RO127273B1 - Anticorpi policlonali anti-edem3 - Google Patents

Description

Invenția se referă la anticorpi policlonali anti EDEM3 (ER degradation-enhancing mannosidase-like protein), destinați diagnosticării stresului la nivel celular.

EDEM3 este o glicoproteină rezidentă în reticulul endoplasmatic (RE), implicată în calea de degradare asociată reticulului endoplasmatic. Ea face parte din familia glicozil hidrolazelorGH (47), care cuprinde a-1,2 RE manozidaza I, a-1,2 Golgi manozidaza IA, IB și IC și cele trei proteine rezidente în RE, EDEM1, EDEM2 și EDEM3. Rolul acestor proteine în reticulul endoplasmatic nu este pe deplin cunoscut.

Proteina EDEM3 diferă față de ceilalți 2 membri ai subfamiliei EDEM (EDEM1 și EDEM2) prin faptul că prezintă în plus un domeniu asociat proteazelor cu funcție necunoscută, și un semnal de retenție KDEL.

în domeniu sunt cunoscuți anticorpii comerciali anti-EDEM3 ce provin de la SigmaAdrich având secvența imunogenă corespunzătoare secvenței de aminoacizi 470-485, 869882 și 869-8825 de EDEM3 uman (http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIGMA/ E8906/lang=en&region=RO).

în documentul a Soluble EDEM Homolog, Enhances Glycoprotein Endoplasmic Reticulum associatedDegradation andMannose Trimming* ΤΗE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 281, NO. 14, pp. 9650-9658, April 7, 2006, Kazuyoshi Hirao¹ și colab. (http://www.uniprot.org/uniprot/Q92611), se descrie faptul că acest control al calității în reticulului endoplasmatic garantează că numai proteinele pliate sunt reținute în celule prin intermediul unor mecanisme ce recunosc și îndepărtează proteinele pliate eronat sau neasamblate, într-un proces denumit degradarea reticulului endoplasmatic - asociate (ERAD). Anterior, s-a donat EDEM (ER degradation-enhancing α-mannosidase-like protein) și s-a arătat că accelerează ERAD a glicoproteinelor pliate eronat.

Problema pe care o rezolvă invenție este de a obține anticorpi policlonali anti-EDEM3.

Anticorpii policlonali anti-EDEM3 înlătură dezavantajele de mai sus prin aceea că au specificitate față de regiunea trunchiată solubilă a proteinei EDEM3 cu secvența de aminoacizi din fig. 1, Secv. Nr. 2.

Prin aplicarea invenției se obțin următoarele avantaje:

- anticorpii policlonali descriși în acest brevet de invenție recunosc specific proteina EDEM3, atât proteina transfectată cu plasmida pTriEx-EDEM3, cât și cea endogenă;

- anticorpii obținuți pot fi folosiți pentru evidențierea proteinei EDEM3 cu o specificitate mai mare față de cea a anticorpilor anti EDEM3 comerciali, prin faptul că aceștia nu recunosc nespecific și alte proteine din lizatele celulare folosite;

- anticorpii descriși în acest brevet de invenție pot fi folosiți în diverse tehnici cum ar fi: Western blotting, imunoprecipitare, imunofluorescență;

- folosirea anticorpilor descriși în acest brevet de invenție în tehnici de biologie celulară poate contribui la descoperirea unor noi parteneri de interacție ai proteinei EDEM3, iar aceasta poate duce la elucidarea mecanismelor prin care proteina EDEM3 participă la degradarea altor proteine depliate.

Anticorpii conform invenției pot fi obținuți folosind un fragment din ADNc al acestei proteine (aa 47-225), donat în vectorul de expresie pHAT-2 care a fost exprimat în sistem procariot. Fragmentul din proteina EDEM3 recombinantă prezintă 6 histidineîn capătul N-terminal ce pot fi folosite pentru purificarea proteinei prin cromatografie de afinitate pe rășină de Ni-NTA. Pentru obținerea acestor anticorpi se pot face imunizări repetate ale animalului cu proteina recombinantă 6His-EDEM3.

