PT99676B - Processo de preparacao de um polipeptido e de determinacao da presenca de auto-anticorpos anti-gpiiia - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 99 676

REQUERENTE: THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE, norte-americana, com sede em 10666 North Torrey Pines Road, La Jolla, Califórnia 92037, Estados Unidos da América

EPÍGRAFE: Processo de preparação de um polipéptido e de determinação da presença de auto-anticorpos anti -GPIIIa

INVENTORES:Robert McMillan, Edward F. berg

Plow e Mark H. Gins

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Estados Unidos da América em 3 de Dezembro de 1990 sob o ηθ 07/620 669.

s* UOQ 113 RF 'STH

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SCR 0600P/SCRF 228.1

POR

PATENTE N^B 99 676

Processo de preparação de um polipéptido e de determinação da presença de auto-anticorpos anti-GPIIla

RESUMO presente invento refere-se a um processo de preparação de um polipéptido possuindo uma sequência de resíduos de aminoácido com menos de cerca de 120 resíduos e incluindo uma sequência de resíduos de aminoácido correspondendo a uma fórmula seleccionada de entre o grupo consistindo em

Tyr-His-Asp-Arg-Lys-Glu-Phe-Ala-Lys-Phe-GluGlu-Glu-Arg-Ala-Arg-Ala-Lys-Trp-Asp-Thr-AlaAsn-Asn (SEQ ID NO 1) ;

Ala-Asn-Asn-Pro-Leu-Tyr-Lys-Glu-Ala-Thr-SerThr-Phe-Thr-Asn-Ile-Thr-Tyr-Arg-Gly-Thr (SEQ ID NO 2) ;

Ile-His-Asp-Arg-Lys-Glu-Phe-Ala-Lys-Phe-GluGlu-Glu-Arg-Ala-Arg-Ala-Lys-Trp-Asp-Thr-AlaAsn-Asn-Pro-Leu-Tyr-Lys-Glu-Ala-Thr-Ser-ThrPhe-Thr-Asn-Ile-Thr-Tyr-Arg-Gly-Thr (SEQ ID NO 4); e

Gly-Pro-Asp-Ile-Leu-Val-Val-Leu-Leu-Ser-ValMet-Gly-Ala-Ile-Leu-Leu-Thr-Gly-Leu-Ala-AlaLeu-Leu-Ile-Trp-Lys-Leu-Leu-Ile-Thr-Ile-HisAsp-Arg-Lys-Glu-Phe-Ala-Lys-Phe-Glu-Glu-GluArg-Ala-Arg-Ala-Lys-Trp-Asp-Thr-Ala-Asn-AsnPro-Leu-Tyr-Lys-Glu-Ala-Thr-Ser-Thr-Phe-ThrAsn-Ile-Thr-Tyr-Arg-GIy-Thr (SEQ ID NO 5).

no qual se procede a uma síntese por técnicas de ácidos nucleicos recombinantes ou a uma síntese química em fase sólida por adição sequencial de um ou mais resíduos de aminoácido ou resíduos de aminoácido adequadamente protegidos a uma cadeia polipéptidica em crescimento, sobre uma matriz.

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-2O invento refere-se ainda a um processo de determinação da presença de auto-anticorpos anti-GPIIIa numa amostra de fluido vascular, sendo os referidos auto-anticorpos indicadores de uma púrpura trombocitopénica imunológica crónica num paciente, que compreende:

(a) misturar uma amostra de fluido vascular de um paciente com um polipéptido preparado de acordo com a reivindicação 1, para formar uma mistura de imunorreacção;

(b) manter a referida mistura sob condições de ensaio biológico, durante um período de tempo suficiente para formar um produto de imunorreacção contendo o referido polipéptido;

(c) determinar a presença do referido produto de imunorreacção e, deste modo, a presença dos referidos auto-anticorpos anti-GPIIIa.

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-3MEMÓRIA DESCRITIVA

Campo Técnico

O presente invento descreve a preparação de polipéptidos úteis na detecção de auto-anticorpos anti-GPIIIa, indicadores de púrpura trombocitopénica imunológica crónica.

Antecedentes

A púrpura trombocitopénica imunológica crónica (ITP) é um distúrbio auto-imunológico caracterizado por trombocitopenia devida à produção de auto-anticorpos antiplaqueta o que resulta na destruição das plaquetas pelo sistema recticuloendotélico ou a inibição da produção de plaquetas (McMillan, N. Encrl. J. Med. , 304:1135-1147, 1981; Kelton et al., Semin. Thromb. Haemost., 8:83-104. 1982). Sabe-se que os auto-anticorpos de aproximadamente três quartos destes pacientes reagem com os complexos GPIIb/IIIa ou GPIb/IX da glicoproteína (GP) da membrana (van Leeuwen et al., Blood. 59:23-26, 1982; Woods et al., Blood, 63:368-375, 1984; Woods et al., Blood. 64:156-160, 1984; Beardsley et al., J. Clin. Invest.. 74:1701-1707, 1984; McMillan et al., Blood, 70:1040-1045, 1987); destes, alguns mostraram ligar-se à GPIIIa (Beardsley et al., J. Clin. Invest.. 74:1701-1707, 1984). Há, contudo, pouca informação sobre a localização precisa dos epitopos na GPIIIa. Um resumo recente, por Kekomaki et al., mostrou que o plasma de um doente com ITP, que reagiu por imunotransferência com a GPIIIa, se ligou a um fragmento de 60 000 dalton de GPIIIa resultante da digestão por quimotripsina (Kekomaki et al., Blood. 74:91, 1989).

Breve Sumário do Invento

Encontraram-se agora polipéptidos capazes de mimetizarem imunologicamente epitopos do domínio citoplasmático da GPIIIa reconhecidos por auto-anticorpos indicadores de ITP crónica.

Assim, numa concretização o presente invento contempla um polipéptido de menos de cerca de 120 resíduos, com uma sequência de resíduos de aminoácido que inclui uma sequência correspondente a uma fórmula escolhida entre as do grupo

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POR constituído por:

Tyr-His-Asp-Arg-Lys-Glu-Phe-Ala-Lys-Phe-GluGlu-Glu-Arg-Ala-Arg-Ala-Lys-Trp-Asp-Thr-AlaAsn-Asn (SEQ ID NO 1) ;

Ala-Asn-Asn-Pro-Leu-Tyr-Lys-Glu-Ala-Thr-SerThr-Phe-Thr-Asn-Ile-Thr-Tyr-Arg-Gly-Thr (SEQ ID NO 2) ;

Ile-His-Asp-Arg-Lys-Glu-Phe-Ala-Lys-Phe-GluGlu-Glu-Arg-Ala-Arg-Ala-Lys-Trp-Asp-Thr-AlaAsn-Asn-Pro-Leu-Tyr-Lys-Glu-Ala-Thr-Ser-ThrPhe-Thr-Asn-Ile-Thr-Tyr-Arg-Gly-Thr (SEQ ID NO 4); e

Gly-Pro-Asp-Ile-Leu-Val-Val-Leu-Leu-Ser-ValMet-Gly-Ala-Ile-Leu-Leu-Thr-Gly-Leu-Ala-AlaLeu-Leu-Ile-Trp-Lys-Leu-Leu-Ile-Thr-Ile-HisAsp-Arg-Lys-Glu-Phe-Ala-Lys-Phe-Glu-Glu-GluArg-Ala-Arg-Ala-Lys-Trp-Asp-Thr-Ala-Asn-AsnPro-Leu-Tyr-Lys-Glu-Ala-Thr-Ser-Thr-Phe-ThrAsn-Ile-Thr-Tyr-Arg-Gly-Thr (SEQ ID NO 5).

Numa outra concretização, um polipéptido deste invento tem uma sequência de resíduos de aminoácido correspondente à fórmula:

Tyr-His-Asp-Arg-Lys-Glu-Phe-Ala-Lys-Phe-GluGlu-Glu-Arg-Ala-Arg-Ala-Lys-Trp-Asp-Thr-AlaAsn-Asn-Ala-Asn-Asn-Pro-Leu-Tyr-Lys-Glu-AlaThr-Ser-Thr-Phe-Thr-Asn-Ile-Thr-Tyr-Arg-GlyThr (SEQ ID NO 3).

O presente invento contempla ainda um processo para determinar a presença de auto-anticorpos anti-GPIlla numa amostra de fluido vascular, sendo os referidos auto-anticorpos indicadores de púrpura trombocitopénica imunológica crónica num paciente. 0 processo compreende misturar uma amostra de fluido vascular de um paciente com um polipéptido deste invento para formar uma

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-5mistura de imunorreacção. A mistura assim formada é mantida em condições de ensaio biológico durante um período de tempo suficiente para formar um produto de imunorreacção contendo o polipéptido. A presença do produto de imunorreacção e, portanto, a presença dos referidos auto-anticorpos anti-GPIIIa, é então determinada .

Breve Descrição dos Desenhos

Nos desenhos que fazem parte desta descrição: a Figura 1 ilustra a ligação de auto-anticorpos a péptidos sintéticos GPIIIa. Alvéolos de microtitulação revestidos com péptidos sintéticos GPIIIa, são incubados com plasma de ensaio. 0 auto-anticorpo bem ligado é detectado usando IgG anti-humana, radiomarcada. A razão de ligação é igual à ligação, em cpm, ao péptido de ensaio/ligação, em cpm, ao péptido de controlo. As barras horizontais indicam 3 desvios-padrão acima das razões de ligação médias de 18 plasmas de controlo.

A Figura 2 ilustra a inibição da ligação anticorpo antipéptido pelas plaquetas e de GPIIb/IIIa purificada por afinidade. 0 plasma (diluição 1/10) de pacientes de ITP 1-3 foi pré-incubado com plaquetas lavadas (A) ou com GPIIb/IIIa (B) purificada, e depois feito reagir com péptidos GPIIIa. Os resultados estão expressos como a % de inibição.

A Figura 3 ilustra a inibição da ligação de auto-anticorpos a plaquetas, por péptidos. 0 plasma de pacientes de ITP 1-3 foi pre-incubado com o péptido apropriado (P8 ou P9) e depois com plaquetas intactas lavadas. Após lavagem, os complexos imunológicos foram capturados ou revestidos em alvéolos de microtitulação com anti-GPllb/IIla monoclonais e detectados por auto-anticorpos com IgG anti-humana marcada. Os resultados exprimem-se como % de inibição.

A Figura 4 ilustra a inibição da ligação de auto-anticorpos a GPIIb/IIIa por péptidos (P8 ou P9) e depois adicionados a alvéolos contendo GPIIb/IIIa de um lisado de plaquetas imobilizado com anticorpos monoclonais (4A) ou a alvéolos

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-6revestidos com GPIIb/IIIa purificada por afinidade (4B). O auto-anticorpo foi detectado usando IgG anti-humana. Os resultados exprimem-se como % de inibição.

