RO131547A2 - Nanotransportori pe bază de squalen vegetal ce pot co-încapsula medicamente hidrofile şi lipofile - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la un procedeu de obţinere a unor nanotransportori lipidici funcţionali, pentru încapsularea şi eliberarea de medicamente hidrofile şi lipofile. Procedeul conform invenţiei constă în formarea unei pre-emulsii lipidice libere şi încărcate cu două componente active, Pemetrexed şi Hesperidin, prin contactarea unei faze lipide şi a unei faze apoase la temperatura de 80...82°C, timp de 15 min, supunerea pre-emulsiei lipidice unor etape succesive de omogenizare cu grad de forfecare la 12000 rpm, timp de 1 min, ulterior la presiune ridicată la 500 bar, timp de 196 s, dispersiile apoase de nanotransportori lipidici liberi şi încărcaţi cu cele două componente active fiind supuse unei etape de liofilizare la -55°C, timp de 72 h, din care rezultă nanotransportori lipidici în stare solidă, funcţionali.

Description

Invenția prezentă se referă la un procedeu de obținere a unor nanotransportori lipidici funcționali pe baza de fracții vegetale cu conținut variabil de Squalen capabili sa co-incapsuleze si sa co-elibereze simultan doua substanțe active de natura hidrofilă si hidrofoba, respectiv un medicament sintetic cu acțiune antitumorala - Pemetrexed (Pm) si un medicament natural Hesperidin (Hes) ce prezintă acțiune antioxidanta in conjuncție cu alte efecte terapeutice.

Pemetrexed disodic este un medicament din categoria metabolitilor de tip folat utilizat in chemoterapie pentru tratarea meduloblastomei (Morfouace M., Cancer Cell 25 (2014) 516-529), a cancerului de plamani pentru pacientii nefumatori (Gautschi O, Clinical Lung Cancer, doi:10.1016/j.cllc.2015.02.007; Liang Y., Lung Cancer, 87 (2015) 34-38) si deasemenea determina apoptoza si citotoxicitate demonstrate in celulele de osteosarcoma (Zhu X., Biochem. and Biophys. Res. Comm. 452 (2014) 72-78).

Hesperidina este un bioflavonoid izolat din coji de portocale care prezintă diferite proprietăți biologice, în special asociate cu prevenirea cancerului și a bolilor cardiovasculare (Roohbakhsh A., Life Sci. 124 (2015) 64-74). Studiile farmacologice au scos in evidenta atât potențialul anti-tumoral cat si chemoprotectiv (ex: induce apoptoza în cancerul de colon (Saiprasad G., Europ. J. of Cancer, 50 (2014) 2489-2507) dar și efecte protectoare împotriva stresului oxidativ (Javed H. J. of the Neurological Sci. 348, (2015) 51-59; Pari L., Toxicology Rep. 2 (2015) 46-55).

Medicamentele lipoftle manifesta o biodisponibilitate redusa, in timp ce medicamentele hidrofile au o permeabilitate limitata de-a lungul membranelor biologice (ex: bariera hematoencefalica - BBB) din cauza caracterului puternic lipofil al acestora. In consecința, aceste medicamente trebuie sa fie administrate in doze zilnice ridicate, ceea ce adesea conduce la apariția unor efecte adverse cu grad variabil de severitate. Pentru distribuția medicamentelor de-a lungul membranelor biologice, incluzând bariera hemato-encefalica si bariera mucoasei stomacale, medicamentul de interes trebuie sa fie intr-o forma lipidica solubila astfel incat biodisponibilitatea sa fie amplificata considerabil.

In tratamentul diferitelor afecțiuni nu este suficient ca medicamentul sa prezinte acțiune farmacodinamica mărită, eficienta terapeutica a oricărui medicament fiind dependenta în principal de distribuția si absorbția acestuia într-o concentrație adecvată pentru a viza celulele si țesuturile lezate. O mare provocare in domeniul sistemelor de încapsulare, distribuție si eliberare de medicamente reiese din dificultatea de a obține sisteme funcționale care sa combine un cumul de

U zCz-20 15-- O D 39 i10 -06-2015 caracteristici, precum o toxicitate scăzută, lipsa de imunogenitate, biodegradabilitate ridicata, sa nu se acumuleze în celule sau țesuturi și ideal, sa prezinte efecte biologice adiționale care sa prezinte o buna sinergie cu medicamentele încapsulate.

Nanoformularile pe baza de lipide si surfactanti biocompatibili cum sunt nanoparticulele lipidice solide (SLNs) si transportorii lipidici nanostructurati (NLC) sunt printre cele mai atractive strategii pentru încapsularea si distribuția medicamentelor cu proprietăți specifice. Sistemele NLC sunt nanoparticule lipidice solide modificate, in care miezul lipidic este format din lipide solide si lichide, iar surfactantii care stabilizează miezul lipidic sunt selectați din categoria materialelor GRAS. Numeroase studii au demonstrat ca NLCs cresc eficienta de încapsulare, îmbunătățesc stabilitatea chimica, biodisponibilitatea si eliberarea prelungita a compușilor de natura lipofila, insa manifesta o restricție ridicata in ceea ce privește încapsularea componentelor de natura hidrofilă.

Primele studii de incorporare a ingredientelor active hidrofile au fost dezvoltate de Gallarate si colab. care au utilizat tehnica coacervarii bazata pe transformarea de faze (ex: soluție micelara in particule solide de acid gras) pentru incorporarea Cisplatinului in nanoparticule lipidice de acid stearic (de tip SLN) (Gallarate M., Journal of Drug Delivery Science and Technology, 20 (2010) 343-347). Tot o metoda bazata pe solubilizarea in micele inverse (tehnica PIT) a fost mai târziu folosita de Vrignaud si colab. pentru încapsularea clorhidratului de Erlotinib in nanotransportori lipidici preparați cu diferiți surfactanti (derivați de sorbitan) si ulei Labrafac (amestec de triacilgliceroli ai acizilor capric si caprilic) in rapoarte de 1 : 1 (Vrignaud S., Int. J. of Pharmaceutics 436 (2012) 194-200). Deși tehnica microemulsionarii permite obținerea unor nanoparticule lipidice de ordinul zecilor de nm, prezintă dezavantajul utilizării unor concentrații foarte mari de surfactant (cuprinse intre 10 si 25%) care pentru domeniul farmaceutic implica existenta unui risc ridicat de toxicitate. Referitor la literatura patentelor, aceasta tehnica a microemulsionarii a fost brevetata in WO 2013105101 A1, US 7611733 B2 pentru încapsularea unei game destul de largi de medicamente de natura hidrofilă si amfifila.

