TR2021018843A2 - Kornea endoteli hücre kültürü için gül taç yaprağı topografisi desenli hücre platformu. - Google Patents

Abstract

Buluş, kornea endoteli hücrelerinin in vitro çoğaltılması ile ilgili tüm gerekli uygulamalarda kullanılabilen, gül taç yaprağı topografisi desenli bir hücre platformu ile ilgilidir. Söz konusu buluş ile ilaç araştırmalarında, hücre bazlı terapilerde, mikroakışkan sistemlerde ve organ çiplerde kullanılabilen, kornea endoteli mikroçevresini düz platformlara göre çok daha iyi taklit ederek hücrelerinin vitro ortamdaki fonksiyonlarını iyileştiren, biyomedikal, biyomühendislik ve biyomalzeme bilimlerinde kullanılabilen bir ortam sunulmaktadır. Buluş ile, sağlıklı kornea endoteli mikroçevresi benzeri mikro ve nano özelliklere sahip yapılar gül taç yaprağı topografisi taklidi ile elde edilmekte; sağlıklı dokunun biyokimyasal ve mekanik özelliklere uygun olarak seçilen malzeme çeşidi ile kornea endoteli hasarı tedavisinde donör ihtiyacı azaltılmakta ve ilaç araştırmalarında hücre içi ortamdakine en yakın sonuçların alınabileceği bir hücre kültürü ortamı sağlanmaktadır.

Description

TARIFNAME KORNEA ENDOTELI HÜCRE KÜLTÜRÜ IÇIN GÜL TAÇ YAPRAGI TOPOGRAFISI DESENLI HÜCRE PLATFORMU Bulusun Ilgili Oldugu Teknik Alan Bulus, kornea endoteli hücrelerinin in vitro çogaltilmasi ile ilgili tüm gerekli uygulamalarda kullanilabilen, gül taç yapragi topografisi desenli bir hücre platformu ile ilgilidir. Söz konusu bulus ile ilaç arastirmalarinda, hücre-bazli terapilerde, mikroakiskan sistemlerde ve organ-çiplerde kullanilabilen, kornea endoteli mikroçevresini düz platformlara göre çok daha iyi taklit ederek hücrelerin in vitro ortamdaki fonksiyonlarini iyilestiren, biyomedikal, biyomühendislik ve biyomalzeme bilimlerinde kullanilabilen bir ortam sunulmaktadir. Teknigin Bilinen Durumu Komea endotel hücreleri poligonal (çogunlukla altigen) sekilli hücreler olup, korneanin ön yüzeyinde tek katmanli bir tabaka olustururlar. Bu hücreler, korneanin isik geçirgenligini korumak için korneaya sivi transferinden sorumlulardir. Genç yetiskinlerde kornea endotel hücresi yogunlugu 3000-3500 hücre/mm2 iken, ilerleyen yaslarda bu hücre yogunlugu, hücrelerin mitotik olarak inaktif olan dogalarindan kaynakli olarak düsmektedir. Ayrica, travma, çesitli hastaliklar ve cerrahi islemler de kornea endotel hücre yogunlugu düsüsünü hizlandirmaktadir. Hücre yogunlugu belirli bir kritik seviyenin altina düstügünde (yaklasik 500 hücre/mmz) endotelyum fonksiyonunu yitirir ve korneanin optik geçirgenligini kaybetmesine, hatta ilerleyen vakalarla körlüge varan görüs sorunlarina sebep olur. Günümüzde kornea endoteli fonksiyonunu geri kazanim için kullanilan tedavilerde tam kat veya belirli katmanlar için keratoplasti uygulanmaktadir ve bunun için de hastaya uyumlu ve hücre yogunlugu yüksek donör doku ihtiyaci olusmaktadir. Kullanilan bu tedavilerin basarili olmasina karsin doku reddi, enfeksiyon ve hastaya uyumlu olan nakledilebilir dokularin bulunma zorlugu bu uygulamalarin kullanilabilirligini azaltmaktadir. Dünyada yaslanan nüfus ile artan kornea endoteli fonksiyonu bozukluklari sebebiyle, hastaya uyumlu donör bekleme listeleri her gün daha da uzamaktadir. Ayrica, genç donörlerden alinan dokular çogunlukla nakil için kullanilabiliyorken, yasli donörlerden elde edilenlerin hücre yogunlugu nakil için uygun olmadigindan, sadece hücre kültürü için kullanilabilmektedir. Bu sebeple, alternatif tedavi ihtiyaci her geçen gün artmakta ve kornea endoteli kaynakli görüs bozulmalarini tedavi etmek veya endotel tabakasini yenilemek için alternatif terapilere ihtiyaç duyulmaktadir. Hücre bazli tedaviler, kornea endoteli hücrelerinin vücut disinda belirli özelliklere sahip biyomalzemeler üzerinde çogaltilmasini ve hasarli endotelyuma nakledilmesini amaçlayarak, kornea endotelyumunun yenilenmesine yeni bir tedavi olanagi saglamaktadir. Ancak, kornea endoteli hücrelerinin in vitro ortamdaki kisitli çogalma kapasitelerine ek olarak hücrelerin temel fonksiyonlarinin vücut disinda korunabilmesi, bu alandaki en büyük zorluklardandir. In vivo sartlarda hücre mikroçevresinden gelen topografiki mekanik ve biyokimyasal sinyallerin hücre davranislarini etkiledigi bilinmektedir. Ayrica dogadaki çogu yapinin da nano ve mikro sekillerinin hücre biyouyumlulugunu arttirdigi görülmüstür. Kornea endoteli hücrelerinin vücut disinda çogaltilmasi amaçli, bu hücrelerin dogal yapisina benzer biyomalzeme tasarimlarina ve hücrelerin üzerinde büyüdügü yüzey olan hücre substrati tasarimlarina iliskin çalismalara literatürde rastlanmaktadir. Standart hücre kültürü çalismalarinda düz/desensiz yüzeylere sahip hücre kültürü platformlari kullanilirken; son arastirmalar, pürüzIü/desenli yüzey topografisine sahip substratlarin hücre davranislari üzerine olumlu etkisini ortaya koymaktadir. Önceki teknikte yer alan, kornea endoteli altindaki doku olan Descemet membraninin topografik özelliklerinden esinlenen bir çalismada, polimer hücre platformlari üzerinde mikro ve nano ölçekte geometrik desenler (sütun ve kuyucuklar) hazirlanmis ve bunlarin kornea endoteli hücreleri in vitro fonksiyonlarini iyilestirdigi saptanmistir [1]. Benzer bir çalismada, desenlenmis hücre kültürü plakalarinin in vitro kornea endoteli çogalmasini ve ilgili protein ifadelerini arttirdigi belirtilmistir [2]. Teknigin bilinen durumunda, insan kornea endotel hücreleri ile yapilan bir arastirmada ise 1 um boyutundaki sütunlarla olusturulan hücre substrati yüzeylerinde, en yüksek hücre çogalma hizina ulasildigi belirtilmistir [3]. Yine yüzey topografisinde 1 um boyutundaki sütunlarin kullanildigi bir baska çalismada, bu desenlerin kare ve altigen seklindeki siralanmalarinin, kornea endoteline özel protein ve gen ifadesini arttirdigi kaydedilmistir [4]. Bir diger çalismada ise, donör dokudan elde edilen Descemet membraninin taklidi ile hazirlanan polimer yapilarin, mezenkimal kök hücrelerinin kornea endoteli hücrelerine farklilasmasini destekledigi, kornea endoteline özgü poligonal hücre morfolojisi ile bu hücrelere özgü genlerin ifadesini belirttigi de raporlanmistir [5]. Diger bir çalismada ise kornea