RO127776A2 - Metodă de analiză rapidă şi selectivă a acroleinei, bazată pe inhibiţia alcool dehidrogenazei - Google Patents
Metodă de analiză rapidă şi selectivă a acroleinei, bazată pe inhibiţia alcool dehidrogenazei Download PDFInfo
- Publication number
- RO127776A2 RO127776A2 ROA201001154A RO201001154A RO127776A2 RO 127776 A2 RO127776 A2 RO 127776A2 RO A201001154 A ROA201001154 A RO A201001154A RO 201001154 A RO201001154 A RO 201001154A RO 127776 A2 RO127776 A2 RO 127776A2
- Authority
- RO
- Romania
- Prior art keywords
- acrolein
- alcohol dehydrogenase
- cysteine
- inhibition
- analysis
- Prior art date
Links
- HGINCPLSRVDWNT-UHFFFAOYSA-N Acrolein Chemical compound C=CC=O HGINCPLSRVDWNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 68
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 title claims abstract description 15
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 title claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 title claims description 12
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims abstract description 17
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 claims abstract 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 7
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 3
- 239000008235 industrial water Substances 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- -1 thiol compounds Chemical class 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- IAJBQAYHSQIQRE-UHFFFAOYSA-N 2,4,5-trimethoxybenzaldehyde Chemical compound COC1=CC(OC)=C(C=O)C=C1OC IAJBQAYHSQIQRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 2-Propenoic acid Natural products OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MNIQECRMTVGZBM-UHFFFAOYSA-N 3-(1-methylpyrrolidin-2-yl)pyridine;7h-purin-6-amine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1NC=N2.CN1CCCC1C1=CC=CN=C1 MNIQECRMTVGZBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019504 cigarettes Nutrition 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 230000001516 effect on protein Effects 0.000 description 1
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 239000002803 fossil fuel Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 1
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000779 smoke Substances 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Invenţia se referă la o metodă de analiză a acroleinei. Metoda conform invenţiei constă în măsurarea spectrofotometrică a activităţii enzimatice în soluţii cu sau fără adaos de cisteină şi se bazează pe proprietatea specifică acroleinei de a reacţiona cu cisteina adaugată în mediul de reacţie şi de a forma astfel aducţi care nu inhibă alcool dehidrogenaza, metoda fiind aplicată la analiza apelorindustriale şi la controlul alimentelor.
Description
Descrierea invenției
Invenția se refera la o metodă de analiză rapidă și selectivă a acroleinei din probe de mediu si alimente. Metoda se bazează pe faptul că acroleina reacționează cu compușii tiolici și astfel denaturează alcool dehidrogenaza care are cisteină in situl activ. Pentru creșterea încrederii în rezultatul analizei, proba este analizată de două ori: direct pentru cuantificarea acroleinei împreuna cu eventaullii interferenți și pretratată cu cisteină pentru studiul interferențelor. In proba pretratată, cisteină reacționează cu acroleina și apoi are loc măsurarea inhibiției alcool dehidrogenazei. Dacă în proba tratată se observă reducerea procentului de inhibiție atunci proba conține acroleină, iar dacă proba tratată inhibă în continuare alcool dehidrogenaza înseamnă că în matricea probei de analizat se găsește un interferent care poate denatura proteinele.
Importanța analizei acroleinei: Acroleina (propenal) este un compus poluant care poate fi găsit in fumul provenit de la țigări, combustibili fosili, motoare diesel sau incendii de pădure. Este un reactiv toxic utilizat la sinteza acidului acrilic și a DLmetioninei, un aminoacid folosit ca supliment alimentar pentru îmbunătățirea calității furajelor. Acroleina este folosită în concentrații relativ mari ca biocid acvatic în canalele de irigație, turnuri industriale de răcire și lacuri de tratare a apelor, dar au fost constatate efecte negative la recoltele irigate cu apă tratată cu acroleina sau în mediul înconjurător în apropierea locurilor de deversare. Acroleina poate fi produsă în alimente prin degradarea termică a uleiului de prăjit sau prepararea la temperaturi mari a grăsimilor, aminoacizilor sau carbohidraților.
Sunt cunoscute metode de analiza a acroleinei din probe complexe folosind tehnici bazate pe separări cromatografice sau electroforetice, dar acestea presupun un echipament complex, etape suplimentare de pretratare a probelor și un timp de analiză îndelungat. Au fost de asemenea raportate metode spectrometrice sau electrochimice de analiză a acroleinei, dar acestea nu sunt selective deoarece se bazează pe proprietăți generale ale aldehidelor.
c\-2010-01154-2 3 -11- ZU1D
Acroleina are ο reactivitate crescută datorită proprietăților electrofile și reacționează cu grupările tiolice ale proteinelor și ăn consecință enzimele care au cisteină în centrul catalitic sunt inhibate. Aceasta proprietate este specifica acroleinei. Alte aldehide nu inhiba alcool dehidrogenaza, aceasta producând în reacția enzimatică de oxidare a alcoolilor diferite aldehide.