In schimb, natura lipofila a acestor nanotransportori lipidici le conferă acestora avantaje multiple asociate încapsulării medicamentelor lipofile prin solubilizare in miezul lipidic. De-a lungul ultimilor ani au fost prezentate în literatură diferite metode și compoziții de preparare a SLN si NLC cu scopul distribuției de ingrediente active lipofile sau dezvoltare de formulări cosmetice si farmaceutice. De exemplu, US 20030235540 A1 și US 7147841 B2 descriu obținerea de astfel de nanoparticule lipidice ce conțin o matrice lipidică formată din diferite lipide solide (ex: palmitat de cetii si esteri ai glicerolului cu acizi grași cu lanț variabil, acid stearic, colesterol, ceară de albine) și un lipid lichid (triacilgliceroli ai acidului capric și caprilic) ce încapsulează ca substanța activa un filtru UV, utilizând metoda omogenizării la presiune înaltă (HPH). Pe aceeași linie științifica este

-2 Ο 15-- 0 0 3 9 1 1 0 -06- 20® încadrata si cercetarea din CN 102283809 (A) realizata cu scopul obținerii unor NLC cu aplicații locale, utilizând ambele metode de omogenizare cu grad înalt de forfecare si la presiune ridicata.

De asemenea, pentru a reduce inflamatia si a asigura o stabilitate chimica adecvata a medicamentelor încapsulate, literatura patentelor furnizează diferite metode de obținere a NLC utilizând tehnici precum difuzia cu solvenți (CN103417481; US 20110038941 A1), omogenizarea cu grad inalt de forfecare, microemulsionarea (US 2010/0247619 A1; US 761 1733), ultrasonarea (EP 2821077 A1) injecție - liofilizare (CN102151250), omogenizare la presiune ridicata (WO 2011116963 A2).

Problemele de stabilitate fizica (agregare, fuziune) si chimica (hidroliză, oxidare), expulzare a medicamentului, control al dimensiunii particulelor, eficienta de încapsulare scăzută a medicamentelor solubile in apa, impurificare cu metale etc., au condus adesea la scăderea calitatii formulării nanotransportorului, dar si a acțiunii farmacologice a medicamentului încapsulat.

Cu scopul de a imbunatati aceste caracteristici definitorii pentru un sistem de distribuție, si in principal de a realiza o co-incapsulare multipla a doua categorii de medicamente lipo- si hidrosolubile in același sistem nanotransportor ce prezintă el insusi proprietăți terapeutice, prezenta invenție descrie o metoda combinata de omogenizare cu grad inalt de forfecare (HSH) si omogenizare la presiune ridicata (HPH) care permite obținerea unor nanotransportori cu eficiente de încapsulare maxime pentru cele doua medicamente cu solubilitate preferențiala apa/ulei.

Comparativ cu metodele existente de preparare a nanotransportorilor lipidici, compoziția, rapoartele intre componentele lipidice, surfactanti si substanțele active, dar si prezenta uleiului de Amarant conferă nanotransportorilor preparați avantajele de a imbunatati semnificativ eficienta de încapsulare a unui medicament hidrofil, simultan cu menținerea unor valori ridicate ale eficientei de încapsulare a medicamentului lipofil (ex: cu valori ale eficientei de încapsulare de 89% pentru Pemetrexed si de 94% pentru Hesperidin) si de a asigura o eliberare controlata a ambelor categorii de medicamente.

Obținerea unor nanoparticuie, care pe langa rolul de transportor eficient manifesta si capacitatea de a prezenta proprietăți terapeutice care sa potențeze sau sa substituie dozele ridicate de medicamente (in special cazul celor utilizate in chemoterapie care prezintă un risc ridicat de citotoxicitate asupra celulelor normale), ramane pana in prezent o problema care nu este pe deplin rezolvata. Drept urmare, dezvoltarea unor nanotransportori eficienți și siguri, bazați pe ingrediente naturale din surse vegetale reprezintă o necesitate în industria farmaceutica. Utilizarea resurselor vegetale, care prezintă efecte benefice asupra organismului prin virtutea proprietăților biologice demonstrate, reprezintă o alternativa ce poate îndeplini cerințele consumatorului asociate unui consum preferențial de produse naturale.

^- 2 0 1 5 -- 0 0 3 9 1 1 0 -06- 2015

Referitor la utilizarea uleiurilor vegetale, Viladot Petit et. al. în US 20130017239 A1 au dezvoltat formulări cosmetice pe baza de capsule de nanoparticule lipidice, reprezentate de nanoparticule lipidice solide (SLN) si de transportori lipidici nanostructurati (NLC) acoperite cu polimeri. Pentru sinteza nanoparticulelor lipidice au fost utilizate diferite tipuri de lipide solide in asociere cu lipide lichide printre care uleiurile de soia, de porumb, de măsline, dar si uleiuri marine (ulei de peste, ulei de alge). Intr-un patent similar (US 2012/0128777A1), uleiul de canepa a fost folosit de Keck si colab. cu scopul obținerii unor micro- si nanoparticule lipidice care sa conducă la acumularea la nivel dermic a particulelor solide. Alte sisteme de distribuție de tip NLC ce încapsulează vitamina C, vitamina A si preparate cu ulei de soia au fost brevetate in US 2013/0017239 A1.

