RO126363A2

RO126363A2 - Biopreparat pe bază de trichoderma viride pentru dezvoltarea de soluri supresive pentru fusariile fitopatogene şi toxigene

Info

Publication number: RO126363A2
Application number: ROA200901077A
Authority: RO
Inventors: Florin Oancea; Tatiana Eugenia Sesan; Carmen Lupu
Original assignee: Institutul De Cercetare Dezvoltare Pentru Protecţia Plantelor
Priority date: 2009-12-22
Filing date: 2009-12-22
Publication date: 2011-06-30
Also published as: RO126363B1

Abstract

Invenţia se referă la o tulpină de Trichoderma viride Td49, depusă cu numărul (P) 001357 la National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms (NCAIM) Budapesta, puternic antagonistă faţă de ciuperci fitopatogene, şi la un biopreparat antifungic, obţinut prin trecerea substratului epuizat de la cultivarea ciupercilor Pleurotus într-un amestecător, adăugarea de superfosfat în proporţie de 0,4...0,5%, pentru normalizarea pH-ului şi a conţinutului de potasiu, inocularea cu 0,1% biopreparate hidrogelifiate pe bază de Trichoderma viride Td49 şi menţinerea compoziţiei rezultate timp de 7...8 zile sub amestecare cu o frecvenţă de 1 rot/h, pentru aerarea substratului.

Description

BIOPREPARAT PE BAZA DE TRICHODERMA VIRIDE PENTRU DEZVOLTAREA DE SOLURI SUPRESIVE PENTRU FUSARIILE FITOPATOGENE SI TOXIGENE

Prezentul brevet se referă la un biopreparat, destinat combaterii fusariilor fitopatogene și toxigene prin formare de soluri supresive, realizat pe baza unei tulpini antagoniste de Trichoderma viride, Td₄g, depozitată cu numărul (P) 001357 la Național Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, NCAIM, Budapesta, printr-un procedeu de bioconversie a substratului epuizat de la cultivarea ciupercilor comestibile.

Sunt cunoscute mai multe biopreparate pe bază de tulpini de ciuperci antagoniste aparținând genului Trichoderma și care sunt destinate tratamentului la sol în vederea formării de soluri supresive. Brevetul SUA 4.642.131 expune un compost supresiv pentru ciupercile care produc bolile complexului de răsărire (Rhizoctonia solarii, Pythium spp., Fusarium spp.), realizat pe baza tulpinilor de Trichoderma hamatum I382 (ATCC 20765) și/sau I 559 (ATCC20764), în combinație cu Flavobacterium spp. I 299 (ATCC 53199) și Pseudomonas maltophila I76 (ATCC53198).

Brevetul SUA 5 422 107 prezintă tulpina SK-55 de Trichoderma harzianum, număr de depozit BP 4346 NIBH, Japonia. Biopreparatul pe baza acestei tulpini este destinat pentru tratament la sol. Acest biopreparat este realizat prin cultivare septică, pe un mediu conținând tărâțe de grâu umectate la 90% apă, care este repartizat în tăvi de aluminiu.

Brevetul SUA 7 070 984 protejează tulpina Li49, depozitată la ATTC cu numărul PTA-1225. Tulpina este cultivată aseptic pe un mediu lichid, iar biomasa este recuperată și adăugată în proporție de cel puțin 10% într-un suport organic alcătuit din boabe de cereale, turbă și compost. Biopreparatul astfel rezultat este utilizat pentru tratamentul solului.

Brevetul EP 1400 586 redă descrie un substrat de creștere supresiv realizat pe baza ciupercii antagoniste Trichoderma asperellum T34(2), depozitată CECT No 20147.

Nici una din biopreparatele sau tulpinile de Trichoderma descrise până în prezent nu a fost destinată dezvoltării de soluri supresive pentru fusariile fitopatogene și toxigene și reducerii pe această cala a riscurilor de dezvoltare epidemică a bolilor cerealelor boabe (înroșirea spicului de grâu produsă de Fusarium graminearum / Gibberella zeae\ înflorirea albă a boabelor de porumb produsă Fusarium verticilloides / Gibberella fujikuroi) care sunt însoțite de contaminarea recoltei cu micotoxine.

Prezenta invenție se referă la un biopreparat destinat combaterii fusariilor fitopatogene și toxigene prin dezvoltare de soluri supresiy^.-realLzat pe baza unei

I

.. . ..