endoteli hücrelerinin hücre disi ortamda çogalmalarini desteklemek amaciyla, Descemet membranindan esinlenerek, hücre boyutlarinda altigen kuyucuklarla desenlenmis platformlar hazirlanmistir [6]. Yukarida açiklanan tüm bu çalismalar kornea endoteli hücrelerinin in vitro hücre kültüründe kullanilan yüzeylerin topografik özelliklerinin, hücre davranislarina olan etkisini açiklamis ve mikroçevre taklidi yapilarin hücre fonksiyonelligine olan olumlu etkisini ortaya koymustur. Fakat, kornea endoteli mikroçevresine benzer geometrik desenler içeren bu hücre substrati yüzeyleri, her ne kadar desensiz yüzeylere göre daha olumlu sonuçlar elde edilmesini saglasa da kornea endoteli hücrelerinin fonksiyonel özelliklerini koruyarak çogaltilmasi açisindan yetersiz kalmaktadir. Bu da hücre substrati yüzeylerinin, kornea endoteli hücrelerinin davranislari üzerine olan pozitif etkilerini sinirlamaktadir. Ayrica, donör dokudan elde edilen Descemet membraninin taklidi ile elde edilen hücre substrati yüzeyleri için belirli yas araliginda ve tamamen saglikli donör dokularin ihtiyaci ortaya çikmaktadir. Bu ihtiyaç da tüm bu yapilan çalismalarla azaltilmaya çalisilan ve oldukça zor elde edilen donör doku gereksinimini tekrar gündeme getirmektedir. Bu sebeple teknikte mevcut çalismalar, donör doku ihtiyaci olusturmadan kornea endoteli hücrelerinin in vitro ortamda kendi dogal ortamlarinda hissetmeleri, hücrelerin fonksiyonelliklerini korumalari ve çogalmalarini destekleme konusunda yetersiz kalmaktadir. U88580564BZ patentinde memeli hücre kültürü ve hücre farklilastirilmasi için biyomimetik hücre kültürü iskeleleri açiklanmaktadir. Bu hücre kültürü iskeleleri genel olarak memeli hücrelerinin kültürü için önerilmektedir. Bu iskelelerin kornea endoteli hücrelerine özel olmamasinin yaninda, burada kornea endoteli hücrelerinin mikroçevresine benzer desenlere sahip yüzeylerden söz edilmemektedir. Ayrica bu patentteki hücre kültürü iskeleleri üç boyutlu olarak verilmekte ve doku mühendisligi uygulamalarini hedef almaktadir. kolajen kapli jelatin hidrojel tabakalari açiklanmaktadir. Buradaki tabaka, bir jelatin hidrojel içinde kornea endotel hücrelerini içermekte ve kornea endotel hücrelerinin kolajen ile kaplanmis bir jelatin hidrojel üzerinde kültürlenmesiyle elde edilmektedir. Burada, kornea transplantasyonlarinda kullanilmak üzere önerilen bu tabakalarin özellikle seffaf, biyouyumlu ve biyobozunur olmalari öne çikarilmakta ve dolayisiyla tabakalarin biyokimyasal özelliklerine deginilmektedir. Ancak, bu tabakalarin yüzeylerinin topografik özellikleri, kornea endoteli mikroçevresine benzer sekilde ayarlanmamaktadir. kullanilacak, bitki türevli hücre kültürü malzemeleri ile ilgilidir. Burada ayrica hücrelerin kültürlenmesine yönelik bir yöntem açiklanmakta ve bu yöntem, hücrelerin saglanmasi; hücrelerin bir matris olusturmak üzere selüloz nanolifleri veya bunlarin bir türevini içeren bir hücre kültürü bilesimi ile temas ettirilmesi ve bahsi matris içindeki hücrelerin üç boyutlu veya iki boyutlu bir düzenlemede kültürlenmesi islem adimlarini içermektedir. Bu hücre kültürü malzemelerinin kornea endoteli hücreleri üzerine etkinliginin gösterilmemesinin yaninda, burada korneaya özgü yüzey desenlerine deginilmemekte ve genel hücre kültürü için bir yöntem önerilmektedir. uygun kavise sahip kaliplar hazirlanip, bu kaliplarda jelatin tabakalar elde edilip kornea endoteli hücre katmani olusturulmaktadir. Hücre tabakalarinin insan kornea endoteli yüzeyindekine benzer kavisteki kaliplarda elde edilmesi sayesinde kornea endoteli hücre tabakalarinin transplantasyonunda düz kaliplara göre çok daha basarili sonuçlar elde edilmesi saglanmaktadir. Ancak burada, kavisli kaliplarin in vitro ortamdaki hücre davranislari üzerine olan etkisine, kornea endoteli hücrelerinin bilinen dogal mikro ya da nano desenlerine benzer yüzey topografilerine yer verilmemistir. süperhidrofobik bir yüzey saglayan çok sayida sekil ve boyutta mikro özelliklerin hiyerarsik düzenlemesi yoluyla arttirilmis yüzey alanina sahip bir substrat ile ilgilidir. Burada, çok katmanli mikro yapili yüzey deseni gelistirmek için dogal kirmizi gül yapragindan ve onun özelliklerinden ilham alinarak desenler tasarlanmistir. Burada, bahsi geçen substratlarin nemli organ ve kas dokularina uygulandiginda yüksek kayma sürtünmesi ve yüksek yüzey adezyonu sagladigindan bahsedilmesine karsin, kornea endoteli hücre kültürü de dahil olmak üzere herhangi bir hücre tipinin in vitro kültüründe bir hücre substrati olarak kullanimindan bahsedilmemektedir. Önceki teknikte hücre kültürü genellikle düz, yani desensiz hücre platformu yüzeyleri üzerinde yapilmaktadir. Yukaridaki çalismalarda belirtildigi üzere önceki teknikte kornea endoteli kültürü için desenli hücre platformu yüzeylerinin hazirlandigi bazi çalismalar mevcuttur. Bu çalismalarda kornea endoteli hücrelerinin in vitro ortamda fonksiyonelliklerinin korunarak çogaltilmasi amaçli hazirlanan hücre kültürü platformlarinin yüzey topografileri kornea endoteli mikroçevresi benzeri geometrik sekiller kullanilarak veya yine bir donör doku yardimiyla hazirlanmaktadir. Gerçek yapidan esinlenerek hazirlanan bu platformlar her ne kadar yüksek teknoloji kullanilirsa kullanilsin, dogada kendiliginden var olan, biyouyumlulugu destekleyen, benzersiz mikro ve nano desenlere ulasamamaktadir. Donör yapi taklidi ile üretilen hücre kültürü ortamlari için ise yine saglikli donör doku ihtiyaci ortaya çikmaktadir. Mevcut teknikteki hücre kültürü platformlarinda kullanilan desenlerin saglikli kornea endoteli mikroçevresine yeterince benzer mikro ve nano özelliklere sahip olmamasi, mevcut yöntemlerin kornea endoteli hücrelerinin in vitro çogaltilmasinda donör ihtiyacini azaltamamasi ve ilaç arastirmalarinda in vivo ortamdakine en yakin sonuçlarin alinamamasi dolayisiyla; saglikli kornea endoteli mikroçevresine yüksek benzerlikte mikro ve nano özelliklere sahip, kornea endoteli hücrelerinin in vitro çogaltilmasinda donör ihtiyacini azaltan, ve ilaç arastirmalarinda in vivo ortamdaki hücre özelliklerine en yakin sonuçlarin alinabilecegi hücre kültürü platformlarinin