RO130587A0 - Trusă de detecţie simultană a microdeletiilor cromozomului y bazată pe analiza curbelor de topire în sistem real time generate succesiv reacţiei touchdown pcr multiplex touchdown - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la o trusă utilizată pentru identificarea bazei genetice a infertilităţii masculine. Trusa conform invenţiei conţine 4 paneluri cvadruplex STS şi 3 triplex STS combinate în 7 tuburi diferite, astfel încât să formeze, împreună cu reactivii necesari standard pentru reacţia PCR, un amestec gata de utilizare, care se congelează pentru păstrare şi se decongelează pentru utilizare în cadrul metodei de analiză genetică moleculară.

Description

In prezent infertilitatea este considerata o problema complexa de sanatate reproductiva si ea a crescut in lume cu pana la 50% începând din anul 1955 astfel incat la ora actuala sunt afectate aproximativ 10 -15% din cupluri^[1,21. Evoluția societății umane a schimbat stilul de viata fapt ce a condus treptat si la o creștere a poluantilor din mediu. Mai mult, obiceiurile alimentare deficitare, efectele adverse ale unor produse farmaceutice si chimice, expunerea la radiații nocive de zi cu zi, stresul fizic si psihologic in viata si de la locul de munca, fumatul, sedentarismul, obezitatea si creșterea vârstei de căsătorie reprezintă împreuna factori care pot afecta in mod direct si indirect, fertilitatea umana ^[3,41. Persoanele de sex masculin sunt responsabile pentru 40-50% dintre cazurile de infertilitate. Infertilitatea masculina are o baza genetica substanțiala si depinde in mare măsură de numeroșii factori de risc din mediul înconjurător care pot conduce la rândul lor la apariția de mutatii genetice. O serie de studii au sugerat ca inca de la mijlocul anilor '70 fertilitatea masculina scade cu cate doua procente in fiecare an in anumite tari europene In prezent, aproximativ unul din 20 de barbati este infertil din cauza prezentei unor defecte grave care afecteaza desfasurarea normala a spermatogenezei si aproape unul din cinci barbati sanatosi intre 18 si 25 ani au o spermograma anormala. In plus, la 50-60% dintre infertili etiologia reprezintă inca o necunoscuta (asa-numita infertilitate idiopatica) i⁵·⁶-⁷-⁸-⁹¹⁰J.

Deși au fost identificate mai multe gene implicate in infertilitatea masculina, mecanismele biologice care conduc la perturbarea spermatogenezei la pacientii cu anomalii genetice si a caile moleculare afectate de pierderea funcției acestor gene sunt inca necunoscute. De asemenea, reglarea exprimării genelor specific implicate in funcționarea liniei germinale umane este inca puțin înțeleasa.

Pe de alta parte, selecția naturala previne transmiterea mutațiilor care cauzeaza infertilitatea, insa acest mecanism natural de protecție este surmontat la ora actuala cu ajutorul noilor tehnici de reproducere umana asistata. In special, tehnica de injectare intracitoplasmatica a nucleului spermatic (ICSI) este folosita la momentul actual pentru a

Ο 1 5 0 0 1 8 7 -1 3 -03- 2015 ' rezolva aceasta problema dar din pacate ea poate facilita in același timp si transmiterea defectului genetic necunoscut responsabil de infertilitate din tata in fiu.

Astfel, recomandarea clinica generala in ghidurile internaționale de management al infertilitatii prevăd ca pentru o concentrație a spermei mai mica de 5xl0⁶/ml este necesara testarea microdeletiilor cromozomului Y.

1.2. Factorii genetici

Factorii genetici cunoscuti in prezent ca fiind implicați in infertilitatea masculina sunt următorii: factorii majoritari sunt reprezentat! de dezechilibrele genetice cauzate de microdeletii si microduplicatii ale cromozomul Y; mai rar rearanjamentele cromozomale (translocatii robertsoniene, translocatii reciproce, inversii) precum si mutațiile genetice unice (in gena pentru receptorul androgenilor, gena fibrozei chistice- CFTR, INSL3, MTHFR) au implicare directa in infertilitate t¹¹-¹²!. Pana in prezent, nu este clar daca fenotipul care rezulta in urma prezentei aceastor rearanjamente se manifesta din cauza pierderii tuturor genele implicate in aceste modificări genomice sau de distrugerea unei gene majore a cărei unica eliminare este capabila de a induce deteriorarea spermatogenezei.

1.3. Microdeletiile din brațul lung al cromozomului Y. Microdeletiile din brațul lung al cromozomului Y (Yq) reprezintă cea mai frecventa cauza genetica moleculara pentru infertilitatea si reprezintă 15% din cazurile de azoospermie non-obstructiva sau oligozoospermie severa Au fost definite trei regiuni ca locusuri genice responsabile de desfasurarea spermatogenezei la om: AZFa, b, si c (azoospermia factor), începând cu regiunea proximala si terminând cu regiunea distala a cromozomului Yq ^[19]. Marea majoritate a deletiilor sunt reprezentate de eliminarea totala a regiunii AZF si ele se numesc in acest caz complete. Regiunea AZFa are 0,8 Mb in lungime, microdeletiile AZFb pot elimina o porțiune de 6,2 Mb, microdeletiile AZFb / c pot ajunge la 7,6 Mb lungime si regiunea cu cea mai frecventa eliminata este AZFc care se întinde in regiunea distala si are 3,5 Mb in lungime!¹³'¹⁴· ¹⁵1.

Mecanismele moleculare alterate in cazul microdeletiilor AZF sunt complet necunoscute si nu se știe care sunt funcțiile complete si precise ale genelor unice din regiunile AZF in desfasurarea spermatogenezei. Cele mai multe dintre microdeletiile AZF sunt generate prin recombinarea omologa intracromozomala intre blocuri secvența

0 1 5 00187-t 3 -33- 2015

repetate similare organizate in structuri palindromice ce prezintă secvențe aproape identice.

Datele recente din literatura de specialitate sugerează ca si alte recombinări intracromosomale in cadrul AZFc, cunoscute sub denumirea de deletii parțiale, ar putea fi asociate cu un risc crescut de modificare a spermatogenezei. Deletiile AZF parțiale sau deletia genelor unice AZF (gl/g2, care indparteaza 1.6 Mb, bl/b3 si b2/b3 care elimina 1.8 Mb) sunt foarte rare, nu sunt bine caracterizate la nivel molecular si numeroase aspecte, atat la nivel biologic si clinic, raman sa fie clarificate. Aceste deletii parțiale pot reprezenta un factor de risc puternic pentru eșecul spermatogenezei.

Microdeletiile AZF pot fi considerate pre-mutatii care pot genera ulterior pierderea completa a cromozomului Y din spermatozoizii pacienților cu deletia AZF, crescând astfel riscul de apariție a celulelor embrionare XO. Recent s-a descoperit ca barbatii cu deletii AZFc produc, de asemenea, un procent mai mare de spermatozoizi cu aneuploidii. De fapt, pacientii cu deletii AZFc prezintă o reducere semnificativa a procentului de spermatozoizi normali in comparație cu barbatii normospermici utilizați drept control, concomitent cu o creștere a spermatozoizilor nullisomici si o creștere a spermatozoizilor XY-disomici. Exista indicii conform carora pacientii cu AZFc pot prezenta spermatozoizi nucleosomici care, in urma fertilizării unui ovul sănătos din punct de vedere genetic, pot creste riscul apariției sindromului Turner (45, X).

O serie de cercetări realizate de solicitant ^112,161 indica faptul ca mai multe forme de infertilitate pot fi declanșate printr-un mecanism patogenic comun, care este probabil legat de modificările care apar la nivelul sistemului de stocare specific mRNA din celulele germinale masculine. Prezenta microdeletiilor AZFc in linii celulare in mozaic sau pierderea funcției genelor AZFc, in special a genei DAZ, poate explica acest mecanism patogenic comun ^116]. Pe baza datelor obținute de noi si cele din literatura de specialitate actuala se poate ipotetiza ca pierderea funcției genei DAZ asociata cu microdeletia AZFc completa sau parțiala poate explica numărul mare de cazuri despre care s-a crezut anterior ca ar avea infertilitate idiopatica si investigațiile asupra acestei gene pot fi importante pentru a dezvălui cauzele moleculare ale infertilitatii masculine.

ΜΜ5 0 0 1 8 7 -- ,,Λ

I 3 -13- 20β ’

1.4. Semnificația analizei de baza din trusa de detecție a microdeletiilor

In principiu analizarea unui singur locus STS nepolimorfic specific fiecărei regiuni AZF este suficient pentru a determina prezenta unui microdeletii. Situsurile ADN cu secvența cunoscuta (STS - sequence tagged sites) reprezintă secvențe scurte de ADN a căror localizare si ordine a abazelor in genomul uman este deja cunoscuta. Aceste secvențe sunt unice in genom motiv pentru care sunt foarte utile in cartarea genelor si servesc ca puncte de reper in genomul uman. In cazul deletiilor de fragmente cromozomale in general si a microdeletiilor cromozomului Y in special, aceste STS-uri analizate individual sau combinat permit detecția microdeletiilor cromozomului Y.

Analizarea a doi loci per regiune creste acuratețea analizei astfel incat analizarea cu ajutorul setului standard de primeri (sY84, Sy86, sY127, sY134, sY254, sY255) a doar 2 loci per regiune ramane inca valida. In cazul STS sY 84 s-a constatat ca exista un mismatch la mijlocul secvenței primerului forward precum si un SNP in primerul reverse. Acesta este motivul pentru care acest STS a fost eliminat din cadrul trusei propuse de noi.

Semnificația analizei de baza si a celei extinse in cazul regiunii AZFa

Având in vedere mecanismul patogenic al microdeletiilor atunci când ambii markeri STS aleși sunt absenți cel mai probabil avem o deletie AZFa completa. Totuși, deletiile parțiale ale regiunii AZF a au fost documentate in literatura de specialitate iar din punct de vedere fenotipic manifestările clinice sunt mult mai puțin severe decât in cazul deletiei complete. Analiza extinsa a regiunii AZFa este astfel absolut necesara, motiv pentru care sunt indicații cu privire la analizarea suplimentara a altor markeri STS. Urmând o cale de analiza mai sofisticata dar, in opinia noastra, foarte precisa, noi am ales următorul panel de markeri STS: sY 82 (prezent), Sy 1064 (absent), AZF- proximal2 (absent), sY 86(absent), sY 1182 (absent), AZF-distall (absent), sY 88 (prezent).