% <· .4'

......r'/

OFICIUL DE STAT PENTRU INVENȚII Șl MĂRCII

Cerere de bre vet de invenție

Nr. 3,.4°° θ ⁰ | Daladepr·:,: 2L:Op9.... |

O C 9 - Ο 1 C 7 7 - 2 ζ 12- 2009 tulpini antagoniste de Trichoderma viride (Td₄₉ depozitată cu numărul (P) 001357 la Național Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, NCAIM, Budapesta) cu capacitate mare de colonizare a resturilor vegetale și un procedeu de conversie a substratului epuizat de la cultivarea ciupercilor Pleurotus într-un biopreparat antifungic destinat formării de soluri supresive.

Biopreparatul conform invenției are următoarea compoziție: materie organică totală 22... 27,5 părți, din care celuloză 10 .. 12,5 părți, lignină 5...6,5 părți, acizi humici 2,5... 3,5 părți, chitină 1,5... 2 părți, substanțe azotate total 2,5 ... 3,5 părți, substanțe minerale totale (cenușă) 5 ... 7,5 părți, apa până la 100 părți, părțile fiind exprimate în greutate. In biopreparat numărul de propagule de Trichoderma viride Td₄₉ este mai mare de 1 million per gram de produs.

Tulpina de Trichoderma viride Td₄₉, depozitată cu numărul (P) 001357 la Național Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, NCAIM, Budapesta, a fost izolată de pe resturi vegetale. Procedeu de conversie a a substratului epuizat de la cultivarea ciupercilor Pleurotus într-un biopreparat antifungic pe bază de Trichoderma viride Td₄₉ cuprinde următoarele etape: (/) trecerea a substratului epuizat de la cultivarea ciupercilor Pleurotus într-un amestecător universal; (ii) adăugarea de superfosfat în proporție de 0,4...0,5% pentru normalizarea pH-ului și a conținutului de potasiu; (iii) inocularea cu 0,1% biopreparate hidrogelifiate pe bază de Trichoderma viride Td₄₉, realizate prin uscarea granulelor formate după cultivarea timp pe 7 zile a ciupercilor Td₄₉ pe un mediu cu următoarea compoziție: 2 g of KH₂PO₄; 1,4 g of (NH₄)₂SO₄; 0,3 g of CaCI₂2H₂O; 0,3 g of MgSO₄ 7H₂O; 0.6 g uree; 10 mg of FeSO₄ 7H₂O; 2.8 mg ZnSO₄2H₂O, 3.2 mg of CoCI₂ 6H₂O, sirop de glucoză 80% 15 ml, 7 g hidrogel superadsorbant pe bază de poliacrilamidă și poliacrilat de potasiu Aquasorb, apă până la 1 litru; (iv) menținerea timp de 7 .. 8 zile a compoziției de mai sus, amestecând cu o frecvența de o rotație pe oră pentru aerarea substratului.

Invenția prezintă următoarele avantaje:

- tulpina Td₄₉, fiind izolată de pe resturi vegetale, are o mare capacitate de colonizare a unui astfel de substrat; această capacitate de colonizare, adăugată proprietăților antagoniste față de diferiții agenți fitopatogeni această capacitate asigură reducerea inoculului primar dezvoltat pe aceste resturi vegetale;

- procedeul de bioconversie folosit determină o exprimare ridicată a chitinazelor și β-glucanazelor, substratul epuizat de la cultivarea ciupercilor Pleurotus fiind bogat în chitină și celuloză

- procedeul de bioconversie include etape de normalizare a caracteristicilor

Ck- 2 009-010772 2 Ί2- 2009 conținutul de fosfor), permițând astfel realizarea unui biopreparat cu proprietăți constante.

Prezenta invenție se ilustrează prin următorul exemplu.

Exemplu

Trichoderma viride Pers., tulpina Td₄₉, a fost izolată de pe resturi vegetale (tulei de porumb), din ferma epxerimentală a ICDPP București. încadrare taxonomică a tulpinii de Trichoderma viride Td₄g este: Filumul Ascomycota, Clasa Sordariomycetes, Ordinul Hypocreales, Familia Hypocreaceae, genul Trichoderma.

Caracteristicile morfologice ale tulpinii Td₄₉sunt descrise mai jos.

