RO127271A2 - Anticorpi policlonali anti-edem1 - Google Patents

Abstract

Prezenta invenţie se referă la anticorpi policlonali anti-EDEM1, destinaţi diagnosticării stresului celular la nivelul reticulului endoplasmic, prezentând specificitate ridicată faţă de EDEM1 de şoarece şi umană, cu capacitate redusă de interacţie cu alte proteine din familia EDEM.

Description

Invenția se referă la produsul anticorpi policlonali față de proteina EDEMI (ER-egradation enhancing α-mannosidase like protein), destinați identificării proteinei în celule de mamifere în special de om și șoarece.

In afecțiunile neurodegenerative și cele cauzate de stresul reticulului endoplasmic cum ar fi boala Parkinson, sindromul Alzheimer. diabetul de tip 2 și multe altele, modificările majore care au loc la nivel celular sunt legate de: acumularea proteinelor în reticulul endoplasmic și blocarea funcționării normale a celulei în vederea depășirii stării de stres. Acumularea proteinelor în reticulul endoplasmic are loc datorită funcționării defectuoase a mașinăriei de degradare a proteinelor care asigură îndepărtarea și degradarea proteinelor incorect pliate din reticulul endoplasmic, în acest caz celula nu mai poate funcționa normal și toate procesele celulare normale sunt atenuate.

Dintre componentele mașinăriei de degradare a proteinelor, proteina EDEM I este una din proteinele a căror expresie crescută are ca efect accelerarea degradării proteinelor incorect pliate.

Proteina EDEMI este o proteina exprimată constitutiv în toate celulele mamaliene și este supraexprimată în condiții de stres. Din punct de vedere structural, EDEM 1 este o glicoproteină care conține un domeniu omolog cu manozidaza, enzimă care hidrolizează resturile de manoză ale glicanilor oligomanozidici. Identificarea acestei proteine este favorizată de recunoașterea specifică prin intermediul anticorpilor policonali.

Anticorpii policonali sunt produși de celulele B ca răspuns la pătrunderea în organism a unui antigen care declanșează activarea sistemului imun. Acești anticorpi pot fi utilizați într-o gama largă de tehnici biochimice ca reactiv de diagnostic.

Problema pe care o rezolvă aceasta invenție este obținerea unui produs cu proprietatea de a reacționa ca anticorp cu antigenele de tipul EDEM I.

Avantajele aplicării acestei invenții sunt următoarele:

Anticorpii descriși în invenție recunosc proteina EDEMI forma wild lype cât și mutantele acesteia

Anticorpii folosiți în invenție pot fi utilizați pentru detecția EDEMI prin Western blot, imunoprecipitare și imunofluorescență

Anticorpii descriși în invenție pot fi folosiți în diagnosticul stărilor de stres la nivel celular

Anticorpii, conform invenției pot fi obținuți folosind ca imunogen proteina EDEMI tară secvența semnal, obținută prin expresie în celule bacteriene și purificare prin cromatografie de afinitate. Pentru obținerea anticorpilor policonali se pot utiliza metodele convenționale care implică imunizarea animalelor cu proteina recombinantă obținută în bacterii și colectarea serului animalelor imunizate care conține anticorpii de interes.

< .·

V

^--2 0 1 0 - 0 0 588--

8 -09- 2010

Anticorpii descriși în aceasta invenție pot fi folosiți pentru detecția proteinei EDEMI din celule sau extracte celulare ca reactiv de analiză în vederea identificării proteinei în diferite linii celulare. Rezultatele obținute indică o specificitate ridicată a anticorpilor față de proteina EDEMI supraexprimată, acești anticorpi fiind validați în comparație cu anticorpi comerciali față de secvența HA adaugată la proteina EDEMI și cu alți anticorpi produși față de proteina EDEMI descriși în literatură. Anticorpii obținuți pot fi folosiți pentru evidențierea proteinei prin metode biochimice: Western blot. imunoprecipitare, imunofluorescență, cu rezultate mai bune față de anticorpii comerciali.