Descrição Detalhada do Invento

A. Definições

Resíduo de aminoácido: aminoácido formado por digestão química (hidrólise) de um polipéptido nas suas ligações peptídicas. Os resíduos de aminoácido aqui descritos estão de preferência na forma isomérica ”L”. Contudo, resíduos na forma isomérica D podem substituir quaisquer resíduos de L-aminoácido, desde que a propriedade funcional pretendida se mantenha no polipéptido. NH₂ refere-se ao grupo amino livre presente no terminal amino de um polipéptido. COOH refere-se ao grupo carboxilo livre presente no terminal carboxilo de um polipéptido. Para manter a nomenclatura clássica dos polipéptidos (descrita em J. Biol. Chem.. 243:3552-59 (1969) e adoptada em 37 C.F.R. §l,822(b) (2)), as abreviaturas dos resíduos de aminoácido estão indicadas na seguinte Tabela de Correspondência:

TABELA DE CORRESPONDÊNCIA

SÍMBOLO_ AMINOÁCIDO

1-Letra Y	3-Letras Tyr	tirosina
G	Gly	glicina
F	Phe	fenilalanina
M	Met	metionina
A	Ala	alanina
s	Ser	serina
I	Ile	isoleucina
L	Leu	leucina
T	Thr	treonina
V	Val	valina
P	Pro	prolina
K	Lys	lisina
H	His	histidina
Q	Gin	glutamina
E	Glu	ácido glutâmico
Z	Glx	Glu e/ou Gin
w	Trp	triptofano
R	Arg	arginina

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SCR 0600P/SCRF 228.1 POR -7- TABELA DE CORRESPONDÊNCIA	(continuação)
SÍMBOLO		AMINOÁCIDO
1-Letra 3	-Letras
D	Asp	ácido aspártico
N	Asn	asparagina
B	Asx	Asn e/ou Asp
C	Cys	cisteína
X	Xaa	desconhecido ou	outro

Note-se que todas as sequências de resíduos de aminoácido aqui representadas por fórmulas estão orientadas da esquerda para a direita, na direcção convencional de terminal amino para terminal carboxilo. Além disso, a frase resíduo de aminoácido é definida latamente para incluir os aminoácidos indicados na Tabela de Correspondência e os aminoácidos modificados ou menos usuais como os indicados em 37 C.F.R. §1.822(b)(4), aqui citados apenas para referência. Note-se ainda que um travessão no começo ou no fim de uma sequência de resíduos de aminoácido indica uma ligação peptídica a uma outra sequência de um ou mais resíduos de aminoácido ou a um grupo terminal amino, como o NH₂, ou a um grupo terminal carboxilo, como o COOH.

Polipéptido: refere-se a uma série linear de resíduos de aminoácido ligados uns aos outros por ligações peptídicas entre o grupo amino alfa e o grupo carboxilo de resíduos de aminoácido contíguos.

Péptido: refere-se aqui a uma série linear de não mais de cerca de 50 resíduos de aminoácido ligados uns aos outros como num polipéptido.

Proteína: refere-se a uma série linear de mais de 50 resíduos de aminoácido ligados uns aos outros como num polipéptido.

Péptido sintético: refere-se a uma cadeia, produzida quimicamente de resíduos de aminoácido ligados por ligações peptídi-

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POR cas, isenta de proteínas que ocorrem naturalmente ou de fragmentos seus.

-8B. Polipéptidos presente invento contempla um polipéptido que imunorreage com auto-anticorpos anti-GPIIIa. Um polipéptido do presente invento caracteriza-se ainda por ter uma sequência de resíduos de aminoácido que inclui uma sequência de resíduos de aminoácido representada por uma das seguintes fórmulas:

Fórmula

Designação

P89 p(721-762) p(690-762)

SEQ ID NO Sequência¹

YHDRKEFAKFEEERARAKWDTANN

ANNPLYKEATSTFTNITYRGT

YHDRKEFAKFEEERARAKWDTANNANNPLYKEATSTFTNITYRGT

IHDRKEFAKFEEERARAKWDTANNPLYKEATSTFTNITYRGT

GPDILWLLSVMGAILLTGLAALLIWKLLITIHDRKEFAKFEEERARAKWDTANNPLYKEATSTFTNITYRGT £a sequência de resíduos de aminoácido é mostrada em código de uma letra, e um travessão no fim de uma linha indica que a sequência continua na linha seguinte.

Numa concretização preferida, um polipéptido deste invento contém, e de preferência consiste essencialmente na sequência de resíduos de aminoácido de acordo com uma das fórmulas acima indicadas na Tabela 1.

Numa outra concretização, o referido polipéptido é caracterizado pela presença de uma pluralidade de segmentos (regiões) de GPIIIa dentro da estrutura principal do polipéptido, sendo cada um dos segmentos definido por uma sequência de resíduos de

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-9aminoácido correspondente a uma das fórmulas P8, P9, P89, p(690-762) OU p(721—762).

Os segmentos derivados da GPIIIa podem ser adjacentes e/ou contíguos na cadeia do polipéptido, estando os segmentos adjacentes separados por um ou mais resíduos de espaçamento, na sequência de resíduos de aminoácido do polipéptido. De preferência, os resíduos de espaçamento constituem um segmento de espaçamento na gama de cerca de 1 até cerca de 20, de preferência de cerca de 5 até cerca de 15 e mais usualmente cerca de 10, resíduos de aminoácido de comprimento.

Além disso, um dos referidos polipéptidos pode conter um segmento de comando de 1 até cerca de 33, por exemplo cerca de 11, ou cerca de 18 ou cerca de 22 resíduos de aminoácido, localizados no terminal amino, conduzindo ao terminal amino do derivado de GPIIIa ou ao do segmento espaçador.

De modo análogo, um polipéptido objecto não precisa de terminar com o resíduo carboxi-terminal de um segmento derivado da GPIIIa ou de um segmento espaçador. Pode estar presente um segmento de cauda no terminal carboxilo, contendo 1 até cerca de 33, p. ex. cerca de 11, ou cerca de 18 ou cerca de 22 resíduos de aminoácido.

Os polipéptidos preferidos do presente invento são portanto definidos pelas fórmulas I, II, III, IV ou V:

Fórmula I

B-(Xaa_n-Tyr-His-Asp-Arg-Lys-Glu-Phe-Ala-LysPhe-Glu-Glu-Glu-Arg-Ala-Arg-Ala-Lys-Trp-AspThr-Ala-Asn-Asn-Xaa_m)_B-J (SEQ ID NO 6);

Formula II

B-(Xaa_n-Ala-Asn-Asn-Pro-Leu-Tyr-Lys-Glu-AlaThr-Ser-Thr-Phe-Thr-Asn-Ile-Thr-Tyr-Arg-GlyThr-Xaa_m)_a-J (SEQ ID NO 7);

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Formula III

B-(Xaa_n-lle-His-Asp-Arg-Lys-Glu-Phe-Ala-Lys-PheGlu-Glu-Glu-Arg-Ala-Arg-Ala-Lys-Trp-Asp-Thr-AlaAsn-Asn-Pro-Leu-Tyr-Lys-Glu-Ala-Thr-Ser-Thr-PheThr-Asn-Ile-Thr-Tyr-Arg-Gly-Thr-Xaa_m)_a-J (SEQ ID

NO 8); and

-10Formula IV

B-(Xaa_n-Gly-Pro-Asp-Ile-Leu-Val-Val-Leu-Leu-SerVal-Met-Gly-Ala-Ile-Leu-Leu-Thr-Gly-Leu-Ala-AlaLeu-Leu-Ile-Trp-Lys-Leu-Leu-Ile-Thr-Ile-His-AspArg-Lys-Glu-Phe-Ala-Lys-Phe-Glu-Glu-Glu-Arg-AlaArg-Ala-Lys-Trp-Asp-Thr-Ala-Asn-Asn-Pro-Leu-TyrLys-Glu-Ala-Thr-Ser-Thr-Phe-Thr-Asn-Ile-Thr-TyrArg-Gly-Thr-Xaa_m)_e-J (SEQ ID NO 9).

Nas fórmulas anteriores, B é um grupo NH₂ do terminal amino ou um segmento de comando anteriormente referido; J é um grupo COOH carboxi-terminal ou um segmento de cauda anteriormente referido; Xaa representa segmentos espaçadores cujas sequências de resíduos de aminoácido podem ser as mesmas ou diferentes; n ou é 1 ou é 0, de tal modo que quando n for 1, Xaa estará presente, e quando n for 0, Xaa não estará presente; m é 1 ou 0, tal que quando m for 1, Xaa estará presente, e quando m for 0, Xaa não estará presente; e a é um número inteiro de 2 a cerca de 10, de preferência de 2 a cerca de 5 e usualmente de 2 a 3, indicando o número de vezes que a sequência de resíduos de aminoácido entre parêntesis está presente (é repetida) ma estrutura primária do polipéptido. De preferência, a sequência entre parêntesis corresponde na sua totalidade, e de preferência é idêntica, a uma parte de sequência de resíduos de aminoácido de GPIIIa.

Além disso, na fórmula I anterior, considera-se que uma

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POR -11substituição do resíduo de tirosina (Tyr) no início da especificada que corresponde à posição 721 de P8, é tal que, nessa posição, em lugar de Tyr, esteja um resíduo de isoleucina (Ile). A isoleucina é o resíduo normalmente encontrado na GPIIla nativa, na posição de resíduos 721.

Um 721 polipéptido objecto contém normalmente um total de cerca de 20 até cerca de 450 resíduos de aminoácido, de preferência menos do que cerca de 120 resíduos. Normalmente, um polipéptido objecto não contém mais do que cerca de 100, de preferência não mais do que cerca de 70 e usualmente não mais do que cerca de 20 ou 40 resíduos de aminoácido na sua sequência principal. A limitação preferida do tamanho do polipéptido deve-se principalmente às limitações de tamanho e de pureza dos polipéptidos sintéticos apresentadas pelas tecnologias correntes e também à maior imunoespecificidade obtida pela apresentação de uma região mais pequena da GPIIla.

Um polipéptido objecto inclui qualquer análogo, fragmento ou derivado químico de um polipéptido cuja sequência de resíduos de aminoácido seja a aqui indicada, desde que o polipéptido seja capaz de imunorreagir com os auto-anticorpos GPIIla indicadores de ITP crónica. 0 polipéptido objecto pode, portanto, ser submetido a várias alterações, substituições, inserções e delecções, quando tais alterações proporcionam certas vantagens para o seu uso.

termo análogo inclui qualquer polipéptido com uma sequência de resíduos de aminoácido substancialmente idêntica à sequência aqui especificamente indicada, onde um ou mais resíduos tenham sido substituídos conservativamente por um resíduo de funcionalidade semelhante e que apresente a capacidade de mímetízar um epítopo de GPIIla como aqui se descreve. Exemplos de substituições conservativas incluem a substituição de um resíduo não polar (hidrofóbico) como a isoleucina, valina, leucina ou metionina por um outro, a substituição de um resíduo polar (hidrofílico) por um outro, como entre a arginina e a lisina, entre a glutamina e as asparagina, entre a glicina e a

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-12serina, a substituição de um resíduo básico como a lisina, arginina ou histidina por um outro, ou a substituição de um resíduo ácido como o ácido aspártico ou o ácido glutâmico por um outro.

A frase substituição conservativa também incluem o uso de um resíduo derivado quimicamente em lugar de um resíduo não derivado, desde que esse polipéptido apresente a necessária actividade de ligação.

Derivado químico refere-se a um polipéptido objecto que tenha um ou mais resíduos derivados quimicamente por reacção de um grupo funcional lateral. Estas moléculas derivadas incluem por exemplo as moléculas em que os grupos amino livres formaram derivados como os hidrocloretos de amina, grupos p-toluenossulfonilo, grupos carbobenzoxilo, grupos t-butiloxicarbonilo, grupos cloroacetilo ou grupos formilo. Os grupos carboxilo livres podem formar derivados como sais, ésteres metílicos e etílicos ou outros tipos de ésteres ou hidrazidas. Os grupos hidroxilo livres podem formar derivados como os derivados O-acilo ou O-alquilo. 0 azoto do imidazolo da histidina pode formar como derivado a N-im-benzil-histidina. Também incluídos nos derivados químicos estão os péptidos que contêm um ou mais derivados dos aminoácidos que ocorrem naturalmente, entre os vinte aminoácidos comuns. Por exemplo: a 4-hidroxiprolina pode substituir a prolina; a 5-hidroxilisina pode substituir a lisina; a 3-metil-histidina pode substituir a histidina; a homosserina pode substituir a serina; e a ornitina pode substituir a lisina. Os polipéptidos do presente invento também incluem qualquer polipéptido com uma ou mais adições e/ou delecções ou resíduos relativos à sequência de um polipéptido cuja sequência é aqui indicada, desde que se mantenha a necessária actividade.

termo fragmento refere-se a qualquer polipéptido objectivo que tenha uma sequência de resíduos de aminoácido mais curta do que a de um polipéptido cuja sequência de resíduos de aminoácido seja aqui indicada.