Dezvoltarea coloniei: 4,5-7,5(-9,0) cm diametru după 5 zile, pe mediul CGA, inițial ± hialină, ulterior albicioasă-verde cu zone de mănunchiuri de conidiofori albastru-verzi; reversul coloniei necolorat;

Conidiofori: ramificați piramidal, cu ramuri mai scurte spre apex;

Fialide: în grupuri de 2-4, destul de subțiri și adesea curbate, de (6)8-14(-20) X 2.4-3,0 pm;

Conidii subgloboase sau elipsoidale, de 3,6-4,5 pm în diametru cu pereții aspri;

Clamidospori prezenți în miceliul culturilor mai vârstnice, intercalări și uneori terminali, cel mai adesea globoși, hialini, cu pereții netezi.

Caracteristicile fiziologice, de utilizare a diferitelor substrate, sunt descrise în cele ce urmează.

Surse de carbon: optime: manita, fructoza, riboza, glucoza (dextroza), galactoza, manoza; dezvoltare fungală moderată pe: arabinoză, sorboză, melibioză, maltoză, lactoză, celobioză, celuloză, amidon, inulină; dezvoltare fungală slabă pe: sorbitol, xiloză, zaharoză (sucroză), glicerol;

Surse de azot: optime: DL-leucina, L-cystina, DL-citrulina, DL-nor-leucină, azotatul de amoniu, tartratul de amoniu; dezvoltare fungală moderată pe: L-arginină, L-leucină, glicocol, asparagină, riboflavină, sulfat de amoniu, carbonat de amoniu, fosfat monobazic; dezvoltare fungală slabă pe: triptofan, tirozină, D-serină, lizină, uree, azotați de sodiu, calciu și potasiu;

Caracteristici fizice de creștere și sporulare sunt:

Temperatura: temperatura optimă: 20-25°C; temperatura minimă: 2°C;

temperatură maximă: 37°C;

Reacția substratului de cultură: pH optim: 4.0-5.5; dezvoltare slabă a ciupercii la valori de pH de la 9,0 Ia13.0.

Tulpina Td49 este puternic antagonistă față de ciupercile fitopatogene:

Fusarium graminearum, F. culmorum, F. verticilloides, Pythium ultimum, Botrytis cinerea, Alternaria alternata, Stemphylium radicinum ș.a.

A-2 O C 2 - G ' !) 7 7 - 2 2 -12 - 2()09

Pentru obținerea biopreparatului s-a aplicat următorul procedeu.

Tulpina Td₄₉ de Trichoderma viride este cultivată pe mediu Weidling agarizat, repartizat în eprubete cu mediu înclinat. Cultura de pe mediu agarizat este reluată și utilizată pentru inocularea mediului hidrogelifiat, de multiplicare industrială (cu următoarea compoziție: 2 g of KH₂PO₄;1,4 g of (NH₄)₂SO₄; 0,3 g of CaCI₂ 2H₂O; 0,3 g of MgSO₄ 7H₂O; 0.6 g uree; 10 mg of FeSO₄ · 7H₂O; 2.8 mg ZnS0₄ 2H₂O, 3.2 mg of CoCI₂ 6H₂O, sirop de glucoza 80% 15 ml , 7 g hidrogel superadsorbant pe bază de poliacrilamidă și poliacrilat de potasiu Aquasorb, apă până la 1 litru). Mediul hidrogelifiat este repartizat în pungi de polietilenă, sterilizat prin autoclavare la 121°C și inoculat cu ciuperci T. viride Td49. După 7 zile amestecul semisolid, hidrogelifiat, rezultat este omogenizat cu un turbomixer și uscat pe sită de inox și hârtie de filtru, în curent de aer cald la 35°C.

Procedeu de conversie substratului epuizat de la cultivarea ciupercilor comestibile într-un biopreparat antifungic pe bază de Trichoderma viride Td49 implică următoarele etape:

• trecerea substratului epuizat de la cultivarea ciupercilor Pleurotus întrun amestecător universal;

• adăugarea de superfosfat în proporție de 0,4...0,5% pentru normalizarea pH-ului și a conținutului de potasiu;

• inocularea cu 0,1% biopreparate hidrogelifiate pe bază de Trichoderma viride Td49, realizate prin uscarea granulelor formate după cultivarea timp pe 7 zile a ciupercilor Td49 pe un mediu cu următoarea compoziție: 2 g of KH₂PO₄; 1,4 g of (NH₄)2SO₄; 0,3 g of CaCI₂ 2H₂O; 0,3 g of MgSO₄ 7H₂O; 0.6 g uree; 10 mg of FeSO₄ 7H₂O; 2.8 mg ZnSO₄ 2H₂O, 3.2 mg of CoCI₂ 6H₂O, sirop de glucoză 80% 15 ml, 7 g hidrogel superadsorbant pe bază de poliacrilamidă și poliacrilat de potasiu Aquasorb, apă până la 1 litru;

• menținerea timp de 7 .. 8 zile a compoziției de mai sus, amestecând cu o frecvența de o rotație pe oră pentru aerarea substratului.