Anticorpii descriși în această invenție pot fi folosiți pentru identificarea proteinei EDEM3supraexprimatăîn celule A375 (celule de melanom uman nepigmentat-amelanotice), HEK 293 T (celule embrionare de rinichi uman) și HUH7 (celule de hepatom uman), prin

RO 127273 Β1 transfecția vectorului pTriEx-EDEM3, cât și proteina EDEM3 exprimată constitutiv de aceste 1 celule. Proteina poate fi identificată prin Western Blot, imunofluorescență și imunoprecipitare. Rezultatele obținute au arătat faptul că, prin Western Blot, poate fi identificată atât proteina 3 EDEM3 supraexprimată, cât și cea endogenă ca o bandă distinctă la aproximativ 100 kDa care își modifică mobilitatea electroforetică în urma tratamentului cu endoglicozidază H 5 (endoH). Prin imunofluorescență se poate identifica proteina EDEM3 supraexprimată, cât și proteina EDEM3 endogenă. Aceasta prezintă o distribuție clară în reticulul endoplasmatic, 7 lucru demonstrat prin colocalizarea cu calreticulina și calnexina, proteine ce sunt folosite adesea ca marker de RE. Prin imunoprecipitare poate fi detectată proteina EDEM3 transfec- 9 tată, cât și cea exprimată constitutiv în celule cu o specificitate ridicată. Pentru validarea specificității anticorpilor, au fost testați prin comparație cu anticorpii comerciali anti-EDEM3 11 ce provin de la Sigma.

Anticorpii conform invenției au următoarele proprietăți: specificitate înaltă pentru 13 EDEM3 glicozilat și neglicozilat, capacitate redusă sau absentă de interacție cu celelalte proteine din familia EDEM, EDEM1 și EDEM2. 15 în continuare se prezintă 9 exemple de realizare a invenției, în legătură cu fig. 1...9, ce reprezintă:17

- fig. 1 - secvența de nucleotide (Secv. Nr. 1) și aminoacizi (Secv. Nr. 2) a proteinei recombinante pHAT-2-EDEM3;19

- fig. 2 - secvența primerilor folosiți pentru donarea proteinei recombinante pHAT-2-

EDEM3;21

- fig. 3 - analiza SDS-PAGE pentru verificarea expresiei în sistem bacterian, și purificarea prin cromatografie de afinitate a proteinei pHAT-2-EDEM3;23

- marker de masă moleculară; 2 - proteinele solubile din supernatant, în urma sonicării; 3 - proteinele solubile care nu s-au legat de rășina de agaroză; 4-5 - spălări; 6-7 -25 eluatul ce conține proteina EDEM3 purificată; 8 - proteinele solubile care au rămas prinse de rășină în urma eluției de pe rășina de agaroză.27

Proteinele separate prin SDS-PAGE au fost colorate cu Coomassie blue. Analiza prin electroforeză în mediu denaturant indică prezenta proteinei EDEM3 la masa corespun- 29 zătoare (aproximativ 30,7 kDa), în urma purificării proteinei prin cromatografie de afinitate;

- fig. 4 - verificarea proteinei pure prin Western Blot cu anticorpi anti-His.31

Analiza SDS-PAGE a proteinelor pHAT-2-EDEM3 și pHAT-2-EDEM1 în urma purificării prin cromatografie de afinitate. în liniile 1, 2 și 3 din fig. 4 a fost încărcată în gel de 33 poliacrilamidă proteina pHAT-2-EDEM3 în urma purificării, în liniile 2 și 3 au fost făcute 2 diluții ale proteinei, respectiv, 1/5 și 1/15. în liniile 4 și 5 a fost încărcată proteina pHAT-2- 35 EDEM1. Proteinele au fost separate prin SDS-PAGE și apoi transferate pe membrană de nitroceluloză, apoi detectate utilizând anticorpii anti-HIS în diluție 1/3000 (provin de la 37 Sigma);

- fig. 5 - analiza SDS-PAGE a proteinei EDEM3 în urma etapei de dializă în PBS:39

