RO110680B1 - Procedeu de obținere a unui preparat enzimatic, multivalent - Google Patents

Abstract

Prezenta invenție se referă la un procedeu de obținere a unui preparat enzimatic, multivalent, destinat tratamentului insuficiențelor digestive. Procedeul conform invenției constă în aceea că prevede cultivarea tulpinilordeAspergillus niger I^,, Aspergillus niger Kr, Aspergillus niger As șiAspergillus oryzae 63, din colecția ISB, pe un mediu de cultură, conținând șrot de floarea soarelui 6% și mălai 4% în apă distilată, sterilizat 1 h, la 1,2 at, timp de 5 zile, la 28’C, în condiții staționare, filtrarea culturilor obținute prin nylon și vată de sticlă, centrifugare la 3500 rpm, timp de 20 min, purificarea enzimelor din supematant, prin precipitare fracționată cu acetonă 20 ... 50 % pentru tulpiniledeAspergillus niger1^,Aspergillus niger Kr și Aspergillus niger A, și 20 ...60% pentru tulpina de Aspergillus oryzae 63, spălarea precipitatelor cu acetonă rece, uscarea la temperatura camerei, 24 b, și amestecul pulberilor rezultate în rapoarte egale.

Description

Prezenta invenție se referă la un procedeu de obținere a unui preparat enzimatic, multivalent, pentru tratamentul insuficiențelor digestive.

Clinica bolilor digestive însumează o mare varietate de simptome, unele generate de leziuni sau dereglări funcționale, la nivelul gastro-intestinal, altele de ingestia de alimente. O serie de boli se dezvoltă funcție de alimentele consumate și adjuvantele lor, și de aceea, echilibrul fiziologic, între ceea ce se digeră și reacțiile morfo-funcționale indusei capătă o deosebită importanță.

Mecanismele generatoare de intoleranțe alimentare, în afecțiunile gastro-intestinale, sunt multiple, factorul de bază fiind insuficiența proceselor de digestie, determinată de deficiențele enzimatice. Așa, de exemplu, în enteropatia glutenică, s-a observat o scădere a eficienței acțiunii lipazei, datorată reducerii nivelului enzimatic pancreatic. De asemenea, maldigestiile ereditare sunt cauzate de deficite enzimatice amilolitice, lipolitice sau proteolitice.

Modalitățile terapeutice capătă astfel o importanță deosebită, ele vizând corectarea deficiențelor care diminuează procesul de digestie. In acest sens, terapia de substituție, respectiv administrarea unor medicamente conținând enzime, oferă posibilitatea reglării procesului de digestie, prezentând și avantajul unei alimentații normale.

In practica terapeutică, se utilizează deja preparate enzimatice, de origine vegetală sau pancreatică Luizym, Nutryzim, Triferment - care suprimă sau previn simptomele datorate unei insuficiențe digestive.

Dezvoltarea biotehnologiei a oferit noi posibilități de obținere a unor preparate enzimatice, cu largi aplicații în medicină, farmacie, chimie analitică, industria alimentară. In acest cadru, atenția a fost îndreptată, în special, asupra obținerii enzimelor de origine fungică, sursele microbiene oferind avantajul unui preț de cost scăzut și posibilitatea producerii la scară industrială, într-un timp relativ scurt.

Astfel, este cunoscut un procedeu de obținere a unui produs enzimatic, conținând lactază, prin cultivarea microorganismului Aspergillus niger, înregistrat în colecția Institutului de Chimie Alimentară București sub nr. 34, pe un mediu de cultură ce conține tărâțe de grâu, timp de 5 zile la 3O°C, după care miceliul se amestecă cu apă distilată, în proporție de 1 : 10 g/v, timp de 4 h, la temperatura camerei, se centrifughează și supernatantul obținut se supune precipitării fracționate cu acetonă.

Problema, pe care o rezolvă invenția, constă în obținerea unui preparat enzimatic, multivalent, fungic, utilizabil în tratamentul insuficiențelor digestive.

