RO126014A0 - Suport compozit poros pentru tratarea defectelor osoase şi procedeu de obţinere - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la un suport compozit poros, pentru tratarea defectelor osoase, şi la un procedeu pentru obţinerea acestuia. Suportul conform invenţiei este constituit din 35...60% beta-fosfat tricalcic substituit cu 2,5...10 mol % magneziu cu dimensiunea medie a particulelor de 1...5 μ m, 25...40% colagen tip I acido-solubil, cu greutate moleculară medie 280...330 kDa şi conţinut de colagen peste 80%, 12...20% condroitin sulfat cu greutate moleculară medie 9...30 kDa şi conţinut de acizi uronici minimum 25%, şi 2...4% acid hidroxietil-piperazin-etan-sulfonic, părţile fiind exprimate în greutate. Procedeul de obţinere, conform invenţiei, cuprinde amestecarea a 9...18 părţi compoziţie 1, conţinând o soluţie 4...9% de fosfat tricalcic substituit cu magneziu, în tampon fosfat salin 2...4%, pH 7...7,7, cu 74...78 părţi compoziţie 2, conţinând un amestec de colagen 4...6% dializat în apă distilată şi o soluţie de condroitin sulfat 2...4% în apă, şi cu 9...10 părţi compoziţie 3, conţinând o soluţie acid hidroxietil-piperazin-etan-sulfonic de concentraţie 0,3...0,5%; amestecul astfel obţinut, prin vortexare puternică, timp de 10...50 min, la temperatura camerei, se liofilizează la -30...-40°C şi se usucă sub vid, la 18...25°C.

Description

Invenția se refera la un material compozit poros pe baza de fosfați de calciu si magneziu, colagen si condroitin sulfat, destinat terapiei defectelor osoase (nesudari osoase, fracturi, înlocuirea osului vatamat, cancer, etc) si un procedeu de obținere a acestuia.

Compușii utilizați in compoziția acestui suport compozit, fosfatii de calciu si magneziu, colagenul si condroitin sulfatul sunt constituenti naturali, care intra in compoziția osului, proprietate ce face ca acest produs sa fie suportul ideal pentru stimularea creșterii si proliferării osteoblastelor, celule implicate in sinteza componentelor matriceale ale noului tesut osos. Osul este un compozit biomineralizat complex, constând in principal dintr-o componenta anorganica (cristale de fosfat de calciu) si apa (70-80 %) si o componenta organica formata din colagen tip I, proteoglicani si alte proteine (20-30 %). In timpul formarii acestui tesut, cristalele de fosfați de calciu se acumulează si se asociaza intim la fibrilele componentei organice, astfel ca se formează un compozit cu proprietăți mecanice (greutate, rezistenta, duritate, elasticitate) si biologice (activitati osteoinductive, osteogenice, angiogenice, chemotactice, etc) excelente. Defectul osos si necesitatea reintegrării zonei lipsa sau măririi zonei existente constituie o problema majora in domeniul ortopedic, maxilo-facial si neurochirurgical.

Principalele componente minerale ale osului sunt calciul si fosforul care formează săruri complexe ce se depun sub forma de microcristale de hidroxiapatita la nivelul fibrelor de colagen. Alti compuși anorganici din compoziția osului sunt fluoruri, săruri de sodiu, potasiu si magneziu. Hidroxiapatita este fosfatul de calciu cel mai des utilizat in compoziția substituentilor de os. Acest material are avantajul ca asigura substituentilor o rezistenta mecanica ridicata dar, comparativ cu alte materiale ce conțin fosfat de calciu precum fosfatul tricalcic (TCP) sau octocalcic (OCP), prezintă o solubilitate foarte scăzută. In cazul in care se urmărește producerea de biomateriale osoase cu grad de biodegradare ridicat se prefera utilizarea fosfatului tricalcic in forma alfa-TCP sau beta-TCP.