- proteina purificată prin cromatografie de afinitate de pe rășina de agaroză; 2 - proteina purificată obținută în urma etapei de dializă în PBS;41

- fig. 6 - analiza SDS-PAGE a probelor prelevate în urma concentrării proteinei

EDEM3 prin liofilizare;43

- marker de masă moleculară; 2-3 - proteina obținută în urma eluțiilor; 4-5 - proteina obținută în urma eluțiilor, și apoi supusă procesului de concentrare prin liofilizare;45

- fig. 7 - utilizarea anticorpilor pentru identificarea proteinei EDEM3 prin tehnica

Western Blotting. Pentru caracterizarea anticorpilor anti EDEM3 s-a făcut Wester blot în care47 s-au folosit anticorpii acestei invenții. Experimentul s-a realizat pe celule HEK293 (celule

RO 127273 Β1 embrionare de rinichi uman) transfectate cu EDEM3, și celule HEK293 care nu au fost transfectate. Apoi au fost digerate cu enzima endoglicozidază H (EndoH) pentru a urmări modificarea compoziției glucidice a proteinei EDEM3, atunci când trece din lumenul RE în aparatul Golgi. Proteinele prezente în lizatele celulare au fost separate prin SDS-PAGE, apoi transferate pe membrane de nitroceluloză și detectate cu anticorpii prezentați în acest brevet de invenție;

- fig. 8 - marcarea radioactivă a proteinei EDEM3 cu [³⁵S] metionină/cisteină.

în acest experiment s-au folosit celule aderente HEH 293 T (celule embrionare de rinichi uman) care nu au fost transfectate, pentru a putea detecta proteina EDEM3 endogenă și celule HEH 293 T care au fost transfectate cu proteina pTriEx-EDEM3.

în fig. 8a este prezentată marcarea cu [³⁵S] a celulelor transfectate cu plasmida pTriEx-EDEM3, și imunoprecipitarea cu anticorpii descriși în acest brevet de invenție în trei diluții diferite. Analiza s-a realizat prin SDS-PAGE și autoradiografierea în condiții reducătoare.

în fig. 8b este reprezentată marcarea cu [³⁵S] a celulelor transfectate cu plasmida pTriEx-EDEM3 (liniile 1 si 2), marcarea cu [³⁵S] a celulelor netransfectate (liniile 3 și 4) și imunoprecipitarea cu anticorpii anti-EDEM3 descriși în acest brevet.

în fig. 8c este reprezentată marcarea cu [³⁵S] a celulelor transfectate cu plasmida pTriEx-EDEM3 (liniile 1 și 2), marcarea cu [³⁵S] a celulelor netransfectate (liniile 3 si 4) și imunoprecipitarea cu anticorpii anti-EDEM3 produși de firma Sigma. Această comparație s-a realizat pentru a determina specificitatea anticorpilor descriși în acest brevet, în comparație cu anticorpii existenți pe piață.

în fig. 8c, se observă că anticorpii produși de firma Sigma recunosc nespecific proteine pe care anticorpii acestui brevet de invenție nu le recunosc (proteine marcate cu săgeată în fig 8c). Scopul acestui experiment a fost de a analiza specificitatea anticorpilor descriși pe celule care au fost transfectate cu plasmida pTriEx-EDEM3 și pe celule care exprimă constitutiv această proteină. Din fig. 8b se observă că anticorpii acestei invenții recunosc specific atât proteina transfectată în celule, cât și proteina endogenă, diferența fiind dată de o recunoaștere mai slabă a proteinei endogene. Se mai poate observa că atât în celule transfectate, cât și în celule netransfectate cu plasmida pTriEx-EDEM3, anticorpii nu recunosc decât proteina de interes în comparație cu anticorpii comerciali (Sigma) ce recunosc nespecific și alte proteine. în aceste trei experimente a fost realizată digestia cu endoglicozidază H (EndoH) deoarece, prin digestia cu această enzimă a părții glucidice a glicoproteinei, a fost urmărită modificarea compoziției glucidice a proteinei EDEM3, atunci când aceasta trece din lumenul reticulului endoplasmatic în aparatul Golgi. Acest lucru servește drept control pozitiv pentru determinarea poziției de migrare electroforetică a polipeptidului deglicozilat;

- fig. 9 - utilizarea anticorpilor pentru identificarea proteinei EDEM3 prin imunofluorescență;

- fig. 9 a - colocalizarea intracelulară a proteinei EDEM3 cu calreticuIină (Crt) în celule A375 transfectate cu plasmida pTriExEDEM3.