gelistirilmesi ihtiyaci bulunmaktadir. Bulusun Kisa Açiklamasi Bulusta, kornea endoteli hücrelerinin in vitro çogaltilmasi için gül taç yapragi topografisi desenli bir yüzeye sahip hücre platformu açiklanmaktadir. Bulusta olusturulan, hücrelerin üzerinde çogaldigi substratlarin kornea endoteli mikroçevresine mikro ve nano boyutlarda oldukça benzeyen yüzey özellikleri sayesinde, donör doku ihtiyaci olusturmadan kornea endoteli hücrelerinin in vitro ortamda kendi dogal ortamlarinda hissetmeleri ve dolayisiyla fonksiyonelliklerini korumalari saglanmakta, böylece kornea endoteli hücrelerinin hücre platformu üzerinde çogalmalari desteklenmektedir. Bulusun ilk amaci, saglikli kornea endoteli hücrelerinin dogal mikroçevresinin topografik özelliklerine yüksek uyumluluk gösteren bir ortam saglanmasi, böylece hücrelerin in vitro ortamdaki fonksiyonelliklerini korumalarina destek olunmasi ve çogalmalarinin tetiklenmesidir. Bulus ile gül taç yapragi topografisinin saglikli insan kornea endoteli mikroçevresine olan benzerligi gösterilmekte, gül taç yapragi taklidi hücre platformlari ile hücrelerin in vitro ortamdaki fonksiyonelliklerini korumalarina destek olunmakta ve çogalmalari desteklenmektedir. Gül taç yapragi desenli platform, kornea endotel hücre benzeri bir derinlik saglamakta ve taze gül taç yapragi, en iyi sekilde kornea endotel hücre seklini taklit eden altigen benzeri hücreler saglamaktadir. Kornea endotel hücre seklini taklit eden altigen benzeri hücreler, izotropik olmayan özel düzensiz bir yapi olusturmakta ve bu sayede kornea endotel hücre seklini en iyi sekilde taklit etmektedir. Bu özel desenler birçok hücre substrati malzemesi ile elde edilebilmekte ve dolayisiyla kornea endoteline uyumlu topografiye sahip platformlarin mekanik ve kimyasal özellikleri istenilen amaca göre ayarlanabilmektedir. Hücre disi ortamda fonksiyonelligi korunarak çogaltilmasi oldukça zor olan kornea endoteli hücrelerinin, bulusa konu gül taç yapragi taklidi hücre substrati yüzeyleri ile fonksiyonellikleri korunmakta ve bu hücreler platform üzerinde çogaltilmaktadir. Bulusun diger amaci, kornea endoteli hücrelerinin çogaltilmasinda kullanilan hücre platformlarinin yüzey desenlemesinin kolayca ulasilabilen bir yapi kullanilarak olusturulabilmesidir. Bulus ile saglikli insan kornea endoteli hücre yapisina ve hücre yogunluguna uygun hücre substrati yüzey desenlenmesi, yine dogada kolayca ulasilabilecek bir yapi olan gül taç yapragi ile saglanmakta; böylelikle herhangi bir çiçekçiden alinabilecek bir gül ile dogada kendiliginden olusan yüksek biyouyumluluga sahip mikro ve nano yapilara sahip hücre platformu topografisi elde edilmektedir. Bulusta özellikle biyomimetik bir yaklasim kullanilarak direkt olarak orjinal gül yapraklarinin kalibi çikarilip, spesifik olarak kornea endoteli hücreleri in vitro kültürü için hücre substrati desenlemesi yapilmaktadir. Bulus kapsaminda olusturulan platformlar ile hücre bazli tedavilerin yani sira; ilaç sektörü, biyomedikal arastirmalar ve malzeme bilimi çalismalarinda da kornea endoteli hücreleri in vitro ortamda çogaltilabilmektedir. Bulusun bir diger amaci, keratoplasti için gerekli donör doku ihtiyacini azaltabilecek ve in vitro ortamda kornea endoteli hücrelerinin büyümesini saglayacak alternatif bir ortam olusturmaktir. Bulusa konu gül taç yapragi taklidi hücre substrati yüzeyleri ile nakil için gerekli hücre yogunluguna sahip olmayan yasli dokularin hücre yogunlugu, in vitro hücre kültüründe arttirilmaktadir. Buna ek olarak, hastadan alinabilecek kök hücrelerin bulusta açiklanan gül taç yapragi taklidi desene sahip hücre substratlari kullanilarak, kornea endoteline farklilastirilmalari saglanip hem doku reddi ihtimali hem de donör doku ihtiyaci ortadan kaldirilmaktadir. Bulus sayesinde donör doku ihtiyacini ortadan kaldirarak, düsük bütçe ile elde edilebilen gül taç yapragi taklidi desenler, birçok biyomalzemeye uygulanabilmektedir. Dogal ve biyobozunur özellikteki maddelerin yani sira sentetik malzemelerde de bu yüzey topografisi elde edilebilmektedir. Bulusun bir diger amaci, ilaç arastirmalari için kornea endoteli hücrelerinin in vivo ortamdaki fonksiyonelligine benzer sekilde in vitro ortamda da fonksiyonelliginin ve davranislarinin korunmasidir. Bunun için bulusta hücre substrati hazirliginda gül taç yapragi taklidi desenler kullanilmakta, bu sayede hem hücre substratlarinin biyouyumlulugu arttirilmakta hem de hücrelerin etkilesimde olduklari platformdan aldiklari fiziksel uyarilar, kendi dogal mikroçevrelerine mikro ve nano ölçekte çok daha benzer oldugundan, incelenecek ilaca karsi hücreler tarafindan verilen tepkiler gerçege çok daha yakin olmaktadir. Gül taç yapragi taklidi desenler, kornea endoteli hücrelerinin kimyasal ve mekanik özellikleri ile uyumlu olup, hücrelerin in vitro hücre kültüründeki davranislarini olumlu yönde etkilemekte ve fonksiyonel özelliklerinin korunmasini saglamaktadir. Ek olarak, bulusta gül taç yapragi benzeri desenlemesi yapilan yüzey, kornea endoteli hücre disi matriksinde bulunan makromoleküller kullanilarak kimyasal olarak modifiye edilmekte ve böylece substratlarin biyomimetik özellikleri daha da gelistirilmektedir. Substratlarin biyomimetik özellikleri gelistirildikçe hücre disi ortamdaki kültürlerde dogala daha yakin sonuçlar elde edilip, hücre çogalmasi desteklenmektedir. Bulustaki kolajen kapli jelatin hidrojellerin yüzeylerinde kornea endoteli mikroçevresi benzeri desenler elde edilerek, kornea endoteli hücrelerinin fonksiyonlarinin iyilestirilmesi saglanmaktadir. Bulusta gül taç yapragi topografisi taklidi desen sayesinde saglikli kornea endoteli mikroçevresine yüksek benzerlikte mikro ve nano özelliklere sahip, kornea endoteli hücrelerinin in vitro çogaltilmasinda donör ihtiyacini azaltan, ilaç arastirmalarinda In w'vo ortamdaki hücre özelliklerine en yakin sonuçlarin alinabilecegi ve hücrelerin çogalmasi sirasinda fonksiyonel özelliklerin korundugu bir hücre kültürü platformu saglanmaktadir. Sekillerin Açiklamasi Sekil 1: (A) Beyaz gül taç yapragi taklidi kuyucuklu desen polidimetilsiloksan (PDMS) topografisinin taramali elektron mikroskobu (SEM) görüntüsü ve (B) saglikli insan kornea endoteli hücrelerinin konfokal mikroskobu görüntüsü. Sekil 2: PDMS yüzeylerde gül taç yapragi desenlerinin SEM görüntüleri; (A) (i) taze kirmizi gül yapragi ve (ii) kuru kirmizi gül yapragi, (iii) taze beyaz gül yapragi ve (iv) kuru beyaz gül yapragi desenlerinin pozitif kopyalari; (B) (i) taze beyaz gül yapragi desenli ve (ii) taze kirmizi gül yapragi desenli PDMS'nin yüzey topografyasi ölçümleri; (C) (i) taze beyaz gül desenli kalip ve (ii) taze beyaz gül desenli hücre substrati. Sekil 3: PDMS yüzeylerinde sigir kornea endoteli hücrelerinin çogalmasi ve hücre morfolojilerinin incelenmesi; (A) desensiz PDMS yüzeyler üzerinde kornea endoteli hücrelerinin çogalmasi, (B) beyaz gül taç yapragi desenli PDMS yüzeyler üzerinde kornea endoteli hücrelerinin çogalmasi ve (C) hücre kültürünün 7. gününde düz ve desenli yüzeylerin üzerinde kornea endoteli hücrelerinin aktin hücre iskeleti (yesil) ve hücre çekirdegi (mavi) boyamasi (ölçek çubugu = 100 pm) (PDMS: dogal PDMS, PDMS-C4: Kolajen tip 4 modifikasyonu yapilmis PDMS, PDMS-HA: Hyaluronik asit modifikasyonu yapilmis PDMS, TCP: standart hücre kültürü tabakalari, -R: beyaz gül taç yapragi desenli substratlar). Sekil 4: PDMS hücre kültürü substratlari üzerinde çogaltilan sigir kornea endoteli hücrelerinin kornea endoteline özel belirteçlerden Na+/K+ ATPase (kirmizi) immünofloresan boyamasi ile hücre çekirdegi (mavi) boyamasi (ölçek çubugu = 100 pm) (PDMS: dogal PDMS, PDMS-C4: Kolajen tip 4 modifikasyonu yapilmis PDMS, PDMS-HA: Hyaluronik asit modifikasyonu yapilmis PDMS, TCP: standart hücre kültürü tabakalari, -R: beyaz gül taç yapragi desenli substratlar). Bulusun Ayrintili Açiklamasi Bulus, kornea endoteli hücrelerinin in vitro çogaltilmasi ile ilgili tüm gerekli uygulamalarda kullanilabilen, gül taç yapragi topografisi desenli bir hücre platformu ile ilgilidir. Bulus ile kornea endoteli mikroçevresi ile gül taç yapragi, özellikle beyaz gül taç yapragi topografisindeki mikro ve nano düzeydeki benzerlikler gösterilmektedir. Bulus ile biyomimetik yaklasim kullanilarak gelistirilen hücre kültürü platformlarinin hücre substrati yüzeyinde olusturulan gül taç yapragi desenlemeleri sayesinde in vitro kornea endoteli hücre kültürü için kullanilan bir kültür ortami saglanmaktadir. Bulus ile saglikli kornea endotel hücreleri mikroçevresi benzeri üç boyutlu yapilar, gül (Rosa Pascali', Rosa Hybrida, Rosa Damascena, Rosa Gallica, Rosa Moschata, Rosa Kordesii, Rosa Rugosa, Rosa La Sevil/ana, Laxa veya Rosa Zori'na gibi yabani, modern veya bahçe gülü çesitleri) taç yapragi topografisi ile dogal ve/veya sentetik malzemeler kullanilarak olusturulmaktadir. Kullanilan malzemelere bagli olarak elde edilen hücre platformunun kimyasal, mekanik ve biyolojik özellikleri kornea endoteli mikroçevresine uygun aralikta ayarlanip, hücre kültürü platformlarinin biyomimetik özellikleri arttirilabilmektedir. Bulusta saglikli insan kornea endotelinin dogal mekanik özelliklerinde ( ana malzeme kullanilarak, bu hücre kültürü malzemesinin kültür yapilan substrat yüzeyinin gül taç yapragi benzeri desenlemesi yapilmaktadir. Ayni zamanda bu substrat yüzeyi, kornea endoteli hücre disi matriksinde bulunan makromoleküller kullanilarak kimyasal olarak modifiye edilmekte ve böylece substratlarin biyomimetik özellikleri daha da gelistirilmektedir. Substratlarin biyomimetik özellikleri gelistirildikçe hücre disi ortamdaki kültürlerde dogala daha yakin sonuçlar elde edilip, hücre çogalmasi desteklenmektedir. Bulus kapsaminda belirtilen gül taç yapragi topografisi taklidi yüzeylerin hazirlanmasi için bulusun tercih edilen bir uygulamasinda, beyaz gül taç yapragi topografisi desenli PDMS membranlar üretilmektedir. Bulusa konu hücre platformunun üretilmesi için öncelikle, tercihen beyaz gülün (örnegin Rosa Pascai'i') taç yapraklari ayrilarak sabitlenir. Bulusa konu hücre platformunda yer alan hücre substrati yüzeyindeki taklit yapilar, direkt olarak gül taç yapraklari kullanilarak hazirlanabilecegi gibi, taç yaprak topografisinin aynisina sahip bir kalip ile de elde edilebilir. Bulusta hücrelerin üzerinde çogaldigi substratlarin üretilmesinde, gül taç yapragi üzerine polimer dökülerek kuyucuk içeren bir negatif kopya (substrat) olusturulabilmekte veya bu negatif kopyalarin kalibi olan tepecikli/kabartili yapi içeren pozitif kopya (kalip) olusturulabilmektedir. Negatif kopya ve pozitif kopya kullanimi ile benzer hücre kültürü platformlari hazirlanabilmektedir. Pozitif kopya kullanimi ile aslinda negatif kopyanin bir kalibi üretildiginden, her defasinda tam olarak ayni desene sahip substrat/platform üretimi ve sürecin tekrarlanabilirligi saglanmaktadir. Negatif kopyanin olusturuldugu yöntemde, kullanilan gül taç yapraginin kopyalanan yerine göre desenlerde çok ufak farkliliklar olabilmektedir. Kuyucuk içeren negatif kopya (substrat), direkt olarak hücre kültürü platformunun özelliklerini tasir. Pozitif kopya olan kabartili yapi içeren kaliplarla ise en basta kullanilan negatif kopyalarin birebir aynilari üretilerek, ayni desene sahip kuyucuk deseni içeren hücre kültürü platformlari elde edilir. Negatif kopyanin çogaltilmasi için negatif kopya altin kaplanarak kopyalarin kaliplari çikarilir ve pozitif kopya elde edilir. Bu pozitif kopya olan kalip da tekrar altin kaplanarak, bulusa konu platformu üretmede kullanilan ana kalibi olusturur. Bulusta altin kaplanmasinin amaci yüzeylerdeki desenlerin bozulmasinin önüne geçilmesi ve tekrar tekrar kullanilabilirliginin saglanmasidir. Altin kaplama için optimum parametreler 1.5 W, 10 mA ve 4 dakika seklindedir. Altinin ince bir tabaka olarak kaplanmasi yeterlidir. Altin kaplama basamagi olmadan, sadece gül taç yapraklari kullanilarak da platformlar hazirlanabilmektedir. Ancak, sürecin tamamen ayni desenler ile tekrarlanabilmesi açisindan kalip kullanimi önerilir. Böylece, tamamen ayni desene sahip hücre kültürü substrati yüzeyleri elde edilerek, sürecin tekrarlanabilmesi saglanir. Üretilen kuyucuk desenli substrat direkt olarak kornea endoteli hücre kültürü platformunda kullanilmaktadir. Bahsi geçen kabarti desenli topografiye sahip