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-13Um polipéptido objectivo pode ser preparado usando metodologias de ácidos nucleicos recombinantes já bem conhecidas na arte. Por exemplo, as sequências de ADN úteis na produção de um polipéptido deste tipo estão descritas em Paik et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82:3445-3449, (1985)? McLean et al., Biol. Chem.. 259:6498-6504, (1984); e Rall et al., J. Biol.

Chem.. 257:4171-4178, (1982). Um segmento de ADN que codifica um polipéptido deste invento, pode ser sintetisado por técnicas químicas, por exemplo, pelo método do fosfotriéster de Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc.. 103:3185, (1981). O segmento de ADN pode depois ser ligado a um vector de expressão, e pode usar-se um hospedeiro transformado com ele, para produzir o polipéptido. Veja-se por exemplo Current Protocols In Molecular Biolocrv. Ausubel et al., eds., John Willey & Sons, New York, NY; Patentes U.S. N^a . 4 237 224, N^a . 4 356 270, N^a. 4 468 464, N^a. 4 683 195 e N^a 4 889 818.

Os vectores de expressão recombinantes capazes de expressar um polipéptido objecto e os métodos para o seu uso na produção destes polipéptidos, estão abrangidos pelo presente invento.

Um polipéptido objecto pode também ser preparado usando a técnica sintética de fase sólida, inicialmente descrita por Merrifield, in J. Am. Che,. Soc.. 85:2149-2154 (1963). Podem encontrar-se outras técnicas de síntese de polipéptidos em, por exemplo, M. Bodanszky et al., Peptide Svnthesis. John Wiley & Sons, 2d Ed., (1976) bem como em outros trabalhos de referência conhecidos dos peritos na arte. Pode encontrar-se um resumo das técnicas de síntese de polipéptidos em J. Stuart and J. D. Young, Solid Phase Peptide Svnthesis. Pierce Chemical Company, Rockford, IL, 3d Ed., Neurath, H. et al., Eds., p. 104-237, Academic Press, New York, NY (1976). Os grupos protectores adequados nestas sínteses podem ser encontrados nos textos acima referidos, bem como em J.F.W. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry. Plenum Press, New York, NY (1973).

Em geral, estes métodos de síntese compreendem a adição se73 433

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quencial de um ou mais resíduos de aminoácido, ou de resíduos de aminoácido adequadamente protegidos, a uma cadeia polipeptídica em crescimento. Normalmente, o grupo amino ou o grupo carboxilo do primeiro resíduo de aminoácido está protegido por um grupo protector adequado, selectivamente removível. Utiliza-se um grupo protector selectivamente removível diferente para os aminoácidos que contêm um grupo lateral reactivo como a lisina.

Usando como exemplo a síntese em fase sólida, liga-se o aminoácido protegido ou derivado, a um suporte sólido inerte por meio do seu grupo carboxilo ou amino, não protegido. 0 grupo protector do grupo amino ou carboxilo é depois removido selectivamente e o aminoácido seguinte na sequência com o grupo complementar (amino ou carboxilo) adequadamente protegido, é misturado e feito reagir em condições adequadas à formação da ligação amida com o resíduo já ligado ao suporte sólido. 0 grupo protector do grupo amino ou carboxilo é depois removido deste resíduo de aminoácido recentemente adicionado, o aminoácido seguinte (devidamente protegido) é depois adicionado e assim sucessivamente. Depois de todos os aminoácidos pretendidos se terem ligado na devida sequência removem-se quaisquer grupos protectores de grupos laterais e terminais remanescentes (e o suporte sólido), em sequência ou simultaneamente, obtendo-se o polipéptido final.

Qualquer péptido do presente invento pode ser usado sob a forma de um sal farmaceuticamente aceitável. Ácidos adequados que são capazes de formarem sais com os péptidos do presente invento incluem os ácidos inorgânicos como o ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido perclórico, ácido nítrico, ácido tiociânico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico-acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido antranílico, ácido cinâmico, ácido naftalenossulfónico, ácido sulfanílico ou semelhantes.

Bases adequadas que são capazes de formarem sais com os péptidos do presente invento incluem as bases inorgânicas como o

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POR —15— hidróxido de sódio, hidróxido de amónio, hidróxido de potássio e semelhantes; e as bases orgânicas como as mono-, di- e tri-alquil e arilaminas (p. ex. trietilamina, diisopropilamina, metilamina, dimetilamina e semelhantes) e as etanolaminas opcionalmente substituídas (p. ex. etanolamina, dietanolamina e semelhantes).

A preparação de composições terapêuticas que contêm polipéptidos como ingredientes activos é bem conhecida na arte. Normalmente estas composições são preparadas como injectáveis, como soluções ou suspensões líquidas, mas podem também ser preparadas formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em líquidos antes da injecção. A preparação pode também ser emulsionada. 0 ingrediente terapêutico activo é frequentemente misturado com excipientes que são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente activo. São excipientes adequados, por exemplo, água, solução salina , dextrose, glicerol, etanol ou semelhantes e suas combinações. Além disso, se se desejar, a composição pode conter pequenas quantidades de substâncias auxiliares tais como agentes molhantes ou emulsionantes, agentes tampão do pH, que melhorem a eficiência do ingrediente activo.

Um polipéptido pode ser formulado na composição terapêutica sob a forma de sais neutralizados farmaceuticamente aceitáveis. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupos amino livres do polipéptido ou da molécula de anticorpo) que são formados com ácidos inorgânicos como, por exemplo, os ácido clorídrico ou fosfórico, ou com ácidos orgânicos como o acético, oxálico, tartárico, mandélico e semelhantes. Os sais formados a partir dos grupos carboxilo livres podem também derivar de bases inorgânicas como por exemplo os hidróxidos de sódio, potássio, amónio, cálcio ou férrico e de bases orgânicas como a isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína e semelhantes.

C. Anticorpos Anti-Polipéptidos termo anticorpo, nas suas várias formas gramaticais, é aqui usado como um substantivo colectivo que se refere a uma

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-16população de moléculas de imunoglobulina e/ou a partes imunologicamente activas de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contêm um local de combinação de anticorpo ou paratopo.

Um local de combinação de anticorpo é aquela porção estrutural de uma molécula de anticorpo que compreende regiões variáveis e hipervariáveis, de cadeias pesadas e leves, que se liga especificamente ao antigénio.

A frase molécula de anticorpo nas suas várias formas gramaticais tal como aqui usada contempla uma molécula de imunoglobulina intacta e uma porção imunologicamente activa de uma molécula de imunoglobulina.

São exemplos de moléculas de anticorpo para uso nos métodos de diagnóstico e sistemas do presente invento, as moléculas de imunoglobulina intactas, moléculas de imunoglobulina substancialmente intactas e as partes de uma molécula de imunoglobulina que contenham o paratopo, incluindo as porções conhecidas na arte por Fab, Fab', F(ab')₂ e F(v).

As porções Fab e F(ab')₂ ^e anticorpos são preparadas pela reaeção proteolítica da papaína e da pepsina, respectivamente, em anticorpos substancialmente intactos por processos já bem conhecidos. Ver, por exemplo, Patente E.U.A.. N² 4 342 566 de Theofilopolous e Dixon. As porções Fab' de anticorpo são também bem conhecidas e são preparadas a partir de porções F(ab')_2/ seguindo-se a redução das ligações dissulfureto que ligam as duas porções de cadeia pesada, p. ex. com mercaptoetanol, e seguida da alquilação do mercaptano de proteína resultante com um reagente como a iodoacetamida. Prefere-se um anticorpo contendo moléculas intactas de anticorpo e utiliza-se como é aqui ilustrado.

Um anticorpo do presente invento imunorreage com um polipéptido objecto, de preferência com um polipéptido de acordo com as fórmulas P8, P9, P89, p(690-762) p(721-762), Fórmula I,

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-17Fórmula II, Fórmula III ou Fórmula IV. O anticorpo caracteriza-se ainda por não imunorreagir com um polipéptido de acordo com as fórmulas P_lz P₂, P₃, P₄, P₅, Pg e P₇ como se indicam na Tabela 1. Em concretizações preferidas o anticorpo não imunorreage com a GPIIIa presente na superfície das plaquetas. Na patente E.U.A. N^s. 4 810 632 estão descritos processos úteis para determinar a capacidade de um anticorpo reagir com antigénios sobre a superfície de plaquetas.

Um anticorpo objecto é normalmente produzido pela imunização de um mamífero com um inoculo contendo um polipéptido de acordo com as fórmulas P8, P9, P89, p(721-762), Fórmula I, Fórmula II, Fórmula III ou Fórmula IV. As moléculas de anticorpo anti-polipéptido induzidas pelo inoculo são depois retiradas do mamífero. Nas patentes E.U.A. N^E. 4 663 436 e N^E. 4 493 795 estão descritos processos úteis para preparar e caracterizar anticorpos anti-polipéptidos.

Para aumentar a especificidade do anticorpo, preferem-se os anticorpos que são purificados por cromatografía por imuno-afinidade, usando polipéptidos imunizantes fixados a fase sólida. O anticorpo é posto em contacto com o polipéptido imunizante fixado à fase sólida por um período de tempo suficiente para que o polipéptido imunorreaja com as moléculas de anticorpo formando um imunocomplexo fixado a fase sólida. Os anticorpos ligados são separados do complexo pelas técnicas clássicas.

anticorpo assim produzido pode ser usado inter alia nos métodos de diagnóstico e sistemas do presente invento para detectar auto-anticorpos anti-GPIIIa indicadores de ITP crónica presente numa amostra corporal.

A palavra inóculo, nas suas várias formas gramaticais, é aqui usada para descrever uma composição contendo um polipéptido deste invento como um ingrediente activo usado para a preparação de anticorpos imunorreactivos com o referido polipéptido. Quando se usa um polipéptido num inóculo para induzir anticorpos, deve-se notar que o polipéptido pode ser usado em várias

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-18concretizações, p. ex., sozinho ou ligado a um transportador como um conjugado, ou como polímero polipeptídico. Contudo, para facilidade de expressão e no contexto de um inoculo de polipéptido, as várias concretizações dos polipéptidos deste invento são aqui colectivamente referidas pelo termo polipéptido” e pelas suas várias formas gramaticais.

Para um polipéptido que contenha menos do que cerca de 35 resíduos de aminoácido, prefere-se usar o péptido ligado a um transportador a fim de induzir a produção de anticorpos.

Para ajudar a ligação do polipéptido a um transportador podem adicionar-se aos terminais amino ou carboxilo do polipéptido um ou mais resíduos de aminoácidos adicionais. Verificou-se que os resíduos de cisteína adicionados aos terminais amino ou carboxilo do polipéptido são particularmente úteis para preparar conjugados através de ligações dissulfureto. Podem, contudo, ser usados outros métodos bem conhecidos na arte para preparar conjugados. São exemplos de processos de ligação adicionais, o uso de produtos de reacção de adição de Michael, dialdeídos como o glutaraldeído, Klipstein et al. , J. Infect. Dis.. 147:318-326 (1983), e semelhantes, ou o uso da tecnologia da carbodiimida, p. ex. o uso de uma carbodiimida solúvel em água para formar ligações amida ao transportador. Para uma revisão sobre a conjugação de proteínas ou sobre o acoplamento através de grupos funcionais activados vej a-se Avrameas et al., Scand. J. Immunol.. 1:7-23 (1978).