Semnificația analizei de baza si a celei extinse in cazul regiunii AZFb

Cei doi markeri STS, sY127 si sY 134, sunt localizați in regiunea mediana respectiv diastala a AZFb. Conform informațiilor disponibile la momentul actual absenta celor doi STS indica absenta completa a regiunii AZFb. Ghidul european din 2014 prevede testarea a mai muți markeri pentru acesta regiune. Noi am ales următorul panel de markeri STS: sY 105 (\2O 1 5 0 0 1 8 7

3 -03- 2015 ' (prezent), Sy 1224 (absent), sY 113, sY 116, sY117, sY127, sY134, sY 143/ 1192(absent), sY 153(prezent).

Semnificația analizei de baza si a celei extinse in cazul regiunii AZFc

Markerii STS sY254 si sY255 sunt specifici pentru gena DAZ prezenta in 4 copii in cromozomul Y fiind organizate doua cate doua in 2 complexe palindromice (PI si P2) orientate cap la cap. Absenta ambelor STS-uri indica absenta completa a regiunii AZFc. Absenta a doar unui singur marker nu a fost documentata si trebuie privita întotdeauna drept o eroare metodologica. Analizând si markerul sY160 specific heterocromatinei localizate in regiunea terminala a brațului scurt permite laboratorului sa indentifice daca deletia a avut loc după paternul b2/b4. De cele mai multe ori deletiile terminale ale cromozomului Y caracterizate de absenta heterocromatinei sunt de cele mai multe ori asociate cu cariotipul mozaic (46, XY/45, X). Prezenta liniilor celulare cu cromozomul Y absent reprezintă un prognostic negativ pentru prezenta spermatozoizilor viabili.

Deletia completa a AZFb si AZFc (P5/diastal PI sau P4/distal PI) este indicata de absenta markerilor specifici precum si de markerii sY 116 (prezent in cazul P4/distal PI si absent in cazul P5/distal PI).

Testarea genei SRY localizata in brațul scurt al cromozomului Y (sY14) este necesara pentru a documenta prezenta cromozomului Y chiar daca acesta a suferit modificări genetice in brațul sau lung.

Bibliografie

1. Sarvari A. 2010. Effect of Environmental Risk Factors on Human Fertility, J Reprod.

Infertil.11(4):341.

2. Nishimune Y & Tanaka H. 2006. Infertility caused by polymorphisms or mutations in spermatogenesis-specific genes. Journal of Andrology 27 326-334.

3. Sharpe RM. 2004. How strong is the evidence of a link between environmental chemicals and adverse effects on human reproductive health? British Medical Journal, 328, 447-451.

4. Skakkebaek NE. 2003 Testicular dysgenesis syndrome. Hormone Research 60 (Supplement 3).

(Κ 2 Ο 1 5 0 Ο 1 8 7 - - rz t 3 -33- 281S ’'

5. te Velde E. 2010 Is human fecundity declining in Western countries? Hum Reprod. 25(6):1348-53.

6. Swan SH. 2006. Does our environment affect our fertility? Some examples to help reframe the question. Semin Reprod Med., 24(3):142-6.

7. Skakkebaek NE, Rajperts-de Meyts E, Main KM. 2001. Testicular dysgenesis syndrome: an increasingly common developmental disorder with environmental aspects. Hum Reprod; 16: 972-8.

8. Auger J, Kunstmann JM, Czyglik F, Jouannet P. 1995. Decline in semen quality among fertile men in Paris during the past 20 years. N Engl J Med. 332-281.

9. Irvine DS. Falling sperm quality. BMJ 1994; 309:476.

10. Carlsen E, Giwercman A, Keiding N, Skakkebaek NE. Evidence for decreasing quality of semen during past 50 years. BMJ 1992; 305:609.

11. Alexandra M. Lopes et al. 2013. Human Spermatogenic Failure Purges Deleterious Mutation Load from the Autosomes and Both Sex Chromosomes, including the Gene DMRT1. PLoS Genet; 9(3).

12. Ferlin A, Raicu F, Gatta V, Zuccarello D, Palka G, Foresta C. 2007. Male infertility: role of genetic background. RBM Online 14: 734-745

13. Vogt, P. H., Edelmann, A., Kirsch, S., Henegariu, O., Hirschmann, P., Kiesewetter, F. et al. 1996. Human Y chromosome azoospermia factors (AZF) mapped to different subregions in Yqll. Human Molecular Genetics 5: 933-943.

14. Machev N, Saut G, Longepied G, et al. 2004. Sequence family variant loss from the AZFc interval of the human Y chromosome, but not gene copy loss, is strongly associated with male infertility. Journal of Medical Genetics 41: 814-825.

15. Massart A, Lissens W, Tournaye H and Stouffs K 2012. Genetic causes of spermatogenic failure. Asian Journal of Andrology 14:40-48.

16. Gatta V., Raicu F, A. Ferlin, I. Antonucci, A.P. Scioletti, A. Garolla, G. Palka, C. Foresta, L.Stuppia, 2010. Testis transcriptome analysis in male infertility: new insight on the pathogenesis of oligo-azoospermia in cases with and without AZFc microdeletion. BMC Genomics, 11-401.

17. Florina Raicu, L. Popa, Pompilia Apostol, D. Cimponeriu, Letitia Dan, Elena llinca, Laura Luana Dracea, B. Marinescu, Screening for microdeletions in human Y chromosome 6

AZF candidate genes and male infertility, Journal of Cellular and Molecular Medicine. Voi 7, No 1, 2003 pp. 43-48

18. Vinci G, Raicu Florina, Popa L, Popa O, Cocos R, McEIreavey K., A deletion of a novei heat shock gene on the Y chromosome associated with azoospermia, 2005, Molecular Human Reproduction, Apr;ll(4):295-8

19. Krausz C, Hoefsloot L, Simoni M, Tuttelmann F. EAA/EMQN best practice guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions: state-of-the-art 2013. Andrology. 2014;2(l):5-19.

2. DESCRIEREA DETALIATA A INVENȚIEI

Invenția descrie dezvoltarea unei truse de analiza genetica integrata care sa ofere un diagnostic molecular detaliat, simplu, rapid, robust, eficient si ieftin ce poate fi aplicat in diagnosticul molecular al infertilitatii masculine cu cauze genetice. Identificarea microdeletiilor aparute in cromozomului Y asociate cu infertilitatea masculina, cu ajutorul noii truse de analize genetice propuse pentru a fi dezvoltate, ar reprezenta un diagnostic optim de rutina, la indemana fiecărui cuplu cu probleme de infertilitate, care ar genera rezultate rapide pentru stabilirea unui tratament precoce. Utilizarea acestei metode de analiza genetica de înalta rezoluție ar prezenta astfel un impact clinic relevant asupra calitatii vieții cuplurilor infertile deoarece ar permite o evaluare corecta a diagnosticului individualizat avand in același timp costuri terapeutice reduse pentru societate si eficienta maxima pentru pacient.

Trusa de diagnostic molecular va conține 7 paneluri de primeri, acoperind o baterie de 21 de markeri genetici STS (Short Tagged Sequence) de confirmare a microdeleltiilor si microduplicatiilor Y. Acest panel a fost alcătuit ținând cont de noile rezultate științifice din ultimii ani din literatura de specialitate si are la baza toate indicațiile privind testarea microdeletiilor cromozomului Y din ultimului Ghid European (2014). Trusa prezintă primul model de acest fel utilizat la dezvoltarea unui diagnostic genetic molecular inovator al infertilitatii masculine.

(\ 2 0 1 5 0 0 1 8 7 -- lij 1 3 -33- 2315

Procedeul de diagnostic molecular propus utilizează tehnologia Real Time PCR multiplex si reprezintă o inovare si îmbunătățire clara a testelor existente pentru robustețea, simplitatea de utilizare si costul redus.

Trusa pentru testarea microdeletiilor aparute in cromozomul Y se bazeaza atat pe o serie de primeri clasicii pentru STS (short tagged sequences) cat si unii noi care acopera in cele mai multe cazuri zonele cele mai predispuse la pierderi de material genetic din cromozomul Y si care sunt relevante din punct de vedere clinic urmând indicațiile ultimului Ghid European EAA/EMQN din 2014. Acest ghid european este in permanenta actualizat o data la aproximativ 10 ani, timp in care numeroase alte cauze genetice sunt nou identificate si pot furniza din ce in ce mai multe explicații privind apariția cazurilor de infertilitate considerate atunci idiopatice (cauze necunoscute).

Pentru regiunea AZFa subregiunile detectate sunt: sY82, sY 1064, AZF-prox2, sY 86, sy 1182, AZF-distl, sY 88. Pentru regiunea AZFb subregiunile detectate sunt: sY 116, sY 117, sY153, sy 105, sY 1224, sY 127, sY 134, sY 1192 + sY 143, sY 1291. Pentru regiunea AZFc subregiunile detectate sunt: sY 254, sY 255, sY 160. Pentru brațul scurt al cromozomului Y: sY 14.

2.1. Metode de analiza utilizate in diagnosticul molecular ale companiilor care comercializează produse asemanatoare

Laboratoarele clinice internaționale oferă diferite metode pentru detectarea infertilitatii masculine cu cauze genetice cum ar fi: PCR (Polymerase Chain Reaction) multiplex cuplat cu electroforeza, revers-hibridizarea, MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) sau analiza de fragmente cuplata cu secventierea.

2.1.1. PCR (Polymerase chain reaction) cuplata cu detecție in gel de agaroza.

Reacția PCR este cea mai mare achiziție științifica ce a revoluționat domeniul geneticii moleculare. Este foarte raspandita si are numeroase aplicații deoarece permite producerea unui număr mare de copii ADN plecând de la o singura molecula de ADN.

Metoda clasica de identificarea a mutațiilor genetice asociate cu infertilitatea masculina a fost PCR combinata cu analiza ampliconilor cu ajutorul electroforezei in gel de agaroza. La ora actuala tehnica este considerata extrem de laborioasa, consumatoare de timp si poate fi supusa permanent erorilor de lucru in laborator. Mai mult, lucrul in laborator presupune

CA 2 O 1 5 O O 1 8 7 - 1 3 -03- 2OIS utilizarea unor substanțe cu un ridicat potențial cancerigen cum ar fi bromura de etidiu necesara atunci când se vizualizează la transiluminator produsii de amplificare in vederea analizării rezultatelor.

2.1.2. Metoda MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) este complexa, costisitoare si necesita utilizarea secventiatorului de acizi nucleici, un echipament complex si costisitor, precum si un personal extrem de bine calificat pentru lucrul cu acest aparat. Acesta tehnica nu poate la ora actuala sa intre in rândul tehnicilor de rutina realizate de către tehnicienii de laborator.

