiile anterioare au arătat că o serie de procese celulare, inclusiv aderența, migrarea și proliferarea [43] ar putea fi influențate de substratul însuși pentru a determina soarta celulei. Măsurătorile AFM în modul contact, ale forței vs. distanță și aderența vârf-substrat au fost evaluate în punctele superficiale ale fiecărui substrat, evidențiind probele PDMS obținute prin texturarea cu strat sacrificial de sare ca fiind cele ce dețin cele mai semnificative forțe de adeziune. De asemenea, rugozitatea acestor probe este mai mare comparativ cu cea a celorlalte suprafețe.

Tabel . Forțele de desprindere și energiile de adeziune ale probelor PDMS.

Material	Forță de desprindere (10'9 N)	Energie de adeziune (IO18 J)
PDMS neted	5.0	344.2
PDMS radial	4.31	229.6
PMDS radial poros	9.7	648.3

Hidrofilicitatea/hidrofobicitatea definita prin masurarea unghiului de contact afecteaza orientarea si conformația proteinelor adsorbite si, prin urmare, afecteaza diferențierea celulara.

Unghiul de contact pe care il face o picătură de apa lichida cu o suprafața PDMS oferă cea mai simpla si mai elementara măsură a hidrofobicitatii sale. Suprafețele texturate sunt caracterizate de un profil hidrofobic, unghiul de contact crescând cu peste 10-20% in cazul texturarii

(103 pentru PDMS, 118 pentru PDMS structurat). Determinarea parametrilor rugozității a fost realizată prin profilometrie de contact. Valorile obținute pentru parametrii de rugozitate Ra si Rq au aratat ca microtopografiile create pe suprafețele de PDMS cresc rugozitatea biomaterialului.Astfel, au fost evidențiate modificări ale valorilor rugozității suprafeței de la 0.021 pm (Ra) și 0.032 pm (Rq) pentru PDMS neted până la Sa 13.82pm si Sq 16.3 pm pentru proba dual structurata.

Protocol de validare a microstructurilor obținute prin replicare in analiza interactiei cu celule. Răspunsul caracteristic al suprafețelor la celule a fost obtinut urmărind pașii de mai jos:

1. Cultivarea celulelor RAW264.7. înainte de utilizarea in experimente in vitro, probele au fost supuse sterilizării la temperatura camerei cu soluție de penicilinastreptomicina 1% in PBS timp de 20 de minute, cu efect germicid, pentru prevenirea contaminării bacteriene.

Citotoxicitatea probelor a fost evaluată prin investigarea viabilității celulare după 24 și 72 de ore de la expunerea la suprafețele de PDMS, precum și prin evidențierea modificărilor citomorfologice induse de microtopografii prin evidențierea citoscheletului celular după 24 și 72 de ore de la tratament. Experimentele derulate au fost realizate atât în condiții pro-inflamatorii (+LPS), cât și standard (-LPS) de cultivare.

2. Testarea ratei de supraviețuire a celulelor macrofage LIVE/DEAD. Pentru a studia rata de supraviețuire a celulelor pe substraturile replicate, a fost evaluată viabilitatea RAW264.7 la 24 și 72 de ore după însămânțarea macrofagelor prin testul LIVE/DEAD. Monostraturile celulare aderate pe suprafețele de PDMS microtexturate au fost spălate cu mediu de cultură iară ser și colorate cu calceină AM și homodimer de etidiu timp de 10 minute la întuneric, pentru a investiga calitativ viabilitatea celulară. Celulele vii emit o fluorescență verde datorită hidrolizei esterului de calceină AM la calceină, în timp ce celulele moarte emit o fluorescenta roșie din cauza legării în ADN celular a homodimerului de etidiu, în celulele cu membrane nucleare compromise. Rezultatele colorării au fost achiziționate cu ajutorul unui microscop de fluorescență.

3. Evaluarea modificărilor citomorfologice induse de substraturile de PDMS prin microscopie de fluorescență. Evaluarea capacității microtopografiilor de PDMS de a induce modificări morfologice în culturile de macrofage murine a fost realizată prin evidențierea filamentelor de actină din compoziția citoscheletului, precum și prin marcarea fluorescentă a nudei lor.