Celule A375 transfectate cu plasmida pTriEx-EDEM3 au fost fixate, permeabilizate apoi marcate cu anticorpi anti-EDEM3 și anticorpi anti-Calregulină - marker de RE. Anticorpii secundari folosiți au fost: Alexa Fluor 488 (EDEM3) și Alexa Fluor 594 (Crt). Pentru vizualizarea nucleilor s-a folosit DAPI;

- fig. 9b, 9c - colocalizarea intracelulară a proteinei EDEM3 cu calnexină (CNX) în celule HUH7 (fig. 9b) și celule HUH7 transfectate cu plasmida pTriEx-EDEM3 (fig. 9c).

RO 127273 Β1 înfig. 9b, celulele HUH7 au fost fixate, permeabilizateapoi marcate cu anticorpi anti- 1 EDEM3 și anti-calnexină. Anticorpii secundari folosiți au fost AlexaFluor 488 (EDEM3) și AlexaFluor 594 (CNX). Pentru vizualizarea nucleilor s-a folosit DAPI. 3 în fig. 9c, celulele HUH7 transfectate cu plasmida pTriEx-EDEM3 au fost fixate, permeabilizate apoi marcate cu anticorpi anti-EDEM3 și anticorpi anti-calnexină. Anticorpii 5 secundari folosiți au fost AlexaFluor 488 (EDEM3) și AlexaFluor 594 (CNX). Pentru vizualizarea nucleilor s-a folosit DAPI. în aceste două figuri se observă că proteina EDEM3 colocali- 7 zează cu calnexina, fapt care demonstrează că localizarea intracelulară a proteinei este în reticulul endoplasmatic. Anticorpii descriși în acest brevet de invenție recunosc specific atât 9 proteina transfectată, cât și proteina endogenă.

în fig. 9d, celulele HUH7 transfectate cu plasmida pTriEx-EDEM au fost fixate, 11 permeabilizate, apoi marcate cu anticorpi anti-EDEM3 și anticorpi anti-EEAI (Early Endosome Marker). Anticorpii secundari folosiți au fost AlexaFluor 488 (EDEM3) și 13 AlexaFluor 594 (EEAI). Pentru vizualizarea nucleilor s-a folosit DAPI. Se observă în această figură că proteina EDEM3 nu colocalizează cu EEAI, așa cum era de așteptat datorită 15 localizării intracelulare diferite.

în fig. 9e, celulele HUH7 transfectate cu plasmida pTriEx-EDEM3 au fost fixate, 17 permeabilizate, apoi marcate cu anticorpi anti-EDEM3 și anticorpi anti RAB7. Anticorpii secundari folosiți au fost AlexaFluor 488 (EDEM3) și AlexaFluor 594 (RAB7). Pentru 19 vizualizarea nucleilor s-a folosit DAP1. Se observă în această figură că proteina EDEM3 nu colocalizează cu RAB7, așa cum era de așteptat, datorită localizării intracelulare diferite. 21 în fig. 9f, celulele HUH7 transfectate cu plasmida pTriEx-EDEM3 au fost fixate, permeabilizate, apoi marcate cu anticorpi anti-EDEM3 și anticorpi anti-LAMP2 (Lysosome 23 Marker). Anticorpii secundari folosiți au fost AlexaFluor 488 (EDEM3) și AlexaFluor 594 (LAMP2). Pentru vizualizarea nucleilor s-a folosit DAPI. Se observă în această figură că 25 proteina EDEM3 nu colocalizează cu LAMP2, așa cum era de așteptat, datorită localizării intracelulare diferite. 27