Colagenul tip I este componenta organica majora a matricilor extracelulare si se cunoaște ca este un substrat optim pentru atașarea si proliferarea a numeroase tipuri celulare, incluzând pe cele responsabile de menținerea si organizarea osului, precum celulele osteoprogenitoare, osteoblastele, osteocitele si osteoclastele (BARRERE F„ VAN >-2010-00567-3 0 -06- 2010

BLITTERSWIJK C.A., DE GROOT K., Internat. J. Nanomed., 2006, 1, 317-332). Comparativ cu osul natural, colagenul este un material cu rezistenta mecanica mai scăzută, dar proprietățile biologice sunt superioare materialelor ceramice. Este cunoscuta utilizarea acestei proteine sub forma de colagen insolubil sau gelatina, mineralizata cu fosfat de calciu pentru realizarea unor materiale polimerice destinate regenerării osoase (BREVET WO 03071991; BREVET WO 2006031196). De asemenea, se cunoaște utilizarea amestecului de colagen denaturat (gelatina) cu beta-fosfat tricalcic sub forma de particule sferice la realizarea de compozite osoase avand o suprafața specifica mare pentru aderarea celulelor (BREVET CN 101401967).

Condroitin sulfatul este un glicozaminoglican prezent in matricea extracelulara si pe suprafața celulara a țesuturilor conjunctive animale, printre care si osul. In acest tesut, condroitin sulfatul face parte din structura proteoglicanilor mici, de tipul decorinei si biglicanului, care au rol in reglarea mineralizării cristalelor de fosfat de calciu din compoziția osului (BOSKEY A.L., SPEVAK L., DOTY S.B., ROSENBERG L„ Calcif. Tiss. Int., 1997, 61, 298-305).

Diferite biomateriale au fost investigate si propuse ca substituenti ososi, care trebuie sa prezinte proprietăți de biocompatibilitate ridicata si caracteristici biomimetice pentru a activa mecanismele biologice in tesutul osos gazda si componenta lor celulara sa favorizeze procesele de formare si consolidare a osului. Materialele sunt, apoi, complet resorbite lasand spațiu pentru osul nou format (BREVET WO 2009004445). Dintre factorii care controlează proprietățile mecanice si biologice ale biomaterialelor, cei mai importanți sunt compoziția chimica si microstructura acestora, iar porozitatea joaca un rol esențial. Prezenta porilor este foarte importanta pentru ca permite dezvoltarea noului tesut osos in interiorul lor.

S-a raportat obținerea unui material pentru înlocuirea osului conținând hidroxiapatita, colagen si condroitin sulfat prin amestecarea mecanica a celor 3 componente si reticularea dehidrotermala (BREVET EP 0214070(Al)). Acest material a prezentat o buna compatibilitate, dar o remodelare limitata a țesutului lezat. Hae-Won Kim et al. descriu un nanocompozit biomimetic obtinut prin coprecipitarea hidroxiapatitei cu o soluție de gelatina si liofilizarea ulterioara a amestecului (KIM H.-W., KIM H.-E., SALIH V., Biomaterials, 2005, 26, 5221-5230). Produsul s-a obtinut prin adaugarea de ioni de calciu si fosfat in soluția de gelatina rezultând un compozit poros, util in regenerarea osului si a cartilajului datorita unei viteze de resorbție in vivo adecvata, proporționala cu procesele de formare rapida a noului tesut.

Κ-2 0 1 0 - 0 0 5 6 7 -3 Ο -06- 2010

Prezenta invenție urmărește realizarea unui produs cu eficienta mare, util in regenerarea țesutului osos după traumatisme, nesudari osoase, cancere, inflamatii, etc.

Produsul, conform invenției, reprezintă un suport compozit poros, cu dimensiunea medie a porilor variind intre 20 si 200 gm, biocompatibil si bioresorbabil si este constituit din

35.. .60 % beta-fosfat tricalcic conținând 2,5...10 mol.% magneziu, cu dimensiunea medie a particulelor cuprinsa intre 1...5 pm, 25...40 % colagen tip I acido-solubil, cu greutatea moleculara medie intre 280 si 330 kDa si continui in colagen mai mare de 80%, 12...20 % condroitin sulfat cu greutatea moleculara medie de 9...30 kDa si continui in acizi uranici de minim 25 % si 2...4 % HEPES (acid hidroxietil-piperazin-etan-sulfonic), părțile fiind exprimate in greutate.