4. însămânțarea tulpinii și prepararea suspensiei bacteriene

Au fost utilizate tulpini standard de Pseudonomas Aeruginosa. însămânțarea tulpinilor s-a realizat prin descărcarea ansei bacteriologice de unică folosință pe mediul de cultură agar nutritiv (PCA - Plate Count Agar), scopul cultivării fiind de a obține cultură pură. Condițiile de incubare au fost: 37°C, 5% CO2, timpul de incubare 24 de ore. Probele de PDMS au fost tăiate cu un bisturiu steril la o dimensiune de 1x1 cm și au fost sterilizate la UV timp de 15 minute pe fiecare parte. După sterilizare, probele au fost mutate în plăci cu 24 de godeuri, iar peste materiale au fost pipetați 600 pL/godeu din suspensia bacteriană preparată. în final, plăcile au fost incubate până la 48 ore la 37°C pentru a permite dezvoltarea de biofilme pe suprafețele de interes. Pentru evidențierea efectului anti-biofilm a suprafețelor de interes, substraturile au fost fixate în diluții seriale de etanol (35%-100%) timp de 15 minute după 2 zile de creștere bacteriană și vizualizate prin SEM.

5. Microscopia SEM. Efectele induse de suprafața biomaterialelor asupra morfologiei macrofagelor au fost investigate prin SEM, utilizând Inspect S Electron Scanning Microscope (FEI Company).Materialele conținând celule aderate au fost fixate cu glutaraldehida 2,5% in tampon fosfat (PBS) timp de 20 min, apoi deshidratate si uscate cu etanol si HMDS (hexamethyldisilazane) si uscate in hota timp de 24 ore.

Se poate observa din Desenul 4 (Desen 4-Imagini de fluorescenta ale celulelor macrofage incubate in condiții de stimulare cu LPS) ca la 72 de ore, imaginile de fluorescență indică prezența predominantă a celulelor viabile marcate verde fluorescent, în prezența stimulului proinflamator (+LPS), atat pe suprafața de control cat si pe cea microstructurata, iar in urma marcării actinei citoschelelate cu faloidină, la 72 de ore post-însămânțare, celulele RAW 264.7 cultivate în condiții pro-inflamatorii (+LPS) au prezentat dimensiuni mult mai mari și numeroase filopodii pe suprafețele de control comparativ cu cele structurate, acest comportament morfologic fiind caracteristic unui fenotip activat pro-inflamator și migrator.

In desenul 5 (Desen 5- Imagini SEM ale bacteriilor incubate pe probele dual structurate), informațiile legate de morfologia celulara a bacteriilor la 48 ore afectate de microstructurare demonstrează abilitatea acestora de a împiedica formarea de biofilm. Pentru vizualizarea biofilmelor formate pe suprafețele de interes prin SEM, probele au fost fixate in metanol timp de 15 minute si lasate la uscat peste noapte.

Eficienta suprafețelor de PDMS împotriva P. aeruginosa care face parte din grupul bacteriilor Gram negative, a aratat o reducere a numărului de UFC/mL (2,5x10⁴ UFC/mL PDMS texturat comparativ cu 2x10⁵ UFC/mL pentru controlul pozitiv). Imaginile SEM arata o diferența semnificativa intre suprafața Control si cea microstructurata pe baza de PDMS, pe suprafața de Control fiind observata formarea de biofilm in timp ce suprafața dual structurata prezintă doar cateva bacterii izolate , si nu sub forma de biofilm.

In urma analizelor efectuate pe suprafețele microstructurate obținute si a testelor efectuate cu 2 tipuri de celule implicate in interactia implant mamar-organism, putem concluziona:

-Materialele pe baza de PDMS structurate dual - favorizează aderarea macrofagelor la un nivel mai mic decât cel al controlului

- Celulele macrofage se ataseaza pe suprafețele testate si prezintă un aspect morfologic adaptat la topologia suprafeței materialelor pe baza de PDMS.