2.1.3. Metodele Array CGH (array comparative genome hybridization) si FISH (fluorescence in situ hybridization) au fost utilizate pentru detecția modificărilor genetice privind numărul de copii (deletii/duplicatii). Rezoluția aCGH comerciala este prea scăzută pentru a detecta microdeletiile si microduplicatiile iar in cazul FISH este dovedita utilitatea doar pentru regiunile definite anterior de literatura de specialitate insa si in acest caz rezoluția este scăzută conducând la obținerea de date imprecise. Metoda aCGH este prea costisitoare pentru a fi utilizata in screening-ul a numeroși pacienti iar FISH este consumatoare de timp. Ambele tehnologii necesita dotări de ultima generație precum si un personal de laborator foarte înalt specializat. Mai mult, datele obținute trebuie oricum reconfirmate ulterior cu ajutorul altor tehnici standard.

2.1.4. Reverse dot-blot cunoscuta si sub numele de hibridizare inversa este o metoda eficienta dar laboriaosa si in plus necesita costuri de producție ridicate deoarece sistemul presupune manufacturarea unor strip-uri de nylon pe care sunt depuse sondele complementare regiunilor de interes.

2.1.5. Real Time PCR reprezintă o metoda prin care se imbunatateste detecția pe baza specificității PCR. Procedura este simpla si necesita doar amplificarea prin PCR a fragmentelor de interes ce vor fi cuantificate in timp real intr-un sistem închis ceea ce reduce posibilitatea contaminării. Nu este necesara confirmarea ulterioara prin alte tehnici. Real time PCR reprezintă o metoda din ce in ce mai utilizata in diagnosticul molecular actual datorita avantajelor de ordin material, si joaca un rol din ce in ce mai important in diagnosticul integrat.

La nivel mondial, dar mai ales la nivel European, se manifesta in ultimii ani o tendința de studiere a modalităților de diagnostic a cauzelor infertilitatii, in vederea

C\ 2 Ο 1 5 0O187-1 3 -03- 2015 reducerii timpilor necesari si a costurilor asociate procedurilor de diagnostic si tratament. Rezultatele acestei tendințe recomanda proceduri mai ieftine si mai rapide ca prima evaluare a infertilitatii si renunțarea la o serie de teste depășite si laborioase (PCR cuplat cu electroforeza) care nu oferă informații utile in diagnostic dar care consuma resurse, sau cele costisitoare (MLPA, analiza fragmente cu secventiere).

3. Real Time PCR cuplata cu analiza curbelor de topire

Reacția de amplificare PCR in timp real cuplata cu analiza curbelor de topire este o metoda sensibila cu aplicații importante. Metoda poate defini precis punctele de rupere cromozomala ale microdeletiilor. Analiza curbei de topire ADN cuplat cu coloranti fluorescent! este o noua metoda ce permite verificarea variabilitatii ADN fara a necesita secventiere.

Cu ajutorul curbei de topire (melting-curve) se verifica specificitatea reacției de amplificare. După finalizarea reacției de amplificare simultana a 3 sau 4 STS-uri (PCR multiplex) se definește o etapa suplimentara in care se creste controlat temperatura in mediul de reacție, monitorizând in timp real semalului fluorescent, pentru a putea genera curba de melting multipla care va avea un profil specific in funcție de STS-urile aflate in combinație si condițiile de desfășurare a reacției. Când ADN dublu catenar denaturează sub influenta temperaturii ridicate, semnalul fluorescent scade generând un peak caracteristic fiecărui amplicon rezultat atunci când 50% dintre perechile de baze din secvența ADN a ampliconului sunt separate. Analiza Real time PCR cuplata cu analiza curbelor de topire pentru YCM se bazeaza pe compararea ampliconilor pentru markeri diferiți localizați in regiuni alelice afectate de microdeletii avand la baza chimia Eva Green.

Aplicațiile Real Time PCR sunt binevenite pentru identificarea numărului de copii alelice constituționale permițând detecția atat a microdeletiilor cat si a microduplicatiilor. Metoda Real-Time PCR in identificarea microdeletiilor si mutațiilor asociate infertilitatii masculine prezintă multiple avantaje.

Din acest motiv reprezintă si metoda preferata de singura companie care produce o trusa de identificarea a integrității cromozomului Y prin analiza a 8 STS uri (STS: 84, 86,127, ^2015 00187-î 3 -03- 2015

134, 254, 255) al cărei principiul de funcționare este bazat pe Singleplex Real-Time cu Sybr Green si analiza Melting Curve.

Spre deosebire de acesta trusa, cea propusa de noi conține un număr de 21 STS-uri analizate pentru microdeletii comparativ cu cele 8 analizate de compania menționata. Cele 22 de STS-uri sunt analizabile in paneluri de cate 3 respectiv 4 STS-uri simultan. De asemenea, noi vom utiliza chimia EvaGreen si nu SybrGreen, deoarece colorantul Eva Green nu are proprietatea de a inhiba reacția Real Time PCR la nivele maxime de saturație, este singurul colorant fluorescent produs care este in totalitate sigur fiind nonmutagen si non-toxic (SybrGreen utilizat in trusa Roche este chiar mai cancerigen decât mult utilizata bromura de etidiu), prezintă stabilitate superioara celorlalți coloranti fluorescenti cunoscuti, compatibila cu PCR multiplex.

Utilizarea procedeului propus de noi reduce semnificativ timpul de lucru si costul analizelor reprezentând in același timp o metoda de diagnostic foarte precisa si robusta. Raportul cost-eficienta din propunerea noastra este mai ridicat in comparație cu toate celelalte metode de diagnostic existente la momentul actual adaugand astfel o valoare suplimentara acestei noi truse de diagnostic molecular in practica clinica.

Avantajele metode Real-Time PCR pentru diferențiere alelica:

1. detecția microdeletiilor atipice si cartarea detaliata a punctelor de deletie aspect important in stabilirea unui diagnostic precis si abordarea corecta a unui tratament.

2. detecția microduplicatiilor - microduplicatiile nu pot fi analizabile cu metodele de rutina utilizate pana in prezent.

3. un avantaj este reacția multiplex cuplata cu analiza curbei de topire care permite detecția mai multor STS in același tub de reacție.

4. in comparație cu celelalte tehnici este mai rapida.

5. tehnica nu mai necesita confirmare ca in cazul celorlalte metode.

6. interpretarea rezultatelor este simpla si rapida iar programele de analiza specializate pe care le vom utiliza minimizează erorile umane de interpretare.

7. metoda poate fi automatizata pentru analize numeroase.

a ^{2 0 1 5 0} o 1 8 7 - - IU I 3 -03-2015 '

4. Metode

Pentru a putea realiza identificarea microdeletiilor de la nivelul cromozomului Y au fost testati toti cei 21 markeri ADN de tip STS, (Sequence Tagged Site), situati la nivelul regiunilor AZFa, AZFb, AZFc, respectiv controlul intern al amplificării. Secvențele selectate aparțin in special regiunilor exonice UNI STS. Programul BLAT [Basic Local Alignment Search Tool] a fost utilizat pentru a identifica similarități ale secvențelor genice unice selectate de pana la 95% la o rezoluție de cel puțin 40pb. Am utilizat acest program pentru a verifica daca exista omologie de 100% a secvențelor primerilor pentru o unica locație din întregul genom uman. Au fost selectate condițiile de lucru care au condus la obținerea produsilor de amplificare cu eficienta maxima astfel incat utilizarea lor in combinație in cadrul reacțiilor PCR multiplex sa ofere cele mai bune rezultate. A fost utilizat un ADN de referința obtinut de la mai multi barbati neinruditi cu fertilitate cunoscuta si testati anterior pentru microdeletii cu ajutorul tehnicilor standard.

Procesul de testare a avut rolul de a identifica orice parametri critici ce pot afecta performanta si masurile de control si limitare necesare care trebuie luate in considerare. Parametri critici includ: caracteristicile primerilor, stabilirea temperaturii optime de aliniere a primerilor, calcularea setului termodinamic specific in vederea obținerii unei temperaturi de topire optime, conținutul de guanina si citozina al regiunilor de interes.

4.1. Izolarea ADN

Calitatea ADN-ului necesar realizării protocolului standard de lucru a fost stabilita prin analiza spectrofotometrica standard a concentrației ADN genomic. Concentrația a fost stabilita masurand absorbanta la 260 nm (A₂6o)· Valorile normale pentru citirea făcută la 260nm sunt intre 0,15 si 1,0. Puritatea a fost calculata prin raportul A260: A 280 ce trebuie sa se situeze intre 1,8 si 2.0. O unitate de absorbanta la 260 nm corespunde la 50ug ADN/ml.

Am testat o serie de kituri de izolare ADN existente pe piața pentru a verifica compatibilitatea cu metoda de analiza genetica propusa de noi. Am selectat 4 kituri urmărind in principal ca sa: sa conțină cat mai puține etape de lucru, in special cat mai puține runde de centrifugare; sa permită izolarea unui ADN a cărui concentrație sa fie satisfacatoare iar puritatea sa fie maxima; sa necesite utilizarea unui număr redus de cC 2 Ο 1 5 0 0 1 8 7 -1 3 -03- 2015

echipamente; echipamentele necesare sa fie ușor de utilizat si sa nu necesite mantenata sau consumabile suplimentare; sa coste puțin; sa poata fi livrat rapid si sa nu necesite condiții speciale de depozitarejn acest sens am analizat tehnic mai multe protocoale de lucru aferente următoarelor kituri de izolare:

1. „InnuPREP Blood DNA Mini Kit produs de ANALITYK JENA

2. „Purelink genomic DNA kit produs de INVITROGEN

3. „Qia Amp DNA mini kit produs de QIAGEN

4. „Quickextract produs de EPICENTRE

Deoarece probele utilizate drept control pozitiv din arhiva centrului au fost izolate prin metode clasice disponibile la momentul respectiv s-a optat si pentru citirea absorbantei la 270nm si 230nm pentru a identifica probele contaminate cu fenol sau alti compuși organici. Probele ADN care au prezentat un raport al absorbantei A260:280 mai mic de 1,7 nu au fost incluse in testare.In urma testelor am constatat ca atat ADN izolat prin metoda clasica cat si kiturile testate sunt compatibile cu metoda propusa de noi.