II. Problema tehnică pe care o rezolvă procedeul conform invenției constă în obținerea unor nanotransportori lipidici pe baza de fracții vegetale, cu conținut variabil de Squalen, capabili sa coincapsuleze si sa co-elibereze susținut doua tipuri de medicamente (cu acțiune antioxidanta si antitumorala) ce prezintă polaritati diferite. Procedeul de obținere a nanotransportorilor lipidici conform invenției cuprinde:

a) formarea unei faze lipidice fara conținut de medicament, la o temperatură de 80°C, ce conține un amestec de lipide solide și ulei izolat din semințe de Amarant, respectiv monostearat de gliceril : palmitat de cetii : fracție vegetala cu concentrație variabila de Squalen, într-un raport de greutate de 1,16 : 1,16 : 1, respectiv formarea unei faze lipidice ce conține o concentrație de component activ de natură hidrofobă de 0,6% Hesperidin si respectiv 0,27% Hesperidin;

b) formarea unei faze apoase fara conținut de medicament, la o temperatură de 80°C, ce conține un amestec de surfactanți de tip colat de sodiu : monolaurat de polioxietilensorbitan : copolimer bloc polietilenglicol-polipropilenglicol într-un raport de greutate de 28 : 20 : 1, respectiv formarea unei faze apoase ce conține o concentrație de component activ de natură hidrofilă de 0,8% Pemetrexed si respectiv 0,53% Pemetrexed;

c) formarea unei pre-emulsii lipidice - precursoare de transportori lipidici nanostructurati - prin contactarea sub agitare magnetică a celor doua faze, apoasă și lipidică, și menținere la un regim de temperatură constant de 80°C timp de 15 min;

d) obținerea unor dispersii apoase de nanotransportori lipidici liberi si co-încărcați cu cele doua medicamente cu caracter hidrofil si lipofil, prin supunerea pre-emulsiei lipidice inițial la un proces de omogenizare cu grad înalt de forfecare (la 12000 rpm, timp de 1 min), urmat de un proces de omogenizare la presiune ridicata (la 500 bar, timp de 196 sec) si ulterior răcire ușoară la temperatura camerei, sub agitare magnetică;

/C-- 2 0 1 5 -- 0 0 3 9 1 1 Ο -06- 2015

e) obținerea de nanotransportori lipidici funcționali in stare solida, liberi si incarcati cu Pm si Hes, prin supunerea dispersiilor apoase de nanotransportori la o etapa de liofilizare la -55°C timp de 72h.

Nanotransportorii lipidici încărcați cu medicament antitumoral - Pemetrexed și antioxidant Hesperidin obținuți pe baza de fracții de Amarant cu conținut variabil de Squalen bioactiv cuprind:

a. 21,6% fracție vegetala cu conținut variabil de Squalen din întreaga matrice lipidică formată din lipide solide și lichide;

b. 10,1% amestec de medicamente de natură hidrofobă si hidrofila din care 5,8% Pm și 4,3% Hes, respectiv 5,9% amestec de medicamente din care 3,9% Pm și 2% Hes, încapsulate în matricea lipidică astfel formată, procentele fiind exprimate în greutate.

III. Invenția prezintă următoarele avantaje:

• Asigură o co-încapsulare a ambelor categorii de medicamente, atat de natura hidrofila cat si hidrofobă, in același sistem nanotransportor ce prezintă particularitati structurale unice, favorabile pentru o încapsulare multipla atat in miezul lipidic hidrofob cat si in învelișul exterior generat de prezenta surfactantilor.

• Procedeul de co-încapsulare a ambelor medicamente - Pemetrexed si Hesperidin în nanotransportorii lipidici pe bază de fracții naturale izolate din semințe de Amarant se desfășoară în mediu apos, nu utilizează condiții de proces care să conducă la denaturarea principiilor active provenite din uleiurile vegetale si nu afectează integritatea structurală a celor doua medicamente încapsulate.

• Obținerea nanoparticulelor lipidice se bazeaza pe folosirea unor materii prime biocompatibile, concentrații minime de surfactanti și nu implica utilizarea unor substanțe agresive (ex: solvenți organici sau surfactanți ce prezintă efect toxic asupra organismului).

• Prin procedeul propus se formează o rețea lipidică puternic dezordonată, favorabila pentru coîncapsularea a cel puțin doua medicamente cu concentrații adaptabile efectului biologic urmărit; aceste caracteristici structurale se datoreaza golurilor create prin utilizarea unor lipide cu structuri chimice diferite, respectiv a lipidelor solide împreuna cu fracțiile uleioase cu conținut variabil de Squalen.

• Utlizarea celor trei uleiuri vegetale izolate din semințe de Amarant cu concentrații de 5,8%, 34,7% si 83,4% Squalen bioactiv si conținut ridicat de acizi grași ω-6, manifestă multiple beneficii:

^“ 2 0 1 5 -- 0 0 3 9 1 10 -06- 7Μ5

a. participă la formarea unui miez lipidic omogen si/sau miez cu nanocompartimente distincte ce pot fi utilizate ca transportori de substanțe active de natură hidrofobă si hidrofila;

b. imprima proprietăți biologice suplimentare, în completare la cele ale medicamentelor de sinteza și ca atare un important potențial terapeutic de natura să îmbunătățească sănătatea publică;

c. prin asocierea acestor remedii naturale cu cele sintetice se realizează o diminuare a concentrației de medicamente sintetice care, funcție de efectul biologic urmărit poate manifesta efecte toxice (ex: medicamentele utilizate in terapia cancerului);

d. prin virtutea proprietăților sale antioxidante poate proteja anumite medicamente ce prezintă o sensibilitate ridicata la oxidare;

e. constituie o sursa de valorificare a resurselor naturale provenite din flora autohtona asociata cu o eficienta economica sporita.

• Procedeul propus este simplu și eficient, implică etape distincte și ușor de reprodus, asigurând același nivel de control și prin transpunere la scară pilot.

• Procedeul constituie o metodă optimă pentru obținerea unor nanotransportori lipidici ce manifestă ei insusi proprietăți terapeutice prin virtutea miezului lipidic format din fracții vegetale cu concentrații ridicate de Squalen bioactiv si acizi grași ω-3 si -6 (ex: proprietăți antioxidante chiar si in absenta medicamentelor de sinteza) si deasemenea pot sa fie adaptați pentru coincapsularea unei game largi de medicamente ce prezintă proprietăți specifice.

• Nanoparticulele lipidice cu continui de medicament antitumoral si antioxidant, obținute prin procedeul propus pot fi utilizate sub ambele forme - ca dispersii apoase sau sub formă de produs solid - pentru dezvoltarea unor formulări medicamentoase ce îmbina remediile sintetice cu cele naturale in scopul obținerii unui maxim de eficienta a tratamentului asociat cu existenta unor efecte secundare minime.