- Nivelul de citochine TNF-α masurat atesta absenta unui efect inflamator pentru structurile lineare porosase, nivelul de TNF-α fiind nesemnificativ fata de CTRL (celule crescute pe coverslip si tratate cu LPS).

-Materialele pe baza de PDMS structurate dual - nu favorizează aderarea microorganismelor.

Referințe bibliografice:

1. Health, C. for D. and R. Medical Device Reports of Breast Implant-Associated Anaplastic Large Cell Lymphoma. FDA 2022.

2. Daniels, A. Silicone Breast Implant Materials. Swiss Med Wkly 2012, doi:10.4414/smw.2012.13614.

3. Shaik, I.H.; Gandrapu, B.; Gonzalez-Ibarra, F.; Flores, D.; Matta, J.; Syed, A.K. Silicone Breast Implants: A Rare Cause of Pleural Effusion. Case Reports in Pulmonology 2015, 2015, 1-3, doi: 10.1155/2015/652918.

4. Dolwick, M.F.; Aufdemorte, T.B. Silicone-Induced Foreign Body Reaction and Lymphadenopathy after Temporomandibular Joint Arthroplasty. Oral Surg Oral Med Oral Pathol 1985, 59, 449-452, doi: 10.1016/0030-4220(85)90079-9.

5. Headon, H.; Kasem, A.; Mokbel, K. Capsular Contracture after Breast Augmentation: An Update for Clinical Practice. Arch Plast Surg 2015, 42, 532-543, doi:10.5999/aps.2015.42.5.532.

6. Keech, J.A.; Creech, B.J. ANAPLASTIC T-CELL LYMPHOMA IN PROXIMITY TO A SALINE-FILLED BREAST IMPLANT: Plastic &amp Reconstructive Surgery 1997, 100, 554,555, doi:10.1097/00006534-199708000-00065.

7. Di Napoli, A.; Pepe, G.; Giarnieri, E.; Cippitelli, C.; Bonifacino, A.; Mattei, M.; Martelli, M.; Falasca, C.; Cox, M.C.; Santino, I.; et al. Cytological Diagnostic Features of Late Breast Implant Seromas: From Reactive to Anaplastic Large Cell Lymphoma. PLoS One 2017, 12, e0181097, doi: 10.137 l/joumal.pone.0181097.

8. Nava, M.B.; Adams, W.P.; Botti, G.; Campanale, A.; Catanuto, G.; Clemens, M.W.; Del Vecchio, D.A.; De Vita, R.; Di Napoli, A.; Hall-Findlay, E.; et al. MBN 2016 Aesthetic Breast Meeting BIA-ALCL Consensus Conference Report. Plast Reconstr Surg 2018, 141, 40-48, doi:10.1097/PRS.0000000000003933.

9. Doren, E.L.; Miranda, R.N.; Selber, J.C.; Garvey, P.B.; Liu, J.; Medeiros, L.J.; Butler, C.E.; Clemens, M.W. U.S. Epidemiology of Breast Implant-Associated Anaplastic Large Cell Lymphoma. Plast Reconstr Surg 2017, 139, 1042-1050, doi: 10.1097/PRS.0000000000003282.

IO. de Boer, M.; van Leeuwen, F.E.; Hauptmann, M.; Overbeek, de Boer, J.P.; Hijmering, N.J.; Sernee, A.; Klazen, C.A.H.; Lobbes, M.B.I.; van der Hulst, R.R.W.J.; et al. Breast Implants and the Risk of Anaplastic Large-Cell Lymphoma in the Breast. JAMA Oncol 2018, 4, 335-341, doi:10.1001/jamaoncol.2017.4510.

11. Cordeiro, P.G.; Ghione, P.; Ni, A.; Hu, Q.; Ganesan, N.; Galasso, N.; Dogan, A.; Horwitz, S.M. Risk of Breast Implant Associated Anaplastic Large Cell Lymphoma (BIA-ALCL) in a Cohort of 3546 Women Prospectively Followed Long Term after Reconstruction with Textured Breast Implants. J Plast Reconstr Aesthet Surg 2020, 73, 841-846, doi: 10.1016/j.bjps.2019.11.064.