Am constatat ca uneori valorile temperaturilor de topire pot varia cu +/_ 2,5 (°C) intre experimente diferite in funcție de concentrația ADN si MgCI₂. Adaugarea unor adjuvanti (in special DMSO - dimetilsulfoxid) in reacțiile PCR scad de asemenea temperatura de melting. Deoarece temperatura de melting este afectata la toate STS-urile amplificabile din reacția PCR multiplex am stabilit ca in reacțiile PCR sa nu adaugam adjuvanti iar concentrația ADN sa fie in jurul valorii de 30-50 ng ADN in toate reacțiile.

4.2. PCR. Aceasta metoda implica utilizarea unor perechi scurte de oligonucleotide ADN sintetizat numite primeri (de obicei de 20-25 pb lungime), ADN matrita, soluție tampon(ce conține MgCI₂), cele 4 DNTP-uri si Taq ADN polimeraza generandu-se astfel milioane de copii ale secvenței tinta. PCR-ul singleplex realizează amplificarea unei singure secvențe ADN. PCR multiplex, este utilizat pentru amplificarea unor secvențe multiple. In ambele cazuri, reacția PCR este constituita din 3 etape esențiale ce definesc un ciclu PCR: denaturarea DNA matrita dublucatenar, alinierea perechilor de primeri la matrițele de DNA monocatenar si extensia enzimatica a primerilor prin care se produc copii care servesc drept copii in ciclurile următoare.

Ct2015 00187-I 3 -33- 2315

Amestecul de reacție este mai intai încălzit la 94°C pentru denaturarea catenelor duble ale ADN si apoi răcit la o temperatura optima ce facilitează alinierea primerilor. Este foarte important ca temperatura de aliniere a primerilor folosiți in reacția multiplex sa fie una apropiata. Perechea de primeri este formata dintr-un primer sens (forward), care se cuplează la secvența sa complementara în amonte de regiunea ce urmeaza sa fie amplificata, si un primer anti-sens, reverse, care se cuplează in aval, ambele având căpătui 3' orientat spre interiorul secvenței tinta. în timpul exensiei primerilor, DNA polimeraza adauga progresiv deoxinucleotide, complementar cu secvența matrita, la căpătui 3' al fiecărei matrite, generandu-se o noua copie. De obicei, PCR consta intr-o serie de 20-40 astfel de cicluri de temperatura. Aceste cicluri sunt adesea precedate de o singura etapa de temperatura (denumita „hold) la o temperatura înalta (> 90 °C) și urmata de o pauza la sfârșit pentru extinderea finala de produs. Temperaturile utilizate și durata de timp in care sunt aplicate in fiecare ciclu depinde de o varietate de parametri. Aceștia includ enzima utilizata pentru sinteza ADN-ului, concentrația ionilor bivalenți și dNTP in reacție, precum si temperatura de topire (Tm) a primerilor.

Amestecurile de reacție au fost standardizate pe baza mai multor încercări de laborator in cazul fiecărui marker STS in parte pana când s-a obtinut un rezultat satisfăcător in ceea ce privește calitatea ampliconului obtinut.

Astfel, după selecționarea zonelor de interes din cadrul secvenței cromozomului Y s-a realizat alegerea optima a perechilor de primeri analizandu-se pentru fiecare STS in parte dimensiunea, concentrația, conținutul in GC, temperatura de topire si calitatea efectului de cuplare. Am urmărit, de asemenea, ca pentru fiecare primer in parte raportul purina: pirimidina sa fie de 1:1 sau cel puțin de 40-60% iar capetele sa fie terminat in 1-2 perechi deCG.

4.2.1. PCR singleplex in timp real

Amplificarea markerilor aleși s-a realizat într-un volum final 25 μι, iar amestecul de reacție a fost standardizat pe baza mai multor încercări de laborator pana când s-a obtinut un rezultat satisfăcător in ceea ce privește calitatea ampliconului obtinut. Au fost testate mai multe tipuri de tampoane pentru PCR evaluandu-se pentru fiecare caz in parte eficienta amplificării.

^2015 00187-1 ³ -03- 2015

Amestecul de reacție a fost realizat si testat pentru stabilirea eficientei de funcționare in cazul tuturor celor 21 STS analizate. Amestecurile de reacție au fost testate utilizând:

1. Concentrații diferite de ADN; acestea s-au situate intr-un interval de 30-500 ng de ADN genomic; (Valoare optima stabilita 50ng/ 25 pL )

2. Buffer conținând: concentrații dferite de TrisHCI (pH 8,3) intre 10-50 ^mmol/L , KCI intre 50-100 ^mmol/L; (Valoare optima stabilita 100 ^mmol/_L)

3. Taq polimeraza intre 0.5-2.5 unitati 25 μι amestec de reacție (Valoare optima stabilita )

4. MgCI2 0,5-2 ^mmol/L; (Valoare optima stabilita 2^mmol/L)

5. 50-1200 ^μσιοΙΛ din fiecare dNTP; (Valoare optima stabilita 200 ^μπιοΙΛ )

6. 0,04-0,6 ^μΓηοΙ/₁. din fiecare primer utilizat; (Valoare optima stabilita empiric 0,5 ^μΓηοΙ/ί )

7. Taq-polimeraza 0,5-2U; (Valoare optima stabilita 0,5U)

De asemenea, pentru fiecare reacție in parte au fost optimizate si temperaturile de aliniere ale fiecărei perechi de primeri in parte.

Concentrația primerilor in vederea implicării lor in metoda propusa a fost optimizata prin testarea unui interval de concentrații de la 100 la lOOOnM. Concentrația optima a fost stabilita atunci când a fost indentificat cel mai scăzut Ct si ARn maxim. Specificitatea amplificării fiecărui produs PCR a fost confirmata prin determinarea curbei de melting care trebuie sa apara ca un unic „peak ce corespunde fiecărui amplicon analizat. Seturile de primeri utilizate in reacțiile multiplex trebuie sa se amplifice cu eficienta comparabila. In cazul apariției dublelor peak-uri acestea au fost eliminate prin s-a ajustat concentrația de MgCI2 in sensul creșterii ei. Experimentele au fost realizate cu ajutorul unei platformei Real-Time ABI Prism 7500 iar rezultatele au fost interpretate cu ajutorul programului SDS versiunea 2.1

4.2.2 PCR Multiplex Touchdown in timp real

După identificarea condițiilor optime de lucru s-a trecut la realizarea combinațiilor optime de multiplexuri PCR.

In cursul reacției multiplex PCR condiționată prin touchdown are loc o reacție de PCR simultana si una specifica ale cărei condiții de realizare sunt prezentate in tabelul 1. Etapa ^2 015 0()187-1 3 -03- 2015

ΓPCR simultana permite alinierea primelor la catena matrita in mod gradual prin creșterea temperaturii de aliniere cu 1 grad per ciclu PCR. Etapa PCR specifica permite multiplicarea numărului de copii generate anterior. Astfel in strategia touchdown, in etapa de PCR simultana, temperatura de aliniere scade cu un grad la fiecare al doilea ciclu plecând de la 65 grade si ajungând la 55 grade pentru un total de 20 de cicluri. Specificitatea amplificării fiecărui produs PCR din amestecurile realizate de noi a fost confirmata prin determinarea curbei de melting care trebuie sa apara cu un profil alcătuit din 3 respectiv 4 „peak-uri unice ce corespund tuturor ampliconilor analizați. Programul generării curbei de melting este prezentat in tabelul 2.

înainte de a pune la punct sistemele de reacție de amplificare in lanț cu perechi multiple de primeri (multiplex PCR) a fost selectate anumite combinații de markeri STS specifice locusurilor genomice de interes si au fost identificate cele mai eficiente combinații de perechi de primeri, precum si anumiti parametri de lucru, astfel incat ampliconii rezultați sa nu se suprapună in ceea ce privește temperatura curbelor de topire. Acesta selecție s-a realizat prin analiza virtuala utilizând diferite programe de predictie si modelare. In cazul metodei imbunatatite de noi nu este necesara analizarea separata a ampliconilor cu aceeași greutate moleculara asa cum este cazul metodei PCR multiplex cuplata cu electroforeza in gel de agaroza. Pentru rigurozitate a fost introdus si un control intern pozitiv in toate combinațiile de multiplexuri pentru a putea identifica corectitudinea amplificării la fiecare pacient in parte.

Combinațiile specifice de locusuri genice analizate sunt unice si caracterizează aceasta aplicație. Combinațiile de succes au fost generate prin încercări si prin ajustarea concentrației primerilor pentru a identifica un echilibru in care toate locusurile analizate sa fie amplificate specific (Figurile 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 si tabelele complementare). Primerii utilizați cuprind regiuni unice, evitând regiunile repetitive, posibil in exoni.

Locusurile STS specifice si caracteristicile lor sunt prezentate	in tabelul de	mai jos
(Tabelul 1) Tabelul 1
Localizare	Nume	Greutate	Conținut	Tm Real Time	Temperatura	Temperatura
	marker	moleculara	GC%	predictiva	PCR aliniere	melting
	sY82	264pb	36%	83	60	80,88
	SY1064	HOpb	38%	80	60	78,64

Ο 1 5 ο Ο 1 87 - f 3 Ό3- 2015

	AZFa-prox2 sY86	22Opb 318pb	53% 51%	91 89,5	63 60	88,05 83.28
	SY1182	247pb	52%	88,5	60	85,21
	AZFa-distl	390pb	29%	79,5	57	81,47
	sY88	123pb	36%	81,5	56	80,04 ;
	sY 113	304pb	33%	86	60	77,44
	SY116	154pb	28%	79	61	78,04
	sY153	139pb	36%	81,5	56	80,13
	SY117	261pb	41%	85,5	56	84,79
	sY134	3Olpb	33%	82	56	80,73
	sY 1224	640 pb	35%	83,5	61	81,32
	sY105	3Olpb	40%	85	56	83,42
	sY127	274pb	41%	85,5	56	83,51
	....... - . - ... . ------------ .		*. ..		----------------------	. --------------------------
	SY143	311pb	46%	87,5	58	85,06
		------------------------------------------	-------------------.-----—--------------------	...---------------------------—.....	. —... .. .-------------------------	------------------------------———...—-------------
	SY1192	255pb	52%	92	61	88,65
	SY1191	385pb	28%	79,5	61	78,93
	sY 1291	527pb	47%	95	61	90,74
AZFc	SY254	38Opb	38%	84,5	58	82,82
AZFc	SY255	123pb	51%	88	60	85,21
control gena SRY	sY14	470pb	50%	90	58	87,75
heterocromatina	sY160	236pb	37%	83,5	61	82,07

Imbunatatirea performantelor PCR-Real Time

In general colorantii fluorescent! utilizați la analizele real-time formează complexe cu molecula ADN iar aceasta interactie conduce inevitabil la anumite interferențe in desfasurarea reacției PCR: topirea cu dificultatea a ADN dublu catenar, formarea dimerilor de primeri sau chiar alinierea greșita a primerilor si ingreunarea procesului de elongare. Utilizarea unor coloranti precum SybrGreen prezintă dezavantaje atunci când este necesara detecția ampliconilor multipli din reacțiile PCR multiplex din cauza migrării colorantului de la ampliconii mai mici la cei mai mari. Utilizarea Eva Green un nou colorant fluorescent diponibil pe piața la ora actuala conduce la imbunatatirea semnalelor. Acest colorant fluorescent este alcătuit din doua unitati monomerice unite printr-un element de legătură flexibil. In absenta ADN-ului structura dimerica a colorantului prezintă o coformatie in ac de par si este inactiva. Atunci când ADN este disponibil structura colorantului se desface si se leaga la ADN emițând in același timp fluorescenta specifica. Echilibrul chimic se bazeaza pe un mecanism unic prin care este alimentata permanent foma activa a colorantului din rezerva inactiva prezenta in amestecul de reacție pe măsură ce cantitatea de ADN sporește $(2015 0 ο 1 8 7 - î 3 -03- 2015

in cursul amplificării real-time. In afara de acet avantaj tehnic colorantul EvaGreen este si singurul colorant non-mutagenic si non-citotoxic. Eva Green este stabila in timpul ciclurilor PCR si de-a lungul depozitatii si transportului.