Exemplul 1. Clonarea EDEM3 recombinant

ADN-ul complementar (secvența 1, fig. 1) utilizat pentru realizarea expresiei proteinei 29 EDEM3 (secvența 2, fig. 1) în sistem bacterian a fost donat în vectorul pHAT-2. în urma activării promoterului inductibil T7 din vector, este sintetizată proteina recombinantă EDEM3 31 care conține la capătul N terminal șase histidine. Astfel, ADN-ul complementar a fost amplificat prin PCR folosind Taq ADN polimeraza (New England Biolabs), folosind primeri 33 specifici, cărora li s-au adăugat la capătul 5'-terminal situsurile de recunoaștere ale enzimelor de restricție BamHI și, respectiv, Notl (fig. 2). Ampliconul a fost supus digestiei cu enzimele 35 BamHI și Notl, urmată de o nouă purificare folosind kitul DNA Gel extraction (Qiagen). Clonarea în vectorul pHAT2 liniarizat prin digestia cu aceleași enzime de restricție s-a 37 realizat printr-o reacție de ligare, urmată de transformare în bacteriile E. coliXL1-Blue. ADNul extras din clona pozitivă a fost în continuare supus digestiei enzimatice cu enzima BsrGI, 39 urmată de electroforeză. Fragmentul de ADN care conține vectorul, primele 676 de perechi de bază și ultimele 161 pb din EDEM3, a fost purificat prin extracție din gel și recircularizat 41 prin reacția de ligare, urmată de transformare în bacteriile E. coli XL1-Blue. întregul insert a fost secvențiat pentru verificarea fidelității reacției de PCR și a cadrului de citire. 43

Exemplul 2. Obținerea expresiei proteinei EDEM3 recombinante în sistem procariot

Pentru obținerea proteinei recombinante au fost parcurse două etape: expresia și 45 purificarea proteinei EDEM3 recombinante.

Proteina utilizată în acest studiu a fost proteina pHAT-2-EDEM3, și reprezintă 47 secvența de aminoacizi 47-225 din gena EDEM3. Strategia de donare a genei ce codifică pentru EDEM3 este prezentată la exemplul 1. 49

RO 127273 Β1

Testele de optimizare a expresiei au vizat principalii parametrii care influențează expresia proteinelor în sistem procariot: temperatura, timpul de inducție, tipul celulelor și concentrația de inductor, β-D-izopropil-tiogalactozid (IPTG). Condițiile optime de expresie au fost creșterea celulelor BL21 (DE3) (a fost aleasă această linie celulară deoarece conține gena pentru T7 ARN polimeraza) la temperaturi cuprinse între 30 și 37°C, și 150...250 rpm, până la densitatea optică ce este cuprinsă între 0,5 și 0,7 nm. Celulele au fost induse cu IPTG în concentrații cuprinse între 0,4 și 0,8 mM, timp de 4.. .6 h. Celulele obținute au fost resuspendate în tampon de extracție care conține: tampon fosfat de potasiu 50 mM, NaCI 300 mM, și 20 mM imidazol, pH 7. în acest tampon s-au adăugat inhibitori de proteaze, DNA-ză (50 pg/ml) și lizozim (1 mg/ml), și au fost incubate 30 min pe gheață. Celulele resuspendate în vederea eliberării conținutului celular au fost supuse lizei cu ajutorul unui aparat (sonicator Bandelin Electronic) 10 s, putere 70%, 7 cicluri. Omogenatul obținut din aceste celule a fost centrifugat la 14000 x g, 30 min, la 4°C. în urma acestei centrifugări s-a separat extractul conținând proteinele solubile. Proteina EDEM3 a fost vizualizată prin SDS-PAGE în fracția solubilă, fracție care a fost folosită ulterior la etapa de purificare prin cromatografie de afinitate. Proteinele exprimate în vectorul de expresie pHAT-2 sunt fuzionate cu o oligopeptidă formată din 6 resturi de histidină la capătul N-terminal al proteinei, și pot fi astfel purificate aproape omogen prin cromatografie de afinitate pe rășină chelatată cu Ni²⁺. în fig. 3 se prezintă etapele purificării. Datele finale optime pentru expresia și purificarea proteinei EDEM3 au fost folosite în continuare pentru obținerea unor cantități mai mari de proteină purificată.