în matricea probelor complexe pot să se afle și diferite substanțe care au un efect denaturant asupra proteinelor. Pentru evitarea interferențelor, mecanismul de detecție este utilizat pentru investigarea cauzei inhibiției alcool dehidrogenazei. Astfel proba este amestecată cu cisteină și apoi este măsurată inhibiția remanentă. în cazul în care cisteină reduce inhibiția alcool dehidrogenazei înseamnă că în proba se afla acroleina, iar în caz contrar denaturarea enzimei este cauzată de un interferent. Această posibilitate de a crește selectivitatea măsurătorilor de inhibiție prin consumarea selectivă a analitului este unică în cazul biosenzorilor enzimatici.
Metoda de analiză conform invenției necesită un spectrometru UV și celule de cuarț tansparente în acest domeniu al spectrului electromagnetic.
Metoda de analiză, conform invenției, prezintă următoarele avantaje:
- permite identificarea rapida a probelor contaminate cu acroleina;
- asigura selectivitatea analizelor;
- este simplă de utilizat chiar și de personal mediu calificat;
- are un preț de cost scăzut;
- este portabilă;
- nu necesită utilizarea unor reactivi toxici;
- nu necesită efectuarea unor etape lungi de tratare/extragere/purificare/derivatizare a probei înaintea analizei propriuzise.
Pentru metoda de analiză sunt necesari următorii reactivi: etanol, nicotin adenin dinucleotidă forma oxidata (NAD+), cisteină din care sunt preparate zilnic soluții stoc in apă purificată. Alcool dehidrogenaza din Saccharomyces cerevisiae este dizolvată în tampon fosfat pH=7,7 și împărțită în alicoturi păstrate la -20°C. Probele sunt tamponate cu TRIS/HCI (0,1 M, pH=8,8).
Metoda de măsurare a activității enzimatice a alcool dehidrogenazei se bazeaza pe cuantificarea NADH-ului la λ=340 nm. Analiza este efectuată in cuve din quarț cu ^-2010-01154-2 3 -11- 2010 volumul de I mL. Pentru analiza, 800 pL de probă este amestecată cu 145 pL tampon TR1S, 10 pL soluție 0,1 M NAD+, 40 pL soluție 0,1 M etanol. După omogenizare în cuvă se adaugă 5 pL soluție de alcool dehidrogenază cu activitate specifica 22 Ul/mL. Amestecul este omogenizat și absorbanța este măsurată timp de 50 secunde. Pentru studiul interferențelor: se amestecă 800 pL de probă cu 135 pL tampon TR1S și 10 pL soluție 0,1 M cisteină. După 5 minute se adaugă 10 pL soluție 0,1 M NAD+, 40 pL soluție 0,1 M etanol si 5 pL soluție de alcool dehidrogenază cu activitate specifică 22 Ul/mL. Viteza reacției enzimatice este exprimată în unități de adsorbanță per secundă (ΔΑ/Δί) și se calculează prin interpolarea părții liniare a curbei experimentale A-t. Procentul de inhibiție se calculează ca reducerea activității enzimatice în raport cu o măsurătoare blank tară acroleină.
Invenția va fi prezentată în continuare în legătură cu figurile 1 și 2 care prezintă:
- figura 1: semnalele analitice obținute folosind soluții standard de acroleină și acroleină cu cisteină în comparație cu un control.
- figura 2: domeniul liniar al curbei de calibrare folosind soluții standard de acroleină și acroleina cu cisteină.
Modul de interpretare al rezultatelor analizelor conform invenției este explicat în figura 1. Inițial se efectuează o măsurare a activității enzimatice de control tară acroleină și a fost măsurată o variație a absorbantei ΔΑ/Δί= 0.002 U.A./sec. Ulterior se investighează efectul inhibitor al acroleinei și pentru o soluție de 0,8 mM acroleină se obține ΔΑ/Δΐ= 0.0013 U.A./sec ceea ce corespunde la un procent de inhibiție Inh(%)=35%. Măsurarea variației absorbantei unei soluții care conține 0,8 mM acroleină si 1 mM cisteină se obține ΔΑ/Δί= 0.0019 U.A./sec care corespunde unei variații a activității enzimatice de 5%. Aceasta este mai mică decât 10% care este considerată limita de detecție și astfel se poate concluziona că în prezența unui exces de cisteină nu are loc o variație semnificativă a activității enzimatice în raport cu un control.
Metoda de analiză conform invenției poate analiza acroleina cu o limită de detecție de 0,2 mM. Curba de calibrare este liniară între 0,2 și 2 mM. Pentru concentrații mai mari de acroleină se obține un platou. Ecuația curbei de calibrare prezentate în figura 2 este: Inhibiție (%)= 34,05*Conc acroleină (mM)+ 1,07; R2=0.9918 (n=5). Tot în figura ^-2010-01154-2 3 -11- 20W r
ϊ este prezentată și activitatea enzimatică măsurată pentru soluții în care 1 mM cisteină a fost amestecată cu diferite concentrații de acroleină. Pentru acest amestec variația relativă aadsorbanței este sub ±10% și astfel este nesemnificativă.