Amplificarea multiplex a fost testata cu 2 tipuri de coloranti fluorescenti: SYBR Green si Eva Green. Compararea aceleiași reacții utilizând cei doi coloranti a indicat faptul ca EvaGreen a fost cu 30% mai eficienta decât SYBRGreen calitatea peak-rilor fiind mult mai buna.

Sensibilitatea sistemului de testare a fost evaluata utilizând ADN genomic provenind de la un mascul control fara deletie pe cromozomul Y. Am realizat reacția PCR multiplex in timp real utilizând dilutii ale probei control de la 10-100 ng/ul. Pick-urile individuale se pot identifica cu acuratețe pana la concentrații de 10 ng/ul.

Tabelul 2. Programul PCR multiplex condiționat touchdown

Programul de ciclurilor de amplificare	Valori
Etapa 1 (touchdown)
Număr de cicluri	20
Modulul de analizare	PCR
Temperaturi tinta	Segmentul 1	Segmentul 2	Segmentul 3
°C	94	65-55	72
		(l°C/ciclu)
timpul de incubare (sec)	30	30	30
Rata de tranziție atemperaturii (°/s)	0,3	0,3	0,3
Etapa II
Număr de cicluri	15
Modulul de analizare	PCR
Temperaturi tinta	Segmentul 1	Segmentul 2	Segmentul 3
°C	94	58	72
timpul de incubare (sec)	30	30	30
Rata de tranziție a temperaturii (°/s)	0,3	0,3	0,3

Tabelul 3. Programul pentru generarea curbei de melting

Programul de ciclurilor pentru analiza	Valori
curbei de melting
Număr de cicluri	1
Modulul de analizare	Melting curve
Temperaturi tinta	Segmentul 1	Segmentul 2	Segmentul 3
°C	94	59	94
timpul de incubare (sec)	30	Rampa 2 °C	-

Ο 1 5 Ο Ο 1 87 -1 3 -03- 2015

Rata de tranziție a temperaturii (%) 0,3 0,3 0,3

5. Validarea analitica si clinica a metodei

Laboratoarele de diagnostic molecular sunt tot mai interesate pentru a respecta standardele de calitate stricte si testele de validare necesare pentru a obține acreditare oficiala a metodei de analiza. Masurile de control adecvate au inclus utilizarea de controale pozitive si negative, analiza de replici tehnice si biologice si utilizarea unui sistem de cuantificare a calitatii.

5.1. Validarea analitica înainte ca trusa de diagnostic sa fie finalizata a fost necesar sa se stabilească daca: markerii analizați sunt eficienți in diagnostic, de a stabili analitii corecti si daca numai analitii corecti sunt cei masurati. Acești parametri ne asigura ca primerii nu se suprapun la nivelul unui polimorfism si ca aceștia sunt specifici secvenței genetice de interes. Alte concepte critice pe care le-am luat in considerare au fost: selectivitatea, interferența, si cross-contaminarea. In toate experimentele derulate ne-am luat precauții procedurale stringente de rutina pentru a reduce riscul de contaminare.

După stabilirea procedurii de testare adecvate am determinat gradul de acuratețe si reproductibilitate.

Deoarece trusa de diagnostic reprezintă o metoda noua pentru care nu exista specificații de performanta adecvate, am realizat o validarea completa. Acest proces implica evaluarea performantei testului in comparație cu un test de referința („golden standard) capabil de evaluarea probei fara erori (un test care da numai rezultate adevarate). In cazul domeniului geneticii medicale, care in majoritatea cazurilor nu prezintă teste de referința, sau materiale de referința certificate, referința este metoda de diagnostic disponibila care a demonstrat cele mai bune rezultate conform literaturii de specialitate. Daca determinarea specificității de performanta este necesar sa se stabilească daca noul test Îndeplinește aceasta specificație in laborator. Verificarea trebuie sa fie adecvata pentru standardele metodei de anliza in house.

In vederea validării analitice am realizat primele experimente de testare a reproductibilitatii analizelor real-time pornind de la probe ADN cu concentrații diferite (Figura 1 si Figura 2). După cum se poate observa in imaginea alaturata, deși concentrația

Ο 1 5 0 0 1 8 7 -1 3 -03- 2015

Figura 1 PCR-singleplex in care este prezentata curba de topire caracteristica produsului amplificat pornind de la concentrații diferite de ADN. Valorile tuturor temperaturilor de topire pot varia cu maxim +/_ 2,5 (°C ] intre experimente diferite in funcție de concentrația ADN

ADN este diferita in cele doua probe de control curbele derivative specifica temperaturii de melting sunt aproape identice. Metoda de validare cu cele mai bune rezultate a fost

WXACi

W>XXi<j

400W 0

Melt Curve

Melt Curve i i I

I

Mj 60 0 '4 ij -fio <4U 88 0 04 0

ΓβπρβτΜυ·! i’Ci

0 48 0 '4 0 70 0 84 0 8v 0 CMC

TemoerMure CC) [m y cfirornosome considerata

PCR

Figura 2 PCR multiplex A.- Amestec reacție nr.5; B. - Amestec reacție nr.2; cu concentrații diferite de ADN. Diferența intre cele 2 concentrații ADN este de lOx. Se observa ca intensitatea pentru EvaGreen nu se modifica semnificativ atunci când concentrația ADN in PCR multiplex diferă. Valorile tuturor temperaturilor de topire pot varia cu maxim +/_ 2,5 (“C ) intre experimente diferite <^2 Ο 1 5 Ο Ο 1 8 7 - I 3 -03- 2015 cuplata cu electroforeza in gel de agaroza. Pentru verificarea corectitudinii rezultatelor rezultatelor reacțiilor de amplificare singleplex, câte 10 pL produs de reacție a fost supus electroforezei în gel de agaroza 2% în tampon TBE (89 ^mmol/L Tris, 89 ^mmol/L Acid boric, 2 ^mmol/_L EDTA, pH 8,3), cu bromura de etidiu incorporata în gel la concentrația de 0,5 ^/mL drept colorant fluorescent pentru vizualizare standard. Marker-ul de greutate moleculara de 100 pb a fost utilizat pentru estimarea dimensiunii fragmentelor PCR. Fiecare proba analizata a fost considerata pozitiva pentru un marker STS daca banda corespunzătoare acestuia a fost prezenta. In cazul reacțiilor PCR multiplex am ales exclusiv ca in urma analizei profilului curbei multiple de mellting peak-urile caracteristice sa corespunda peakurilor obținute individual in ceea ce privește valoarea temperaturii de melting. Utilizarea PCR cuplata cu analiza in gel de agaroza nu are utilitate in acest caz deoarece pot exista ampliconi cu aceeași greutate moleculara care se vor suprapune in gel. Curba de melting va evidenția un profil special bazat exclusiv pe temperatura de melting si nu pe greutatea moleculara.

5.2. Validarea clinica

In vederea realizării validării clinice am realizat experimente de confirmare sau infirmare a microdeletiilor. Numeroase teste genetice sunt utilizate pentru a confirma sau infirma prezenta unei anumite boli cu cause genetice. In mod ideal asemenea teste ar trebui sa identifice precis prezenta sau absenta modificărilor genetice asociate cu respectiva maladie. Cu alte cuvinte un test perfect nu este niciodată pozitiv pentru un pacient care nu are boala si nu este niciodată negativ pentru cel care o are.

Validarea clinica a metodei de analiza pentru infertilitatea masculina cu cauze genetice s-a realizat in acord cu practicile standardizate in diagnosticul infertilitatii (Figurile 3, 4, si 5). Validarea clinica a fost gandita sa se realizeze pe probe ADN provenind de la pacienti încadrați in diferite grupe de infertilitate bazate pe analiza spermogramei si a caracteristicilor fenotipice la care anterior a fost identificata precis cauza genetica.

Posibilitatea de identifica corect pacientii afectați de boli genetice este foarte importanta de atins atunci când testele sunt utilizate pentru identificarea bolilor grave tratabile. Sensibilitatea metodei propuse de noi este de 97%. Specificitatea testelor se refera la abilitatea de a identifica correct acei pacienti care nu sunt bolnavi. Specificitatea metodei propuse de noi este de 84,5%.

