RO126240A2 - Biosenzor enzimatic - Google Patents

Abstract

Prezenta invenţie se referă la un biosenzor enzimatic, cu enzime de tip oxidază, destinat determinării rapide in situ a concentraţiei unor specii chimice sau biologice, alcătuit dintr-o structură de dozare-măsurare cuprinzând un corp (1) în care se găseşte o unitate electronică (2) de achiziţii, prelucrare şi afişare date, o unitate electronică amperometrică (3), pentru măsurarea curentului de electroliză, o unitate electronică conductometrică (4), pentru măsurarea conductivităţii electrolitului, o tastatură (5) pentru programarea aplicaţiilor cu enzime diferite, un sistem de dozare compus, la rândul lui, dintr-o capsulă (6) din plastic, conţinând soluţia de oxidază, un furtun siliconic (10), prin care se dozează cantitatea de oxidază, la rotirea manuală a unui cilindru (11) sprijinit excentric, o tijă (12) prevăzută, la partea inferioară, cu doi electrozi semicirculari (14 şi 15) din platină, pentru măsurători amperometrice şi conductometrice, o cupă detaşabilă (17), reprezentând camera de reacţie în care se intoduce soluţia de analizat, printr-o pipetă de dozare (21) sau printr-un dozator electronic.

Description

Invenția se referă la un Biosenzor enzimatic universal ce folosește drept catalizator enzime de tip oxidază și este destinat determinării rapide și in situ a concentrației unor specii chimice sau biologice.

In vederea determinării rapide și in situ a concentrației , a masei sau a grosimii de strat a unor specii chimice sau biologice sînt folosiți biosenzori care reprezintă sisteme biologico - electronice selective integrate , formate dintrun receptor biologic activ, un traductor și un sistem electronic de amplificare, prelucrare și afișare date. Receptorul biologic activ dă informații analitice specifice ce permit recunoașterea și determinarea cantitativă sau semicantitativă a unei anumite specii biologice sau chimice dintr-un amestec complex ce compune materia analizată, componenta biologică activă a receptorului putînd fi formată dintr-o enzimă, un anticorp, ADN, sau chiar din celule întregi, iar traductorul transformă valoarea concentrației produselor de reacție într-o mărime electrică proporțională compatibilă cu sistemul de prelucrare și afișare date.

Pentru domeniul enzimatic reprezentativi sînt biosenzorii care folosesc drept componentă biologică activă enzime de tip oxidaze care catalizează reacția specifică de transformare a speciei urmărite în produs de reacție, în acest sens sînt redate mai jos cîteva aplicații specifice de asemenea biosenzori

1. Glucoza + O₂ —Glucozoxidaza > Qluconolactona + H₂O₂

2. Colesterol + O₂

Colesteroloxidaza ^Colestenona + H₂O₂

3. Glutamate + O₂ D-Glutamatoxidaza _>Oxigi_{utarat + NHj +} H₂O₂

4. Lactate + (9, ^Lactatoxi^^za _ypi_{rmat +} H O ² 2 2

5. Piruvat + HPO₄ ^{Piruvat0Xldaza} > Acetilfosfat + CO₂ + H₂O₂

La toate reacțiile prezentate rezultă pe lingă produsul de reacție specific și apă oxigenată care se determină cantitativ pe cale amperometrică sau conductometrică, cantitatea de apă oxigenată generată în reacție și consumată în electroliză fiind stoechiometric proporțională cu concentrația speciei analizate, deci o măsură a acesteia, transformarea valorilor de curent sau de conductivitate în unități de concentrație făcîndu-se automat pintr-o curbă de calibrare memorată în microprocesorul aparatului. Cel mai reprezentativ biosenzor enzimatic este cel de glucoza folosit la scară largă pentru determinarea rapidă a glucozei din sînge la diabetici și la sportivi în acest scop fiind necesară o singură picătură de sînge ce se aduce pe un suport de plastic de unică utilizare pe care se găsesc doi electrozi si o depunere uscata a unui gel ce conține o anumită cantitate de glucozoxidază care are rol catalitic în transformarea în cîteva secunde a glucozei din picătura de sînge în gluconolactonă și apă oxigenată. Aplicarea din partea electFpnică a unei

>-2009-00857-2 3 HO- 2009 tensiuni continue și constante celor doi electrozi permite ca din valoarea curentului de electroliză instalat și a legii lui Faraday să se determine cantitatea de apă oxigenată rezultată din reacție care la rîndul ei, conform stoechiometriei proceselor chimice și electrochimice și a reacției nr.1 de mai sus, este o măsură a concentrației glucozei din sînge. Același principiu se aplică și la un biosenzor pentru determinarea unor procente mai mari de glucoză cum sînt cele din procesele fermentative cu cca. 10 -15% glucoză, evident biocatalizatorul glucozoxidază avînd în acest caz o participare masică mai mare.