Claims (3)
1. Metodă de analiză rapidă a acroleinei bazată pe doua măsurători spectrometrice ale inhibiției alcool dehidrogenazei produsă de proba în absența și prezenta cisteinei.
2. Metodă conform revendicării 1, caracterizată printr-o sensibilitate bună a măsurătorilor bazată pe inhibiția alcool dehidrogenazei de către acroleină.
3. Metodă conform revendicării 1, caracterizată printr-o selectivitate ridicată a măsurătorilor bazată pe proprietatea specifică acroleinei de a reacționa cu cisteină adaugată în mediul de reacție ceea ce duce la formarea de aducți care nu inhibă alcool dehidrogenaza.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ROA201001154A RO127776B1 (ro) | 2010-11-23 | 2010-11-23 | Metodă pentru determinarea rapidă a acroleinei |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ROA201001154A RO127776B1 (ro) | 2010-11-23 | 2010-11-23 | Metodă pentru determinarea rapidă a acroleinei |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RO127776A2 true RO127776A2 (ro) | 2012-08-30 |
| RO127776B1 RO127776B1 (ro) | 2016-03-30 |
Family
ID=46724105
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ROA201001154A RO127776B1 (ro) | 2010-11-23 | 2010-11-23 | Metodă pentru determinarea rapidă a acroleinei |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RO (1) | RO127776B1 (ro) |
-
2010
- 2010-11-23 RO ROA201001154A patent/RO127776B1/ro unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RO127776B1 (ro) | 2016-03-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Klein et al. | Effects of increasing temperature on antioxidant defense system and oxidative stress parameters in the Antarctic fish Notothenia coriiceps and Notothenia rossii | |
| Isaac et al. | Electroanalytical methods for the determination of sulfite in food and beverages | |
| Sunda et al. | The effect of nitrogen limitation on cellular DMSP and DMS release in marine phytoplankton: climate feedback implications | |
| Yang et al. | Novel spectrofluorimetric method for the determination of sulfite with rhodamine B hydrazide in a micellar medium | |
| Peng et al. | Rapid colorimetric detection of H2O2 in living cells and its upstream series of molecules based on oxidase-like activity of CoMnO3 nanofibers | |
| Garcia-Guzman et al. | Selective methods for polyphenols and sulphur dioxide determination in wines | |
| Filik et al. | Cloud point extraction for speciation of iron in beer samples by spectrophotometry | |
| Frezzini et al. | Effects of operating conditions on PM oxidative potential assays | |
| Ensafi et al. | Determination of glutathione in hemolysed erythrocyte by flow injection analysis with chemiluminescence detection | |
| Wang et al. | Direct determination of reduced glutathione in biological fluids by Ce (IV)–quinine chemiluminescence | |
| Hatton et al. | Determination of dimethyl sulfoxide in aqueous solution by an enzyme-linked method | |
| Shi et al. | Influence of dissolved organic matter on dissolved vanadium speciation in the Churchill River estuary (Manitoba, Canada) | |
| Song et al. | A highly selective NIR ratiometric fluorescent probe for in situ detection of metabolized hydrazine in living cells | |
| Chaichi et al. | Determination of cysteine and glutathione based on the inhibition of the dinuclear Cu (II)-catalyzed luminol–H2O2 chemiluminescence reaction | |
| Li et al. | A label-free fluorimetric detection of biothiols based on the oxidase-like activity of Ag+ ions | |
| Topçu et al. | Evaluation of a new biosensor-based mushroom (Agaricus bisporus) tissue homogenate: investigation of certain phenolic compounds and some inhibitor effects | |
| Fang et al. | An overview of analytical methods for detecting endogenous hydrogen sulfide (H2S) in plants | |
| Wang et al. | A reusable ratiometric fluorescent biosensor with simple operation for cysteine detection in biological sample | |
| Wu et al. | A biosensor with myrosinase and glucose oxidase bienzyme system for determination of glucosinolates in seeds of commonly consumed vegetables | |
| Su et al. | A colorimetric sensing strategy for detecting 10-hydroxy-2-decenoic acid in royal jelly based on Ag (I)-tetramethylbenzidine | |
| CN105985291B (zh) | 一种快速高选择性分析氟离子的比色荧光探针 | |
| CN116333005A (zh) | 一种二茂铁基烯酮氨基脲Schiff碱检测Al3+、Cu2+和Fe3+ | |
| Hogg et al. | Detection of nitric oxide and peroxynitrite in biological systems: a state-of-the-art review | |
| RO127776A2 (ro) | Metodă de analiză rapidă şi selectivă a acroleinei, bazată pe inhibiţia alcool dehidrogenazei | |
| Uraisin et al. | Kinetic-spectrophotometric method for the determination of trace amounts of bromide in seawater |