Procedeul de obținere al produsului, conform invenției, consta in aceea ca se realizează un suport compozit poros prin amestecarea a 9...18 parti compoziție 1, constituita dintr-o soluție de beta-fosfat tricalcic conținând 2,5...10 mol.% magneziu, de concentrație

4.. .9 %, preparata in tampon fosfat salin 2...4 %, pH 7...7,7 cu 74...85 parti compoziție 2, reprezentând un amestec dintr-o soluție vascoasa de 4...6 % colagen acido-solubil, dializat in prealabil fata de apa distilata si o soluție opalescenta de 2...4 % condroitin sulfat si cu 9-10 parti compoziție 3 reprezentata de o soluție HEPES de concentrație 0,3...0,5 %. Beta-fosfatul tricalcic substituit cu magneziu se obține prin amestecarea a 40...100 g carbonat de calciu cu

30.. .70 g fosfat acid de amoniu, 1...3 g oxid de magneziu si 0,200...0.500 1 etanol, solvent ce se evapora ulterior prin uscare, urmata de calcinarea amestecului de componente la 900 °C si sinterizarea acestuia la 1000...1200 °C. înainte de amestecarea cu compozițiile 2 si 3, compoziția 1 conținând beta-fosfat tricalcic substituit cu magneziu se omogenizează prin vortexare la temperatura camerei. Amestecul celor 3 compoziții obtinut prin vortexare puternica, timp de 10...50 minute, la temperatura camerei, se toama in tavite de inox si se liofilizează prin înghețare la temperatura de -30...-40 °C si uscare sub vid la temperaturi de +18...+25 °C.

In scopul creșterii rezistentei la degradare enzimatica, respectiv reticularii produsului, după liofilizare, acesta se introduce intr-o soluție de etanol 30...50 %, timp de 30...60 minute, la temperatura camerei, apoi, intr-o soluție de etil-dimetil-aminopropil carbodiimida (EDC) de concentrație 5...30 mM preparata, in prealabil, in tampon acid morfolino-etanol-sulfonic (MES) ce conține etanol 70 %, pH 5,5...6, timp de 15...24 ore, la temperatura camerei, prin agitare continua pe shaker. Suportul poros reticulat este supus unor spălări repetate cu o soluție de fosfat disodic 0,1...0,2 M, de 1...2 ori, timp de 1...2 ore, apoi cu o soluție de clorura de sodiu 0,5...1 M, de 1...2 ori, timp de 1...2 ore, după care se realizează 5-6 spălări cu o ^-2010-00567-’

Ο -06- 2010 soluție de clorura de sodiu 1,5...2 M, timp de 2...4 ore si, in final, 5-6 spălări cu apa distilata, timp de 3...5 ore fiecare. Condiționarea produsului se realizează prin liofilizare, in condițiile prezentate anterior, după care se ambaleaza in pungi de polietilena si se sterilizează prin expunere la radiații gamma, la doze de 15...20 kGy.

Produsul biopolimeric, obtinut in conformitate cu prezenta invenție, prezintă următoarele avantaje:

• suportul compozit obtinut prezintă o eficienta mare in tratarea afecțiunilor osoase (nesudari osoase, fracturi, înlocuirea osului vatamat, cancer, etc) conținând in compoziția sa biopolimeri care se găsesc, in mod natural, in tesutul osos.

• produsul este implicat in procesul de inițiere a depozitarii de tesut osos nou datorita substanțelor organice si anorganice din compoziția lui (efect osteoinductiv). Datorita structurii sale poroase, produsul realizează un contact strâns cu zona lezata facilitând, astfel, influxul celulelor din tesutul neafectat înconjurător si proliferarea acestora.

• Produsul obtinut poate servi si ca matrice suport pentru celulele osului (osteoblaste) sau celulele stern mezenchimale oferind acestora o rețea tridimensionala, asemanatoare matricei extracelulare osoase - condiție esențiala pentru menținerea fenotipului celular.

• Suportul este biocompatibil si biodegradabil in timp asigurând, astfel, substratul ideal pentru formarea de tesut nou in timp ce produsul este degradat, condiție esențiala in chirurgia osoasa.

• Produsul este stabil in timp, nu creeaza antigenicitate in contact cu organismul.

• Procedeul de obținere este relativ simplu si fezabil.

In vederea îmbunătățirii calităților osteoinductive ale beta-fosfatului tricalcic, s-a adaugat in compoziția sa magneziul, care reduce degradarea fosfatului tricalcic, este implicat in metabolismul mineral si previne osteoporoza. Pentru realizarea prezentei invenții, s-a utilizat ca sursa anorganica un beta-fosfat tricalcic substituit cu magneziu in raportul molar (Mg_xCa3__x):(PO4) de 1,5, in care substituția calciului cu magneziu a fost de maxim 10 mol.%. Verificarea purității compușilor ceramici elaborați s-a realizat prin măsurători de difracție de raze X si spectroscopie in infrarosu. Morfologia si dimensiunile granulelor au fost măsurate prin microscopie electronica de baleiaj.