IV. Procedeul conform invenției constă în aceea că se formează inițial o pre-emulsie lipidică ce conține 10% amestec lipidic și 2,45% amestec de surfactanți, la o temperatură de 80°C, prin contactarea sub agitare magnetică a două faze, o fază lipidică ce conține monostearat de gliceril : palmitat de cetii : fracție uleioasa vegetala ce conține 5,8%, 34,8% sau 83,7% Squalen, într-un raport de greutate de 1,16 : 1,16 : 1 și o fază apoasă ce conține colat de sodiu : monolaurat de polioxietilensorbitan : eopoiimer bloc polietilenglicol-polipropilenglicol într-un raport de greutate de 28 : 20 : 1; pre-emulsia lipidică obtinuta este menținută la un regim de temperatură constant de 80°C, timp de 15 min, este supusă unei prime etape de omogenizare cu grad înalt de forfecare la 12000 rpm, timp de 1 min, ulterior unei etape de omogenizare la presiune ridicata la 500 bar,

- 2 Ο 1 5 - - 0 0 3 9 1 - ’frf

-06- W15 timp de 196 sec, după care este lăsată să se răcească la temperatura camerei, sub agitare magnetica, și ulterior în urma unui proces de liofilizare la -55°C timp de 72h, conduce la obținerea de nanotransportori lipidici de natura solida cu proprietăți antioxidante amplificate si o abilitate excelenta de eliberare treptata a ambelor categorii de medicamente de natura hidrofilă si lipofila.

în cazul prezentei invenții, pentru urmărirea caracteristicilor dimensionale, de stabilitate, structurale, precum si a efectului și tipului de matrice lipidică asupra obținerii de nanotransportori lipidici ce manifestă activitate antioxidantă amplificata si capacitate de eliberare treptata a celor doua tipuri de medicamente, s-au utilizat:

a. Nanotransportori lipidici liberi (fără conținut de medicament hidrofil si lipofil), formați prin combinarea a doua lipide solide biocompatibile (monostearat de gliceril si palmitat de cetii), cu o fracție uleioasa vegetala izolata din semințe de Amarant (ex: Sq 1 = fracție vegetala ce conține 5,8% Squalen; Sq 2 = fracție vegetala ce conține 34,7% Squalen si Sq 3 = fracție vegetala ce conține 83,4 % Squalen).

b. Nanotransportori lipidici ce co-incapsuleaza concentrații variabile de medicament hidrofil (Pm) si hidrofob (Hes), formați similar cu nanotransportorii fara conținut de substanțe active.

Etapele de obținere a nanotransportorilor lipidici ce co-incapsuleaza cele două componente hidrofil si hidrofob sunt:

• formarea unei topituri lipidice, prin utilizarea de lipide solide și uleiuri vegetale (monostearat de gliceril, palmitat de cetii si fracții uleioase din semințe de Amarant cu concentrații variabile de Squalen);

• adăugarea în topitura lipidică a unor cantitati diferite de medicament lipofil ce asigura o concentrație de 0,6% si respectiv 0,27% Hesperidin in dispersia apoasa de nanotransportori lipidici;

• adăugarea în faza apoasa formata dintr-un amestec de surfactanți de tip colat de sodiu : monolaurat de polioxietilensorbitan : copolimer bloc polietilenglicol-polipropilenglicol a unor cantitati diferite de medicament hidrofil ce asigura o concentrație de 0,8% si respectiv 0,53% Pemetrexed in dispersia apoasa de nanotransportori lipidici.

V. Se dau în continuare cinci exemple de realizare a procedeului conform invenției, în legătură cu tabelul și figurile care reprezintă:

Tabel 1 - Compoziția nanostructurilor lipidice obținute prin utilizarea fracțiilor vegetale cu continui variabil de Squalen

Tabel 2 - Parametrii cinetici ai eliberării Pemetrexed din nanotransportorii lipidici

Tabel 3 - Parametrii cinetici ai eliberării Hesperidin din nanotransportorii lipidici

Λ- -2 0 1 5 -- 0 0 39 11 0 -06-2015

Figura 1 - Determinarea diametrelor medii ale nanotransportorilor lipidici, pe baza tehnicii de imprastiere dinamica a luminii (DLS)

Figura 2 - Valorile potențialului electrocinetic determinate pe sistemele de NLC libere si încărcate cu amestec de Pm si Hes sintetizate cu diferite fracții de Squalen

Figura 3 - Microscopia de transmisie electronică a probelor de nanotransportori lipidici NLC_Sq3_PmHes 1 (a) si NLC_Sq3_PmHes 2 (b)

Figura 4 - Evaluarea modificărilor structurale, înainte si după co-incapsularea Pm si Hes in sistemele NLC preparate cu fracții vegetale ce conțin 5,8% Squalen (a), 34,7% Squalen (b) si 83,4% Squalen (c).

Figura 5 - Eficienta de încapsulare a Hes si Pm in sistemele nanostructurate sintetizate cu fracții variabile de Squalen

Figura 6 - Evaluarea in vitro a proprietăților antioxidante a NLC-urilor preparate cu fracții diferite de Squalen bioactiv si încărcate cu concentrații variabile de Pm si Hes

Figura 7 - Profilele in vitro ale eliberării cantității cumulative procentuale de Pm (a) si Hes (b) din NLC cu diferite concentrații de Squalen

Figura 8 - Profilele in vitro ale eliberării cantității cumulative procentuale de Pm (a) si Hes (b) din NLC cu diferite concentrații de medicament hidrofil/lipofil

Exemplul 1. Se formează o fază lipidică prin topirea la o temperatură de 80 ... 82°C a unui amestec de 10% monostearat de gliceril, palmitat de cetii si fracție vegetala izolata din semințe de Amarant cu continui de 5,8% Squalen într-un raport de greutate de 1,16 : 1,16 : 1. Formarea unei faze apoase la o temperatură de 80 ... 82°C prin utilizarea a 2,45% amestec de surfactanti ce conține colat de sodiu, monolaurat de polioxietilensorbitan, copolimer bloc polietilenglicolpolipropilenglicol într-un raport de greutate de 28 : 20 : 1. Prin contactarea celor doua faze lipidice si apoase, sub agitare magnetică și la o temperatură de 80 ... 82°C, se formează o pre-emulsie lipidică care se menține la regim de temperatură constant, timp de 15 min. Pre-emulsia rezultată se supune inițial unei etape de omogenizare cu grad înalt de forfecare, aplicând 12000 rpm timp de 1 minut si ulterior unei etape de omogenizare la presiune ridicata la 500 bar, timp de 196 sec. Nanodispersia rezultata este lăsată să se răcească la temperatura camerei, sub agitare magnetica, cu formarea unei dispersii apoase de transportori lipidici nanostructurati (NLC). Ulterior disperisia apoasa de NLC este congelata la -20°C timp de 24h si supusa unui proces de liofilizare la -55°C timp de 72h, cu obținerea unei pulberi de NLC libera (fără medicament încapsulat).