Os transportadores úteis são já bem conhecidos na arte e, em geral, eles próprios são proteínas. São exemplos destes transportadores a hemocianina de lapa (género Fissurela) (KLH), edestina, tiroglobulina, albuminas como a albumina do soro bovino (BSA) ou a albumina do soro humano (HSA), glóbulos vermelhos como os eritrócitos de carneiro (SRBC), toxóide do tétano, toxóide da cólera, bem como poliaminoácidos como o ácido poli-(D-lisina; ácido poli-D-glutâmico) e semelhantes.

A escolha do transportador depende muito do fim último a

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-19que se destina o inoculo e baseia-se em critérios que não estão particularmente envolvidos no presente invento. Por exemplo, deverá ser escolhido um transportador que não produz uma reacção inconveniente no animal a ser inoculado.

presente inoculo contém uma quantidade imunogénica efectiva de um polipéptido deste invento, normalmente como um conjugado ligado a um transportador. A quantidade eficaz de polipéptido, por dose unitária, suficiente para induzir uma resposta imunitária ao polipéptido imunizante, depende, entre outras coisas, da espécie animal inoculada, do peso corporal do animal e do regime de inoculação escolhido, como é bem conhecido na arte. Os inóculos contêm normalmente concentrações em polipéptido de cerca de 10 microgramas até cerca de 500 miligramas por inoculação (dose), de preferência de cerca de 50 microgramas até cerca de 50 miligramas por dose.

O termo dose unitária no que se refere aos inóculos refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para animais, contendo cada unidade uma quantidade predeterminada de material activo calculada para produzir o efeito imunogénico pretendido em associação com o diluente necessário, isto é, transportador ou veículo. As especificações de nova dose unitária de um inoculo deste invento são ditadas por, e dependem directamente de (a) das características únicas do material activo e do efeito imunológico particular a alcançar e (b) das limitações inerentes à arte da composição deste material activo para utilização imunológica em animais, como aqui se referiu em pormenor, sendo estas características do presente invento.

Os inóculos são normalmente preparados a partir do conjugado-polipéptido sólido, seco, pela dispersão do conjugado-polipéptido num diluente fisiologicamente tolerável (aceitável) como a água, solução salina ou solução salina tamponada com fosfato, para formar uma composição aquosa.

Os inóculos podem também incluir um adjuvante como parte do

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-20diluente. Os adjuvantes como o adjuvante completo deTTeund (CFA), o adjuvante incompleto de Freund (IFA) e o alúmen, são materiais bem conhecidos na arte e estão disponíveis em várias fontes comerciais.

As técnicas de conjugação de polipéptidos ou de acoplamento através de grupos funcionais activados, actualmente conhecidas na arte, são particularmente aplicáveis. Veja-se, por exemplo, Avrameas, et al., Scand. J. Immunol., Vol. 8, Suppl. 7:7-23 (1978) e Patente E.U.A. N^a. 4 493 795, N^a. 3 791 932 e N^a. 3 839 153. Além disso, pode realizar-se uma reacção de acoplamento dirigido a local, de forma a que qualquer perda de actividade devida à orientação do polipéptido possa ser minimizada após o acoplamento. Veja-se, por exemplo, Rodwell et al., Biotech., 3:889-894 (1985), e Patente E.U.A. N^a. 4 671 958.

Para ajudar a ligação do polipéptido para formar um conjugado, podem juntar-se, aos terminais amino ou carboxilo do polipéptido, um ou mais resíduos de aminoácido adicionais. Verificou-se que os resíduos de cisteína, usualmente adicionados ao terminal carboxilo do polipéptido, são particularmente úteis para preparar conjugados através de ligações de dissulfureto, mas também podem ser usados outros métodos bem conhecidos na arte para preparar conjugados.

D. Processos de Ensaio

Discutem-se aqui os processos de ensaio úteis, em fase sólida e líquida. No entanto, o invento não fica limitado a isto. Além disso, embora os processos de ensaio particularmente descritos utilizem um marcador radioactivo, o presente invento não está especificamente limitado a esses ensaios. Descrevem-se abaixo processos de ensaio adicionais com ênfase particular para os processos de imunoensaio em fase sólida.

Os peritos na arte entenderão que podem ser aqui utilizados numerosos processos de imunoensaio em fase sólida. Exemplos de ensaios, em fase sólida, úteis, incluem técnicas de imunoensaio multiplicado por enzima (EMIT) e imunoensaios de fluorescência

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-21(FIA), para além do RIA discutido especificamente, do radio-imunoensaio em fase sólida (SPRIA) do Exemplo 8B e do ELISA. Contudo, qualquer processo que resulte num sinal dado pela reacção dos auto-anticorpos com um polipéptido deste invento, deve ser considerado. Cada um daqueles processos de ensaio pode utilizar técnicas de anticorpo simples ou duplo nas quais se utiliza um meio indicador para assinalar a imunorreacção e portanto a ligação de um auto-anticorpo que esteja a ser ensaiado com o polipéptido deste invento. Podem encontrar-se técnicas de exemplo explicadas em Maggio, Enzvme Immunoassav. CRC Press, Cleveland, OH (1981); e em Goldman, Fluorescent Antibodv Methods. Academic Press, New York, NY (1980).

Neste processo de ensaio utiliza-se uma amostra de fluido vascular. A amostra é normalmente soro ou plasma.

Um dos processos de ensaio considerados determina a presença e de preferência a quantidade de auto-anticorpos anti-GPIIIa numa amostra de fluido vascular. Este processo inclui os seguintes passos;

(a) uma amostra de fluido vascular é misturada com um polipéptido objecto para formar uma mistura de imunorreacção. De preferência o polipéptido está operativamente ligado a um suporte sólido de modo que a mistura de imunorreacção tenha uma fase líquida e uma fase sólida.

(b) a mistura de imunorreacção é mantida em condições de ensaio biológico durante um período de tempo, normalmente predeterminado, suficiente para formar um produto de imunorreacção contendo um polipéptido na fase sólida. Em formatos de ensaio heterogéneo, os reagentes são usualmente separados após o período de manutenção, normalmente lavando e retendo a fase sólida.

(c) a presença, e de preferência a quantidade de produto de imunorreacção formado no passo (b), e portanto a presença ou quantidade de auto-anticorpos anti-GPIIIa na amostra de fluido

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POR -22vascular, é então determinada.

As condições de ensaio biológico são as condições capazes de manter a actividade biológica dos reagentes imunoquímicos deste invento e o antigénio que se procura ensaiar. Estas condições incluem uma gama de temperaturas de cerca de 4°C até cerca de 45° C, uma gama de valores de pH entre cerca de 5 até cerca de 9 e uma força iónica que varia desde a da água destilada até cerca da de cloreto de sódio IM. Os métodos para optimizar estas condições são bem conhecidos na arte.

Numa concretização preferida do processo anterior, a quantidade de produto de imunorreacção é determinada de acordo com o passo (c) (i) mistura de um agente de ligação específico, marcado, capaz de ligar o produto de imunorreacção contendo o polipéptido, para formar uma mistura reaccional de marcação (ii) manter a mistura reaccional de marcação em condições de ensaio biológico durante um período de tempo suficiente para que o agente de ligação específico, marcado, se ligue ao produto de imunorreacção contendo o polipéptido, para formar um complexo marcado e (iii) detectar a presença ou quantidade de qualquer complexo marcado formado e, portanto, detectar a presença ou a quantidade de produto de imunorreacção contendo auto-anticorpo anti-GPIIIa.

Numa concretização particularmente preferida, o agente de ligação específico, marcado, é anti-IgG marcado.

Numa outra concretização, a amostra de fluido vascular imunorreage com um polipéptido objecto sob forma marcada e não marcada. Normalmente, o polipéptido não marcado está ligado a uma matriz sólida. Um braço do auto-anticorpo ligar-se-á ao polipéptido em fase sólida e um outro braço do anticorpo ligar-se-á ao polipéptido marcado, formando-se portanto um produto de imunorreacção marcado, em fase sólida. As imunorreacções com o polipéptido marcado e não marcado podem ser realizadas de modo substancialmente concorrente, isto é, na mesma mistura ou em série.

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-23Numa outra concretização, um polipéptido objecto imunorreage simultaneamente com um anticorpo anti-polipéptido deste invento e com a amostra de fluido vascular. De preferência, fixa-se o polipéptido ao suporte sólido e marca-se o anticorpo anti-polipéptido. Em alternativa, fixa-se o anticorpo anti-polipéptido ao suporte sólido e marca-se o polipéptido. Em qualquer dos casos forma-se um produto de imunorreacção marcado, em fase sólida, o que é indicador da presença e/ou quantidade de auto-anticorpos anti-GPIIIa.

De preferência, os locais de ligação não-especifica da proteína sobre a superfície do suporte de fase sólida estão bloqueados. Assim, o polipéptido ligado à fase sólida fica fixado por adsorção ou por outro meio bem conhecido de fixação à matriz sólida. Depois mistura-se com a fase sólida uma solução aquosa de uma proteína isenta de interferência com o ensaio, p. ex. albumina de soro bovino, de cavalo ou outra albumina de soro que também esteja isenta de contaminação com a GPIIIa, com o fim de adsorver a proteína misturada na superfície do suporte sólido contendo o polipéptido, em locais de ligação da proteína sobre a superfície que não estejam ocupados pela molécula paratópica monoclonal.

Uma solução de proteína aquosa típica contém de cerca de 3 a cerca de 10% em peso de albumina de soro bovino em PBS, a um valor do pH de 7,1 a 7,5. A mistura solução aquosa de proteína/suporte sólido é normalmente mantida durante um período de tempo de pelo menos uma hora a 37 °C e a fase sólida resultante é depois lavada para se libertar de proteína não ligada.

A amostra de fluido vascular pode ser plasma ou soro, como já se referiu. De preferência, a amostra é diluída de cerca de 1:10 até cerca de 1:5000, com maior preferência a cerca de 1:10.

E. Sistemas de Diagnóstico

O presente invento também contempla um sistema de diagnóstico, normalmente em forma de conjunto, que pode ser utilizado na realização dos processos de ensaio anteriormente descritos. 0

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-24sistema inclui um polipéptido objecto, numa quantidade suficiente para pelo menos um ensaio, como reagente imunoquímico embalado separadamente. Normalmente incluem-se também instruções para a utilização do reagente embalado.

Numa concretização, o sistema de diagnóstico em forma de conjunto inclui um suporte sólido que compreende uma matriz sólida, p. ex. uma placa de microtitulação, com um polipéptido deste invento fixado nela (ligado operativamente à matriz sólida), numa quantidade suficiente para realizar pelo menos um ensaio.

Em concretizações preferidas, o sistema de diagnóstico acima referido inclui ainda, como reagente embalado em separado, um segundo anticorpo, um anticorpo de revelação, que contém moléculas de anticorpo que imunorreagem com a IgG humana. 0 sistema pode ainda incluir, como um reagente embalado em separado, um anticorpo anti-polipéptido deste invento para utilização num formato de ELISA de competição.

De preferência, quando o marcador é uma enzima, o sistema de diagnóstico inclui ainda um ou mais das seguintes: (i) um abastecimento de peróxido de hidrogénio de concentração conhecida; (ii) um precursor de corante oxidativo de visualização, como o OPD; (iii) uma solução de um agente de paragem, p. ex. ácido sulfúrico 4N, para parar a reacção de formação de cor; (iv) um ou mais tampões, em forma seca ou líquida para uso no ensaio; e (v) materiais para preparar as curvas de referência padrão.

termo embalagem”, tal como aqui usado, refere-se a um material ou matriz sólida como o vidro, plástico, papel, folha metálica e semelhantes, capazes de conterem, dentro de certos limites, um polipéptido, anticorpo policlonal ou anticorpo monoclonal do presente invento. Assim, por exemplo, uma embalagem pode ser um frasco de vidro usado para conter quantidades da ordem dos miligramas de um polipéptido contemplado ou pode ser um alvéolo de placa de microtitulação ao qual se fixaram operativamente quantidades da ordem dos

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-25microgramas de um dado polipéptido, isto é, ligados de modo a serem capazes de serem ligados imunologicamente por um anticorpo .