Invenția de față se referă la un procedeu de obținere a unui preparat multivalent, conținând amilaze, invertază, lactază, lipaze și proteaze, de origine fungică, enzime cu rol esențial în metabolismul glucidic, lipidic și protidic.

Procedeul conform invenției prevede cultivarea tulpinilor de Aspergillus niger l₂₂₁ .Aspergillus niger Kr, Aspergillus niger A₅ și Aspergillus oryzae 63 din colecția ISB, pe un mediu de cultură conținând șrot de floarea soarelui 6% și mălai 4% în apă distilată, sterilizat Ϊ h la 1,2 at, timp de 5 zile, la 28°C, în condiții staționare, filtrarea culturilor obținute prin nylon și vată de sticlă, centrifugare la 3500 rpm, timp de 20 min, purificarea enzimelor din supernatante prin precipitarea fracționată cu acetonă 20 ... 50 %, pentru tulpinile de Aspergillus niger '221 Aspergillus niger Kr și Aspergillus niger A₅ și 20 ... 60 % pentru tulpina de Aspergillus oryzae 63, spălarea precipitatelor cu acetonă rece și uscarea la temperatura camerei 24 h și amestecul pulberilor obținute astfel în rapoarte egale.

Avantajele invenției sunt următoarele :

- procedeul este simplu și nu necesită instalații speciale ;

- sursele microbiene, utilizate pentru obținerea enzimelor, oferă posibilitatea producerii la scară industrială, într-un timp relativ scurt ;

- solventul organic, utilizat pentru purificarea parțială a enzimelor, se recuperează 85 % ;

- utilizarea unui produs pe bază de enzime, în tratamentul tulburărilor de digestie, permite o alimentație normală.

Tulpinile de Aspergillus oryzae 63, Aspergillus niger l₂₂₁, Aspergillus niger A₅ și Aspergillus niger Kr sunt tulpini din colecția ISB, înregistrate sub nr. de colecție ISB-1042 din 1989 pentru Aspergillus oryzae 63; ISB-1032 din 1989 pentru Aspergillus niger - 1221; ISB-1030 din 1989 pentru Aspergillus niger A₅ și ISB-1031 din 1989 pentru Aspergillus niger Kr. Caracteristicile morfologice, toxonomice și biochimice, pentru fiecare tulpină în parte, sunt următoarele ;

Aspergillus oryzae - 63 ( Ahlb )

Caracteristici morfologice:

Pe mediul Czapek, formează colonii cu margine ușor ondulată, miceliu submers și miceliu aerian. In faza nesporulată, miceliul aerian este alb, păslos, iar în faza sporulată, devine verde-olive.

Capetele conidiene sunt globoase, radiate și poartă lanțuri de conidii. Conidioforii au lungimea de

2...5 mm, iar diametrul de 20 ... 30 μ. Veziculele sunt globoase, mai mult sau mai puțin hemisferice, cu diametru de 50 ... 60 μ. Pe veziculă, se dispun două serii de sterigme (cele primare 5 ... 12 μ, iar cele secundare 3,7 ... 10 μ). Conidiile sunt mai mult sau mai puțin piriforme, de culoare verde-olivegălbui, cu dimensiuni cuprinse între 3 ... 8μ.

încadrare toxonomică:

Fungi Imperfecți:

- Ord. Moniliales;

- Fam. Moniliaceae;

- Aspergillus oryzae.

Caracteristici biochimice:

Tulpina Aspergillus oryzae-63 produce amilaze și proteaze neutre și alcaline.

Aspergillus niger -1₂₂₁ '

Caracteristici morfologice:

Pe mediul Czapek, formează colonii cu margine ușor ondulată, miceliu submers și miceliu aerian. Reversul coloniei este de culoare bej. In faza nesporulată, suprafața coloniei este de culoare albă, iar după sporulare, devine de culoare neagră. Conidioforii sunt netezi, neseptați, lungi de 200 ... 300 μ și diametrul de 15 μ.