^‘2015-- 0 0 3 9 1 1 0 -06- 2015

Exemplul 2. Similar exemplului 1, cu deosebirea că fracția vegetala cu conținut de 5,8% Squalen este înlocuita cu o fracție de ulei de Amarant ce conține 34,7% Squalen.

Exemplul 3. Similar exemplului 1, cu deosebirea că fracția vegetala cu continui de 5,8% Squalen este înlocuita cu o fracție de ulei de Amarant ce conține 83,4% Squalen.

Exemplul 4. Similar exemplelor 1, 2 si 3, cu deosebirea că se adaugă în faza lipidică încălzită la 80°C o cantitate de substanța activa lipofila ce corespunde unei concentrații de 0,6% Hesperidin în dispersia apoasa de NLC obținută conform procedeului descris anterior. Topitură lipidică obtinuta se menține la 80°C timp de 2 min pentru a se asigura o bună dispersare a Hes.

Similar exemplelor 1, 2 si 3, cu deosebirea că se adaugă în faza apoasă încălzită la 80°C o cantitate de substanța activa hidrofila ce corespunde unei concentrații de 0,8% Pemetrexed în dispersia apoasa de NLC obținută conform procedeului descris anterior. Faza apoasă obtinuta se menține la 80°C timp de 2 min pentru a se asigura o bună dispersare a Pm.

Etapele ulterioare corespund celor descrise în cadrul exemplelor 1, 2 si 3 cu obținerea dispersiilor apoase de nanotransportori lipidici pe bază de fracții vegetale cu conținut variabil de Squalen și medicamente hidrofile si lipofile si în final a NLC în formă solidă ce co-încapsuleaza Pm și Hes intrun raport de greutate de 1,3 : 1. Compoziția fiecărei formulări de NLC este prezentată în Tabelul 1. Exemplul 5. Similar exemplului 4, cu deosebirea că în faza lipidică se înlocuiește concentrația de 0,6% Hesperidin cu o concentrație de 0,27% Hesperidin, iar în faza apoasă se înlocuiește concentrația de 0,8% Pemetrexed cu o concentrație de 0,53% Pemetrexed. Etapele ulterioare corespund celor descrise anterior, cu obținerea de NLC în formă solidă ce co-încapsuleaza Pm și Hes intr-un raport de greutate de 2 : 1 (Tabel 1).

Caracterizarea dimensionala a nanotransportorilor lipidici pe baza de Squalen bioactiv (DLS si TEM)

Influenta fracției de Squalen bioactiv asupra obținerii unor nanostructuri lipidice încărcate cu cele doua substanțe active - Pm si Hes a fost inițial evaluata pe baza metodei de imprastiere dinamica a luminii (DLS). Avand in vedere caracterul hidrofil/lipofil al celor doua substanțe active (ex: solubilitate diferențiata in miezul lipidic/invelis de surfactant), cat si efectul concentrației de antitumoral versus antioxidant asupra acțiunii antitumorale, au fost utilizate diferite rapoarte masice intre Pm si Hes pentru fiecare NLC preparat cu fracție vegetala cu conținut variabil de Sq.

Primul set de NLC-uri preparat la un raport de Pm : Hes = 1,3 : 1 a prezentat diametre medii ceva mai mari (ex: Z_ave cuprins intre 141 si 116 nm), comparativ cu NLC-urile preparate cu o cantitate mai mare de Pm (ex: Z_ave cuprins intre 124 si 106 nm pentru NLC preparate cu un raport de Pm : Hes = 2 : 1). In schimb, creșterea concentrației de Squalen in fracția de ulei de Amarant a condus pentru ambele rapoarte masice la o scădere a diametrelor medii (Fig. 1), un raport optim

42/-2 015-- η Β 39 1-;

0 -06-2015 intre Zave/Pdl fiind obtinut in cazul NLC_Sq3_PmHes 1 (116,5 nm/0,191) si respectiv NLC_Sq3_ PmHes2(106 nm/0,228).

De asemenea, nu a fost observata o influenta clara a co-incapsularii celor doua substanțe active asupra Z_ave a NLC-ului preparat cu fracția vegetala bogata in Sq (83,4%).

In ceea ce privește morfologia nanotransportorilor lipidici, cele doua formulări obținute cu fracția inalt concentrata in Sq (83,4%) ce încapsulează 0,8% amestec de Pm si Hes, respectiv 1,4% amestec de Pm si Hes au fost supuse analizei TEM. Rezultatele obținute au scos in evidenta formarea de nanotransportori lipidici sferici, cu o structura bine definita, diametre medii < 100 nm (Fig. 3) si existența unui miez lipidic ce conține nanocompartimente distincte in care este localizat componentul activ.

Evaluarea stabilității nanotransportorilor lipidici liberi si incarcati cu Pm si Hes

Dezvoltarea unei sarcini nete la suprafața unei particule afecteaza distribuția ionilor in regiunea interfaciala, conducând la o concentrație crescută de ioni cu sarcina opusa fata de cea a particulei si la existenta unui strat dublu electric in jurul flecarei particule. Valorile potențialului electrocinetic datorate sarcinilor din stratul dublu electric trebuie sa fie mai electronegative sau mai electropozitive de 25 mV pentru a evita apariția fenomenelor de agregare a particulelor in timp.