Anticorpii conform invenției au următoarele proprietăți:

-specificitate înalta pentru EDEMI. in condiții reducatoare si nereducatoare;

-capacitate redusă sau absentă de interacție cu celelalte proteine din familia EDEM

Se dau în continuare cinci exemple de realizare a invenției, în legătură și cu figurile 1-6. care reprezintă:

- fig. 1. secvența de nucleotide (secvența 1) și aminoacizi (secvența 2) a proteinei EDEM 1;

- fig. 2. secvența de nucleotide a primerilor folosiți pentru donarea EDEMI în vectorul pHAT2:

-fig. 3, expresia și purificarea proteinei EDEMI din bacterii: a) Expresia proteinei EDEMI în sistem bacterian: I-standard de masă moleculară. 2-lizat celular neindus cu IPTG (supernatant), 3-lizat celular neindus cu IPTG (sediment), 4-lizat celular indus cu IPTG (supernatant), 5-lizat celular indus cu IPTG (sediment); b) Purificarea proteinei EDEMI: l-standard de masă moleculară. 2-solubilizarea corpilor de incluziune, 3-proteina solubilizată legată de rășină, 4-proteina solubilizată nelegată de coloană, 5-eluție 1 a proteinei de pe coloană cu tampon fosfat cu imidazol, 6-eluție 2 a proteinei de pe coloană cu tampon fosfat cu imidazol: c) Randamentul de purificare al proteinei de interes: 1-standard de masă moleculară, 2-EDEMI- proteina purificată prin cromatografie de afinitate. 3-BSA 2mg/ml. 4-BSA 1.5mg/ml. 5-BSA Img/ml,

- fig. 4. utilizarea anticorpilor pentru identificarea proteinei EDEM I prin Western blotting: a) Verificarea specificității anticorpilor produși comparativ cu anticorpii descriși în literatură: I, 2EDEM1 transfectat în celule HEK293T (celule embtrionare de rinichi uman) - și respectiv + digestie cu EndoH- WB anticorpi policonali față de EDEMI; 3,4-aceleași probe ca mai sus- WB anticorpi policonali Stephen High, descriși anterior în literatură: b) Specificitatea anticorpilor produși folosiți la diferite concentrații în Western blotting: 1.3- lizat celule HEK 293T care suparaexprimă EDEM 1; 2.4lizat celule transfectate cu EDEM I digerate cu EndoH- WB α-EDEMl diluție 1:700 godeurile 1 și 2. 1:500 godeurile 3,4: c) Verificarea specificității anticorpilor în condiții reducătoare și nereducatoare și reacția nespecifică între anticorpii produși și proteina EDEM 2: l-HEK. 293T control redus, 2-HEK 293T+EDEM1 redus. 3-HEK 293 T+EDEM1 neredus, 4-HEK 293 T+EDEM 2 redus- WB a-EDEMl diluție 1:700.

- fig. 5. Utilizarea anticorpilor pentru imunoprecipitrea proteinei EDEM I: a) Specificitatea anticorpilor produși comparativ cu anticorpii comerciali: celule HEK 293T transfectate cu EDEM 1:

'''' „(GreștA__ (V2 0 1 0 - 0 0 9 8 8 -1 8 -09- 2010 /ΰ

IP α-EDEM 1. 2-IP α-ΗΑ; b) verificarea specificității anticorpului atât pentru forma glicozilată a proteinei cât și pentru forma polipeptidului deglicozilată: 1-celule HEK 293T control, 2-HEK 293T transfectate cu EDEM1,3- digestie cu EndoH pentru proteina supraexprimată- IP EDEM I; c) verificarea specificității anticorpilor in condiții reducatoare si nereducatoare si reacția nespecifica intre anticorpii produși si proteina EDEM 2: 1. HEK 293T+EDEM 1 redus. 2. HEK 293 T+EDEM I neredus. 3. HEK 293 T+EDEM 2 redus

-fig. 6. utilizarea anticorpilor pentru identificarea proteinei EDEM 1 prin imunofluorescență.