Exemplul 3. Verificarea proteinei pure prin tehnica Western Blot folosind anticorpi anti-His

Proteina purificată a fost verificată prin tehnica Western Blot folosind anticorpi anti His (Sigma), deoarece proteina EDEM3 a fost donată în vectorul de expresie pHAT-2 (fig. 4).

Această verificare s-a făcut prin migrarea probele prelevate pe parcursul etapelor de expresie și purificare, și anume: supernatantul în urma sonicării (neindus cu IPTG - luat drept control negativ), fracția insolubilă obținută în urma sonicării (fără IPTG), fracția solubilă obținută în urma sonicării (indus cu IPTG),) și în urma purificării proteinei (proteinele din fracția solubilă care au rămas nelegate de rășină), eluatul obținut în urma eluției cu diferite diluții de IPTG și proteină ρΗΑΤ-2-EDEMI purificată (drept control pozitiv) în diluție 1/5, proteina pHAT-2- EDEM1 purificată (drept control pozitiv) în diluție 1/15. Detecția proteinelor s-a realizat cu ajutorul anticorpilor anti-HIS (care provin de la Sigma). Din fig. 4 se observă că anticorpii anti-His se leagă specific de cele două proteine EDEM3 și EDEM1. Din acest experiment rezultă că proteina obținută în urma purificării prin cromatografie de afinitate este proteina 6His - EDEM3.

Exemplul 4. Dializa proteinei în tampon fosfat salin (PBS)

Proteina pHAT2-EDEM3 a fost dializată față de tampon fosfat salin cu pH 7,4, pentru îndepărtarea imidazolului adăugat la eluarea proteinei de pe rășină de agaroză și a sărurilor. Dializa s-a realizat în pahar erlenmeyer de 3 I, care a fost umplut cu soluție PBS. Proteina a fost mutată în saci de dializă, în membrane impermeabile pentru proteine, dar permeabile pentru substanțe neproteice. Dializa se poate face la temperaturi de 4...10°C, cu schimb la fiecare oră. Proteina obținută în urma dializei a fost analizată prin metoda Bradford, de determinare a proteinei totale, și vizualizată prin SDS-PAGE în fig. 5.

Exemplul 5. Concentrarea proteinei recombinante prin liofilizare

Fracțiile de eluat culese la etapa de purificare prin cromatografie de afinitate au fost analizate pentru determinarea concentrație de proteină prin citirea absorbantei la 595 nm prin metoda Bradfourd. Acesta analiză a fost necesară datorită faptului că, pentru obținerea anticorpilor policlonali anti-EDEM3, a fost nevoie de o concentrație a proteinei de 2 mg/ml.

RO 127273 Β1

Proteina a fost stocată în prealabil în tuburi Eppendorf de 1,5 ml, la -85°C, și transfe- 1 rată rapid în aparatul de liofilizare, unde a fost lăsată aproximativ 2 h. Metoda presupune transformarea directă din gheață în vapori, și se realizează la temperatură mică (-50... -55°C) 3 și vid. Scopul folosirii acestei metode a fost de a obține produși ușor solubili în apă, care să aibă aceleași caracteristici ca produsul original după adiția apei. După expirarea timpului de 5 incubare, tuburile au fost scoase și proteina a fost resuspendată în apă pură, pentru a ajunge la volumul de 2 mg proteină/500 μΙ. 7

Proteina a fost vizualizată prin SDS-PAGE pentru a verifica proteina în urma etapei de concentrare prin liofilizare (reprezentat în fig. 6, liniile 1 și 2). 9