12. Aladily, T.N.; Medeiros, L.J.; Amin, M.B.; Haideri, N.; Ye, D.; Azevedo, S.J.; Jorgensen, J.L.; de Peralta-Venturina, M.; Mustafa, E.B.; Young, K.H.; et al. Anaplastic Large Cell Lymphoma Associated with Breast Implants: A Report of 13 Cases. Am J Surg Pathol 2012, 36, 1000-1008, doi: 10.1097/PAS.0b013e31825749b!.

13. Clemens, M.W.; Medeiros, L.J.; Butler, C.E.; Hunt, K.K.; Fanale, M.A.; Horwitz, S.; Weisenburger, D.D.; Liu, J.; Morgan, E.A.; Kanagal-Shamanna, R.; et al. Complete Surgical Excision Is Essential for the Management of Patients With Breast ImplantAssociated Anaplastic Large-Cell Lymphoma. J Clin Oncol 2016, 34, 160-168, doi:10.1200/JCQ.2015.63.3412.

14. Clemens, M.W.; Nava, M.B.; Rocco, N.; Miranda, R.N. Understanding Rare Adverse Sequelae of Breast Implants: Anaplastic Large-Cell Lymphoma, Late Seromas, and Double Capsules. Gland Surg 2017, 6, 169-184, doi:10.21037/gs.2016.11.03.

15. Clemens, M.W.; Brody, G.S.; Mahabir, R.C.; Miranda, R.N. How to Diagnose and Treat Breast Implant-Associated Anaplastic Large Cell Lymphoma: Plastic and Reconstructive Surgery 2018, 141, 586e-599e, doi:10.1097/PRS.0000000000004262.

16. Kricheldorff, J.; Fallenberg, E.M.; Solbach, C.; Gerber-Schăfer, C.; Rancso, C.; Fritschen, U. von Breast Implant-Associated Lymphoma. Dtsch Arztebl Int 2018, 115, 628-635, doi: 10.3238/arztebl.2018.0628.

17. Clemens, M.W.; Jacobsen, E.D.; Horwitz, S.M. 2019 NCCN Consensus Guidelines on the Diagnosis and Treatment of Breast Implant-Associated Anaplastic Large Cell Lymphoma (BIA-ALCL). Aesthet Surg J 2019, 39, S3-S13, doi: 10.1093/asj/sjy331.

18. Lee, J.S.; Shin, B.H.; Yoo, B.Y.; Nam, S.-Y.; Lee, M.; Choi, J.; Park, H.; Choy, Y.B.; Heo, C.Y.; Koh, W.-G. Modulation of Foreign Body Reaction against PDMS Implant by Grafting Topographically Different Poly(Acrylic Acid) Micropatterns. Macromol Biosci 2019, 19, el900206, doi: 10.1002/mabi.201900206.

19. Swerdlow, S.H.; Campo, E.; Pileri, S.A.; Harris, N.L.; Stein, H.; Siebert, R.; Advani, R.; Ghielmini, M.; Salles, G.A.; Zelenetz, A.D.; et al. The 2016 Revision of the World Health Organization Classification of Lymphoid Neoplasms. Blood 2016, 127, 23752390, doi: 10.1182/blood-2016-01 -643569.

20. Falini, B.; Martelli, M.P. Anaplastic Large Cell Lymphoma: Changes in the World Health Organization Classification and Perspectives for Targeted Therapy. Haematologica 2009, 94, 897-900, doi: 10.3324/haematol.2009.008250.

21. Laurent, C.; Delas, A.; Gaulard, P.; Haioun, C.; Moreau, A.; Xerri, L.; Traverse-Glehen, A.; Rousset, T.; Quintin-Roue, I.; Petrella, T.; et al. Breast Implant-Associated Anaplastic Large Cell Lymphoma: Two Distinct Clinicopathological Variants with Different Outcomes. Ann Oncol 2016, 27, 306-314, doi:10.1093/annonc/mdv575.