pozitif kopya olan kaliba dökülerek elde edilen substratin yüzey topografisi ile negatif kopya olarak hazirlanan substratin yüzey topgrafisi ayni özelliklere sahip olmaktadir. Bulusun bir uygulamasinda, negatif kopya olusturulmasi için kütlece 30:1 oraninda PDMS ön polimerizçapraz baglayici kullanilarak hazirlanan PDMS karisimi, homojenlesene dek karistirilir. Buradaki ön polimer ve oran sadece PDMS özelinde kullanilmaktadir. Bulusun diger uygulamalarinda PDMS disinda bir polimer kullanilmasi durumunda, seçilen polimere özgü kimyasallar, oranlar ve hazirlama teknigi kullanilmaktadir. Bulusun PDMS içeren uygulamasinda, 1- mbar arasinda vakum altinda hava kabarciklarindan arindirilan polimer, mikro ve nano kabarti/tepecik desenli topografi içeren sabitlenmis taç yapraklar üzerine istenen kalinlikta dökülür. Bulusun bu uygulamasinda PDMS ön polimeri ve çapraz baglayici ile elde edilen PDMS'in 70°C'de 4 saat boyunca hava kabarcigi kontrolü yapilarak yaprak üzerinde sertlesmesi beklenir. Sertlesen PDMS polimeri, gül yapraklarindan ayristirilir ve distile su içinde sonikasyon islemi uygulanir. Temizlenen ve kuyucuk desenli topografi içeren PDMS polimer kurutularak kullanima hazir substrat haline getirilir ve bu substrat kornea endoteli hücreleri için hücre platfomunda kullanilir. Bulusa konu hücre platformunun negatif kopya olarak üretim yöntemi genel hatlariyla, i. gülün taç yapraklarinin ayrilarak taç yapraginin sabitlenmesi, ii. substrat olusturulmasi için polimer karisiminin hazirlanmasi, iii. polimerin vakum altinda hava kabarciklarindan arindirilmasi ve polimerin iv. taç yapragi üzerine dökülen polimer karisiminin taç yapragi üzerinde polimerlestirilmesi, v. polimerlesen malzemenin gül yapraklarindan ayristirilmasi ve polimerin temizlenmesi ile gül taç yapragi taklidi üç boyutlu yüzey topografisi desenine sahip kuyucuklu yapida substrat (negatif kopya) içeren hücre platformunun elde edilmesi, Ayni yüzey topografisine sahip substratlarin üretilmesi ve tekrarlanabilirligin saglanmasi için negatif kopya olusturulmasi ardindan kabartili yapi içeren kalip, yani pozitif kopya hazirlanmasi önerilir. Pozitif kopya (kalip) hazirlanarak gerçeklestirilen üretim yönteminde ise, üretilen 10:1 oranindaki PDMS ön polimerizçapraz baglayici ile hazirlanan kuyucuk desenli topografiye sahip PDMS polimer (negatif kopya) yüzeyleri püskürtmeli kaplama yöntemi kullanilarak tercihen altin kaplanir (. Ardindan, kütlece 15:1 oraninda PDMS ön polimerizçapraz baglayici ile hazirlanan PDMS, altin kapli negatif kopyanin/substratin üzerine dökülerek yumusak litografi teknigi ile kabarti desenli topografiye sahip taklit yüzeyi olan pozitif kopya (kalip) elde edilir. Bu pozitif kopya da tekrar altin kaplanarak, bulusa konu platformu üretmede kullanilan ana kalibi olusturur. Polimer, tercihen PDMS için kullanilan bu oranlar, ürünlerin farkli sertliklerde hazirlanmasini saglayarak, kalip ve ürünlerin birbirlerinden ayrilma süreçlerini kolaylastirmaktadir. Kütlece 30:1 oraninda PDMS ön polimerizçapraz baglayici ile hazirlanan PDlVIS polimer, bahsi geçen pozitif kopya üzerine tercihen altin kaplanarak hazirlanan ana kaliba dökülüp polimerlestirilerek kuyucuk desenli topografiye sahip substrat ve bu substrati içeren hücre kültürü platformlari hazirlanir. Kullanilan farkli PDMS ön polimeri çapraz baglayici oranlari PDMS membranlarin farkli sertliklerde üretilmesini sagladigindan yumusak litografi ile kalip çikarilmasini kolaylastirir. Bulusa konu hücre platformunun pozitif kopya olarak üretim yöntemi genel hatlariyla, i. gülün taç yapraklarinin ayrilarak taç yapraginin sabitlenmesi, ii. substrat olusturulmasi için polimer karisiminin hazirlanmasi, iii. polimerin vakum altinda hava kabarciklarindan arindirilmasi ve polimerin iv. taç yapragi üzerine dökülen polimer karisiminin taç yapragi üzerinde polimerlestirilmesi, v. polimerlesen malzemenin gül yapraklarindan ayristirilmasi ve polimerin temizlenmesi ile gül taç yapragi taklidi üç boyutlu yüzey topografisi desenine sahip kuyucuklu yapida substratin (negatif kopya) elde edilmesi, vi. polimerin substrat üzerine dökülerek yumusak litografi teknigi ile kabarti desenli topografiye sahip taklit yüzeyi olan kalibin (pozitif kopya) elde edilmesi, vii. kalip yüzeyinin kaplanmasi ile ana kalibin elde edilmesi, viii. tekrar polimerin hazirlanmasi ve hazirlanan polimerin ana kaliba dökülmesi, ix. ana kaliba dökülen polimerin polimerlestirilmesi ardindan gül taç yapragi taklidi üç boyutlu yüzey topografisi desenine sahip kuyucuklu yapida substrat içeren hücre platformunun elde edilmesi, islem adimlarini içermektedir. Bu islem adimlarinda bahsi geçen (v) nolu islem adimindan sonra ve (vi) nolu islem adimindan önce substrat yüzeyinin püskürtmeli kaplama yöntemi kullanilarak altin veya platin kaplanabilir. Burada altin veya platin disinda, bu kaplamalar ile benzer gösterecek diger kaplamalar da kullanilabilmektedir. Bu islem adimlarinda bahsi geçen polimerin PDMS olmasi durumunda yöntem, (ii) nolu islem adiminda kütlece 10:1 oraninda PDMS ön polimerizçapraz baglayici ile elde edilen PDMS polimerin hazirlanmasi, (vi) nolu islem adiminda kütlece 15:1 oraninda PDMS ön polimerizçapraz baglayici ile elde edilen PDMS polimerin hazirlanmasi ve PDMS"in substrat üzerine dökülerek yumusak litografi teknigi ile kabarti desenli topografiye sahip taklit yüzeyi olan kalibin (pozitif kopya) elde edilmesi islem adimlarini içermektedir. Bu yöntemde bahsi geçen polimerin PDMS olmasi durumunda yöntem, (vii) nolu islem adiminda kütlece 3021 oraninda PDMS ön polimeri:çapraz baglayici ile elde edilen PDMS polimerin hazirlanmasi ve ana kaliba dökülmesi islem adimlarini içermektedir. Gül taklidi topografiye sahip hücre kültürü platformunun ve substratin hazirlanabilecegi polimer malzemeler; gliserol, hyaluronik asit, kolajen, aljinat, selüloz, kitosan, jelatin, jelatin metakrilat (GeIMA), poliakrilamit (PAM), polikaprolakton (PCL), karboksimetilkitosan, polikaprolakton (PCL), poliglikolik Asit (PGA), poli-l-laktik asit (PLLA), polilaktik asit-glikolik asit (PLGA), polihidroksialkanoat, poli-3-hidroksibütirat (PSHB), poli-4- hidroksibütirat (P4HB), polihidroksivalerat (PHV), polihidroksihekzanoat (PHH), polihidroksoktanoat (PHO)], polivinilalkol (PVA), polivinilklorür (PVC), polivinilprolidon (PVP), polivinilidenflorür (PVDF), polisiloksanlar [poli(methylhydrosiloxan), poli(dimetilsil0ksan) (PDMS), poli(metilfenilsiloksan), poli(vinilmetil-ko-dimetil) siloksanlar, poli(metiIhidrojenosiloksanlar), poli(hidrometilsiloksan)], polimetakrilatlar [poli (benzyl metakrilat), poli (butil metakrilat), poli (siklohekzil metakrilat), poli (dodesil metakrilat), poli (2-etoksietil metakrilat), poli(etil metakrilat), poli(hekzil metakrilat), poli(2-hidroksietil metakrilat), poli(izobütil metakrilat), poli(izopropil metakrilat), poli(metil metakrilat), poli(oktadesil metakrilat), poli(oktil metakrilat), poli(fenil metakrilat), poli(pr0pil metakrilat), poli (2-kloroetil metakrilat)], polihidroksimetakrilat (pHEMA), [genisletilmis politetrafloroetilen (e-PTFE), politetrafloroetilen (PTFE), polietilasetat (PEA), polieter eter keton (PEEK), poliüretan (PÜ) ve türevleri, polietilen (PE) ve türevleri, polipropilen (PP) ve türevleri, polietilenoksit (PEO), polistiren (PS), polikarbonat (PK) ve polietilenglikol (PEG) gibi polimerden en az biri olabilecegi gibi, bu malzeme grubunun karisimindan da (%10-90 araliginda degisen yüzdelerde hazirlanmali) seçilebilir ve bulusa konu platform bu malzemelerden mamul olabilir. Bulusa konu platformun birden fazla malzeme kullanilarak hazirlanmasi durumunda malzemelerin oranlari amaca yönelik degisecektir. Hücre kültürü platformunun boyutu ve kalinligi istenen sekilde hazirlanabilmektedir. Sertligi ise seçilecek platform malzemesine ve son asamada hazirlanan substrat kalinligina göre degisebilmektedir. Bulusa konu platformun tercih edilen uygulamasinda, platformun sertligi saglikli insan kornea endoteli sertligi olan 50 ± 17.8 kPa olarak belirlenmektedir. Hücrelerin vücut disinda fonksiyonelliklerini ve çogalmalarini koruyabilmek için bulunduklari platformlarin özelliklerini dogal mikroçevrelerine benzer olmasi gerektiginden sertligi optimum olarak saglikli insan kornea endoteli sertligine ayarlamak gerekmektedir. Bulusun bir uygulamasinda, yüzey desenlemesinin yaninda substrat malzemesi olarak saglikli insan korneasi mekanik özelliklerine benzer sekilde 200-290 kPa sertlige sahip sentetik bir polimer olan PDMS (30:1 PDMS ön polimeri ve çapraz baglayici orani ile 211.85 ± kullanilmasi ve bu substratlarin hücre kültürü yapilacak yüzeylerinin kornea endoteline özgü makromoleküller (kolajen tip i ve lV, fibronektin, Iaminin gibi) kullanilarak modifiye edilmesi ile topografik, mekanik ve biyokimyasal açidan biyomimetik hücre substratlari hazirlanabilmektedir. Böylelikle bulus ile elde edilen yüzey desenlerinin yani sira, substrat malzemesinin bütünsel ve yüzey özelliklerinin gelistirilmesi sayesinde kornea endotelinin dogal mikroçevresi daha genis bir kapsamla taklit edilebileceginden, bu substratlar üzerindeki hücre davranislari da dogal ortamdakine çok daha uyumlu olmaktadir. Bu uyum, hem in vitro ortamda kornea endoteli hücresi çogalmasini ve fonksiyonelitenin korunmasini saglamakta hem de kornea endoteline özgü ilaç arastirmalarinda vücut içindekine benzer sonuçlar elde edilmesini saglayip, yapilmasi muhtemel hayvan deneylerinin sayisini azaltmaktadir. Bulusun bir uygulamasinda, bulusa konu hücre kültürü platformunun kültür yapilacak yüzeyine fiziksel adsorpsiyon veya yüzeyin aktiflestirilmesi sonrasi modifikasyon ajani olarak 1-etiI-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid/N- hidroksisüksinimit (EDC/NHS) gibi çapraz baglayicilar kullanilarak kornea endoteli hücre disi matrisindeki makromoleküller ile yüzeyin kimyasal modifikasyonu gerçeklestirilebilmektedir. Böylece kornea endoteli mikroçevresini çok daha iyi taklit edecek hücre substrati yüzeyleri elde edildiginden, bu platformlar ile yapilan hücre kültürü çalismalarinda çok daha olumlu sonuçlar alinmaktadir. Bulus ile kornea endoteli ile alakali ilaç çalismalarinda da kullanilabilecek hücre substratlari saglanmaktadir. Bu substratlar kullanilarak yapilacak in vitro toksikolojik çalismalarda vücut içindekine çok daha yakin yanitlar alinabilmektedir. Ayrica, bu malzemelerin yüzey kimyasi/biyokimyasi, yukarida belirtilen bulusun bir uygulamasinda oldugu gibi farkli kaplamalar veya kimyasal reaksiyonlar ile modifiye edilebilir ve degistirilebilir. Bulusta substrat yüzeyinin modifiye edilmesi için kimyasal kaplama ajani, biyokimyasal kaplama ajani ya da modifikasyon ajani olarak laminin, fibronektin, kondroitin sülfat, fibrinojen, tüm kolajen tipleri, antibiyotikleri antienflamatuar ajanlar, yara iyilesmesini hizlandirici kimyasallar, grafen ve grafen oksitten en az biri kullanilabilir. Bulusun yukarida bahsi geçen tercih edilen uygulamasinda, beyaz gül taç yapragi topografisi ve kornea dostu (bütünsel korneaya özgü) Young modülü ( substratlari, önemli kornea hücre disi matris (ECM) bilesenlerinden ikisi olan kolajen IV (COL 4) ve/veya hyaluronik asit (HA) ile fonksiyonellestirilmektedir. Bu amaçla beyaz gül taç yapragi desenli PDMS substratlarin yüzeyinde oksijen plazma (50 sccm 02 akis, kullanilarak reaktif hidroksil gruplari olusturulmakta, sonrasinda ise PDMS substratlari hacimce %10 oraninda 3- aminopropil trietoksisilan içeren etil alkol çözeltisine daldirilarak yüzeyde -NH2 gruplari elde edilmektedir. 