Capetele conidiene sunt globoase, de culoare neagră, cu diametrul de 500 ... 700 μ. Pe conidiofor, se dispune vezicula globoasă, al cărei dimatru este de 40 ... 50 μ. Pe veziculă, se dispun două serii de fialide (= sterigme de ordinul I și II, cu lungimea de 20 ... 30 μ). Conidiile sunt globoase ornamentate, de culoare neagră, cu dimensiuni cuprinse între 2,5 ... 3,5 μ . Nu formează scleroți.

încadrare taxonomică:

Fungi Imperfecți:

- Ord. Moniliales;

- Fam. Moniliaceae;

- Aspergillus niger.

Caracteristici biochimice:

Tulpina Aspergillus niger - l₂₂₁ produce lactază, invertază și proteaze acide.

Aspergillus niger A₅

Caracteristici morfologice:

Pe mediul Czapek, formează colonii cu margine ușor ondulată, miceliu submers și miceliu aerian. Reversul coloniei este de culoare bej. In faza nesporulată, suprafața coloniei este de culoare albă, iar după sporulare, devine de culoare neagră. Conidioforii sunt netezi, neseptați, lungi de 200 ... 250 μ, iar diametrul este cuprins între 10 ... 15 μ.

Capetele conidiene sunt globoase, de culoare neagră, cu diametrul de 300 ... 500 μ. Pe conidiofor, se află vezicula cu φ de 20 ... 30 μ. Prezintă fialide primare, de 20 ... 30 μ lungime și fialide secundare, de 6 ... 10 μ lungime. Conidiile sunt globoase, ornamentate, de culoare neagră, cu diametrul de 2,5 ... 4 μ. Nu formează scleroți.

încadrare taxonomică:

Fungi Imperfecți:

- Ord. Moniliales-,

- Fam. Moniliaceae;

- Aspergillus niger.

Caracteristici biochimice:

Tulpina Aspergillus niger A₅ produce lipaze și amilaze.

Aspergillus niger - Kr :

Caracteristici morfologice:

Pe mediul Czapek, formează colonii cu margine ușor ondulată, miceliu submers si miceliu aerian.

I

Reversul coloniei este incolor. In faza nesporulată, suprafața coloniei este de culoare albă, iar după sporulare, devine de culoare neagră. Conidioforii sunt netezi, neseptați, lungi de 250 ... 300 p, cu diametrul de 15...25 μ.

Capetele conidiene sunt globoase, de culoare neagră, cu diametrul 400 ... 500 μ. Pe conidiofor, se dispune vezicula cu φ 25 ... 35 μ. Pe conidiofor, se dispune vezicula cu Θ 25 ... 35 μ și cele secundare, lungi de 5 ... 12 μ. Conidiile sunt globoase, ornamentate, de culoare neagră, cu φ 2 ... 4 μ. Conidiile sunt globoase, ornamentate, de culoare neagră, cu φ 2 ... 4 μ. Nu formează scleroți.

încadrare taxonomică:

Fungi Imperfecți:

- Ord. Moniliales;

- Fam. Moniliaceae;

- Aspergillus niger.

Caracteristici biochimice:

Tulpina Aspergillus niger - Kr produce lactază, invertază și amilaze.

Se dă, mai jos, un exemplu de realizare a invenției :

Exemplul . In patru baloane Erlenmeyer, de 5 I capacitate fiecare, se repartizează câte 72 g șrot de floarea soarelui, 48 g mălai și 1200 ml apă distilată. Se agită și se sterilizează mediul la 1,2 at, timp de 1 h. Mediul sterilizat se inoculează cu spori, astfel : balonul 1 cu spori de Aspergillus niger l₂₂₁, balonul 2 cu spori de Aspergillus niger Kr, balonul 3 cu spori de Aspergillus oryzae 63 și balonul 4 cu spori de Aspergillus niger A₅. Culturile obținute după incubare 5 zile la 28°C, în condiții staționare, se filtrează prin nylon și vată de sticlă, apoi se centrifughează la 3500 rpm, timp de 20 min.