In biopreparatul astfel obținut s-au efectuat determinări de umiditate (gravimetric, după uscare la 104°C), materie organică totală și cenușă (gravimetric, după calcinare la 800°C), substanțe azotate totale (mineralizare umedă Kjedahl), acizi humici (extracție NaOH 1M și precipitare cu HCI 1M), celuloză (colorimetric cu antronă, după extragere prealabilă a ligninei cu acid acetic și acid nitric); chitină (determinarea colorimetrică a N-acetilglucozaminei după hidroliză în HCI 6M).

Analizele au fost repetate de trei ori, iar conținutul determinat a fost următorul: materie organică totală 22... 27,5% (celuloză 10 .. 12,5%, lignină 5...6,5%, acizi humici 2,5... 3,5%, chitină 1,5... 2%, substanțe azotate total 2,5 ... 3,5%), substanțe minerale totale (cenușă) 5 ... 7,5%, apă 65 ...731%.- ·.

Ο Ο 9 - Ο 1 Ο 7 7 - 2 2 Ί2- 2009

Din biopreparat a fost determinat și numărul de ciuperci antagoniste Trichoderma vinde, folosindu-se următoarea formulă de mediu selectiv: 0,2 g MgSO₄ 7H₂O; 0,9 g K₂HPO₄,1,0 g of NH₄NO₃, 0,15 g KCI, 0,15 g roz Bengal, 3 g glucoză,20 g agar, apă până la 1 litru (William et al, 2003, A selective medium for quantitative reisolation of Trichoderma harzianum from Agaricus bisporus compost, Appl. Envir. Microb., 68, 4190-4191).

Mediul a fost sterilizat prin autoclavare (la 12ΓΟ timp de 15 min) și distribuit în plăci petri cu diametrul de 9 mm. Din biopreparat s-au prelevat probe, care au fost omogenizate. Din omogenizat s-a reluat 1 g care s-a suspendat în 10 ml. Din suspensie s-au reluat 1 ml, care a fost diluat zecimal de 5 ori și apoi inoculat pe mediu selectiv. In toate analizele efectuate numărul de propagule de T. viride Td49 per gram de biopreparat a fost mai mare de 10⁶ ufc.

Biopreparatul propus conform invenției reprezintă de fapt o etapă de reciclare conform unui ciclu integrat asemănător celor naturale. Prin cultura ciupercilor lignocelulozice (si mai ales a celor din genul Pleurotus) materialul vegetal rezultat ca subprodus agricol (paie de grâu, de ex.) este convertit într-un produs agroalimentar cu valoare biologica si comerciala ridicata (bureți păstrăvi). Ciupercile lignocelulozice consumă preponderent celuloza (care se degradează hidrolitic la glucoză, utilizată ca sursă de carbon și de energie) și oxidează parțial lignina (polimer care se degradează oxidativ, printr-un proces denumit si de “combustie enzimatică”). Substratul epuizat, care conține celuloză înalt organizată rezistentă la biodegradare, lignina parțial oxidată și miceliu de Pleurotus în faza finala a ciclului biologic (bogat în chitina si betaglucan) este convertit într-un biopreparat petnru dezvoltarea de soluri supresive pentru un patogen major al culturii de grâu.

Biopreparatul pe bază de T. viride Td₄₉ a fost testat din punct de vedere al antagonismului față de Fusarium graminearum Schw. DSMZ 4527 (teleomorfa Gibberella zeea Schw. Petch). Ciuperca toxigenă a fost cultivată pe mediu înclinat cartof - glucoză - agar. După 7 zile de creștere cultura a fost reluată în tampon fosfat salin, pH 7,2, adusă la 10⁶ ufc/ml și inoculată (0,1 ml / g) peste paie de grâu sterilizate prin autoclavare. Același tratament a fost aplicat și unor variante experimentale tratate aseptic (anterior, concomitent sau ulterior) cu biopreparat realizat conform exemplului (0,1 g la 10 g de paie) și cu inocul de T. viride Td49 reluat de pe mediu Weidling agarizat, înclinat (inoculare 0,1 ml suspensie 10⁶ ufc/ml perg de paie).