As instruções para uso normalmente incluem uma expressão acessível gue descreva a concentração do reagente ou pelo menos um parâmetro do processo de ensaio, tal como as quantidades relativas de reagente e de amostra a serem misturadas, períodos de tempo de manutenção para misturas reagente/amostra, temperatura, condições de tampão e semelhantes.

Em concretizações preferidas, o sistema de diagnóstico do presente invento inclui ainda um marcador ou meios indicadores capazes de assinalarem a formação de um complexo contendo um polipéptido ou molécula de anticorpo do presente invento.

A palavra complexo, tal como aqui usada, refere-se ao produto de uma reacção de ligação específica, p. ex. uma reacção anticorpo-antigénio ou receptor-ligando. São exemplos de complexos os produtos de imunorreacção.

Os termos marcador ou meios indicadores tal como aqui usados, nas suas várias formas gramaticais, referem-se a simples átomos e moléculas que estão directa ou indirectamente envolvidas na produção de um sinal detectável para indicar a presença de um complexo. Quaisquer marcadores ou meios indicadores podem ser ligados ou incorporados numa proteína, polipéptido ou molécula de anticorpo que é parte de um anticorpo ou de uma composição de anticorpo monoclonal do presente invento, ou serem usados separadamente, e esses átomos ou moléculas podem ser usados sozinhos ou conjuntamente com reagentes adicionais. Estes marcadores são eles prórios bem conhecidos na química do diagnóstico clínico e constituem parte deste invento apenas na medida em que são utilizados com novos processos e/ou sistemas de proteínas.

Os meios marcadores podem ser um agente marcador fluorescente gue se liga quimicamente a anticorpos ou antigénios, sem

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os desnaturar, para formar um fluorocromo (corante) que é uma etiqueta imunofluorescente útil . São agentes marcadores fluorescentes adequados os fluorocromos como o isocianato de fluoresceína (FIC), isotiocianato de fluoresceína (FITC), cloreto de 5-dimetilamina-l-naftalenossulfonilo (DANSC), isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC), lissamina, cloreto de sulfonilo de rodamina 8 200 (RB 200 SC) e semelhantes. Uma descrição das técnicas de análise por imunofluorescência encontra-se em DeLuca Immunofluorescence Analysis”, in Antibodv As a Tool. Marchalonis, et al., eds., John Wiley & Sons, Ltd., pp. 189-231 (1982), que é aqui incorporado para referência.

Em concretizações preferidas, o grupo indicador é uma enzima como a peroxidase do rábano silvestre (HRP), glucose-oxidase ou semelhantes. Nos casos em que o grupo indicador principal é uma enzima como a HRP ou a glucose-oxidase, são necessários reagentes adicionais para visualizar o facto de se ter formado um complexo receptor-ligando (imunorreagente). Estes reagentes adicionais para a HRP incluem o peróxido de hidrogénio e um precursor de corante de oxidação como a diaminobenzidina. Um reagente adicional útil com a glucose-oxidase é o 2,2'-azino-di-(ácido 3-etil-benztiazolino-G-sulfónico) (ABTS).

Os elementos radioactivos são também agentes marcadores úteis e o seu uso é aqui ilustrado. Um exemplo de agente radiomarcador é um elemento radioactivo que produz emissão de raios gama. Os elementos que por si próprios emitem raios gama, como o ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹²⁸I, ¹³²I e ⁵¹Cr, representam uma classe de grupos indicadores, de elementos radioactivos produtores de emissão de raios gama. É particularmente preferido o ¹²⁵I. Um outro grupo de meios indicadores úteis é o dos elementos como o ^C, ¹⁵0 e ¹³N que por si próprios emitem positrões. Os positrões assim emitidos produzem raios gama por encontro com electrões presentes no corpo do animal. Também é útil um emissor beta como o ^i:L1índio do ³H.

A ligação dos marcadores, isto é, a marcação de polipéptidos e proteínas é bem conhecida na arte. Por exemplo, as mo-

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-27léculas de anticorpo produzidas por um hibridoma podem ser marcadas por incorporação metabólica de aminoácidos contendo o radio-isotopo proporcionados como um componente do meio de cultura. Ver, por exemplo Galfre et al., Meth. Enzvmol.. 73:3-46 (1981). São particularmente aplicáveis as técnicas de conjugação ou de ligação de proteínas através de grupos funcionais activados. Ver, por exemplo, Aurameas, et al., Scand. J. Immunol.. Vol. 8 Suppl. 7:7-23 (1978), Rodwell et al., Biotech.. 3:889-894 (1984), e Y.S. Patente E.U.A. N“. 4 493 795.

Os sistemas de diagnóstico podem também incluir, de preferência como embalagem separada, um agente de ligação específico. Um agente de ligação específico é uma entidade molecular capaz de se ligar selectivamente a uma espécie reagente do presente invento ou a um complexo contendo essa espécie, mas ele próprio não é um polipéptido ou uma composição de moléculas de anticorpo do presente invento. São exemplos de agentes de ligação específicos as moléculas de anticorpo secundárias, proteínas do complemento ou seus fragmentos, a proteína A de S. aureus e semelhantes. De preferência, o agente de ligação específica liga-se à espécie reagente quando essa espécie está presente como parte de um complexo.

Em concretizações preferidas, o agente de ligação específico está marcado. Contudo, quando o sistema de diagnóstico inclui um agente de ligação específico não marcado, o agente é normalmente usado como meio amplificador ou reagente. Nestas concretizações, o agente de ligação específico marcado é capaz de se ligar especificamente ao meio amplificador quando o meio amplificador está ligado a um complexo que contenha a espécie reagente.

Os conjuntos de diagnóstico do presente invento podem ser usados em formato ELISA para detectar a quantidade de anticorpos anti-GPIIIa, particularmente auto-anticorpos GPIIIa, numa amostra de fluido vascular como o sangue, soro ou plasma. ELISA refere-se a um ensaio imunoadsorvente de enzima ligada que utiliza um anticorpo ou um antigénio ligado a uma fase

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sólida e um enzima-antigénio ou um enzima-conjugado de anticorpo para detectar e quantificar a quantidade de um antigénio presente numa amostra. Encontra-se uma descrição da técnica ELISA no Capítulo 22 da 4^a. Edição de Basic and Clinicai Immunologv. por D.P. Sites et al., publicado pela Lange Medicai Publications of Los Altos, CA em 1982 e nas Patentes E.U.A. N^a. 3 654 090; N^a. 3 850 752; e N^a. 4 016 043, aqui incorporadas para referência.

Um reagente é normalmente fixado a uma matriz sólida por adsorção a partir de um meio aquoso, ainda que posam ser usados outros modos de fixação aplicáveis a proteínas e polipéptidos, bem conhecidos dos peritos na arte.

Assim, em concretizações preferidas, um polipéptido, ou uma molécula de anticorpo anti-polipéptido, do presente invento pode ser fixado numa matriz sólida para constituir um suporte sólido que compreende uma embalagem do sistema de diagnóstico objecto.

As matrizes sólidas úteis são também bem conhecidas na arte de preparação de um suporte sólido contendo um reagente nelas fixado. Estes materiais são insolúveis na água e incluem dextrano recticulado disponível sob a marca comercial SEPHADEX da Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NJ); agarose; esferas de poliestireno com diâmetro de cerca de 1 micron até cerca de 5 milímetros, disponíveis em Abbot Laboratories of North Chicago, IL; poli(cloreto de vinilo), poliestireno, poliacrilamida recticulada, teias à base de nitrocelulose ou nylon como folhas, tiras ou pás; ou tubos, placas ou os alvéolos de uma placa de microtitulação como as fabricadas em poliestireno ou poli(cloreto de vinilo).

A espécie reagente, agente de ligação específico, marcado, ou o reagente amplificador de qualquer sistema de diagnóstico aqui descrito podem ser proporcionados em solução, como numa dispersão líquida ou como um pó substancialmente seco, p. ex., em forma liofilizada. Quando o meio indicador é uma enzima, o substrato da enzima pode também ser proporcionado numa embalagem

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-29separada de um sistema. Neste sistema de ensaio de diagnóstico podem também ser incluídos, como elementos embalados em separado, um suporte sólido, como a placa de microtitulação atrás descrita, e um ou mais tampões.

Os materiais de embalagem aqui tratados em relação aos sistemas de diagnóstico são os habitualmente utilizados em sistemas de diagnóstico. Estes materiais incluem garrafas e frascos em vidro e plástico (p. ex. polietileno, polipropileno e policarbonato), envólucros em plástico ou em folha laminada de metal-plástico e semelhantes.

Exemplos

Os seguintes exemplos pretendem ilustrar o presente invento sem o limitar.

1. Pacientes

Analisou-se o plasma de 13 pacientes com ITP crónica. Todos os pacientes com ITP crónica tinham auto-anticorpos associados às plaquetas e ao plasma, dirigidos contra a GPUb/IIIa da membrana das plaquetas Beardsley et al., J. Clin. Invest., 74:1701-1070, 1984). Além disso, cada um reagiu com GPIlb-lIla ligada a alvéolos de microtitulação por um anticorpo monoclonal (Woods et al., Blood. 63:368-375, 1984; Woods et al., Blood. 64:156-160, 1984) e com GPIIb/IIIa purificada por afinidade (McMillan, Trans. Med. Rev.. 4:136-143, 1990). Os pacientes com ITP crónica obedecendo a estes critérios representam cerca de 10% de \ima população aleatória com ITP (McMillan et al., Blood. 70:1040-1045, 1987). Foi também estudado o plasma de 3 pacientes com púrpura pós-transfusão causada pelo anticorpo anti-PLAl que se sabe ligar-se à GPIIIa, o de 1 paciente com trombastenia e alo-anticorpos anti-GPIIb/IIIa pós-transfusão, o de 1 paciente com anticorpos anti-HLA, o de 4 pacientes com trombocitopenia não imunológica (esplenomegalia congestiva, anemia aplástica, leucemia linfoide crónica, glioblastoma na quimioterapia) e o de 18 dadores normais.

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-302. Preparação de Péptidos Sintéticos

Como base para a produção de péptidos sintéticos usou-se a sequência de aminoácidos da GPIIIa humana, descrita por Fitzgerald et al. (Fitzgerald et al., J. Biol. Chem.. 262:3936-3939, 1987). Os péptidos foram preparados com um sintetizador Applied Biosystems, Modelo 430 (Foster City, CA) usando aminoácidos t-Boc e resinas mono-oxigenase a-aminadora da peptidilglicina (D'Souza et al., J. Biol. Chem., 263:3943-3951, 1988). As reacções de desprotecção para libertação dos péptidos do suporte de fase sólida, foram realizadas tratando o péptido na matriz com fluoreto de hidrogénio anidro, contendo 10% de tioanisolo, durante l h a 0°C. Os péptidos clivados foram purificados por cromatografia líquida de alta eficiência nua coluna C18-ODS2. A eluição fez-se em gradiente linear 0-80% de acetonitrilo contendo 0,1% de ácido trifluoroacético. A composição final de aminoácidos dos péptidos foi confirmada por análise de aminoácidos. Os péptidos usados neste estudo estão indicados na Tabela 1.