La ora actuală există cereri mari de biosenzori industriali și medicali atît pentru glucoză cît și pentru alte specii de tipul celor arătate în reacțiile de mai sus. Profitul înregistrat cu folosirea chitului biologic de unică utilizare este însă atît de mare îneît producătorii de biosenzori s-au orientat cu toții spre această formă de aplicație încercînd totodată și acreditarea ideii că este singura posibilitate tehnică viabilă, în schimb industria și laboratoarele de specialitate, unde se fac sute de analize pe zi, solicită biosenzori fără chituri de unică utilizare exploatarea acestora fiind mult mai economică dar și mai bine controlabilă din punct de vedere a preciziei, a sensibilității și a limitei de detecție.

Problema tehnică pe care o rezolvă invenția constă în realizarea unui biosenzor enzimatic universal ce folosește drept catalizator enzime de tip oxidază sub formă lichidă, senzorul fiind destinat determinării rapide și in situ a concentrației unor specii chimice sau biologice fără folosirea unor chituri biologice de unică utilizare.

In acest scop este folosit un biosenzor, conform invenției, format dintr-o structură portabilă ce conține un recipient cu o enzimă lichidă de tip oxidază din care se dozează manual, cu ajutorul unui sistem de pompare peristaltic, un anumit volum de enzimă de tip oxidază într-o cuvă a aparatului în care sînt plasați doi electrozi de platină pentru măsurători amperometrice și conductometrice ale apei oxigenate rezultate din reacția de oxidare. După dozarea oxidazei, în aceeași cuvă a biosenzorului, se dozează volumetric precis cantitatea de materie analizată, iar prin calcul electronic intern se determină și se afișează ulterior valoarea concentrației speciei catalizate de oxidază în produse de reacție într-o unitate de timp.

Prin aplicarea invenției se obțin următoarele avantaje:

- se obține un biosenzor universal și fiabil, echipat cu doi detectori electrochimici, utilizabil pe termen lung la toate tipurile de reacții catalizate prin enzime de tip oxidaze

- se elimină chiturile de unică utilizare și prin aceasta scade mult prețul de cost al analizelor

- soluția constructivă a biosenzorului permite dozarea rapidă a glucozoxidazei și corespunzător o productivitate ridicată la analiză

- crește precizia de determinare datorită posibilității dozării volumetrice precise a cantității de materie transformată de oxidază în produse de reacție

- crește precizia de determinare prin posibilitatea verificării periodice și rapide a activității oxidazelor folosite la cataliză

^-2 0 0 9 -Ο 0 8 5 7 -2 3 -10- 2009

- crește precizia măsurătorilor prin folosirea concomitentă, în cadrul aceleiași determinări, atît a metodei amperometrice cît și a celei conductometrice.

Se dă în continuare un exemplu de realizare a invenției în legătură cu figura 1 care reprezintă o vedere în secțiune a biosenzorului enzimatic, figura 2 care reprezintă o vedere laterală și din față a biosenzorului enzimatic și figura 3 care reprezintă schema de principiu a măsurării amperometrice și conductometrice a concentrației speciei urmărite folosind biosenzorul conform invenției.

Biosenzorul enzimatic conform invenției și a figurilor 1,2 și 3 este format dintr-un corp 1 în care se găsește o unitate 2 electronică de achiziție, prelucrare și afișare date, o unitate 3 electronică amperometrică pentru măsurarea curentului de electroliză, o unitate 4 electronică conductometrică pentru măsurarea conductivității electrolitului, o tastatură 5 pentru programarea aplicațiilor cu enzime diferite, un sistem de dozare peristaltică pentru soluția ce conține o enzimă de tip oxidază compus la rîndul lui dintr-o capsulă 6 din plastic ce conține o soluție o de oxidază, un șurub 7, randalinat la partea superioară și cav la partea inferioară, un reper 8 prevăzut la partea superioară cu un perforator p pentru tăierea foliei f termosudate de închidere a capsulei 6 din plastic, iar la partea inferioară cu un con c și o piuliță 9 pentru strîngerea și etanșarea unui furtun 10 siliconic subțire prin care curge oxidaza, un cilindru 11 sprijinit excentric și cu rotație excentrică, acționat manual, prevăzut cu un locaș I conic pentru plasarea cilindrului 11 sprijinit excentric pe poziția obturat a furtunului 10 și acționat manual cu un buton b, un clichet 12 cu arc de compresie și bilă, în corpul 1 se mai găsește cuplată prin apăsare o tijă 13 prevăzută la partea inferioară cu doi electrozi 14,15 semicirculari din platină pentru măsurare amperometrică și conductometrică , un con 16 perforat pentru fixarea și strîngerea furtunului 10, o cupă 17 detașabilă prin desfiletare ce constituie camera de reacție și la partea superioară cu două contacte 18, 19 și un locaș e de fixare elastică a tijei 13 prin intermediul unui clichet 20 cu bilă și arc de compresie, reperul 21 este extern biosenzorului, poate fi o pipetă sau un dozator electronic manual și folosește pentru dozarea precisă a unui anumit volum prescris din soluția de analizat în cupa 17 ce constituie camera de reacție a biosenzorului.