1 mg/mL HA ve 0,5 mg/mL COL 4 çözeltileri 1:1 EDC ve NHS içeren 2-(m0rf0lino) etansülfonik asit (MES) tampon çözeltisi (50 mM, pH .0) içinde hazirlanmakta ve 30 dakika boyunca karistirilmaktadir. Son olarak, yüzeyinde -NH2 gruplari elde edilmis olan PDMS substratlar bu çözeltiler içinde oda sicakliginda gece boyu bekletilmekte ve ertesi gün MES tampon çözeltisi ve su ile yikanmaktadir. Bulusta gül yapraginin pozitif ve negatif kopya olan topografik yapilarini tercihen PDMS substratlari üzerine aktarmak için yumusak litografi kullanilmaktadir. Sekil 1'de görüldügü üzere, beyaz gül taç yapragi taklidi kuyucuklu yapi içeren PDMS topografisinin SEM görüntüleri ve saglikli insan kornea endoteli hücrelerinin konfokal mikroskobu görüntüleri yüksek oranda benzerlik göstermektedir. Sekil 2Aida görüldügü üzere, taze kirmizi gül yapragi, (ii) kuru kirmizi gül yapragi, (iii) taze beyaz gül yapragi ve (iv) kuru beyaz gül yapragi desenli pozitif kopyalarin SEM görüntüleri verilmektedir Burada hem mikro hem de nano boyutlu yapilarin basariyla kopyalandigi görülmektedir. Her iki renkteki taze gül yapragi desenli olan pozitif kopyalarda; hücre sayisi fizyolojik olarak ilgili kornea endotel hücre yogunlugu araligindadir (= 2000 hücre/mmî). Desenli PDMS'nin mikro oluk ortalama derinlikleri (3 PDMS kopyasi üzerinden optik profilometre kullanilarak N = 30 ölçüm), kirmizi ve beyaz gül için sirasiyla 12.9 pm ve 6.6 pm olarak hesaplanmistir (Sekil 28). Bunlardan taze beyaz gül desenli olani, kornea endotel hücre benzeri bir derinlik saglamakta ve taze beyaz gül yapragi, kirmizi gül yapragindan daha iyi kornea endotel hücre seklini taklit eden altigen benzeri hücreler saglamaktadir. Bu nedenle, bulusta, desenli hücre substratlarinin üretimi için tercihen beyaz gül yapraklari (Rosa Pascali) kullanilmaktadir. Ancak, beyaz gül yapraklari disindaki gül taç yapraklari ile de kornea endotel hücre seklini taklit eden altigen benzeri hücreler elde edilebilmektedir. Sekil ZC'de (i) beyaz gül yapragi çogaltma kalibi ve (il) PDMS hücre yüzeylerini taklit eden beyaz gül yapragi topografisinin SEM görüntüleri verilmektedir. Sekil 2C(ii)'deki son derece düzenli olarak siralanmis özel düzensiz yapidaki altigen benzeri sekiller ve nano ölçekli yapilar hem basarili çogalma hem de kornea endotel hücre seklini taklit eden hücre substrati üretimini kanitlamaktadir. Bulusun bir uygulamasi olan beyaz gül yapragi desenli ve optimize edilmis sertlige sahip COL 4 ile modifiye edilmis PDMS, daha yüksek yogunluklu tek hücre tabakalari ve artan fenotipik markör ifadesi ile gelismis sigir kornea endotel hücre yaniti saglamaktadir. Sekil 3ite görüldügü üzere, sigir kornea endoteli hücrelerinin desenli, desensiz, modifikasyon yapilmis ve yapilmamis PDMS substrat yüzeyleri üzerindeki metabolik aktiviteleri indirgenmis alamar mavisi yöntemi ile hücre kültürünün 1., 3. ve 7. günlerinde incelenmektedir. Sekil 3A"da sadece substrat yüzey kimyasinin hücre çogalmasi üzerine etkisi verilmis ve tüm hücre kültürü süresi boyunca hücre çogalmasini istatistiksel olarak en çok arttiranin COL 4 modifikasyonu (PDMS-C4) oldugu görülmüstür. Sekil SB'de ise substrat yüzeylerinde beyaz gül desenlerinin her bir grup için hücre metabolik aktivitesini arttirdigi gösterilmistir. Sekil 3A ve BB'ye göre HA modifikasyonunun sigir kornea endoteli hücrelerinin çogalmasi üzerine ciddi bir etkisi görülmediginden, Sekil SC'de hücre kültürünün son gününde desensiz (PDMS ile PDMS-C4)/desenli (PDMS-R ile PDMS-C4-R) substratlarin COL 4 kimyasal modifikasyonu öncesi (PDMS ve PDMS-R) ve sonrasinda (PDMS-C4 ve PDMS- C4-R) hücre çogalmasina olan etkileri karsilastirilmistir. Bu sonuçlara göre, COL 4 modifikasyonunun desenli ve desensiz gruplarin tümünde hücre çogalmasina pozitif etki yarattigi (p<0.0001) ve beyaz gül topografisi desenlerinin kornea endoteli metabolik aktivitesini hem düz hem de COL 4 modifiye gruplarda istatistiksel olarak önemli (p<0.0001) sekilde arttirdigi görülmüstür. Sekil 3D'de verilen hücre kültürünün 7. günündeki aktin hücre iskeleti boyamasi da hem beyaz gül taç yapragi desenli substratlarin, hem de COL 4 yüzey modifikasyonunun tutunan hücre sayisini arttirdigini ve çok daha belirgin aktin baglari organizasyonu sagladigini göstermistir. Sigir kornea endoteli hücrelerin PDMS substratlar üzerindeki fonksiyonellikleri kornea endoteline özel belirteçlerden Na+/K+ ATPase (kirmizi) immünofloresan boyamasi ile hücre çekirdegi (mavi) boyamasi ile Sekil 4'te gösterilmektedir. Hücre çogalmasinda oldugu gibi, burada da COL 4 modifiye beyaz gül taç yapragi desenli PDMS substratlarin en yüksek yogunlukta fenotipik markör boyamasini sagladigi görülmüstür. Tüm bu analizlerde kullanilan PDMS hücre platformlarinin sertligi de saglikli kornea sertligi araliginda hazirlandigindan (211.85 ± mekanik, kimyasal ve topografik anlamda biyomimetik özelliklere sahip bu hücre substratlari, kontrol grup olarak kabul edilen standart hücre kültürü plakalarina (TCP) göre çok daha olumlu in vitro hücre davranislari gözlemlenmektedir. TR TR TR TR

Claims (1)

1.ISTEMLER . Kornea endoteli hücre kültüründe kullanilmak üzere hücre kültürü platformu olup özelligi, gül taç yapragi taklidi üç boyutlu yüzey topografisi desenine sahip kuyucuklu yapida substrat içeren bir hücre platformu olmasidir. . Istem 1'e göre hücre platformu olup özelligi, bahsi geçen gülün yabani, modern veya bahçe gülü çesitlerinden seçilen Rosa Pascali, Rosa Hybrida, Rosa Damascena, Rosa Gallica, Rosa Moschata, Rosa Kordesii, Rosa Rugosa, Rosa La Sevillana, Laxa veya Rosa Zorina olmasidir. . Istem 1 veya Zye göre hücre platformu olup özelligi, bahsi geçen gülün Rosa Pascali olmasidir. . Istem 1`e göre hücre platformu olup özelligi, bahsi geçen gül taç yapraginin taze gül taç yapragi olmasidir. . Istem ile göre hücre platformu olup özelligi, bahsi geçen substratin malzemesi olarak gliserol, hyaluronik asit, kolajen, aljinat, selüloz, kitosan, jelatin, jelatin metakrilat (GeIMA), poliakrilamit (PAM), polikaprolakton (PCL), karboksimetilkitosan, polikaprolakton (PCL), poliglikolik Asit (PGA), poli-I-Iaktik asit (PLLA), polilaktik asit-glikolik asit (PLGA), polihidroksialkanoat, poli-3-hidroksibütirat (P3HB), poli-4- hidroksibütirat (P4HB), polihidroksivalerat (PHV), polihidroksihekzanoat (PHH), polihidroksoktanoat (PHO)], polivinilalkol (PVA), polivinilklorür (PVC), polivinilprolidon (PVP), polivinilidenflorür (PVDF), polisiloksanlar poli(metilfenilsiloksan), poli(vinilmetil-ko-dimetil) siloksanlar, poli(metilhidrojenosiloksanlar), poli(hidrometilsiloksan)], polimetakrilatlar poli (dodesil metakrilat), poli (2-etoksietil metakrilat), poli(etil metakrilat), poli(hekzil metakrilat), poli(2-hidr0ksietil metakrilat), poli(izobütil metakrilat), poli(izopropil metakrilat), poli(metil metakrilat), poli(0ktadesil metakrilat), poli(ektil metakrilat), poli(fenil metakrilat), poli(propil