Tabela 1 Péptidos GPIIIa

Desionaeão	Localização da GPIIIa*	SEQ ID Nl	Seq. de aminoácidos1
PI	(93-103)	10	RPDDSKNFSIQ
P2	(118-128)	11	MDLSYSMKDDL
P3	(154-165	12	GAFVDKPVSPYM
P4	(400-417)	13	EAKVRGCPQEKEKSFTIK
P5	(561-573)	14	TTRTDTCMSSNGL
P6	(636-654)	15	RDEIESVKELKDTGKDAVN
P7	(669-680)	16	YYEDSSGKSILY
P8	(721-744)	1	YHDRKEFAKFEEERARAKWDTANN
P9	(742-762)	2	ANNPLYKEATSTFTNITYRGT
P10+	(controlo)	17	ARAKWDTVRDGA

Estão indicados os números dos aminoácidos dos terminais amino e carboxilo (p. ex. Pj começa com o aminoácido 93 da GPIIIa e termina com o aminoácido 103)

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POR -31-

⁺ Sequência de aminoácidos de um péptido não relacionado, usado como controlo.

¹ As sequências de resíduos de aminoácido estão representadas pelo código de uma só letra.

Os péptidos sintetizados foram solubilizados em solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou em PBS contendo ureia 8M (P8, P9, PIO). Estudos preliminares mostraram que cada um dos péptidos se ligou ao plástico e que a concentração de ureia na solução diluída de péptidos usada no ensaio não afectava os resultados .

3. Anticorpos Monoçlonais

Anticorpos monoçlonais do murino contra GPIIb de plaquetas (2A9, fornecidos pelo Dr. V.L. Woods, UCSD) e a cadeia pesada gama de IgG humana (HB43, American Type Culture Collection, Rockville, MD) foram purificados a partir de ascites usando a técnica MAPS (Biorad, Richmond, CA). A radiomarcação do HB-43 foi obtida usando o método do iodogénio.

4. Preparação do Extracto de Plaquetas

Plaquetas do tipo 0 foram lavadas 6 vezes em tampão de citrato isotónico 0,05M, pH 6,2, e depois solubilizadas por incubação durante 30 min. a 4°C em Triton-X100 a 1% (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) em PBS (10⁹ plaquetas/ml). 0 material insolúvel foi removido por ultra-centrifugação.

5. Preparação de GPIIb/Illa Purificada por Afinidade

Passou-se extracto de plaquetas por uma coluna de anticorpos monoçlonais anti-GPIIb (2A9) acopladas a Sepharose CL. Após lavagem extensiva com PBS, o complexo GPIIb/IIIa foi eluído com dietilamina O,1M em octaglucopiranósido (OPG) a 1% em PBS, pH 10,0, e imediatamente dialisado contra NaP0₄ O,1M contendo 1% de OGP. Confirmou-se a pureza por SDS-PAGE e determinou-se a concentração em proteína.

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6. Radio-imunoensaio em Fase Sólida (RIA)

A. Ligação ao Péptido GPIIIa

Activaram-se alvéolos de microtitulação com 100 μΐ de glutaraldeído a 0,1% em tampão de revestimento (NaHCO₃ O,1M, pH 8,3) durante 1 h à temperatura ambiente (TA). Os alvéolos foram lavados duas vezes com PBS e depois incubados durante 2 h à TA com 1 μ% de cada péptido sintético em 100 μΐ de tampão de revestimento. Após 6 lavagens com Tween-20 a 0,05% (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) em PBS (tampão de lavagem), cada alvéolo foi incubado com 200 μΐ de BSA a 2% em tampão de lavagem, durante 1 h à TA. Os alvéolos foram lavados 6 vezes, seguindo-se a adição a alvéolos em triplicado de 100 μΐ de plasma diluído a 1/10 em tampão de lavagem. Após incubação durante 1 h e 6 lavagens, adicionaram-se a cada alvéolo 100 μΐ de IgG anti-humana, radiomarcada, em tampão de lavagem (100 000 cpm). Após uma incubação final de 1 h e 6 lavagens, a radioactividade ligada aos alvéolos foi determinada. Os resultados expressam-se como a razão:média dos cpm ligados ao péptido GPIIIa dividida pela média dos cpm ligados ao péptido de controlo (P10).

Como alvos antigénicos, usaram-se nove péptidos sintéticos correspondentes às diferentes sequências na GPIIIa das plaquetas (P1-P9, Tabela 1). Como controlo, usou-se um péptido sintético de cadeia pesada de HLA humana Classe I (Pio). Estudou-se o plasma de 13 pacientes com ITP crónica. Quando se comparou com o plasma de 19 sujeitos normais, os auto-anticorpos do plasma de 5 destes pacientes (ITP-1 até -5) ligaram-se significativamente (p<0,001) a epítopos em qualquer dos péptidos 8 ou 9 (Figura 1). Estes 2 péptidos hidrofílicos que se sobrepõem estão localizados na região do terminal carboxilo da GPIIIa e os dois juntos compreendem a porção da molécula considerada como o domínio citoplasmático. O plasma dos pacientes ITP-1 e ITP-2 ligaram-se ao péptido 9 com razões médias de 32,4 (3 estudos) e 5,8 (2 estudos), respectivamente, enquanto que o plasma do paciente ITP-3 se ligou a ambos os péptidos 8 e 9 (razões médias de 13,3 e 3,3, respectivamente; 3 estudos) e os dos pacientes ITP-4 e ITP-5 ligaram-se ao péptido 8 (razões médias de 3,6, com dois estudos e 9,4, com 2 estudos). As amostras dos outros 8

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-33pacientes com ITP crónica (ITP-6 até ITP-13), dos 5 pacientes com alo-anticorpos (3 com anti-ΡΙΑΙ, 1 com trombastenia e anticorpo anti-GPIIb/IIIa, 1 com anti-HLA) e dos 4 pacientes com trombocitopônia não imunitária, não mostraram ligação significativa aos péptidos GPIIIa utilizados.

B. Ligação a GPIlb/IIIa

Estudou-se a ligação de auto-anticorpos a GPIlb/IIIa purificada por afinidade como a GPIlb/IIIa a partir de lisado de plaquetas imobilizadas por anticorpo monoclonal (2À9). No primeiro caso, revestiram-se alvéolos em triplicado, durante 1 h, com 100 μ± de GPIlb/IIIa (10 Mg/ml) purificada por afinidade, seguindo-se 6 lavagens e o bloqueio com BSA como acima se descreveu. Para o último ensaio, adicionaram-se a cada alvéolo 100 μΐ de anti-GPIIb (2A9) de murino a 10 Mg/ml. Após incubação durante 2 h a TA e lavagem por 6 vezes, os alvéolos foram bloqueados com BSA a 2% em tampão de lavagem. A cada alvéolo adicionou-se então 10 μΐ de lisado de plaquetas diluído a 1/10 com tampão de lavagem e incubou-se durante 1 h. Depois de lavagem por 6 vezes, completou-se, como acima se descreveu, cada um destes ensaios modificados.

7. Ligação a Plaquetas

Plaquetas lavadas (3 χ 10⁷) foram incubadas com plasma de pacientes (ITP-1-15 μΐ, ITP-2-60 μΐ, ITP-3-30 μ1) num volume total de 200 Ml de tampão citrato, durante 2 h, à temperatura ambiente seguindo-se 4 lavagens. Após ressuspensão em 300 μΐ de tampão citrato, as plaquetas foram lisadas com 33 μΐ de Triton X-100 a 10% em tampão citrato. A seguir juntaram-se 100 μ1 de lisado aos alvéolos revestidos com anti-GPIIb de murino. Detectaram-se os anticorpos ligados com IgG anti-humana marcada como se descreveu.

8. Estudos de Inibição

Para avaliar a capacidade de plaquetas lavadas, de GPIIb/ /Illa purificada por afinidade ou de péptidos sintéticos para bloquearem a ligação de auto-anticorpos, incubaram-se durante a noite, a 4°C, com o plasma do paciente, diluições em série de

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-34plaquetas, GPIIb/IIIa ou péptidos sintéticos (adição máxima: 10-*-° plaquetas, 200 pg de GPIIb/IIIa ou 10 gg de péptidos por 100 μΐ de plasma, respectivamente). 0 plasma pré-incubado (100 μΐ diluição 1/10) foi adicionado a alvéolos replicados contendo GPIIb/IIIa do lisado de plaquetas, GPIIb/IIIa purificada por afinidade ou péptidos sintéticos, e a ligação dos anticorpos a cada alvéolo foi avaliada como acima se descreveu. Os resultados foram expressos como percentagem da ligação de plasma não tratado (% de inibição).

Três das amostras de plasma positivas em relação ao péptido (ITP-1, -2 e -3) foram testadas adicionalmente; os testes adicionais com ITP-4 e ITP-5 não foram possíveis devido a insuficiência de plasma. Para as experiências de inibição usámos concentrações de plasma que não saturaram os alvéolos revestidos com antigénio, as quais em cada caso tiveram uma diluição de 1/10.

A. Inibição da Ligação de Anticorpos Antipéptido a Péptidos por Plaquetas ou GPIIb/IIIa Purificada A reactividade dos anticorpos do plasma de ITP-1, -2 e

-3 com os péptidos GPIIIa foi completamente inibida por pré-incubação do plasma com plaquetas lavadas do tipo 0 (Figura 2a) ou com GPIIb/IIIa purificada por afinidade (Figura 2b), indicando que cada um dos epítopos estava presente nas plaquetas lavadas intactas e na GPIIb/IIIa purificada.

B Inibição da Ligação de Auto-anticorpos a, Péptidos, Plaquetas e GPIIb/IIIa, por Péptidos em Solução Para avaliar a contribuição destes anticorpos antipéptidos para com a actividade anti-GPIIb/IIIa do plasma total dos pacientes, os plasmas de ITP foram pré-incubados com diluições em série do péptido apropriado (8 ou 9) e depois testados em 4 avaliações diferentes. Na primeira, o plasma pré-tratado foi incubado com plaquetas. Depois da lavagem e lise, os complexos GPIIb/IIIa foram capturados em alvéolos de microtitulação, por anticorpos monoclonais. Nos outros 3 ensaios, juntou-se plasma pré-tratado a alvéolos de microtitulação revestidos directamente

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-35com péptido ou com GPIIb/IIIa purificada por afinidade (Aff-GPIIb/IIIa) ou a alvéolos de microtitulação com GPIIa/IIIb do lisado de plaquetas imobilizadas por anticorpos monoclonais (Moab-GPIIb/IIIa). Em todos os ensaios detectou-se a ligação dos anticorpos com IgG anti-humana, marcada.

(i) Inibição da ligação ao péptido

Em todos os 3 casos, a pré-incubação do plasma com o péptido apropriado teve como resultado uma inibição >95% de ligação de anticorpos a péptido imobilizado (resultados não indicados).

(ii) Inibição da ligação a plaquetas

A pré-incubação com o péptido 9 resultou numa inibição quase completa da ligação de anticorpos de ITP-1 [(87,8-98,0), 3 estudos] e de ITP-2 [94,0% (87,9-100), 2 estudos] a plaquetas lavadas, enquanto que o péptido 8 apenas bloqueou parcialmente [19,7% (17,7-21,6), 2 estudos] a ligação de anticorpos de ITP-3 (Figura 3).

(iii) Inibição da ligação a GPIIb/IIIa

A pré-incubação de plasma de ITP-1, -2 e -3 com péptido teve como resultado uma inibição média máxima de ligação a Moab-GPIIb/IIIa de 86,8% (83,7-89,8; 2 estudos), 100% (2 estudos) e 12,5% (8,6-16,3; 2 estudos) respectivamente. Por outro lado, estudos onde se usou affi-GPIIb/IIIa como antigénio alvo deu resultados algo diferentes. 0 pré-tratamento do péptido deu a seguinte % de inibição máxima: ITP-1 - 54,9% (48,7-62,7; 3 estudos) ITP-2 - 87,5% (1 estudo) e ITP-3 - 35,4% (19,4-49,3; 3 estudos). Os exemplos estão indicados nas Figuras 4A e 4B.