Exemplul 1.

Intr-o moara planetara, prevăzută cu doua incinte de măcinare din poliamida, cu un volum util de minim 200 ml se introduc 70 g carbonat de calciu, 50 g fosfat acid de amoniu, 2 g oxid de magneziu si 250 ml etanol si se omogenizează, timp de 6 ore, folosind bile de ^-2010-00567-3 0 -06- 2010 alumina. Suspensia rezultata se usucă intr-o etuva, la o temperatura de 80 °C, timp de 8 ore si, apoi, se calcineaza intr-un cuptor, timp de 2 ore, la 900 °C, temperatura la care are loc formarea compusului fosfat tricalcic. Materialul calcinat este macinat din nou, in același tip de moara, in raportul material :bile de măcinare de 1:1,5, după care este sinterizat la temperatura de 1100 °C, timp de 2 ore, in prezenta de aer, când are loc formarea de beta-fosfat tricalcic cu substituție izomorfa de ioni de magneziu - (3-Ca₃._x,Mg_x(PO₄)2), conținând magneziu 5 mol.%, cu dimensiunea medie a particulelor de 4 pm.

Se iau 20 g de pulbere de beta-fosfat tricalcic substituit cu magneziu astfel preparata si se introduc intr-un vas de sticla, prevăzut cu agitare. Se adauga apoi 0,4 1 tampon fosfat salin 0,2 M, pH 7,4 si se omogenizează minim 15 minute, la temperatura camerei. In final, se obține o soluție opalescenta in care beta-fosfatul de calciu si magneziu este in suspensie (compoziția 1).

Separat, intr-un vas de inox, cu agitare continua, se introduc 3 1 soluție de colagen 0,4% (g/g), cu greutatea moleculara medie 300 kDa, obtinuta din tendon bovin prin extracție cu pepsina dizolvata, în prealabil, in soluție de acid citric 0,1 M (raportul pepsina:tesut este de 1:10), la 4 °C, timp de 24 de ore si dializa excesiva fata de apa distilata. Peste soluția de colagen se adauga 0,15 1 soluție de condroitin sulfat 5 %, cu greutatea moleculara medie 10 kDa si continui in acizi uronici de 27 % (compoziția 2).

Intr-un alt vas, prevăzut cu agitare, se introduc 1,5 g HEPES si 400 ml apa distilata si se agita pana la dizolvarea completa (compoziția 3).

Compozițiile obținute din amestecul de colagen si condroitin sulfat si cea de HEPES se adauga peste suspensia de beta-fosfat tricalcic substituit cu magneziu, la temperatura camerei, si se vortexeaza puternic, timp de 50 minute, pana la omogenizarea completa. Se obține o soluție vascoasa, cu aspect de gel, care se toama in tavite de inox si se liofilizează prin înghețare la temperatura de -40 °C si uscare sub vid la +25 °C.

In vederea reticularii, bucăți de suport liofilizat se introduc in etanol 40 %, timp de 40 minute, la temperatura camerei. Apoi, se prepara o soluție de EDC 30 mM in tampon MES dizolvat in etanol 70 %, pH 5,5, in care se incubeaza suporturile compozite, timp de 18 ore, la temperatura camerei, prin agitare continua pe un shaker. In scopul eliminării reziduurilor de reticulant, produsul se spăl a de doua ori cu o soluție de fosfat disodic 0,1 M, timp de 2 ore, apoi, de doua ori cu o soluție de clorura de sodiu 1 M, timp de 1 ora fiecare, de 6 ori cu o soluție de clorura de sodiu 2 M, timp de 3 ore si, in final, se fac 6 spălări cu apa distilata, timp de 4 ore fiecare. Apoi, suporturile reticulate se usucă prin liofilizare in condițiile prezentate ^-2010-00567-3 O -06- 2010 anterior. După liofilizare, suportul poros se ambaleaza etanș in pungi de polietilena si se sterilizează prin expunere la radiații gamma, la o doza de 15 kGy.

Exemplul 2

Compoziția 1, formata din beta-fosfat tricalcic substituit cu magneziu se prepara in aceleași condiții ca in exemplul 1, cu deosebirea ca magneziul din compoziție are o concentrație de 10 mol.%.