Exemplul 6. Obținerea anticorpilor anti-EDEM3

După obținerea proteinei recombinante pure, s-au realizat 1...8 imunizări, primele 3 11 imunizări au fost făcute cu 1 mg de proteină pură, și următoarele imunizări, cu 500 pg de proteină EDEM3 pură. Pentru un răspuns imun cât mai bun, s-a folosit adjuvant Freund 13 incomplet pentru prima imunizare, și adjuvant Freund complet pentru următoarele imunizări. Volumul final al amestecului a fost de 1 ml pentru primele trei imunizări 500 μΙ proteină + 15

500 μΙ adjuvant (1 mg proteină) și următoarele 4 imunizări din 250 μΙ proteină + 250 μΙ adjuvant (500 pg proteină). Amestecul de imunizare a fost injectat subcutanat la iepure, în 17 urma recoltării serului preimun folosit drept control negativ. După fiecare imunizare s-a recoltat sânge pentru verificarea răspunsului imun și pentru testarea titlului anticorpilor 19 (fig. 7). După obținerea unui titru constant de anticorpi, iepurele a fost sângerat, și serul obținut în urma centrifugării a fost alicotat în tuburi eppendorf de 1,5 ml sterile și păstrate la 21 -85°C. Verificarea serului a fost realizată prin tehnica Western blot, imunofluorescență și imunoprecipitare, și în comparație cu anticorpii comerciali existenți anti-EDEM3 (ce provin 23 de la Sigma).

Exemplul 7. Utilizarea anticorpilor pentru identificarea proteinei EDEM3 prin tehnica 25

Western Blotting

Tehnica western blot (sau imunoblot) este o analiză folosită pentru detecția unei 27 anumite proteine dintr-un amestec de proteine provenind de la o probă de țesut sau un lizat celular. Proteinele separate prin electroforeză sunt transferate din gel pe o membrană de 29 nitroceluloză sau poliviniliden fluorid (PVDF), unde sunt detectate cu ajutorul anticorpilor specifici. 31

Pentru identificarea proteinelor de interes (EDEM3) cu anticorpi specifici, gelurile au fost transferate pe membrane de nitroceluloză. Transferul pe suport lichid al proteinelor din 33 extractele celulare separate prin SDS-PAGE este o metodă care permite evidențierea și caracterizarea lor ulterioară cu anticorpi marcați chimic. Detecția proteinelor de interes s-a 35 făcut după cum urmează:

- membranele au fost incubate cu soluții de anticorpi primari anti EDEM3 în 5% lapte 37 degresatîn PBS, timp de 1 h, cu agitare. A urmat etapa de spălare a excesului de anticorpi cu soluție PBS + Tween 20 0,2% (6 spălări timp de 10 min). 39

Anticorpii secundari au fost folosiți în mod similar: anticorp secundar antiiepure conjugat cu HRPdiluție 1:10000 sau 1:30000. Membranele au fost spălate și incubate 1 min 41 cu reactivii ECL din kit, învelite în folie și puse în contact cu filmul fotografic, pentru detecție.

Exemplul 8. Marcarea radioactivă a proteinei EDEM3 cu [³⁵S] metionină/cisteină 43 Marcarea metabolică a celulelor s-a făcut cu scopul de a identifica apoi calea pe care o urmează în celulă proteina EDEM3 care a fost marcată la intervalul de 20 de min. Prin 45 încorporarea aminoacizilor cu cisteină și metionină care conțin un atom de [³⁵S], polipeptidul în curs de sinteză devine “marcat” radioactiv și poate fi vizualizat prin autoradiografie. 47