Profilul potențialului electrocinetic (Fig. 2) a scos in evidenta existenta unor fenomene de repulsie eficiente intre particulele lipidice aflate in suspensie apoasa, favorabila pentru prevenirea agregării nanotransportorilor lipidici ce co-incapsuleaza Pm si Hes.

Determinarea potențialului electrocinetic a scos in evidenta obținerea unor nanotransportori lipidici ce prezintă o buna stabilitatate fizica, cu valori cuprinse intre -32,3 mV si -54 mV. O observație clara ce se poate desprinde prin compararea valorilor ξ ale primelor doua seturi de NLC ce co-incapsuleaza amestecul de Pm si Hes (Fig. 2) este legata de obținerea unor nanotransportori lipidici mult mai stabili in cazul co-incapsularii unei cantitati mai mici de amestec de substanțe active (ex: 0,8% amestec de Pm si Hes).

Stabilitatea mai buna intalnita in cazul NLC-ului ce co-incapsuleaza 0,57% Pm si 0,27% Hes, de exemplu, între -47.1 si -54 mV poate fi rezultatul distribuției preferențiale a Pm atat in miezul lipidic cat si in învelișul de surfactanți. Datorită elementelor structurale, caracterul anionic al Pm ar putea conduce la o auto-asociere in mediu apos. Conform studiilor din literatura, autoasocierea acidului folie conduce la formarea de mezosfere eolumnare hexagonale (Atluri R., Langmuir 29 (2013) 12003-12012). între Pm si acidul folie există similitudini structurale, ambele poseda în fragmentul heterociclic grupări funcționale ce formează legaturi de H, conducând la fenomene de auto-asamblare (ex: grupări carbonil si amino). Această similitudine ar putea justifica o captura adecvata a mezofazelor de Pm in interiorul miezului lipidic în timpul etapei de preparare.

L' - 1 0 1 5 - - 0 0 3 9 1 1 0 -06-7015

Caracterizarea morfologica anterioara și studiile ulterioare de eficienta de încapsulare si eliberare in vitro susțin aceasta prezumție.

Influenta fracției de Squalen bioactiv si a medicamentelor încapsulate in NLC asupra caracteristicilor structurale

Evaluarea efectului de co-incapsulare a celor doua componente active cu acțiune antitumorala si antioxidanta in sistemele nanotransportor sintetizate cu fracțiile de Squalen a fost realizata pe baza calorimetriei de scanare diferențiala (DSC, Fig. 4).

Rezultatele obținute in urma analizei DSC au scos in evidenta prezenta a doua picuri endoterme cu maxime ale punctelor de topire situate in intervalul 44 + 48°C (specifice acizilor grași nesaturati prezenți in fracția vegetala) si respectiv 52 + 54 °C (corespunzătoare amestecului de lipide solide - monostearat de gliceril, palmitat de cetii). Alura foarte larga a picurilor endoterme sugerează existenta unor miezuri lipidice foarte dezordonate.

Toate sistemele nanotransportor sintetizate cu cele trei fracții de Sq (ex: Sq1, Sq2 si Sq3) prezintă modificări ale valorilor punctelor de topire, ale ΔΗ, precum si ale alurei maximelor endoterme (Fig. 4), după încapsularea componentelor active, ceea ce sugerează o perturbare semnificativa a rețelei lipidice ca urmare a co-incapsularii Pm si Hes.

O analiza comparativa a celor trei tipuri de nanotransportori preparați cu fracție vegetala ce conține 5,8% Sq, 34,7% Sq si respectiv 83,4% Sq (Fig. 4) a scos in evidenta formarea unor rețele lipidice diferite înalt dezordonate in cazul fracției concentrate in Sq.

Determinarea eficientei de încapsulare a Hes si Pm in același sistem lipidic nanotransportor

Pentru demonstrarea funcționalității fracțiilor vegetale cu concentrații de 5,8%, 34,7% si respectiv 83,4% Squalen, izolate din semințe de Amarant, s-a determinat eficienta de încapsulare a celor doua substanțe active - Pm si Hes in sistemele de nanotransportori lipidici sintetizați.

O evaluare comparativa a eficientei de încapsulare a scos in evidenta o capacitate excelenta de încapsulare a bioflavonei - Hes, cu valori ale EE > 93% in cazul primului set de NLC ce co-incapsuleaza un amestec de 0,8% Pm si Hes aflate intr-un raport masic de 1,3 : 1 (Fig. 5). Aceste valori mari ale EE% obținute pot fi asociate cu caracterul predominant lipofil al Hes captata integral in miezul lipidic. O creștere a raportului masic in favoarea Pm a condus la o scădere considerabila a eficientei de încapsulare a Hes, insa valorile raman in continuare ridicate, ex: EE% pentru NLC cu un raport masic Pm : Hes = 2:1 fiind cuprins intre 83.8 si 86.6%.

In ceea ce privește gradul de încapsulare al Pemetrexedului disodic, deși acesta prezintă un caracter puternic hidrofil, au fost obținute eficiente foarte bune de încapsulare tot in cazul NLC11

- 2 0 1 5 -- 0 0 3 9 1 1 o -06- 7015 urilor preparate la un rapoart masic Pm : Hes = 1,3 : 1 (EE% cuprinsa intre 88 si 89,4%). Prin coroborarea rezultatelor potențialului electrocinetic cu rezultatele eficientei de Încapsulare (ex: modificarea si totodată corelarea distribuției sarcinilor de suprafața cu valorile eficientei de încapsulare: EE% ridicate dar ξ mai mici pentru NLC ce conțin un raport masic de Pm : Hes = 1,3 :

si respectiv EE% scăzute dar ξ mult mai electronegative in cazul NLC preparate cu un raport masic Pm : Hes = 2:1) precum si cele ale experimentelor de eliberare in vitro susțin captarea unei cantitati considerabile de Pm in miezul lipidic, in pofida hidrofilicitatii acestuia.

Evaluarea in vitro a proprietăților antioxidante ale nanotransportorilor lipidici liberi si cu conținut variabil de Pemetrexed si Hesperidina

Pentru a se asigura o evaluare comparativa a activitatii antioxidante înainte si după încapsularea Pm si Hes, nanostructurile lipidice libere precum si NLC-urile încărcate cu Pm si Hes au fost supuse acțiunii unor radicali liberi generați in situ intr-un sistem de chemiluminescenta.