Compoziția 2 se prepara prin amestecarea a 2,5 1 soluție de colagen 0,6 %, cu greutatea moleculara de 320 kDa, extrasa din piele bovina cu pepsina in mediu de acid acetic 0,5 M, la temperatura camerei, cu o soluție de condroitin sulfat preparata in prealabil din 8 g de condroitin sulfat cu greutatea moleculara de 12 kDa, dizolvat prin agitare in 0,3 I de apa distilata.

Prepararea soluției de HEPES si amestecarea acesteia cu soluția de beta-fosfat tricalcic substituit cu magneziu si cea de colagen-condroitin sulfat s-a realizat conform exemplului 1. După liofilizarea soluției opalescente obținute, prin înghețare la -35 °C si uscare la 20 °C, produsul poros obtinut se trateaza cu o soluție de EDC 20 mM, preparata ca in exemplul 1. Pentru eliminarea reziduurilor de reticulant, produsul se spala pe rând cu o soluție de fosfat disodic 0,2 M, o soluție de NaCl 1 M, o soluție de NaCl 2 M si apa distilata, in condițiile prezentate in exemplul 1. Apoi, suporturile reticulate se usucă prin liofilizare in condițiile prezentate anterior. După liofilizare, suportul poros se ambaleaza etanș in pungi de polietilena si se sterilizează prin expunere la radiații gamma, la o doza de 20 kGy.

In vederea evaluării gradului de reticulare al materialului compozit obtinut, conform exemplelor de mai sus, s-au determinat spectrofotometric grupările amino libere din structura materialului înainte (proba martor) si după reticularea cu EDC si s-a testat degradarea in vitro a materialului in prezenta colagenazei bacteriene. Gradul de reticulare al compozitului tratat cu EDC a fost de 3 ori mai mare fata de proba martor, iar biodegradabilitatea, după 6 ore de menținere in prezenta colagenazei, a fost de 2 ori mai mica decât martorul. Caracterizarea morfologica a suportului compozit prin microscopie electronica de baleiaj a evidențiat structura lui microporoasa, marimea porilor variind intre 20 si 200 pm si prezenta particulelor de beta-fosfat tricalcic substituit cu magneziu, care sunt dispuse neomogen pe suprafața fibrilelor de colagen.

Suportul compozit a fost testat din punct de vedere al biocompatibilitatii atat in vitro cat si in vivo. Testarea in vitro s-a realizat pe un model experimental reprezentat de culturi primare de osteoblaste obținute din oase parietale de la șobolani nou-nascuti. Osteoblastele au fost injectate in probele de suport, la o densitate celulara de lxlO⁶ celule/ml si cultivate in ^-2010-00567-3 0 -06“ 20W mediu de cultura, timp de 21 de zile. S-au investigat viabilitatea si proliferarea celulelor, morfologia acestora si adeziunea lor la suport, comparativ cu doua probe martor: material plastic si un suport care conține COL/beta-fosfat tricalcic fara magneziu. Rezultatele obținute au demonstrat ca produsul realizat favorizează viabilitatea si proliferarea celulara, menține morfologia normala a celulelor, cu nudei eucromatici avand 1-2 nucleoli si o citoplasmă clar delimitată. In cazul osteoblastelor cultivate in proba conținând magneziu s-a observat o rata mai mare de proliferare a celulelor si o adeziune mai buna a acestora, comparativ cu suportul de COL/beta-fosfat tricalcic simplu. Celulele implantate in suportul de COL/beta-fosfat tricalcic substituit cu magneziu au prezentat fenotip osteoblastic chiar după perioade lungi de cultivare (21 de zile), fiind detectati in vitro markerii specifici osteoblastelor: fosfataza alcalina si osteocalcin.

Efectul in vivo al suportului compozit a fost demonstrat pe animale de laborator (șobolani Wistar) carora li s-au implantat subcutanat probe din compozitul poros, acestea recoltandu-se, apoi, la timpi variind intre 2 si 6 saptamani. Rezultatele testărilor au aratat ca, după 6 saptamani de la implantare, suportul compozit poros a prezentat o activitate osteoinductiva evidentiindu-se, la locul implantării, prezenta substanței fundamentale preosoase depuse de osteocite, precum si a substanței osoase mineralizate.