Exemplul 1. Clonareaproteinei EDEM 1 recombinante

Pentru expresia proteinei de interes în sistem bacterian secvența ADN-ului complementar (secvența 1, Fig. 1) care codifică EDEM1 (secvența 2. Fig. 1) a fost donat în vectorul de expresie pHAT-2. Acest lucru s-a realizat trecând printr-o etapă intermediară de subclonare în vectorul pGEMT easy. Astfel. ADN-ul complementar de EDEM I a fost amplificat prin PCR folosind Taq ADN polimeraza și primeri specifici (oIB-47 si oIB-48) carora li s-au adaugat la căpătui 5'-terminal situsurile de recunoaștere ale enzimelor de restricție ΛΤοΙ și respectiv, Sph\ (Fig. 2). Sub-clonarea în vectorul pGEM-T easy s-a realizat folosind kitul pGEM-T Easy Vector System urmând instrucțiunile din manualul de utilizare. în etapa următoare, plasmidul pGEM-T recombinant a fost supus unor digestii secvențiale cu enzimele de restricție Ncol și NotI, iar insertul. reprezentând ADN-ul de EDEMI a fost introdus printr-o reacție de ligare catalizată de enzima T4 DNA ligaza în vectorul pHAT-2 liniarizat cu enzimele Ncol și Notl. Verificarea eficienței donării și a integrității ADN-ului complementar a fost realizată prin secvențierea întregului insert din plasmidul pHAT-2 recombinant.

Exemplul 2. Obținerea proteinei recombinante

Pentru obținerea proteinei recombinante. celulele bacteriene E. coli tulpina BL21 (DE3) RIL, au fost transformate astfel încât să exprime în cantitate mare proteina recombinantă. Am utilizat tulpina de celule BL21 (DE3) RIL deoarece acestea conțin ARN de transfer pentru aminoacizi rari, iar proteina EDEM! conține un procent ridicat de aminoacizi rari. ADN-ul recombinant a fost introdus în celule prin permeabilizarea peretelui celular cu clorura de calciu și apoi au fost crescute în mediu de cultura lichid pentru multiplicare suplimentat cu antibioticul de selecție. în acest caz ampicilina. Pentru a obține o cultură cât mai omogenă care conține preponderent bacterii care au încorporat plasmidul de interes, creșterea celulelor se face în mediu de cultură cu antibiotic. Expresia proteinei a fost indusă la o densitate optică la 600 nm a celulelor bacteriene de 0.6-0.8 prin adaugarea de isopropil-a-beta D tiogalactopiranozidă (IPTG). urmată de creșterea celulelor la temperaturi de 20-25°C timp de 3-6 ore. IPTG-ul se leagă la represorul operonului lac și astfel induce expresia genelor reglate de operonul lac, în acest caz proteina EDEM 1 în vectorul pHAT 2 care conține operonul lac.

^“2010-00988-1 8 -09- 2010 mg/ml). lizozim (Img/mL) și cocktail de inibitori de proteaze fără EDTA. pe gheață, pentru a evita degradarea proteinei. Tamponul de liză a fost ales astfel încât sa nu interfere în etapa de legare a proteinei pe coloană. Supernatantul și sedimentul obținute în urma centrifugării Uzatului celular au fost separate prin electroforeza SDS-PAGE, și a fost stabilită localizarea exclusivă a proteinei EDEM1 în corpii de incluziune. Solubilizarea proteinei din corpii de incluziune a fost făcută cu tampon fosfat la care a fost adaugată uree în concentrație finală 6-8 M. (Figura 3 a,b)