Majoritatea sistemelor de nanostructuri lipidice sintetizate cu cele trei fracții de Sg si încărcate cu diferite concentrații de antitumoral si bioflavonoid au prezentat o buna capacitate de a capta radicalii liberi oxigenați generați in situ intr-un sistem de chemiluminescenta (Fig. 6).

Valorile activitatii antioxidante (AA%) pentru nanotransportorii liberi au fost cuprinse intre 91 si 93%, ceea ce evidențiază rolul si eficienta fracțiilor vegetale pe baza de Sg de a capta radicalii liberi, fara existenta unui antioxidant suplimentar (Fig. 6). La co-incapsularea Pm si Hes in NLC au fost observate îmbunătățiri ale AA%, acestea fiind cuprinse intre 95,4 si 98% in cazul sistemelor ce conțin 0,8% amestec Pm si Hes. Cele mai eficiente sisteme de captare a radicalilor liberi s-au dovedit a fi NLC-urile ce co-incapsuleaza un amestec de 1,4% Pm si Hes aflate intr-un raport masic 1,3 : 1 (ex: AA% = 97,3 + 98,2).

Studiul eliberării in vitro a celor doua substanțe active din același sistem lipidic nanotransportor preparat cu diferite fracții de Squalen bioactiv

Avantajele evidente ale nanotransportorilor lipidici preparați cu fracții vegetale cu continui variabil de Squalen bioactiv au fost evidențiate in urma testelor de eliberare in vitro ale celor doua componente active - Pm si Hes co-incapsulate in același sistem nanotransportor.

Experimentele de eliberare in vitro au fost realizate pentru formulările optime de nanotransportori lipidici incarcati cu o concentrație totala de 0,8% amestec Pm si Hes si diferite concentrații de Squalen, utilizând celulele de difuzie Franz verticale. Pentru a evalua eliberarea celor doua componente funcție de concentrația acestora in NLC, a fost deasemenea supus testelor de eliberare si un nanotransportor preparat cu fracția cea mai concentrata de Squalen (83,4%) ce co-incapsuleaza o concentrație de 1,4% amestec de Pm si Hes. De asemenea, pentru a χ^- 2 0 1 5 -- 0 0 3 9 1 -.

0 -06-2015 demonstra avantajele clare ale sistemelor NLC dezvoltate in cercetarea prezenta in eliberarea susținuta a ambelor componente active, au fost preparate si supuse studiilor de eliberare, sisteme de nanoparticule lipidice solide - SLN preparate fără fracția vegetala de Squalen dar încărcate cu aceleași concentrații de Pm si Hes. Cantitatea de Pm si respectiv Hes eliberată a fost evaluata timp de 24 ore.

Pentru sistemele nanostructurate studiate, profilul de eliberare prezintă un model similar cu o eliberare rapida în prima oră, urmată de o eliberare lentă de-a lungul celor 24 ore (Fig. 7 si 8). Contrar așteptărilor, Pemetrexedul (distribuit in proporție majoritara in învelișul de surfactanți) este eliberat mai lent comparativ cu Hesperidina. Aceasta comportare poate fi atribuită unor potențiale efecte individuale si/sau cumulate: (i) prezentei unei concentrații mai mici de Hes comparativ cu Pm încărcate în NLCs; (ii) o prindere eficienta a Pm in învelișul de surfactanți cu posibilitatea existentei unor atracții electrostatice (datorita anionilor carboxil din structura Pm) dar si (iii) existentei unei cantitati considerabile de Pm captat in imperfecțiunile create de fracția vegetala din miezul lipidic. Pe de âltă parte, profilul de eliberare a Pm, în special pentru NLC preparat cu fracție vegetala concentrata in Șqualen (83,4%) și 0,8% amestec Pm si Hes, arată o eliberare a Pm aproape constantă de la 1h pana la 24h, în timp ce profilul de eliberare al Hes indica o creștere a cantitatii cumulate de Hes eliberata de la 1 la 8 ore, urmată de o eliberare constantă a Hes pana la 24 de ore.

în ceea ce privește influenta concentrației de Squalen utilizat la prepararea NLC, așa cum era de așteptat, se poate observa că existenta unei concentrații mari de Sq asigura o eliberare lentă a Pm si Hes (ex. NLC_Sq3 asigura o eliberare de 11,2% Pm și 55,2% Hes, în timp ce NLC_Sq1 prezintă o eliberare de 36% Pm și 64,4% Hes). Prezența unei concentrații de 83.4% Sq în matricea lipidică a sistemelor de NLC permite formarea unei rețele lipidice dezordonate cu multe imperfecțiuni in care pot fi găzduite concentrații mari de componenti activi atat de natura lipofila cat si hidrofilă.

Prin creșterea concentrației de medicament co-încapsulat de la 0,8% la 1,4% în NLC preparate cu 83% Sq (Fig. 8), viteza de eliberare a Pm a crescut la 35% (NLC_Sq3 ce încapsulează un amestec de 1,4% Pm si Hes) comparativ cu 11,2% pentru NLC_Sq3 ce încapsulează un amestec de 0,8% Pm si Hes. In mod contrar, viteza de eliberare a Hes a scăzut lent la 44% pentru NLC_Sq3 ce co-incapsuleaza 1,4% amestec Pm si Hes, comparativ cu 55,2% in cazul NLC_Sq3 ce co-incapsuleaza 0,8% amestec Pm si Hes.