9. Preparação de Recombinantes de Células de Hamster Chinês

ADNc de comprimento total para a GPIIb, GPIIIa (0'Toole et al., Blood. 74:14-18, 1989), e um ADNc para a GPIIIa a que faltam nucleótidos que codificam os aminoácidos 728 até 762 da região do terminal carboxilo, foram subclonados no vector de expressão eucariota CDM8 (Aruffo et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 84:8573-8577, 1987) e foram usados para transfectar células

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-36de ovário do hamster chinês (CHO) como foi descrito por (Loftus et al., Science. 249:915-918, 1990). A linha clonal estável que expressa a GPIIb/IIIa intacta foi designada por A5 e foi caracterizada como se descreveu (Loftus, et al., Science. 249:915-918, 1990). As transfectadas com GPIIb completa e com GPIIla truncada, a que faltam os 35 aminoácidos da região do terminal carboxilo, foram designadas por IIbj8₃A728. Em ensaios FACS estas células reagiram com um dos painéis anteriormente descritos, de anticorpos monoclonais anti-GPIIb-IIIa de murino incluindo uma que era específica do complexo (0'Toole et al., Blood, 74:14-18, 1989). Como controlos foram usadas células CHO não transfectadas. Lavaram-se as células três vezes em EDTA 3,5 mM em PBS e uma vez em PBS. Após ressuspensão em PBS (2 x 10⁷/ml), as células foram lisadas por Triton X-100 a 1% e ultracentrifugadas a 100 000 x G durante 30 minutos. O sobrenadante foi removido e usado para RIA em fase sólida, como antigénio GPIIb/IIIa imobilizado em alvéolos de microtitulação pelo anticorpo monoclonal anti-GPIIb/IIIa. A ligação dos anticorpos do plasma à GPIIb/IIIa recombinante foi detectada como acima se descreveu.

A ligação do plasma de 5 pacientes de ITP crónica ao péptido 8 ou ao 9 sugeriu ser esta região um alvo importante para os autoanticorpos na ITP crónica. Para estabelecer que a porção da molécula GPIIla que continha estas sequências era necessária para o reconhecimento dos auto-anticorpos, comparou-se a ligação dos auto-anticorpos à GPIIb/IIIa obtida das células de hamster chinês que expressam o complexo GPIIb/IIIa recombinante, humana, intacta (células A5), ou o complexo GPIIb/IIIa a que falta a região que contém os péptidos 8 e 9 (células IIj-,03 728). Em 10 dos 13 pacientes com ITP crónica, mais do que 75% da ligação a GPIIb/IIIa era dependente da presença do suposto domínio citoplasmático que continha os péptidos 8 e 9 (Tabela 2). A ligação dos alo-anticorpos anti-PLAl [que se sabe serem devidos a um polimorfismo no domínio extracelular da molécula GPIIla (Newman, et al. , J. Clin. Invest.. 83:1778-1781, 1989)] às células A5 e 728 foi idêntica. Analogamente, o plasma de 3 dos 13 pacientes de ITP crónica (ITP-ll, -12 e -13) e de um

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-37paciente trombasténico com alo-anticorpos anti-GPIIb/IIIa deu uma ligação semelhante às células A5 e ΙΙ^β^ 728.

(Segue Tabela 2)

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Tabela 2

Ligação de Anticorpos Anti-plaquetas à GPIIb/IIIa Recombinante em Células de Hamster Chinês

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POR -391 ITP - púrpura trombocitopénia imunitária crónica; GZ-trombastenia de Glanzmann com alo-anticorpos anti-GPIIb/IIIa; PTP - púrpura pós-transfusão com alo-anticorpos anti-PlA-*² Tx - transfusão; preg-grávida; + paciente transfundido ou após gravidez; sem transfusão nem gravidez; ? dado não disponível ³ POS - positivo para anticorpo anti-péptido; NEG - negativo para anticorpo anti-péptido; P8 - péptido 8; P9 - péptido

9.

A5 - células de hamster chinês que expressam GPIIb/IIIa recombinante; II_b0₃ 728 - células de hamster chinês que expressam GPIIb/IIIa a que faltam os resíduos 728-762 da GPIIIa. Os dados expressam-se em cpm final, após subtracção da radioactividade ligada a células de controlo do hamster chinês.

de Ligação = (cpm de II*^ 728 menos cpm das células de controlo * cpm de A5 menos cpm das células de controlo) x x 100.

10. Discussão dos Resultados dos Exemplos 1-9

A maior parte dos auto-anticorpos antiplaquetas na ITP crónica estão dirigidos para a GPIIb/IIIa das plaquetas ou para o complexo GPIb/IX (McMillan et al., Blood. 70:1040-1045, 1987). Em muitos casos, os locais antigénicos do complexo GPIIb/IIIa estão localizados para a GPIIIa (Beardsley et al., J. Clin. Invest.. 74:1701-1707, 1984).

Neste estudo, mostrou-se que o plasma de 5 dos 13 pacientes escolhidos com ITP crónica, se liga aos péptidos sintéticos GPIIIa 8 (3 pacientes) ou 9 (2 pacientes). Estes dois péptidos em conjunto formam a maior parte da região do terminal carboxilo da GPIIIa que se presume ser o domínio citoplasmático. Dos 3 pacientes testados adicionalmente (ITP-1, -2 e -3), a ligação ao péptido sintético (P8 ou P9) foi completamente inibida pela

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-40pré-incubação do plasma com o péptido apropriado, o que mostra a especificidade da ligação do anticorpo e a sua reactividade com o antigénio não só sobre o suporte sólido como também em solução. Além disso, a ligação do anticorpo a cada péptido foi também completamente inibida pela pré-incubação com plaquetas lavadas ou com GPIIb/IIIa purificada, o que indica que os anticorpos antipéptido reagem com toda a molécula GPIIb/IIIa bem como a GPIIIa sobre a superfície da plaqueta.

A pré-incubação do plasma de 2 pacientes (ITP-1 e ITP-2) com péptido (P9) resultou em >80% de inibição da ligação do anticorpo às plaquetas e à GPIIb/IIIa de lisados de plaquetas, enquanto que o plasma tratado com P8 do paciente ITP-3 produziu menos do que 30% de inibição. A inibição do péptido se ligar à GPIIb/IIIa purificada por afinidade foi menos completa do que a observada quando se usa GPIIb/IIIa derivado de lisado de plaquetas, o que sugere que tenha ocorrido alguma alteração da molécula GPIIb/IIIa durante o procedimento de purificação ou que vestígios de contaminantes tenham interferido com o ensaio. Destes resultados concluímos que os anticorpos dirigidos contra a região do terminal carboxilo (P9) nos pacientes ITP-1 e ITP-2 compreendem o componente principal dos auto-anticorpos anti-GPIIb/IIIa do plasma, enquanto que os anticorpos para P8 no paciente ITP-3 representam uma porção minoritária dos auto-anticorpos circulantes, ou o epítopo fica dentro da região de sobreposição do P8 e P9, como é sugerido pela ligação deste anticorpo a P8 e a P9 (P8 > P9).

Para investigar melhor a ligação do auto-anticorpo à região do terminal carboxilo da GPIIIa, transfectaram-se células CHO com a GPIIb e com a molécula de GPIIIa sozinha ou com a molécula GPIIIa a que faltam os aminoácidos 728 e 762 (inclui os péptidos 8 e 9). Dez dos 13 plasmas com ITP crónica necessitaram da presença do domínio do terminal carboxilo para uma ligação máxima, incluindo todos os 5 pacientes com ligação aos péptidos 8 e 9, e 5 pacientes adicionais que não mostraram ligação aos péptidos. Parece provável que o plasma destes últimos 5 pacientes se ligue a outros epítopos do suposto domínio

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citoplasmático, ainda que seja possível que a ausência desta porção da molécula possa perturbar a conformação da restante molécula e impeça a ligação do anticorpo. Além de conformar a especificidade do epítopo em pacientes com anticorpo positivo em relação ao antipéptido, estes resultados proporcionam forte evidência de que a região do terminal carboxilo é uma área importante para estimular a formação de auto-anticorpos antiplaquetas em pacientes com ITP crónica. Obviamente há outras regiões antigénicas importantes tal como se pôs em evidência pela ligação igual dos outros auto-anticorpos ITP, bem como pelos alo-anticorpos para a GPIIb-Illa (anti-PlAl, que se sabe ligar-se à região do terminal amino da GPIIIa e anti-GPIIb/IIIa de um paciente trombasténico), tanto para as moléculas GPIIIa recombinantes intactas como para as truncadas.

Não se conhece o papel patogenético dos auto-anticorpos dirigidos contra a região do terminal carboxilo da GPIIIa. Uma vez que esta região é precedida pelo suposto domínio de transmembranar, ela é considerada citoplasmática e não deverá estar disponível para a ligação de anticorpos. Contudo, os nossos estudos em pacientes ITP-1 e -2 põem em evidência gue os auto-anticorpos dirigidos para região do terminal carboxilo são absorvidos pelas plaquetas lavadas e a ligação de auto-anticorpos a plaquetas lavadas pode ser inibida pelo péptido 9. Estes resultados sugerem que pelo menos uma porção do suposto domínio citoplasmático se expressa sobre a superfície das plaquetas lavadas. Se esta expressão está presente in vivo ou se reflecte meramente perturbações durante a lavagem de plaquetas, ainda está por determinar.

Há explicações alternativas para a presença de auto-anticorpos para o domínio citoplasmático em pacientes com ITP crónica. Os antigénios podem ser expressos no decurso da destruição das plaquetas pelos anticorpos contra os determinantes da superfície, o que resulta na formação de auto-anticorpos contra estes antigénios citoplásmicos. Em alternativa, uma vez que os supostos domínios citoplasmáticos de integrinas estão altamente conservadas entre espécies

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possível que a resposta imunitária a esta região da GPIIIa seja desencadeada pela exposição a uma sequência homóloga de um organismo inferior ou de uma célula que não a plaqueta. Finalmente, deve-se considerar a possibilidade de que os anticorpos contra o domínio citoplasmático nalguns destes pacientes, possam ser alo-anticorpos, ainda que isto não seja possível em pacientes ITP-1 e ITP-8 que não foram nem transfundidos nem estão grávidas (Tabela 2).

Em resumo, os presentes estudos mostram que os auto-anticorpos nalguns pacientes com ITP crónica se ligam ao suposto domínio citoplasmático da GPIIIa de plaqueta e que, em 2 dos pacientes, o anticorpo anti-P9 representou a porção principal dos auto-anticorpos anti-GPIIb/IIIa circulantes detectáveis. Ainda fica por determinar o papel deste tipo de auto-anticorpo na patogénese da ITP crónica.

11. Preparação de Proteínas de Fusão Contendo Polipéptidos

GPIIIa

Para caracterizar adicionalmente a região da GPIIIa importante para o reconhecimento de auto-anticorpos em anti-soros de pacientes com ITP, foram construídas proteínas de fusão contendo porções de GPIIIa fundidas a proteínas de ligação de maltose. Prepararam-se duas construções como proteínas de fusão de ligação de maltose: uma contendo os resíduos 1-200 da GPIIIa e uma outra contendo os resíduos 690-762 da GPIIIa.