metakrilat), poli (2-kloroetil metakrilat)], polihidroksimetakrilat (pHEMA), polietilasetat (PEA), polieter eter keton (PEEK), poliüretan (PÜ) ve türevleri, polietilen (PE) ve türevleri, polipropilen (PP) ve türevleri, polietilenoksit (PEO), polistiren (PS), polikarbonat (PK) ve polietilenglikol (PEG) içeren gruptan en az birinin seçilmesidir. . Istem 1'e göre hücre platformu olup özelligi, bahsi geçen substrat yüzeyinin kimyasal kaplama ajani, biyokimyasal kaplama ajani veya modifikasyon ajani ile modifiye edilmis yapida olmasidir. . Istem 6'ya göre hücre platformu olup özelligi, bahsi geçen kimyasal kaplama ajani, biyokimyasal kaplama ajani veya modifikasyon ajani olarak kornea hücre disi matris bileseni, laminin, fibronektin, kondroitin sülfat, fibrinojen, kolajen tipleri, antibiyotikler, antienflamatuar ajanlar, yara iyilesmesini hizlandirici kimyasallar, grafen ve grafen oksit içeren gruptan en az birinin seçilmesidir. . Istem Tye göre hücre platformu olup özelligi, bahsi geçen kornea hücre disi matris bileseninin kolajen IV (COL 4) ve/veya hyaluronik asit (HA) olmasidir. . Istem G'ya göre hücre platformu olup özelligi, bahsi geçen modifikasyon ajaninin 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidroklorür/ N- Hidroksisüksinimit (EDC/NHS) çapraz baglayicisi olmasidir. 10. Istem ile göre hücre platformu olup özelligi, bahsi geçen kuyucuklu yapida substratin mekanik özelliginin 50-290 kPa deger araliginda olmasidir. 11.Istem 1-10Jdan herhangi birine göre hücre platformunun üretim yöntemi olup özelligi, i. gülün taç yapraklarinin ayrilarak taç yapraginin sabitlenmesi, ii. substrat olusturulmasi için polimer karisiminin hazirlanmasi, iii. polimerin vakum altinda hava kabarciklarindan arindirilmasi ve polimerin taç yapragi üzerine dökülmesi, iv. taç yapragi üzerine dökülen polimer karisiminin taç yapragi üzerinde polimerlestirilmesi, polimerlesen malzemenin gül yapraklarindan ayristirilmasi ve polimerin temizlenmesi ile gül taç yapragi taklidi üç boyutlu yüzey topografisi desenine sahip kuyucuklu yapida substrat (negatif kopya) içeren hücre platformunun elde edilmesi, islem adimlarini içermesidir. 12.Istem 1-10'dan herhangi birine göre hücre platformunun üretim yöntemi olup özelligi, gülün taç yapraklarinin ayrilarak taç yapraginin sabitlenmesi, substrat olusturulmasi için polimer karisiminin hazirlanmasi, polimerin vakum altinda hava kabarciklarindan arindirilmasi ve polimerin taç yapragi üzerine dökülmesi, taç yapragi üzerine dökülen polimer karisiminin taç yapragi üzerinde polimerlestirilmesi, polimerlesen malzemenin gül yapraklarindan ayristirilmasi ve polimerin temizlenmesi ile gül taç yapragi taklidi üç boyutlu yüzey topografisi desenine sahip kuyucuklu yapida substratin (negatif kopya) elde edilmesi, polimerin substrat üzerine dökülerek yumusak litografi teknigi ile kabarti desenli topografiye sahip taklit yüzeyi olan kalibin (pozitif kopya) elde edilmesi, kalip yüzeyinin kaplanmasi ile ana kalibin elde edilmesi, viii. tekrar polimerin hazirlanmasi ve hazirlanan polimerin ana kaliba dökülmesi, ana kaliba dökülen polimerin polimerlestirilmesi ardindan gül taç yapragi taklidi üç boyutlu yüzey topografisi desenine sahip kuyucuklu yapida substrat içeren hücre platformunun elde edilmesi, islem adimlarini içermesidir. 13. istem 11 veya 12iye göre yöntem olup özelligi, bahsi geçen polimer olarak gliserol, hyaluronik asit, kolajen, aljinat, selüloz, kitosan, jelatin, jelatin metakrilat (GellVIA), poliakrilamit (PAM), polikaprolakton (PCL), karboksimetilkitosan, polikaprolakton (PCL), poliglikolik Asit (PGA), poli-l- poli-S-hidroksibütirat (P3HB), poli-4- hidroksibütirat (P4HB), polihidroksivalerat (PHV), polihidroksihekzanoat (PHH), polihidroksoktanoat (PHO)], polivinilalkol (PVA), polivinilklorür (PVC), polivinilprolidon (PVP), polivinilidenflorür (PVDF), polisiloksanlar poli(metilfenilsiloksan), poli(vinilmetil-ko-dimetil) siloksanlar, poli(metilhidrojenosiIoksanlar), poli(hidrometilsiloksan)], polimetakrilatlar poli (dodesil metakrilat), poli (2-etoksietil metakrilat), poli(etil metakrilat), poli(hekzil metakrilat), poli(2-hidroksietil metakrilat), poli(izobütil metakrilat), poli(izopr0pil metakrilat), poli(metil metakrilat), poli(0ktadesil metakrilat), poli(0ktil metakrilat), poli(fenil metakrilat), poli(pr0pil metakrilat), poli (2-kl0roetil metakrilat)], polihidroksimetakrilat (pHEMA), polietilasetat (PEA), polieter eter keton (PEEK), poliüretan (PÜ) ve türevleri, polietilen (PE) ve türevleri, polipropilen (PP) ve türevleri, polietilenoksit (PEO), polistiren (PS), polikarbonat (PK) ve polietilenglikol (PEG) içeren gruptan en az birinin seçilmesidir. 14. Istem 13'e göre yöntem olup özelligi, bahsi geçen polimerin PDMS olmasi ve taç yapragi üzerine dökülen polimerin taç yapragi üzerinde sertlesmesi adiminda PDMS'in 70°C'de 4 saat boyunca taç yapragi üzerinde sertlesmesidir. 15. Istem 11'e göre yöntem olup özelligi, bahsi geçen polimerin PDMS olmasi ve (ii) nolu islem adiminda kütlece 30:1 oraninda PDMS ön polimerizçapraz baglayici ile elde edilen PDMS polimerin hazirlanmasidir. 16. Istem 12'ye göre yöntem olup özelligi, bahsi geçen polimerin PDMS olmasi, (ii) nolu islem adiminda kütlece 1021 oraninda PDMS ön polimeri:çapraz baglayici ile elde edilen PDMS polimerin hazirlanmasidir. 17. Istem 12'ye göre yöntem olup özelligi, bahsi geçen (v) nolu islem adimindan sonra ve (vi) nolu islem adimindan önce substrat yüzeyinin püskürtmeli kaplama yöntemi kullanilarak altin veya platin kaplanmasidir. 18. Istem 12`ye göre yöntem olup özelligi, bahsi geçen polimerin PDMS olmasi, (vi) nolu islem adiminda kütlece 15:1 oraninda PDMS ön polimeri:çapraz baglayici ile elde edilen PDMS polimerin hazirlanmasi ve PDMS”in substrat üzerine dökülerek yumusak Iitografi teknigi ile kabarti 5 desenli topografiye sahip taklit yüzeyi olan kalibin (pozitif kopya) elde edilmesidir. 19.Istem 12'ye göre yöntem olup Özelligi, bahsi geçen polimerin PDMS olmasi ve (vii) nolu islem adiminda kütlece 30:1 oraninda PDMS ön polimerizçapraz baglayici ile elde edilen PDMS polimerin hazirlanmasi ve 10 ana kaliba dökülmesidir. TR TR TR TR