In etapa de clonare. proteinei de interes i s-a atașat un motiv de 6 histidine (His-tag) care prezintă afinitate micromolară pentru ioni de nichel sau cobalt. Pe baza acestei proprietăți pentru purificarea proteinei recombinante care include secvența de 6 histidine s-a folosit rășină cu nichel. Proteina recombinantă a fost purificată prin cromatografie de afinitate pe coloana Ni-NTA (Ninitroacetic acid), acidul nitracetic având 4 situsuri de legare a ionilor metalici, este atașat covalent de suportul solid și are rol de chelator pentru ionii de nichel. Legarea proteinei pe coloana s-a efectuat la 4°C, timp de 1-3 h, după care proteinele legate nespecific au fost îndepărtate prin spălare cu tampon de liză. Eluția proteinei de interes a fost făcută cu tampon de liză suplimentat cu imidazol IOO-3OOmM. Proteina purificată a fost vizualizată prin colorare cu Comassie-Blue în gel de poliacrilamidă în paralel cu o proteină standard în concentrație cunoscută. (Fig 3 c)

Exemplul 3: Obținerea anticorpilor anti-EDEM 1

Pentru producerea anticorpilor față de proteina EDEM I. proteina purificată a fost injectată la iepure împreună cu adjuvant Freud raport 1:1 (v/v). Pentru imunizare a fost injectată o cantitate de 250-1000 țig proteină, la interval de 2-4 săptămâni. Am testat specificitatea de recunoaștere a anticopilor prin WB pentru proteina endogenă și recombinantă exprimată în celule mamaliene. După obținerea unor anticorpi care recunosc proteina recombinantă au fost recoltați cate 5-7ml de ser de la iepure după fiecare imunizare. In continuare serul obținut a fost folosit pentru a testa anticorpii prin diferite metode.

Exemplul 4: Utilizarea anticorpilor pentru identificarea proteinei EDEM 1 prin Western blot

Pentru a determina specificitatea anticorpilor am efectuat un experiment de Western blot în care a fost verificată specificitatea anticorpilor pentru proteina EDEM I recombinantă exprimată în celule mamaliene. Celulele HEK 293T, au fost transfectate pentru a exprima tranzient proteina EDEM I și la 24 de ore după transfecție au fost folosite pentru experiment. Lizatele celulare au fost separate prin SDS-PAGE și proteinele au fost transferate pe membrană de nitroceluloză și în a,b, se poate observa ca anticorpii produși recunosc proteina EDEMI în probele menționate m continuare au fost probate cu anticorpii descriși în invenție. Drept control pentru anticorpii obținuți am folosit un lot de anticorpi primit cadou de la Stephen High, descriși anterior în literatură. In

7/ ,//

V <χ-2 Ο 1 Ο - Ο Ο 9 8 8 - 1 8 -09- 2010 la diferite diluții ale anticorpilor. Prin digestie cu EndoH. enzimă care taie glicanii atașați proteinelor în compartimentul RE. se observă că proteina recunoscută de anticorpi este complet sensibilă la EndoH. deci este o proteină rezidentă în reticulul endoplasmic care nu achiziționează structuri complexe caracteristice pentru aparatul Golgi.

Deoarece proteinele EDEM prezintă un domeniu extins de omologie am efectuat un experiment pentru a determina reacția nespecifică a anticorpilor obținuți cu proteina EDEM2. Am migrat în gel de poliacrilamidă lizatele celulelor care exprimă endogen sau supraexprimă proteina EDEM2 sau proteina EDEME Membranele au fost imunoblotate cu anticorpii policonali pentru proteina EDEMl. Se observă că anticorpii policlonali recunosc specific proteina EDEMl, atât în condiții reducătoare (+DTT-ditiotreitol) cât și nereducătoare (-DTT) și nu reacționează nespecific cu proteina EDEM2. (Figura 4 c)

Exemplul 5: Imunoprecipitarea proteinei EDEMl din celule tnamaliene utilizând anticorpii policlonali obținuți