22. Taylor, C.R.; Siddiqi, I.N.; Brody, G.S. Anaplastic Large Cell Lymphoma Occurring in Association with Breast Implants: Review of Pathologic and Immunohistochemical Features in 103 Cases. Appl Immunohistochem Mol Morphol 2013, 21, 13-20, doi: 10.1097/P AI ,0b013 e318266476c.

23. Turner, S.D. The Cellular Origins of Breast Implant-Associated Anaplastic Large Cell Lymphoma (BIA-ALCL): Implications for Immunogenesis. Aesthet Surg J 2019, 39, S21-S27, doi: 10.1093/asj/sjy229.

24. Loch-Wilkinson, A.; Beath, K.J.; Knight, R.J.W.; Wessels, W.L.F.; Magnusson, M.; Papadopoulos, T.; Conneli, T.; Lofts, J.; Locke, M.; Hopper, I.; et al. Breast ImplantAssociated Anaplastic Large Cell Lymphoma in Australia and New Zealand: HighSurface-Area Textured Implants Are Associated with Increased Risk. Plast Reconstr Surg 2017, 140, 645-654, doi:10.1097/PRS.0000000000003654.

25. Hu, H.; Johani, K.; Almatroudi, A.; Vickery, K..; Van Natta, B.; Kadin, M.E.; Brody, G.; Clemens, M.; Cheah, C.Y.; Lade, S.; et al. Bacterial Biofilm Infection Detected in Breast Implant-Associated Anaplastic Large-Cell Lymphoma: Plastic and Reconstructive Surgery 2016, 137, 1659-1669, doi:10.1097/PRS.0000000000002010.

26. Hu, H.; Jacombs, A.; Vickery, K.; Merten, S.L.; Pennington, D.G.; Deva, A.K. Chronic Biofilm Infection in Breast Implants Is Associated with an Increased T-Cell Lymphocytic Infiltrate: Implications for Breast Implant-Associated Lymphoma. Plast Reconstr Surg 2015, 135, 319-329, doi:10.1097/PRS,0000000000000886.

27. Campanale, A.; Boldrini, R.; Marletta, M. 22 Cases of Breast Implant-Associated ALCL: Awareness and Outcome Tracking from the Italian Ministry of Health. Plast Reconstr Surg 2018, 141, 1 le-19e, doi:10.1097/PRS.0000000000003916.

28. Adams, W.P.; Culbertson, E.J.; Deva, A.K.; R Magnusson, M.; Layt, C.; Jewell, M.L.; Mallucci, P.; Heden, P. Macrotextured Breast Implants with Defined Steps to Minimize Bacterial Contamination around the Device: Experience in 42,000 Implants. Plast Reconstr Surg 2017, 140, 427-^131, doi:10.1097/PRS.0000000000003575.

29. Kang, S.; Sutthiwanjampa, C.; Heo, C.; Kim, W.; Lee, S.-H.; Park, H. Current Approaches Including Novei Nano/Microtechniques to Reduce Silicone Implant-Induced Contracture with Adverse Immune Responses. IJMS 2018, 19, 1171, doi: 10.3390/ijmsl9041171.

30. Wolfram, D.; Dolores, W.; Rainer, C.; Christian, R.; Niederegger, H.; Harald, N.; Piza, H.; Hildegunde, P.; Wick, G.; Georg, W. Cellular and Molecular Composition of Fibrous Capsules Formed around Silicone Breast Implants with Special Focus on Local Immune Reactions. J Autoimmun 2004, 23, 81-91, doi:10.1016/j.jaut.2004.03.005.

31. Carty, M.J.; Pribaz, J.J.; Antin, J.H.; Volpicelli, E.R.; Toomey, C.E.; Farkash, E.A.; Hochberg, E.P. A Patient Death Attributable to Implant-Related Primary Anaplastic Large Cell Lymphoma of the Breast. Plast Reconstr Surg 2011, 128, 112e-l 18e, doi: 10.1097/PRS. ObO 13 e318221 d b96.