RO 127273 Β1

S-au folosit celule HEK293 T (celule embrionare de rinichi uman), care au fost cultivate în mediu RPMI 1640 suplimentat cu ser fetal de vitei 10%, 50 U/mL penicilină și 50 mg/mL streptomicină, și menținute la 37°C cu 5% CO₂. Celulele HEK 293 T au fost transfectate folosind polietilenimină (PEI) ca reactiv de transfecție. La 24 h după transfecție celulele au fost resuspendate în mediu RPMI 1640 fără cisteină și metionină, conținând 1% ser fetal inactivat, timp de 1 h, la 37°C. Apoi s-a realizat marcarea proteinelorîn curs de sinteză (puise) cu [³⁵S] metionină/cisteină, timp de 20 min, la 37°C. Imediat după puise, celulele au fost spălate cu PBS rece, și apoi lizate în tampon HEPES/CHAPS (50 mM HEPES, pH=7,5, 2% CHAPS, 200 mM NaCI și 0,5% inhibitori de proteaze), timp de 30 min, pe gheață. Uzatele celulelor marcate radioactiv au fost transfecție, celulele au fost resuspendate în mediu RPMI 1640 fără cisteină și metionină, conținând 1% ser fetal inactivat, timp de 1 h, la 37°C. Apoi s-a realizat marcarea proteinelorîn curs de sinteză (puise) cu [³⁵S] metionină/cisteină, timp de 20 min, la 37°C. Imediat după puise, celulele au fost spălate cu PBS rece, și apoi lizate în tampon HEPES/CHAPS (50 mM HEPES, pH=7,5, 2% CHAPS, 200 mM NaCI și 0,5% inhibitori de proteaze), timp de 30 min, pe gheață. Lizatele celulelor marcate radioactiv au fost centrifugate și supernatantele au fost incubate peste noapte, la 4°C, cu agitare cu anticorpii anti-EDEM3 descriși în această invenție, sau anticorpii anti-EDEM3 (Sigma) (fig. 8b, Liniile 1,2,3, 4) și 30 μΙ proteină A Sepharose în suspensie. Proteina EDEM3 a fost eluată în tampon de încărcare al probelor ce conține SDS 2% și 0,5 M DTT (condiții reducătoare). Probele au fost migrate în gel de poliacrilamidă 12% și analizate prin autoradiografie. Anticorpii anti-EDEM3 au fost folosiți în diluția 1/50,1/100 și 1/500. S-au folosit și celule netransfectate pentru detecția proteinei EDEM3 endogenă atâtîn cazul incubării cu anticorpii descriși în acest brevet de invenție, cât și în cazul folosirii anticorpilor comerciali.

Exemplul 9. Localizarea intracelulară a proteinei EDEM3 prin microscopie de imunofluorescență

Celulele utilizate în experiment sunt celule aderente ce cresc în monostrat la suprafața de creștere a recipientelor de cultură. Celulele au fost lăsate în incubator peste noapte, pentru a permite atașarea lor de suprafață. A doua zi celulele au fost transfectate cu proteinele pTriEx-EDEM3 și pTriEx-EDEMI și, în aceeași placă, am schimbat mediul celulelor netrasfectate, apoi celulele au fost incubate până ziua următoare. La finalul timpilor de incubare, celulele au fost fixate cu paraformaldehidă 4% (PFA), 15 min, și permeabilizare cu Triton X-100. Celulele au fost incubate cu anticorpii primari (iepure anti EDEM3, descriși în acest brevet, folosiți în diluția de 1/100), capră anti Calnexina (Santa Cruz), șoarece anti LAMP2 (Santa Cruz), șoarece anti EEAI (BD Biosciences), capră anti RAB7 (Santa Cruz), capră anti Calregulină (Santa Cruz, diluați în PBS 1/200), apoi incubate cu anticorpii secundari. La final celulele au fost spălate și montate în mediu de vizualizare cu DAPI. Vizualizarea celulelor în fluorescență a fost realizată la microscopul Nikon Eclipse E600.

Claims (3)

1. Revendicări1

   1. Anticorpi policlonali anti-EDEM3, caracterizați prin aceea că au specificitate față 3 de regiunea truncată, solubilă, a proteinei EDEM3, cu secvența de aminoacizi din fig. 1, Secv. Nr. 2.5
2. 2. Anticorpi policlonali anti-EDEM3, conform revendicării 1, caracterizați prin aceea că se utilizează pentru diagnosticul stării de stres la nivel celular.7
3. 3. Anticorpi policlonali anti-EDEM3, conform revendicării 1, caracterizați prin aceea că se utilizează pentru identificarea EDEM3 uman și de șoarece.9