Paiele au fost trecute apoi aseptic pe plăci Roux, închise cu dopuri de vată, care conțineau câte 5 g de vermiculit steril, umectat cu câte 5 ml de apă sterilă. Plăcile au fost incubate timp de 21 zile, la 25°C, și în lumină fluorescentă cu dominantă în UV apropiat (2 lămpi F40 BLB, două lămpi F40 CWX, Philips). Vermiculitul a fost re-umectat de două ori pe săptămâna.

cc-2 0 0 9 - 0 1 Ο 7 7 - 2 2 Ί2- 2009

Captarea ascosporilor s-a realizat cu ajutorul unor lamele de microscop 25 x 75 mm, tratate cu silicon și plasate la 10 mm de gâtul plăcii Roux. După 21 de zile s-a lăsat vermiculitul să se usuce timp de 5 zile, după care a fost re-umectat abundent cu 7 ml de apă sterilă. Această alternanță a favorizat ejectarea sporilor din apoteci. Spori captați în uleiul siliconi au fost numărați la microscop, pe 25% din suprafața lamelei. Fiecare variantă experimentală a fost realizată în trei repeți!ii, iar întregul experimentul a fost repetat o dată. Datele au fost interpretate pe baza testului Friedman pentru măsurări repetate. Rezultatele sunt prezentate în tab.1. de mai jos.

Tab.1. Influența aplicării biopreparatului pe bază tulpinii T. viride Td49 și a suspensiei de ciuperci antagoniste T. viride Td49 asupra producerii de ascospori de către Fusarium graminearum DSMZ 4527 (teleomorfa Gibberella zea).

Varianta experimentală	Ascospori (χ10⁵) per cnrr de substrat²	% față de martor
Martor, paie de grâu neinoculate cu microorganisme antagoniste, inoculare 0,1 ml suspensie 10⁶ ufc/ml per g de paie	12,1 a	-
Pre-inoculat cu biopreparat cf. ex.1, inoculare 0,1 ml suspensie 10⁶ ufc/ml per g de paie	1,22 d	10,08
Inoculat concomitent cu biopreparat cf. ex.1, inoculare 0,1 ml suspensie 10⁶ ufc/ml per g de paie	2,24 c	18,51
Post-inoculat cu biopreparat cf. ex.1, inoculare 0,1 ml suspensie 10⁶ ufc/ml per g de paie	3,23 c	26,69
Pre-inoculat cu 0,1 ml suspensie Td49 10⁶ ufc/ml per g de paie, inoculare 0,1 ml suspensie 10⁵ ufc/ml per g de paie	1,15 d	9,50
Inoculat concomitent cu 0,1 ml suspensie Td49 10⁶ufc/ml per g de paie, inoculare 0,1 ml suspensie 10⁶ufc/ml per g de paie	2,14 c	17,68
Post-inoculat cu 0,1 ml suspensie Td49 1 0⁶ ufc/ml per g de paie, inoculare 0,1 ml suspensie 10⁶ ufc/ml perg de paie	4,59 b	37,93

z- valorile urmate de aceeași literă nu diferă semnificativ pentru testul Friedman la 0,05 nivel de încredere.

Rezultatele demonstrează că tulpina Td₄₉ este eficientă în reducerea dezvoltării și sporulării ciupercilor fitopatogene și toxigene F. graminearum. Tulpina condiționată sub formă de biopreparat este mai eficace în cazul aplicării după inocularea cu ciuperci toxigene. Acest fapt, similar celui care apare în condiții î ς 1 <· ’ ..-'Λ vfe... A?

A î? îi

C.- 2 0 0 9 - 0 1 0 7 7 -2 2 Ί2- 2009 naturale, este datorat probabil exprimării semnificative a enzimelor implicate în metabolizarea substratului lignocelulozic și cu chitină în ciupercile Td₄g condiționate sub formă de biopreparat.

S-a realizat și un experiment pentru a se evidenția capacitatea biopreparatului realizat, pe baza ciupercii T. viride Td₄g, în formarea unor soluri supresive. S-a lucrat în condiții de seră. Inoculul fungic (de Fusarium graminearum DSMZ 4527) s-a obținut în plăci Roux, pe mediul natural alcătuit din boabe de ovăz dublu sterilizate la 1 atm. timp de 20 minute, prin inocularea cu miceliu si incubarea la 27°C timp de 3-4 zile.