’Ă 2 O 1 5 0 Q Ί g y _ _ î 3 -03' 2015

Experimentele au fost realizate cu ajutorul unei platformei Real-Time ABI Prism 7500 iar
rezultatele au fost interpretate cu ajutorul programului SDS versiunea 2.1
Exemplificare AMESTEC nr.5
M*lt Curve		M·* Curve		Mett Curve
..............................................................’............... 1 A		R		c.
f ·	i - i		Î 1 i
« --«.c ;	A
,..„d	’““4			..
* · 6 a - TS a < a >	»· n			a . ssc bf a-

Figura 3 A. - Amestec reacție nr.5: sY 1064, AZFdist 2, sY 143, sY 14; B. - Amestec reacție nr.5 pacient cu microdeletie pentru sY 143; C. - Amestec reacție nr. 5 pacient versus control

EXEMPLIFICARE AMESTEC nr. 2

MaM CUIVA

Mett Curve

z	c
1
1

Figura 4 A. - Amestec reacție nr. 2: sY 88, sY 254, sY 255, sY 1192; B. - Amestec reacție nr.2 pacient cu microdeletie pentru sY 254

C. - Amestec reacție nr.2 pacient versus control

CK 2 ο 1 5 0 0 1 8 7 -î 3 -03- 2015

EXEMPLIFICARE AMESTEC nr. 3

MettCurve MeirCurve

B	c
// i .	//

Figura 5 A. - Amestec reacție nr. 3: sY 116, sY 1224, sY 1182, sY 1291; B. - Amestec reacție nr. pacient cu microdeletie pentru sY 116, sY1224 si sY 1291

C. - Amestec reacție nr. 1 pacient versus control ¢4(2015 0 0 1 8 7 -1 3 -13- 2015

Figura nr.5 - Prezentarea profilului curbei multiple de topire si a curbelor de topire individuale pentru STS-urile din AMESTECUL No. 1

MIX complet sY134, sY127, sy!4

MIX sY127, sY 134, sY14 temperaturi individuale

I 1000(1 0

ΛιΟΟΟ.ίΙ .o

1200000

V chtornosome chromosome

100000.0

STS marfcer »Y134

STS maricer«Y127

STS marter «Y14

80.73°C

83.57°C

87.75°C

Λ² Ο 1 5 0 0 1 8 7 -ί 3 *03“ 2015

Interpretare rezultate amestec nr. 1

Primeri	Tm (°C ) Control ADN femeie	Tm (°C ) ADN barbat normal	Tm (°C) ADN pacient
sY 134	Fara peak	80.73	Fara peak
sY 127	Fara peak	83.57	Fara peak
sY 14	Fara peak	87.75	Fara peak

Nota: Valorile temperaturilor de topire pot varia cu +/_ 2,5 (°C ) intre experimente diferite in funcție de concentrația ADN ¢£2015 00187-1 3 -03- 2015

Figura nr.6 - Prezentarea profilului curbei multiple de topire si a curbelor de topire individuale pentru STS-urile din AMESTECUL Nr. 2 c IX

S

10000 0

MIX sy88, sY254, sY255, sY1192

I JOOOO £| f10000 0

90000 o *0000 o

50000 0

30000 0

'0 0

0

0

Temperatura i*C‘j

H ^Y chromosome

STSmarker«Y119T s î» nuirker ry2ss

Interpretare rezultate

O î 5 O o <j 8 7 1 3 -03- 2015

Primeri	Tm (°C ) Control ADN femeie	Tm (°C ) ADN barbat normal	Tm (°C) ADN pacient
sY88	Fara peak	80.40	Fara peak
SY254	Fara peak	82.82	Fara peak
SY255	Fara peak	85.21	Fara peak
SY1192	Fara peak	89.88	Fara peak

Nota: Valorile temperaturilor de topire pot varia cu +/_ 2,5 (°C ) intre experimente diferite in funcție de concentrația ADN ¢12 0 15 0 o 1 8 7 - î 3 -03- 2015 //y

Figura nr.7 - Prezentarea profilului curbei multiple de topire si a curbelor de topire individuale pentru STS-urile din AMESTECUL Nr.3

MIX sy82, sY1064, sY86, AZFprox

Temperature ( €1

Y cnromosome

Ο 1 5 0 O 1 8 7 - ί 3 -03- 2015

Interpretare rezultate

Amestec Primeri	Tm (°C ) Control ADN femeie	Tm (°C ) ADN barbat normal	Tm (°C) ADN pacient
sY 1064	Fara peak	78.64	Fara peak
sY82	Fara peak	80.88	Fara peak
sY86	Fara peak	83.28	Fara peak
AZF-proximal 1	Fara peak	88.05	Fara peak

Nota: Valorile temperaturilor de topire pot varia cu +/_ 2,5 (°C ) intre experimente diferite in funcție de concentrația ADN

C\ 2 O 1 5 o o 1 8 7 - 1 3 -03- 2015

Figura nr.8 - Prezentarea profilului curbei multiple de topire si a curbelor de topire individuale pentru STS-urile din AMESTECUL Nr.4 >00000 O

40&00 0 tifOOO 0

MIX sy!16, sY1224, SY1182, SY1291

iH Y chromosome

70 0	’5 0 90 0	85 0
	TemperMure (’C)

'mnurlter«Yii«r

	--SfflHnâffărtYi»!
; ....
9 ·

^2015 0 0 1 8 7 - 1 3 -03- 2015

Interpretare rezultate

Amestec	Tm (°C )	Tm (°C ) ADN barbat	Tm (°C) ADN
primeri	Control ADN femeie	normal	pacient
sY 116	Fara peak	78.04	Fara peak
sY 1224	Fara peak	81.32	Fara peak
SY1182	Fara peak	85.21	Fara peak
SY1291	Fara peak	90.74	Fara peak

Nota: Valorile temperaturilor de topire pot varia cu +/_ 2,5 (°C ) intre experimente diferite in funcție de concentrația ADN

Figura nr.9 - Prezentarea profilului curbei multiple de topire si a curbelor de topire individuale pentru STS-urile din AMESTECUL Nr.5 «0000 o

MIX SY1064, Azf-d, sY143, sY14 ^2015 00187-1 3 -03- 2015 £

t

I or £ » >

s

50000 0

300000 tooooo

-10000 0

Temperatura (’C) |·α e ec «d ·Ε Uf

STS marfcer sY14		STS martMr AZF-dietat2
r		• «...
•		i ...
-·		o, .. .<_
« 1 A 1.....-

(\2 0 1 5 0 0 1 8 7

3 -03- 2015

Interpretare rezultate

Amestec	Tm (°C )	Tm (°C ) ADN barbat	Tm (°C) ADN
primeri	Control ADN femeie	normal	pacient
sY 1064	Fara peak	78.64	Fara peak
AZF-distal	Fara peak	81.47	Fara peak
sY 143	Fara peak	85.06	Fara peak
sY14	Fara peak	87.75	Fara peak

Nota: Valorile temperaturilor de topire pot varia cu +/_ 2,5 (°C ) intre experimente diferite in funcție de concentrația ADN (\2 Ο 1 5 Ο ο 1 8 7 - 1 3 >03- 2015

Figura nr.10 - Prezentarea profilului curbei multiple de topire si a curbelor de topire individuale pentru STS-urile din AMESTECUL Nr.6

MIX complet sY153, sY105, sY14 *000 o

09000 0

29000 0

19000 0

9000 0

Tempersture

<λ2 Ο 1 5 Ο ο 1 8 7 - Î 3 -03- 2015

Interpretare rezultate

Amestec	Tm (°C )	Tm (°C ) ADN barbat	Tm (°C) ADN
primeri	Control ADN	normal	pacient
	femeie
sY 153	Fara peak	80.73	Fara peak
sY 105	Fara peak	83.57	Fara peak
sY14	Fara peak	87.75	Fara peak

Nota: Valorile temperaturilor de topire pot varia cu +/_ 2,5 (°C ) intre experimente diferite in funcție de concentrația ADN ^ 2 0 1 5 0 ο 1 8 7 - î 3 -03- 2015

Figura nr.ll - Prezentarea profilului curbei multiple de topire si a curbelor de topire individuale pentru STS-urile din AMESTECUL Nr.7

MIX complet SY1191, sy160, sy117

50000 Q

20000C

IWOC 0

0000 u • ιύοο o

-21000 0

>140 ύ

840

0

Tsmperature (*Cj

Y chiomosome

^ 2 0 1 5 0 o 1 8 7 - 1 3 -03- 2015

Interpretare rezultate

Amestec Tm (°C ) Control Tm (°C ) ADN Tm(°C)ADN primeri ADN femeie barbat normal pacient sY 1191 Fara peak

79.93

Fara peak sY 160 Fara peak

82.07 Fara peak sY117 Fara peak

84.47 Fara peak

Nota: Valorile temperaturilor de topire pot varia cu +/_ 2,5 (°C ) intre experimente diferite in funcție de concentrația ADN

LISTA STS-uri utilizate in combinații PCR multiplex

STS marker sY1224

Secvența Cromozom Y uman Homo sapiens STS (sequence tagged site) genomic

GenBank: G72342.1

Primer A: GGCTTAAACTTGGGAGGGTG

Primer B: CAAAGAGCCTCCCAGACCA

STS dimensiune: 640pb

ORIGINE ggcttaaact tgggagggtg tatgtgtcca ggaatttatc catttctttt agattttcta gtgtatttgc atagaggtgt tcagagtatt atctgatgat cagcaatgat attccctatg

121 tcatttttta ttgcatctat gtgatttttc tctcttttct tctttgttag tctggctagt

181 ggtctatcta tattgttgat cttttcaaaa aaccagctta cggatttatt gatttttgaa

241 aggtttttgt gtctctgtct tcttcagttc tgctctgatc atagttattt tatgtcttct

301 gctaggtttt gtattcgttt gctctcacta aactagttct tttaattttg atgttagggt

361 gtcaatttta gatctttcct gctttctctt ttgggcattt agtgctatca gtttttctct

421 aaacaccatt ttaaatgtgt ctcagagttt gtgacacatt gtgtcttcat tcttattggt

481 ttcaaagaac atctttattt ctaccttatt tcagtattta cccagcaatg atttacagcc

541 tgctcctaaa tgttcagttt ctatgtagtt gtgcaggttt gtgtgagttt ctgaatcctg

601 ggttctcatt tcattgcact gtggtctggg aggctctttg //

STS marker SY1291

Secvența Cromozom Y uman Homo sapiens STS genomic, sequence tagged site

GenBank: G72340.1

Primer A: TAAAAGGCAGAACTGCCAGG

Primer B: GGGAGAAAAGTTCTGCAACG

STS dimensiune: 527pb ¢1 2 0 1 5 0 0 1 8 7 -“

3 -03- 2015

ORIGIN taaaaggcag aactgccagg tctgtgtctt attttctttg tcattctaat ttatcttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttgagacg gagtctcact ctgtcgccca

121 ggctggagtg cagtggcggg atctcggctc actgcaagct ccgcctcccg ggttcacgcc

181 attctcctgc ctcagcctcc caagtagctg ggactacagg cgcccgccgc tactcccggc

241 taattttttg tatttttagt agagacgggg tttcaccgtt tttagccggg atggtctcga

301 tctcctgacc tcgtgatccg cccgcctcgg cctcccaaag tgctgggatt acaggcgtga

361 gccaccgcac ctggccaagt gtcttctttt gagaagtgtc tgttcatata cttcacccac

421 tttttgatgg ggttgtttgt ttttttcttg taatttttgt ttgagttcat tgtagattct

481 ggatattagc cctttgtcag atgagtacgt tgcagaactt ttctccc //

STS marker sY14

GenBank: G38356.1

Primer A: GAATATTCCCGCTCTCCGGA

Primer B: GCTGGTGCTCCATTCTTGAG

STS dimensiune: 470pb

ORIGIN ctgtgcaaga gaatattccc gctctccgga gaagctcttc cttcctttgc actgaaagct gtaactctaa gtatcagtgt gaaacgggag aaaacagtaa aggcaacgtc caggatagag

121 tgaagcgacc catgaacgca ttcatcgtgt ggtctcgcga tcagaggcgc aagatggctc

181 tagagaatcc cagaatgcga aactcagaga tcagcaagca gctgggatac cagtggaaaa

241 tgcttactga agccgaaaaa tggccattct tccaggaggc acagaaatta caggccatgc

301 acagagagaa atacccgaat tataagtatc gacctcgtcg gaaggcgaag atgctgccga

361 agaattgcag tttgcttccc gcagatcccg cttcggtact ctgcagcgaa gtgcaactgg

421 acaacaggtt gtacagggat gactgtacga aagccacaca ctcaagaatg gagcaccagc 481 taggccactt a //

STS marker SY1191

GenBank: G73809.1

Conținut GC%: 28%

Primer A: CCAGACGTTCTACCCTTTCG

Primer B: GAGCCGAGATCCAGTTACCA

STS dimensiune: 385pb

Specific marker for U3 interval in the AZFc region.