Supernatantele obținute se supun precipitării fracționate cu acetonă, conform schemei:

Supernatantul 1 (Asp. niger l221) precipitare fractionată cu acetonă 20...50%. 1 h la 4°C centrifugare 20 min, la 3500 rpm.	Supernatantul 2 (Asp. niger Kr) precipitare fractionată cu acetonă 20...50%. 1 h la 4°C centrifugare 20 min, la 3500 rpm.	Supernatantul 3 (Asp.oryzae 63) precipitare fracționată cu acetonă 20..60%, 1h la 4°C centrifugare 20 min, la 3500 rpm.	Supernatantul4 [Asp. niger A5) precipitare fracționată cu acetonă 20..50%. 1h la 4°C centrifugare 20 min, la 3500 rpm.
Super- Precipitat natant (se spălări re- înde- petate cu păr- acetonă tează rece, cen- trifugare 20 min, la 3500 rpm	Super- Precipitat natant natant (se spălări înde- repetate cu păr- acetonă rece, tează centrifugare 20 min, la 3500 rpm	Super Precipitat natant (se spălări înde- repetate cu păr- acetonă rece, tează centrifugare 20 min, la 3500 rpm	Ρ* -
(se spălări înde- repetate cu păr- acefcnă reoe, tează centrifugare 20 min, la 3500 rpm
Super Precipitat natant (se 24 h la C° înde- camerei părtează	Super Precipitat natant (se 24 h la t° înde- camerei părtea- ză	Super Precipitat natant (se 24 h la t° înde- camerei părtează	Super- Precipitat natant (se 24 h la t° înde- camerei părtează
Pulbere acetonică 1 (conține activitate invertazică și lactazică)	Pulbere acetonică II (conține activitate lactazică, invertazică și proteaze acide)	Pulbere acetonică III (conține activitate amilazică și proteazică)	Pulbere acetonică IV (conține actiitate lipazică)

Pulberile obținute se amestecă în rapoarte egale și se adaugă 10 % fell tauri (bilă de bou).

Preparatul obținut se prezintă sub forma unei pulberi amorfe, gal·

- amilolitică :

- invertazică :

- lactazică :

- lipolitică :

- proteolitică :

Prin proprietățile sale. preparatul enzimatic. multivalent. poate fi utilizat în tratamentul tulburărilor de digestie, determinate de afecțiuni la nivelul stomacului, inben-cenușie, cu miros slab caracteristic, solubilă în timp în apă distilată și ser fiziologic, pH-ul soluției apoase ί% fiind de 6,5 ... 7. Prezintă următoarele activități enzimatice :

ID;

(2);

(3) ;

(4) ;

(5) .

testinului, pancreasului, ficatului, la ameliorarea toleranței față de alimentele greu digerabile, precum și la facilitarea procesului de digestie la persoanele în vârstă.

minimum 15OO UW/g minimum 1800 UE/g minimum 20 UE/g minimum 35 UE/g minimum 100 UE/g

Claims (1)

1. Procedeu de obținerea unui produs enzimatic, multivalent, conținând amilaze, lactază, invertază, lipaze, proteaze, caracterizat prin aceea că prevede cultivarea tulpinilor de Aspergillus niger l₂₂₁, Aspergillus niger Kr, Aspergillus niger A₅ și Aspergillus oryzae 63, din colecția ISB, pe un mediu de cultură conținând șrot de floarea soarelui 6% și mălai 4% în apă distilată, sterilizat ΐ h, la 1,2 at, timp de 5 zile la 28°C, în condiții staționare, filtrarea culturilor obținute prin nylon și vată de sticlă, centrifugare la 3500 rpm, timp de 20 min, purificarea enzimelor din supernatant, prin precipitare fracționată cu acetonă 20 ... 50 %, pentru tulpinile de Aspergillus niger l₂₂₁, Aspergillus niger Kr și Aspergillus niger A₅ și 20 ...60%, pentru tulpina de Aspergillus oryzae 63, spălarea precipitatelor cu acetonă rece, uscarea la temperatura camerei 24 h și amestecul pulberilor rezultate în rapoarte egale.