32. Rondon-Lagos, M.; Rangel, N.; Camargo-Villalba, G.; Forero-Castro, M. Biologica! and Genetic Landscape of Breast Implant-Associated Anaplastic Large Cell Lymphoma (BIA-ALCL). European Journal of Surgical Oncology 2021, 47, 942-951, doi: 10.1016/j.ejso.2020.10.029.

33. WO 2017/093528- Medical implants and methods of preparation thereof crossreference to related applications -2019

34. WO2020070694A1- Scaffolding for implantable medical devices and methods of use, 2020

35. Byme, M.K., Miellet, S., McGlinn, A. et al. The drivers of antibiotic use and misuse: the development and investigation of a theory driven community measure. BMC Public Health 19, 1425 (2019). https://doi.org/10.1186/sl2889-019-7796-8.

36. US20120277860A1 -Lightweight breast implant material, 2012

37. Brevet 10912636 -Textured surfaces for breast implants

38. Victor, A.H., Apolonia, S., Ribeiro, J.G., Araujo, F.F., Braganpa, Portugal, Apolonia, C.S., Cefet, Reis, R.C., Janeiro, R.D., & Brasil (2019). Study of PDMS characterization and its applications in biomedicine: A review. Journal of Mechanical Engineering and Biomechanics.

39. Lee, S. W., Phillips, K. S., Gu, H., Kazemzadeh-Narbat, M., & Ren, D. (2021). How microbes read the map: Effects of implant topography on bacterial adhesion and biofilm formation. Biomaterials, 268, 120595. https://doi.Org/10.1016/j.biomaterials.2020.120595

40. Zheng, S., Bawazir, M., Dhall, A., Kim, H., He, L., Heo, J., & Hwang, G. (2021). Implication of Surface Properties, Bacterial Motility, and Hydrodynamic Conditions on Bacterial Surface Sensing and Their Inițial Adhesion. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 9, 643722. https://doi.org/10.3389/fbioe.2021.643722}.

41. Chien, H. W., Chen, X. Y., Tsai, W. P., and Lee, M. (2020). Inhibition of biofilm formation by rough shark skin-pattemed surfaces. Colloids Surf. B Biointerf. 186:110738. doi: 10.1016/j.colsurfb.2019.110738

42. Ding, A. M., Palmer, R. J. Jr., Cisar, J. O., and Kolenbrander, P. E. (2010). Shearenhanced oral microbial adhesion. Appl. Environ. MicrobioL 76, 1294-1297. doi: 10.1128/aem.02083-09

43. Wang, H.B.; Dembo, M.; Wang, Y.L. Substrate flexibility regulates growth and apoptosis of normal but nottransformed cells. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2000, 279, C1345C1350.;

44. Pelham, R.J., Jr.; Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. NatLAcad. Sci. USA 1997, 94, 13661-13665].

Claims (5)

1. Revendicări

   1. Suprafețele finale texturale sunt caracterizate prin aceea ca pot fi obținute matrici de structuri lineare radiale poroase cu rol dual in minimizarea adeziunii de microorganisme si de atenuare a profilului inflamator.
2. 2. Noile structuri obținute în condițiile revendicării 1, sunt caracterizate de forțe de adeziune crescute, rugozitate si hidrofobicitate crescute fata de suprafețele nestructurate
3. 3. Structurile obținute în condițiile revendicării 1 sunt caracterizate prin aceea ca permit atașarea celulelor macrofage caracterizate de un aspect morfologic adaptat la topologia suprafeței materialelor pe baza de PDMS
4. 4. Structurile obținute în condițiile revendicării 1 sunt caracterizate prin aceea ca nivelul de citochine TNF-α masurat atesta absenta unui efect inflamator pentru structurile lineare porosase, nivelul de TNF-α fiind nesemnificativ fata de CTRL (celule crescute pe coverslip si tratate cu LPS).
5. 5. Structurile obținute în condițiile revendicării 1 sunt caracterizate prin aceea ca nu favorizează aderarea microorganismelor si implicit formarea de biofilm.