ORIGIN ctatcagaca ctattttggc aattttatgt acctaaacat gttaaataat catgcttacc attttttcca gacgttctac cctttcgaga ttagttaata tgtttacaca cagagttttc

121 tttataggat tataatttac aatgttttca caattttctt aaacagtcga ctttatttta

181 tttaacttta agacaacttt tttattctta agcaaaatac atagttatgc cttataattt

241 ttaactaaaa ccacttttta ccatttttat acacttttat gcaaatccat gtttagcagt

301 tttaattacc tgttataacg gtaattttta gcaattttta actttaatgt aaagcctatt

361 acgtgttttt tattttgttt tgttttgttt tctttttgag acagagtctt gctctctcat

421 caggctagag tgtggtaact ggatctcggc tcactgcaac ctccacttct tggatacaag c< 2 ο 1 5 0 0 1 8 7 -1 3 -03- 2015

481 cgattctgct gcctcagcct cctgagtagc ttggattaca gacgcctgcc accacaccca

541 gctaattatt gtatttttag tagggaggag gtttcaccat gttttccagg attgtcttga //

STS marker sY254

Conținut GC%: 38%

Primer A: GGGTGTTACCAGAAGGCAAA

Primer B: GAACCGTATCTACCAAAGCAGC

STS dimensiune: 380pb

ORIGIN aaggctgggt gttaccagaa ggcaaaatcg tgccaaacac tgtttttgtt ggtggaattg 61 atgctagggt attgtattcg tacctcattt ttaccttaac atacatcatg aacaatggga 121 tgtgggccct gttacaaact taaatttttt tttgtacttc ctggaggttt agaattgctt 181 ttaggtttga cccataggta ctaaaaatat ctttgacaaa gggctgctgg tcattcgggg 241 ataaatgggg gagaaatttc cacctcatgg tagtaaaatt gtagtaaagt tgaaattttt 301 gaatgctgaa tttttactct gacgttcagt tcttttccat agatggatga aactgagatt 361 ggaagctgct ttggtagata cggttcagtg aaagaagtga a //

STS marker sY86

GenBank: G49207.1

Primer A: GTGACACACAGACTATGCTTC

Primer B: ACACACAGAGGGACAACCCT

STS dimensiune: 318pb

ORIGIN atggatccct cagcacatgg gtgacacaca gactatgctt cagcaggtct gtctgggccc 61 aagacacatt gtttctcatc agctcccagg ggatgtcaag gctgcagatc catggatctc 121 actttgcagg acagagactt ggtaatggct tcccagagtt gttacaaaga aatcccaaag 181 actgggcccc ttaaacaaca accttgattc tcacagtcct tgaggctaga agtctgagat 241 caagctatgg ccagggctgg ttcctcctga ggcctctctc cttgggttgt agatgctgtc 301 ttctccctgt gtcctcacag ggttgtccct ctgtgtgtgt ctgtgtcctc atctcctctt 361 cttatgaggt gtcttagtcc atttcaggct gctgtcacag catgccgtag actgggtggc 421 ttatcagcaa cagacattga ttctcccaca gtcctggaag ctggacgtct gagatcaggg 481 tatgggcagg //

STS marker SY143

GenBank: G38347.1

Conținut GC%: 46%

Primer A: GCAGGATGAGAAGCAGGTAG

Primer B: CCGTGTGCTGGAGACTAATC

STS dimensiune: 311pb

ORIGIN ctattcnagg gcttcatgac ccctgcagga tgagaagcag gtagtcatat ttggcttctg cttggtaatc tagcctctat ttcatttcat ctgcataggc ttttcattgg ggaggggttc

Λ^{2 0} ’ 5 0 0 1 8 7 -t 3 -03- 2015

121 tttcattggg ctgttgctag ataaagctgt ctctcaccac agattattta gatgtcaggg

181 attgcagaga gcaaaaggga ctttgggtag gctgtctgca ctccagattg tgggtcattg

241 tctccttttg ggggttgaag ttgtttgcac ttttcaggag gattttgggt cctctgacag

301 gantcagtga acattgatta gtctccagca cacggcagct catcctccca ggtgaacttt

361 nnttttcnnt tgctgtcatg ggggatccac agngctcctc atcagcagtt ntgtacaccc 421 ntatcatgct tgc //

STS marker sY134

GenBank: G12001.1

Primer A: GTCTGCCTCACCATAAAACG

Primer B: ACCACTGCCAAAACTTTCAA

STS dimensiune: 301pb

ORIGIN gaatacgact cactataggg cgaattgggt acgggccccc cctcgaggtc gacggtatcg ataagcttaa aatgtttgag aagccttcag aaagactaca aaactgtctg cctcaccata 121 aaacgtttat cttttagagg aatagtacag gtcaaaggaa ataaatagat ggggttgata 181 ctaaagttta aaacatctgg aacattctac ttgaagcgtt ctgtgactga aagaggatat 241 gataatgaaa cctttttttt ttaacctaaa tcaaaactga actagctaag tttctgaagt 301 gcatagcatg atgaaattaa atgttcctag tttaaatagt ggaaagtagg tgttttgtct 361 tgggtggtac tcatgataat tttttcttga aagttttggc agtggttgtt ataacagttt 421 agtaataagt tctacaaata gggataatta ggatgggttg ggttttatca gttttttttt 481 tgaggtggaa nctaggcttg tcacccagcg ggggtn //

STS marker SY105

GenBank: G11994.1

Primer A: AAGGGCTTCTTCTCTTGCTT

Primer B: AGGGAGCTTAAACTCACCGT

STS dimensiune:: 3Olpb

ORIGIN gggacacctg gttggnccag ctagagatga cagctagctg gttngttnca nnctgtgttc tgtatcataa gggcttcttc tcttgctttg gttttgtttc tctttttttg ctgttggtgt

121 tgttggtacg agcataagac tactactctt gtaaaagaag agctataata aaggggaaac 181 attgaacccc agagagatca acccaccaag agatgacttt cacatcactt gcaatatcca 241 tcttatttat tggctccant aatagcctnc tcactacctt acaggctcaa aatggtaaga 301 gatctcctcc tttgatgcaa aaagggttct gttcctggac tgagttcaga cggtgagttt 361 aagctccctc n //

STS marker sY 127

GenBank: G11998.1

Primer A: GGCTCACAAACGAAAAGAAA

Primer B: CTGCAGGCAGTAATAAGGGA

STS dimensiune:: 274pb

ORIGIN ¢12015 0 0 1 3 7 1 3 -33- MS ggcctgggaa tatagccaaa actaatcagc atctgaagta ataattcata gaggctaggc tcacaaacga aaagaaaaag atagcaccca ctggaatcta ccaaagccca ctgtgttcat

121 gcccacaaaa agagaagaaa ctttttcatg agatgctaat tatacaaaag ncaaaggcat

181 ttctgtgtca cagcttgttt ccttatatgg gtgagccaga tgtttgtnaa agtccttgat

241 taaatgggct ggagatttcc ctgtctgtgt agccatgagc atatttncag ttacaacacc

301 cctgtgctat ttcccttatt actgcctgca gcttgattan ttttttccca gtcagctttt

361 ctatgttatg tgggaatgag ncactn //

STS markersY1192

GenBank: G67166.1

Primer A: ACTACCATTTCTGGAAGCCG

Primer B: CTCCCTTGGTTCATGCCATT

STS dimensiune:: 255pb

ORIGIN tttttaaaaa tgaaagatta ttcttgtttt cactgtgaag cacaataaca ataaattttc cccattggta caagtgaatg atttacatgg taaattgatg tgcttaacta ctaccatttc

121 tggaagccgg atttgatata aacttatttt gggctgggcg cggtggctca cgcctgtaat

181 ctcagcagtt tgggaggccg aggcaggtgg atcacgaggt caggagatgg agaccatgct

241 ggctaacaca gtgaaacccc gtctctacta aatacacaaa aaaattagcc gggtgtagtg

301 gtgggcgcct gtgttcccag ctactccgga ggctgaggca ggagaatggc atgaaccaag

361 ggagcggagc ttgcagtgag ctgagatcga gccactgcac tccagcctag gcgacagagc

421 cagactccgt cttaaaaaaa aaaacaacaa aaaacttatt ttgataaaca tggcttatga

481 tacttgataa taaaattaat aaagatgttg tttttataaa catcaaatgt gaatagctgt

541 tgtcatggtt taaaatgtca aaggacagcc tttgaaaatt aagatactga taacagacat

601 g //

STS marker SY1182

GenBank: G64729.1

Primer A: ATGGCTTCATCCCAACTGAG

Primer B: CATTGGCCTCTCCTGAGACT

STS dimensiune:: 247pb

ORIGIN atggcttcat cccaactgag agtgtgtggg tgtttgtggg tgtgtgtgga cctacccagg acatgagaga ggattgtttt atctgatgag gagtcctggg gtaggactgg tgtgtatgtg