X-2010-005ÎJ7-3 O ”06- 2010

REVENDICĂRI

Produsul pe baza de fosfați de calciu si magneziu, colagen si condroitin sulfat, destinat terapiei defectelor osoase caracterizat prin aceea ca se prezintă ca un suport compozit poros, cu dimensiunea medie a porilor variind intre 20 si 200 pm, biocompatibil si bioresorbabil si este constituit din 35...60 % beta-fosfat tricalcic substituit cu 2,5...10 mol.% magneziu, cu dimensiunea medie a particulelor cuprinsa intre 1...5 μιη, 25...40 % colagen tip I acidosolubil, cu greutatea moleculara medie intre 280 si 330 kDa si conținut in colagen mai mare de 80 %, 12...20 % condroitin sulfat cu greutatea moleculara medie de 9...30 kDa si continui in acizi uranici de minim 25 % si 2...4 % HEPES (acid hidroxietil-piperazin-etan-sulfonic), părțile fiind exprimate in greutate.

Procedeul de obținere al produsului definit la revendicarea 1, caracterizat prin aceea ca, se realizează un suport compozit poros prin amestecarea a 9...18 parti compoziție 1, constituita dintr-o soluție de beta-fosfat tricalcic substituit cu 2,5...10 mol.% magneziu, de concentrație 4...9 %, preparata in tampon fosfat salin 2...4 %, pH 7...7,7, cu 74...85 parti compoziție 2, reprezentata de un amestec dintr-o soluție vascoasa de colagen acido-solubil

4.. .6 % dializat, in prealabil, fata de apa distilata si o soluție opalescenta de condroitin sulfat

2.. .4 % si cu 9-10 parti compoziție 3 reprezentata de o soluție HEPES de concentrație 0,3...0,5 %. Beta-fosfatul tricalcic substituit cu magneziu se obține prin amestecarea a 40...100 g carbonat de calciu cu 30...70 g fosfat acid de amoniu, 1...3 g oxid de magneziu si 0,200...0,500 1 etanol, solvent ce se evapora ulterior prin uscare, urmata de calcinarea amestecului de componente la 900 °C si sinterizarea acestuia la 1000...1200 °C. înainte de amestecarea cu compozițiile 2 si 3, compoziția 1 conținând beta-fosfat tricalcic substituit cu magneziu se omogenizează prin vortexare, la temperatura camerei. Amestecul celor 3 compoziții, obtinut prin vortexare puternica, timp de 10...50 minute, la temperatura camerei, se toama in tavite de inox si se liofilizează prin înghețare la temperatura de -30...-40 °C si uscare sub vid la temperaturi de +18...+25 °C.

In scopul creșterii rezistentei la degradare enzimatica, respectiv reticularii produsului, după liofilizare, acesta se introduce intr-o soluție de etanol 30...50 %, timp de 30.,.60 minute, la temperatura camerei, apoi, intr-o soluție de etil-dimetil-aminopropil carbodiimida (EDC) de concentrație 5...30 mM preparata, in prealabil, in tampon acid morfolino-etanol-sulfonic (MES) ce conține etanol 70 %, pH 5,5...6, timp de 15...24 ore, la temperatura camerei, prin agitare continua pe shaker. Suportul poros reticulat este supus unor spălări repetate cu o

«.-2 0 1 0 - 0 0 5 6 7 -3 0 -06- 2010 soluție de fosfat disodic 0,1,..0,2 M, de 1...2 ori, timp de 1...2 ore, apoi cu o soluție de clorura de sodiu 0,5...1 M, de 1...2 ori, timp de 1...2 ore, după care se realizează 5-6 spălări cu o soluție de clorura de sodiu 1,5...2 M, timp de 2...4 ore si, in final, 5-6 spălări cu apa distilata, timp de 3...5 ore fiecare. Condiționarea produsului se realizează prin liofilizare, in condițiile prezentate anterior, după care se ambaleaza in pungi de polietilena si se sterilizează prin expunere la radiații gamma, la doze de 15...20 kGy.

Claims (1)

1. Revendicări: 1

   Cu începere de la data publicării cererii de brevet, cererea asigură, în mod provizoriu, solicitantului, protecția conferită potrivit dispozițiilor art.32 din Legea nr.64/1991, cu excepția cazurilor în care cererea de brevet de invenție a fost respinsă, retrasă sau considerată ca fiind retrasă, întinderea protecției conferite de cererea de brevet de invenție este determinată de revendicările conținute în cererea publicată în conformitate cu art.23 al/n.flj -(3).