Tehnica de marcare metabolică a proteinelor este folosită pentru studierea biosintezei, procesării și degradării acestor proteine în celule. Proteinele marcate sunt recunoscute de anticorpi care interactionează specific cu proteina A cuplată pe rășină de sefaroză. Pe baza acestor reacții specifice proteinele de interes pot fi separate din lizate celulare totale. Astfel pentru testarea specificității anticorpilor policlonali anti-EDEMl. celulele au fost însămânțate și apoi au fost sau nu transfectate cu ADN-ul plasmidial ce codifică pentru proteina EDEMl recombinantă. Ea 24 de ore de la transfecție celulele au fost marcate folosind o soluție de aminoacizi cu sulf radioactiv ce sunt încorporați în proteinele nou sintetizate. După marcare celulele au fost spalate cu PBS și apoi lizate pe gheața timp de 30 de minute.

Eizatele celulare au fost imunoprecipitate folosind anticorpii obținuți care leaga specific proteina de interes, iar complexele antigen anticorp au fost precipitate pe rășină cuplată cu proteina A. Se observă din figura 5 că anticorpii recunosc specific proteina EDEMl transfectată și proteina endogenă în celulele HEK293T. în condiții reducătoare.

Exemplul 6: Identificarea proteinei EDEMl prin imunofluorescență folosind anticorpii policonali anti-EDEMl

Prin imunofluorescență se poate determina localizarea intracelulară a proteinelor utilizând anticorpi specifici pentru proteina respectivă în paralel cu o proteina marker pentru un anumit compartiment celular. Pentru a identifica fluorescent aceste proteine se aplică a doua reacție antigenanticorp. Sunt utilizați anticorpi cuplați cu fluorofori ce emit la diferite lungimi de undă care recunri^v^^-E^^/T.

“2 010-00988-1 8 -09- 2010 detectată doar în zonele unde sunt exprimate proteinele folosite pentru colocalizare și de care s-au legat specific anticorpii.

Pentru a determina specificitatea anticorpilor policonali pentru proteina EDEM1 am utilizat pentru experiment doua linii celulare. A375, linie de melanom uman nepigmentat si HEK 293T. linie de celule embrionare de rinichi uman. Celulele au fost însămânțate și crescute 24 de ore pe lamele de sticlă, după care au fost sau nu transfectate cu ADN plasmidial să exprime proteina recombinantă. Celulele au fost menținute în prezența amestecului de transfectie timp de 24 de ore, apoi au fost fixate cu paraformaldehida 4% (PFA) și în continuare prelucrate pentru experimentul de fluorescență. Pentru a determina localizarea intracelulară a proteinei EDEM I am efectuat un experiment de colocalizare cu doi markeri pentru compartimentele reticul endoplasmic și lizozom.

Din experimentele de imunofluorescență se poate observa ca anticorpii policlonali obținuți de noi recunosc cu mare specificitate proteina recombinantă supraexprimată în celule HEK 293T și A375. Anticorpii obținuți recunosc de asemenea și proteina exprimată endogen, dar cu specificitate mai mică. Localizarea intracelulară a proteinei este preponderent perinucleară și colocalizeaza cu markerul de reticul endoplasmic calnexina și colocalizează parțial cu proteina Lamp2, un marker pentru lizozom. (Figura 6)

Claims (3)

1. Revendicări

   1. Anticorpi policlonali anti EDEM1 caracterizați prin aceea că au specificitate față de regiunea EDEM2 cu secvența de aminoacizi din figura I, secvența numărul 2.
2. 2. Anticorpi policlonali anti EDEM1 conform revendicării 1, caracterizați prin aceea că se utilizează pentru diagnosticul stării de stres la nivel celular.
3. 3. Anticorpi policlonali anti EDEMI conform revendicării 1. caracterizați prin aceea că se utilizează pentru identificarea EDEMI uman și de șoarece.