121 tgtgaatgtg ggagcctaac tagactaccc agaacatggg agaggcctgt ttcatctaat

181 gagaagtcct ggggcagaga aagtgtatga aagtgtgtga aagagacagt ctcaggagag

241 gccaatg //

SY1065

GenBank: G64724.1

Primer A: TCAGGTACTGTGATGCCGTT

Primer B: TGAAGAGGACACAAAGGGAAA

STS dimensiune:: 239pb

ORIGIN

Ο 1 5 0 0 1 8 7 -1 3 -03- 2015 tcaggtactg tgatgccgtt agttttgttt gttttgctca gagttgcttt ggctctttgg tctctatcag tttcatacaa attttagtat ttttttttct atttctattg aaaataacat

121 tgatattttg atacagactg cattgaatct gtagatggct tctagtagta tggtcatttt

181 aatgatgtca attcttttga tcaatgacat gcaatgtttt tccctttgtg tcctcttca //

STS marker sY160

GenBank: G38343.1

Primer A: TACGGGTCTCGAATGGAATA

Primer B: TCATTGCATTCCTTTCCATT

STS dimensiune:: 236pb

ORIGIN cccctggaat aaagtggaaa gctacgggtc tcgaatggaa taaaaatata tggaatggaa tgcaatgnaa cggaatcgaa tgtcatagaa tgtaatgcaa tgcaaaaaca tggaatccaa 121 aatcattgac tggaaaggct gggtgtcgaa aggaattgac tccaatggaa tggaatcgaa 181 tggaatggaa gtgaatagaa tcgaactaaa tcgaatggaa tggaattgat aggaacggaa 241 tggaaaggaa tgcaatgatt tggcatggaa tggaatcgca tggcatcgaa tggaatggaa 301 tggaatccaa tggaatggaa tgtattagaa tgtaatgccc ttttaatgga atgtactcga 361 catggcattc gactggaatg ggatgttctn gagtgnaatg gtctccactg ggaatggatt 421 caaaaaggaa ttggaatcgt ncggggatgg aatcctnatg ngatnggnat tanatgggaa 481 ntng //

STS marker SY153

GenBank: G12004.1

Primer A: GCATCCTCATTTTATGTCCA

Primer B: CAACCCAAAAGCACTGAGTA

STS dimensiune:: 139pb

ORIGIN aagcttttaa agcatcctca ttttatgtcc aacatcagag acttaatact gaacaaatgc cacataaagg taatgactgt tgaagaagat ttaacttaac atcttgcagc atcactaaga

121 actcgcttta tactcagtgc ttttgggttg ggtttgn //

STS marker sY255

GenBank: G65827.1

Primer A: GTTACAGGATTCGGCGTGAT

Primer B: CTCGTCATGTGCAGCCAC

STS dimensiune: 123pb

ORIGIN ggtctgaacg tgctgagtta caggattcgg cgtgatttgg ggctgcaggt aggtttcagt gtttggattc cgcagacgtt ctgaaactgt ggtggaggag gaggattaac taccaaagga

121 cgtggctgca catgacgagc acataacttt tgttttct //

STS marker sY1064 cK2 Ο 1 5 θΟ187·1 3 -03- 2015

GenBank: G64723.1

DEFINIȚIE sY1064 Sequence of Y chromosome AZFa region Homo sapiens Primer A: GGGTCGGTGCACCTAAATAA

Primer B: TGCACTAAAGAGTGATAATAAATTCTG

STS dimensiune: llOpb

ORIGIN gggtcggtgc acctaaataa ttaaataatt cctcctcaac ccctaggtct ctctgattcc ttaattatcc tgctgcaaat actcagaatt tattatcact ctttagtgca

STS marker sY116

GenBank: G66528.1

Primer A: TGTGTCATTGCACTTTAGCC

Primer B: CATTCCCCATGAAGTCAAAC

STS dimensiune: 154pb

ORIGIN aagcttgcag agagctgaga tgctgagatt gtgtgtcatt gcactttagc ctgggcaaca aaaagaaact ccatcttaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaca

121 cancaccaaa aaaagaccga aaagaaaaaa aaaagttgct gactagtttg acttcatggg

181 gaatgagagc atcactgaca tgttgagaag actgtctctg tacatggctc cacagaaatg

241 gcaatactag ttaattttat tttattttat ttattaatta ttttctggta gtgtttatct

301 gggatngttt nggttattnc ccttagnngn gtttccannn tttgtgtgtg ggttagngca

361 nccctncctg ncccttngtt tagggngagg gggtttncnc nanggccnt //

STS marker SY117

GenBank: G11996.1

Primer A: GTTGGTTCCATGCTCCATAC

Primer B: CAGGGAGAGAGCCTTTTACC

STS dimensiune: 261pb

ORIGIN gaanacgact cactataggg cgaattgggt acgggccccc cctcgaggtc gacggtatcg ataagcttga gccaccaaag accacctcta atgcagattt tcaacacgtt ggttccatgc

121 tccatacaaa gtcagattta attgtttttg tcagatttat taacttttag attctgagtc

181 cagatcatga gcatggctga acaaatccat tccagacctg atatttgttt tcctttcagc

241 ttcatgtctt tgtgtttcac cacagtctat ttggagcaac attcggagaa catcactttc

301 agccatgccc tttaccatct ggtaacaagg ctcccatttc tacttggagg taaaaggctc

361 tctccctgtt tgcctactta agactcatac aacacagata tcactccttc tagggaggtg

421 cttctcatct atcatattag ttttcttgtc tgtctgtgtg ccttgggcaa ccagcactga

481 tggaatacag tatctggcca cn //

STS marker sY88

GenBank: G49210.1

Primer A: TTGTAATCCAAATACATGGGC

Primer B: CACCCAGCCATTTG I I l l AC

STS dimensiune: 123pb ^2015 00187-1 3 -03- 2015

ORIGIN tttgagacaa taatactaaa gactcatgta actaatactt tttgtaatcc aaatacatgg gcttttttac ttactgtnct gaagttgaca gtagcattaa tagaccacca tgttgttcta

121 aactctttta nanccatgta aggngtaaaa caaatggctg ggtgcagtgg ctcatgtctg

181 taatccccgc actttgggaa gctgaggcag gtcgntcacg tgaggtcagg ngttacagnc

241 cagcctgtnc aacatggtga aaccnactta aaaatncaaa aatttggcct nncatggttn

301 gcaatgcanc tgttaggggt cagctncctn ggagtctgng gcaggagnnt cngctcaaan 361 ccnngggggg ngggg //

STS marker sY82

GenBank: G40972.1

Primer A: ATCCTGCCCTTCTGAATCTC

Primer B: CAGTGTCCACTGATGGATGA

STS dimensiune:: 264pb

ORIGIN ttngantgct ttntttngtn tgannaatna agggnncaag tggagttcac ggatatagtg atagtggtga agtctgggct tttagtgtat ctatcacttg aatagtgtac attgtagccc

121 ttaaataatt tctnatccct caacccccac catcctgccc ttctgaatct ccagtgtcta

181 ttattccaca ttggatgtcc atgtgaacac attctttatc tcccacttat aagtgagaga

241 atgcagaatt tgactttctg tttctgagtt gttttacttg agataattgc ctccagttct

301 agccatgttg ctgctaaata catgatttta tttnctatgg ctctgtagta ttccactgtg

361 tatatatatc acattttatt tatccaaaca tcccatcatc catcagtgga cactgag

Claims (10)

1. O metoda de diagnostic pentru identificarea microdeletiilor cromozomului Y, caracterizata prin aceea ca, permite investigarea a 21 STS-uri (Short tagged sequence) cu cazualitate directa asupra fertilității masculine ce cuprinde:

a) . Combinațiile de primeri multipli capabili sa amplifice simultan STS-urie localizate in cromozomul Y.

b) Combinația amestecurilor de amplificare ce conține reactivii necesari cu concentrații optimizate pentru amplificarea simultana a STS-urilor.

c) Programul de amplificare multiplex touchdown.

d) Programul de analiza curbelor de topire in sistem real time.

2. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea ca, amestecul de reacție multiplex nr. 1 conține combinațiile specifice de primeri pentru coamplificarea simultana markerilor STS (Short tagged sequence): sY 88, sY254, Sy 255 si Sy 1192.

3. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea ca, amestecul de reacție multiplex nr. 3 conține combinațiile specifice de primeri pentru coamplificarea simultana markerilor STS (Short tagged sequence): sY 1064, sY82, sY86 si AZFa-proximall.

4. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea ca, amestecul de reacție multiplex nr. 4 conține combinațiile specifice de primeri pentru coamplificarea simultana markerilor STS (Short tagged sequence): sY 116, sY1224, sY1182 si Sy 1291.

5. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea ca, amestecul de reacție multiplex nr. 5 conține combinațiile specifice de primeri pentru coamplificarea simultana markerilor STS (Short tagged sequence): sY 1064, sY143, AZF distal2 si Sy 14.

6. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea ca, amestecul de reacție multiplex nr. 6 conține combinațiile specifice de primeri pentru coamplificarea simultana markerilor STS (Short tagged sequence): sY 153, sY105 si Sy 14.

6. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea ca, amestecul de reacție multiplex nr. 7 conține combinațiile specifice de primeri pentru coamplificarea simultana markerilor STS (Short tagged sequence): sY 1191, sY160 si Sy 117..

7. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea ca, combinațiile de primeri pentru toate amestecurile multiplex sunt amplificate in aceeași placa utilizând un singur program PCR multiplex tochdown cu următoarele caracteristici: denaturare 10 minute la 94°C, etapal cu 20 cicluri ce cuprinde segmentele: denaturare 94°C timp de 30 secunde, aliniere 65-55 (descrescător cu 1°C per ciclu) timp de 30 de secunde, elongare 72 °C timp de 30 secunde, etapa a ll-a cu 15 ¢(2015 0 0 1 8 7 -1 3 -03- 2015 cicluri ce cuprinde segmentele: denaturare 94°C timp de 30 secunde, aliniere 58°C timp de 30 de secunde, elongare 72°C timp de 30 de secunde.

8. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea ca, analizeaza succesiv in același sistem de analiza curbele de topire in sistem real time ale ampliconilor generați simultan prin amplificare multiplex in următoarele condiții: segmentul 1 denaturare la 94°C timp de 30 secunde, segmentul 2 citire din 2 in 2 grade pe modulul oprire-citire in intervatul de temperatura 59-94 °C .

9. Procedeu conform revendicării 8, caracterizat prin aceea ca, generarea semnalului fluorescent înregistrat de sistemul real-time, in toate amestecurile de reacție, in vederea realizării curbelor de topire multiple, se face cu colorantul Eva Geen.

10. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea ca, amestecurile de reacție sunt suplimentate cu soluție tampon, dNTP-uri, MgCI2, Taq polimeraza si primeri in concentrații optimizate in apa ultrapura.