Claims (15)

1. REVENDICĂRI

   1. Procedeu de obținere a unor nanotransportori lipidici funcționali pe baza de fracții uleioase de Amarant cu Squalen bio-activ ce pot co-incapsula doua medicamente - Pemetrexed si Hesperidin, caracterizat prin aceea că, cuprinde:

   a. formarea unei pre-emulsii lipidice libere și încărcate cu două componente active hidrofile si hidrofobe (Pemetrexed si Hesperidin), obținute prin contactarea, sub agitare magnetică, a unei faze apoase și a unei faze lipidice, la o temperatură de 8O...82°C, și menținere la un regim de temperatură constantă, timp de 15 min;

   b. supunerea pre-emulsiei lipidice la un proces inițial de omogenizare cu grad înalt de forfecare (12 000 rpm, timp de 1 min) si ulterior la un proces de omogenizare la presiune ridicata (la 500 bar, timp de 196 sec);

   c. obținerea unor dispersii apoase de nanotransportori lipidici liberi și încărcați cu cele doua medicamente, prin răcire ușoară, sub agitare magnetică, la temperatura camerei a emulsiei supuse celor doua tipuri de omogenizări;

   d. obținerea de nanotransportori lipidici funcționali in stare solida prin supunerea dispersiilor apoase de nanotransportori lipidici liberi și încărcați la un proces de liofilizare, la -55°C timp de 72h.
2. 2. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, faza lipidică este formată dintrun amestec de lipide solide și ulei izolat din semințe de Amarant, respectiv monostearat de gliceril : palmitat de cetii : fracție vegetala ce conține 5,8% Squalen, într-un raport de greutate de 1,16 : 1,16 : 1, la o temperatură de 8O...82°C.
3. 3. Procedeu conform revendicării 2, caracterizat prin aceea că, în loc de fracție vegetala cu conținut de 5.8% Squalen se folosește fracție vegetala cu conținut de 34,8% Squalen.
4. 4. Procedeu conform revendicării 2, caracterizat prin aceea că, în loc de fracție vegetala cu conținut de 5,8% Squalen se folosește fracție vegetala cu conținut de 83,4% Squalen.
5. 5. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, faza apoasă este formată la o temperatură de 8O...82°C dintr-un amestec de surfactanți de tip colat de sodiu : monolaurat de polioxietilensorbitan : copolimer bloc polietilenglicol-polipropilenglicol într-un raport de greutate = 28:20:1.
6. 6. Procedeu conform oricăreia dintre revendicările de la 1 la 5, caracterizat prin aceea că, preemulsia lipidică conține 30% amestec lipidic cu fracții vegetale al căror conținut de Squalen variază (5,8%, 34,7% si 83,4%), 2,45% amestec de surfactanți și 1,4% amestec de medicamente de natura hidrofobă si hidrofila, aflate intr-un raport de greutate de 1,3 ; 1.

   ^-2015-- 0 Β 3 9 1 10-06- Ό15
7. 7. Procedeu conform revendicării 6, caracterizat prin aceea că, în loc de 1,4% amestec de medicamente se folosește un amestec de 0,8% Pm si Hes aflate intr-un raport de greutate de 2 : 1.
8. 8. Nanotransportori lipidici de natura solida încarcati cu doua medicamente - Pm și Hes, obținuți prin procedeul definit în oricare din revendicările de la 1 la 7, caracterizați prin aceea că aceștia conțin:

   a. 21,6% fracție vegetala cu continui variabil de Squalen din întreaga matrice lipidica formată din lipide solide și lichide;

   b. 10,1% amestec de medicamente de natură hidrofobă si hidrofila din care 5,8% Pm și 4,3% Hes, respectiv 5,9% amestec de medicamente din care 3,9% Pm și 2% Hes, încapsulate în matricea lipidică astfel formată, procentele fiind exprimate în greutate.
9. 9. Nanotransportori lipidici conform revendicării 8 obținute prin procedeul definit în oricare din revendicările de la 1 la 7 caracterizați prin aceea că sunt de formă sferică și au un diametru mediu cuprins între 141 si 116 nm, în cazul utilizării unui raport de greutate intre Pm si Hes de

   1,3 : 1 și între 124 si 106 nm în cazul utilizării unui raport de 2 : 1.
10. 10. Nanotransportori lipidici conform revendicărilor 6 si 7 obținute prin procedeul definit în oricare din revendicările de la 1 la 5 caracterizați prin aceea că prezintă o polidispersitate ce variază între 0,253 * 0,190, în cazul utilizării unui raport de greutate intre Pm si Hes de 1,3 : 1 și între 0,152 -s- 0,179 în cazul utilizării unui raport de 2 : 1.
11. 11. Nanotransportori lipidici conform revendicării 6 obținuți prin procedeul definit în oricare din revendicările de la 1 la 5 caracterizați prin aceea că prezintă valori ale potențialului electrocinetic ce variază între -32,3 * -38,7 mV, în cazul utilizării unui raport de greutate intre Pm si Hes de 1,3 : 1 și între -47,1 * -54 mV în cazul utilizării unui raport de greutate intre Pm si Hesde 2 : 1.
12. 12. Nanotransportori lipidici conform revendicării 8 obținuți prin procedeul definit în oricare din revendicările de la 1 la 7 caracterizați prin aceea că prezintă valori ale eficienței de

    Încapsulare a Pm cuprinse între 88 si 89,4 si valori ale eficienței de încapsulare a Hes cuprinse între 93,1 si 94,2 în cazul utilizării unui raport de greutate Pm : Hes de 1,3 :1.
13. 13. Nanotransportori lipidici conform revendicării 8 obținuți prin procedeul definit în oricare din revendicările de la 1 la 7 caracterizați prin aceea că prezintă valori ale eficienței de încapsulare a Pm cuprinse între 83,8 si 86,6 si valori ale eficienței de încapsulare a Hes cuprinse între 86,9 si 87,7 în cazul utilizării unui raport de greutate Pm : Hes de 2 : 1.
14. 14. Nanotransportori lipidici conform revendicării 8, obținuți prin procedeul definit în oricare din revendicările de la 1 la 7, caracterizați prin aceea că au proprietăți antioxidante, prezentând o capacitate de a capta între 97,3 si 98,2% din radicalii liberi oxigenați formați în sistemul ^-20 15-- 0 0 3 9 1 1 0 -06- 2015 generator de chemiluminescență, în cazul utilizării unui raport de greutate Pm : Hes de 1,3 : 1, respectiv între 95,4 si 98,0%, în cazul utilizării unui raport Pm : Hes de 2 : 1.
15. 15. Nanotransportori lipidici conform revendicării 8, obținuți prin procedeul definit în oricare din revendicările de la 1 la 7, caracterizați prin aceea că prezintă abilitatea de a asigura o coeliberare sustinuta/treptata a ambelor categorii de medicamente hidrofile si lipofile.