)

Modul de lucru cu biosenzorul este următorul: se desfiletează la maxim șurubul 7 randalinat și cav după care se întoarce aparatul cu 180° față de poziția normală de lucru, se așează capsula cu oxidază în cavitatea șurubului 7 după care acesta se strînge cu mîna pînă cînd este opusă o rezistență mecanică sensibilă ceea ce înseamnă că folia termosudată a capsulei 6 a fost perforată de cuțitul p al reperului 8, iar gîtul capsulei 6 a realizat etanșarea cu reperul 8. în continuare se întoarce din nou biosenzorul în poziția de lucru și se desfiletează cupa 17 detașabilă de pe tija 13, se execută prin intermediul butonului b cîteva rotații complete spre dreapta a cilindrului 11, sprijinit excentric, pînă cînd pe conul 16 perforat apare o picătură de oxidază. După aceste operații se înfiletează la loc cupa 17, se mai execută o rotație completă a cilindrului excentric în vederea dozării prin sistemul periștaltic, a volumului ^-2009-00857-2 3 -10- 2009 necesar de oxidază în cupa 17 cu oprirea cilindrului 11 pe poziția de opturare completă a furtunului siliconic, poziție sesizată prin săgeata indicatoare de pe butonul b de rotire dar și prin clic-ului bilei clichetului 12. Urmează dozarea în cupa 17 a volumului prescris pentru specia de analizat, cu virful unei pipete 21 de dozare sau a unui dozator electronic manual, după care aparatul se ține în poziție verticală și se urmărește afișajul digital. Declanșarea reacției catalizate duce la apariția pimelor cantități de apă oxigenată, un prag minim al concentrației acesteia provoacă inițierea automată a măsurătorilor amperometrice și conductometrice, acestea desfășurîndu-se în mod alternativ prin comutare electronică automată de la un procedeu de măsurare la celălalt. După 20 secunde este afișată valoarea concentrației rezultată din media a zeci de măsurători amperometrice și conductometrice prelucrate statistic de microprocesorul biosenzorului. Volumul unei capsule de oxidază ajunge pentru sute de determinări, între două determinări cu aceeași oxidază nu este necesară decît spălarea sub jet de apă a cupei 17. La schimbarea tipului de oxidază se spală tot traseul folosind în acest scop o capsulă cu apă bidistilată care se fixează, precum s-a descris deja, pe corpul 1 al biosenzorului și se execută mai multe rotații complete ale cilindrului 11 prin intermediul butonului b în vederea pompării apei de spălare prin circuitul de dozare. La aplicații specifice unde volumul de oxidaze dozat este diferit față de aplicația precedentă sau dacă furtunul este uzat este necesară înlocuirea furtunului 10 siliconic și pentru aceasta se desface piulița de pe partea opusă butonului b de acționare a cilindrului 11 după care acesta se extrage din corpul 1 al biosenzorului, urmează întoarcerea aparatului cu 180° față de poziția normală de lucru, desfiletarea șurubului 7, extragerea capsulei 6 și a reperului 8 din locașul lui, desfiletarea completă a piuliței 9, extragerea furtunului siliconic de pe reperul 8, urmată de exragerea tijei 13 din corpul 1, extragerea conului 16 din tija 13, scoaterea furtunului 10 de pe conul 16. La montarea noului furtun siliconic operațiile se repetă în sens invers celor de la demontarea furtunului 10 siliconic, cilindrul 11 fiind înlocuit cu altul cu excentricitatea corespunzătoare noului diametru de furtun 10 siliconic. Din cauza faptului că o supradozare cu oxidază nu este critică, la necesitatea unor volume mai mari ale acesteia corespunzătoare unor concentrații mai ridicate de materie analizată, se poate apela și la mai multe dozări repetate, una după alta, de oxidază fără a înlocui furtunul existent cu altul de diametru mai mare.

Claims (1)

1. REVENDICARE

   Invenția biosenzor universal caracterizată prin aceea că în vederea realizării unui biosenzor universal cu enzime de tip oxidază, destinat determinării rapide și in situ a concentrației unor specii chimice sau biologice, este folosită o structură de dozare - măsurare formată dintr-un corp (1) în care se găsește o unitate (2) electronică de achiziție, prelucrare și afișare date, o unitate (3) electronică amperometrică pentru măsurarea curentului de electroliză, o unitate (4) electronică conductometrică pentru măsurarea conductivității electrolitului, o tastatură (5) pentru programarea aplicațiilor cu enzime diferite, un sistem de dozare compus la rîndul lui dintr-o capsulă (6) din plastic ce conține soluția de oxidază, un furtun (10) siliconic subțire prin care curge și se dozează o anumită cantitate de oxidază la rotația manuală a unui cilindru (11) sprijinit excentric, o tijă (13) prevăzută la partea inferioară cu doi electrozi (14), (15) semicirculari din platină pentru măsurări amperometrice și conductometrice concomitente, o cupă (17) detașabilă ce constituie camera de reacție, volumul soluției de analizat fiind introdus în cupa (17) detașabilă prin intermediul vîrfului unei pipete (21) de dozare sau a unui dozator electronic manual.