Substratul utilizat in sera a constat din 1/2 pamant de gradina+ 1/4 mranita+ 1/4 nisip. Acesta a fost sterilizat prin iradiere gamma (2,5 KGy) și apoi amestecat uniform cu inoculul fungic ( ~ 2 x 10⁶ spori/ kg sol) și distribuit in tăvi din plastic (32/24 cm) cu 48 ore înainte de semănat. Cu 12 ore înainte de semănat s-a aplicat biopreparatul pe bază de T. viride Td49, în cantitate de 1 g la 1 kg de sol.

In substratul astfel pregătit au fost semănate boabe de grâu. După 15 și 20 zile s-a determinat numărul de plante răsărite și uniform dezvoltate. Rezultatele sunt prezentate în tab. 2, comparative cu un martor netratat și cu un tratament chimic.

Tab. 2. Eficacitatea biopreparatului în prevenirea atacului de Fusarium graminearum la plantulele de grâu (cv. Boema)

Varianta	Tratament	%plante răsărite
15 zile	20 zile
Substrat sterilizat prin iradiere, netratat	-	96,6	96,6
Substrat sterilizat prin iradiere, inocul de F. graminearum, netratat	-	12,6	11,2
Substrat sterilizat prin iradiere, inocul de F. graminearum, Propamocarb-HCI	Stropire sol, 0,2% i a., 12 ore înainte de semănat	89,6	87,6
Substrat sterilizat prin iradiere, inocul de F. graminearum, biopreparat Td₄₉	Incorporare 1g per kg sol 12 ore înainte de semănat	91,2	89,4

Rezultatele susțin faptul că biopreparatul realizat, pe baza ciupercii antagoniste T. viride Td49, are capacitatea de a forma soluri supresive pentru fusariile fitopatogene și toxigene.

Claims

Revendicări

1. Biopreparat pentru dezvoltarea de soluri supresive pentru fusariile fitopatogene și toxigene caracterizat prin aceea că este obținut printr-un procedeu de conversie a substratului epuizat de la cultivarea ciupercilor alcătuit din următoarele etape: trecerea borhotului de la fabricarea (bio)etanolului într-un amestecător universal; adăugarea de superfosfat în proporție de 0,4...0,5% pentru normalizarea pH-ului și a conținutului de potasiu; inocularea cu 0,1% biopreparate hidrogelifiate pe bază de Trichoderma viride Td49, realizate prin uscarea granulelor formate după cultivarea timp pe 7 zile a ciupercilor Td49 pe un mediu cu următoarea compoziție: 2 g of KH2PO4; 1,4 g of (NH₄)₂SO₄; 0,3 g of CaCI₂ 2H₂O; 0,3 g of MgSO₄ 7H₂O; 0.6 g uree; 10 mg of FeSO₄ 7H₂O; 2.8 mg ZnSO₄ · 2H₂O, 3.2 mg of CoCI₂ · 6H₂O, sirop de glucoză 80% 15 ml, 7 g hidrogel superadsorbant pe bază de poliacrilamidă și poliacrilat de potasiu Aquasorb, apă până la 1 litru; menținerea timp de 7 .. 8 zile a compoziției de mai sus, amestecând cu o frecvența de o rotație pe oră pentru aerarea substratului și are următoarea compoziție: materie organică totală 22...

27.5 părți, din care celuloză 10 .. 12,5 părți, lignină 5...6,5 părți, acizi humici 2,5... 3,5 părți, chitină 1,5... 2 părți, substanțe azotate total 2,5 ...

3.5 părți, substanțe minerale totale (cenușă) 5 ... 7,5 părți, apa până la 100 părți, părțile fiind exprimate în greutate, iar numărul de propagule de Trichoderma viride Td₄g este mai mare de 1 million per gram de produs.
2. Tulpină antagonistă de Trichoderma viride, Td49, depozitată cu numărul (P) 001357 la Național Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, NCAIM, Budapesta, caracterizată prin aceea că este puternic antagonistă față de ciupercile fitopatogene: Fusarium graminearum, F. culmorum, F. verticilloides, Pythium ultimum, Botrytis cinerea, Alternaria alternata, Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotinia bataticola, Stemphylium radicinum.