Para esse fim, sintetizaram-se pares de iniciadores de oligonucleotídicos, contendo as referidas sequências de ADN da GPIIIa, usando a síntese clássica de oligonucleótidos, com comprimentos de cerca de 20-24 nucleótidos e incluindo sequências de reconhecimento de Xbal num iniciador e de Hindlll no outro iniciador do par. O primeiro par de iniciadores é usado numa reacção em cadeia de polimerase (PCR), como é já bem sabido para produzir uma molécula ADN alvo, flanqueada pelos locais de endonuclease de restrição indicados, que codifica a sequência de nucleótidos da GPIIIa indicada, que está na estrutura (”in

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POR

-43frame) com uma proteína de ligação de maltose (MBP) pré-seleccionada quando a molécula de ADN alvo é inserida num vector de expressão que codifica a MBP. o vector, pIH821 (New England Biolabs, Beverly, MA), expressa as sequências de codificação clonada da GPIIIa sob a forma de uma proteína de fusão com a MBP, quando o vector construído está em E. coli. O sistema de proteína de fusão MBP foi descrito por Maina et al., Gene. 74:365-373 (1988). 0 vector pIH821 coloca a proteína MBP e a proteína codificada pela inserção, numa configuração de fusão separada por um local de clivagem do Factor Xa. A proteína de fusão GPIIIA-MBP expressa pode ser purificada por afinidade numa coluna de amilose e a proteína de fusão purificada pode ser clivada usando Xa para libertar a porção GPIIIa da MBP.

A. Processo PCR para Clonar Fragmentos de GPIIIa

Um clone de ADNc de comprimento inteiro, codificando a

GPIIIa, foi fornecido por Dr. 0'Toole (The Scripps Research Institute, La Jolla, CA), e o clone e a sequência completa de nucleótidos estão descritos por 0'Toole et al., Blood. 74:14-18 (1989).

Uma mistura de reacção PCR foi preparada em tampão (pH 8,3) contendo KC1 50 mM, Tris-Cl 10 mM, MgCl₂ 1,5 mM, dois iniciadores oligonucleotídicos (1 μΜ), correspondentes às cadeias de com sentido e anti-sentido de Fn nas posições correspondentes aos resíduos 690-762, uma mistura de quatro dNTP (200 μΜ cada), ADNc molde de GPIIIa (10-100 ng em Tris-Cl 10 mM, pH 7,6; EDTA 0,1 mM, pH 8,0) e Taq-polimerase (2 unidades). A mistura foi coberta com óleo mineral e realizou-se a amplificação num DNA Thermal Cycler programado para permitir a desnaturação a 94°C, tempera a 50°C e a extensão da cadeia a 72^eC. Os tempos de desnaturação, têmpera e de polimerização para o primeiro ciclo, ciclos intermédios e ciclos finais, foram respectivamente os seguintes: desnaturação (5, 1, 1 minuto), têmpera (2, 2 e 2 minutos) e polimerização (3, 3 e 10 minutos). Para produzir um produto de PCR a reacção foi repetida num total de 30 ciclos.

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POR

-44O produto de PCR foi analisado em geles de agarose a 1,2%, a banda contendo o fragmento correspondente a 690-762 foi excisada e o ADN recuperado por electro-eluição. O fragmento de ADN e o vector plasmídico pIH821 (New England Biolabs, Inc. Beverly, MA) foram preparados para a ligação por digestão com enzima de restrição. Em cada extremo do produto de PCR (fragmentos de ADN) incorporou-se um local diferente de reconhecimento por enzima de restrição, para assegurar uma orientação correcta ao vector. Depois da purificação do ADN, obteve-se a ligação por incubação de 100 ng do fragmento de ADN com 200 ng do vector do ADN em tampão BSA 0,1% - Tris-Cl 0,05M, pH 7,8, contendo ATP 1 mM, ditiotreitol 20 mM, MgCl₂ 5 mM, seguindo-se a adição de 1 unidade de ligase Bacteriofago T4. Para incorporar os plasmídeos contendo ADN no DH5a E. coli incubou-se uma alíquota da mistura de ligação (25-50 ng de ADN em 5 μΐ) com E. coli (0 DH5a foi tornado competente para a incorporação de ADN) durante 30 minutos em gelo, seguindo-se aquecimento a 42'C durante 90 segundos e depois arrefecimento em gelo durante 2 minutos. À mistura adicionaram-se 90 μΐ de glucose a 0,2% em meio SOB, seguido de incubação durante 45 minutos a 37°C. Depois espalharam-se 100-200 μΐ sobre água de top NYZ com ampicilina. As colónias resistentes à ampicilina, positivas, foram identificadas pela têmpera de fragmentos de PCR, marcados com ³²p, com levantamentos de nitrocelulose.

Para documentar a presença da inserção do fragmento de ADN GPIIIa, recolheram-se colónias positivas representativas e inocularam-se separadamente em 2 ml de meios NZY contendo ampicilina (100 gg/ml) e incubaram-se durante a noite, a 37°C. Centrifugou-se uma alíquota de 1,5 ml de cada e lisou-se a pelota em 100 μΐ de glucose 500 mM, EDTA 10 mM em Tris-Cl 0,025M, pH 8, adicionando sequencialmente: 200 μΐ de NaOH 0,2N, 1% de SDS-incubar 5 minutos? 150 μΐ KC1 3M, acetato 5M - incubar 5 minutos. Após centrifugação, o ADN sobrenadante foi purificado por extracção com fenol/clorofórmio e por precipitação por etanol, digestão com a(s) enzima(s) de restrição apropriada(s) e passagem em gel de agarose a 1,2%. As E. coli contendo os fragmentos de ADN mostraram bandas de tamanho esperado (proteína

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POR

de ligação maltose e fragmento de ADN). Escolheu-se, para uso posterior, a colónia de E. coli. contendo fragmentos de ADN correspondentes a 690-762 da GPIIIa, numa proteína de fusão MBP.

B. Purificação da Fusão GPIIIa-MBP

Alíquotas de 2 ml de culturas realizadas durante a noite de E. coli. contendo a inserção de ADN da GPIIIa 690-792 acima preparada, foram adicionadas a um ou mais balões de 2 1, contendo 500 ml de meio TY (10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levedura, 5 g/l de NaCl, 0,2% de D-glucose, 50 mg/1 de ampicilina) e o crescimento da cultura foi óptimo (abs. 600 de 0,4-0,5); juntaram-se 300 μΐ de indutor IPTG 500 mM [300 μΜ]ρ. Após 30-60 minutos de incubação, arrefeceram-se as células e centrifugaram-se durante 5 minutos a 15 000 x g a 4°C. As pelotas de células de cada cultura foram misturados e ressuspensos em 10 ml de tampão de lise por 500 ml de cultura [tampão de lise - tampão fosfato 5 mM, pH 7, contendo 0,25% de Tween-20, NaCl 30 mM, EDTA 10 mM, EGTA 10 mM e os seguintes inibidores de protease: Pepstatina A (2,5 ^g/ml). Quimostatina (2,5 ^g/ml), Leupeptina (10 μΜ), Benzamidina HC1 (10 mM), PMSF (2 mM) e Aprotinina (1,5-3 unidades)] e congelaram-se em banho de gelo seco/etanol. Imediatamente antes do uso, as células foram rapidamente descongeladas, juntaram-se 200 μg/ml de lisozima sólida e incubou-se a mistura em gelo durante 15 minutos. Após centrifugação durante 30 minutos, a 4°C, a 20 000 x g, o sobrenadante foi diluído a 1:4 com 0,25% Tween-20 em tampão de coluna (fosfato 0,005M, NaCl 500 mM, EDTA 2,5 mM, pH 7) contendo todos os inibidores de protease excepto a Quimostatina e a Pepstatina.

Purificação por Afinidade

A resina de amilose (New England Biolabs) usada de acordo com as instruções do fornecedor foi previamente entumescida e lavada em Tween-20 a 0,25% em tampão de coluna e depois misturada num lote com o lisado de células, seguindo-se uma incubação a 4°C, durante 45 minutos. Após 5 lavagens a 4°C com tampão de coluna/Tween a 0,25% e 5 lavagens com tampão de coluna sozinho, o produto da proteína de fusão de ligação de maltose foi eluído

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POR

do gel por incubação com um volume igual de maltose 10 mM em tampão de coluna durante 30 minutos, a 4°C. O eluído foi recolhido após remoção da resina por centrifugação lenta, obtendo-se a proteína de fusão GPIIIa-MBP.

Determinou-se a concentração da proteína e a massa molecular das bandas de proteína e avaliou-se por SDS-PAGE o grau de degradação. A presença de proteína de ligação de maltose e do fragmento GPIIIa foi comprovada por imunotransferência usando anticorpos apropriados.

As proteínas de fusão GPIIIa-MBP produzidas, contendo os resíduos 1-200 ou os resíduos 690-762, foram analisadas usando ligação directa num ensaio RIA, de acordo com o processo descrito no Exemplo 6A, com excepção de a proteína de fusão ter revestido as placas em lugar dos polipéptidos sintéticos. Pelo ensaio RIA, 4 plasmas de paciente com ITP que anteriormente mostraram imunorreagir com polipéptidos P9, identificando uma parte do domínio citoplasmático da GPIIIa, imunorreagiram com a proteína de fusão GPIIIa-MBP que continha os resíduos 690-762 de GPIIIa. No ensaio RIA, 2 anticorpos antigénio anti-PlAl imunorreagiram com a proteína de fusão GPIIIa-MBP que continha os resíduos 1-200 da GPIIIa, a qual continha o antigénio PIAI. Estes dados mostram que as proteínas de fusão GPIIIa-MBP acima produzidas contêm determinantes definidas como polipéptidos de GPIIIa que são imunorreactivos com anticorpos na forma de uma proteína de fusão. Assim, os dados identificam regiões adicionais definidas como polipéptidos de GPIIIa e, portanto, polipéptidos que são úteis no presente invento para detectar anticorpos anti-GPIIIa, nomeadamente os resíduos 1-200 e os resíduos 690-762 da GPIIIa.

Embora o presente invento tenha sido descrito em termos de certas concretizações preferidas e exemplificado nesses contextos, o perito na arte facilmente notará que podem ser feitas várias modificações, variações, omissões e substituições, sem afastamento do seu âmbito. Pretende-se portanto que o presente invento seja apenas limitado pelo âmbito das reivindicações seguintes.

Ί3 433

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POR -47(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:1:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 24 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Não (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:1:

Tyr His Asp Arg Lys Glu Phe Ala Lys Phe Glu Glu Glu Arg Ala Arg 15 10 15

Ala Lys Trp Asp Thr Ala Asn Asn (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:2:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 21 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Não (V) TIPO DE FRAGMENTO: terminal C (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2:

Ala Asn Asn Pro Leu Tyr Lys Glu Ala Thr Ser Thr Phe Thr Asn Ile 15 10 15

Thr Tyr Arg Gly Thr (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:3:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 45 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

433

SCR 0600P/SCRF 228.1

POR -48(iii) HIPOTÉTICA: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Não (v) TIPO DE FRAGMENTO: terminal C

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3:

Tyr

His

Asp

Arg

Lys

Glu

Phe

Ala

Lys

Phe

Glu

Glu

Glu

Arg

Ala

Arg

1

5

10

15

Ala

Lys

Trp

Asp

Thr

Ala

Asn

Asn

Ala

Asn

Asn

Pro

Leu

Tyr

Lys

Glu

20

25

30

Ala

Thr

Ser

Thr

Phe

Thr

Asn

Ile

Thr

Tyr

Arg

Gly

Thr

35

40

45

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:4:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 42 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Não (v) TIPO DE FRAGMENTO: terminal C (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4:

Ile His Asp Arg Lys Glu Phe Ala Lys Phe Glu Glu Glu Arg Ala Arg 15 10 15

Ala Lys Trp Asp Thr Ala Asn Asn Pro Leu Tyr Lys Glu Ala Thr Ser

25 30

Thr Phe Thr Asn Ile Thr Tyr Arg Gly Thr

40 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:5:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 73 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Não

433

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POR

-49(v) TIPO DE FRAGMENTO: terminal C

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA:

Gly	Pro	Asp	Ile	Leu	Vai	Vai	Leu
1				5
Leu	Thr	Gly	Leu	Ala	Ala	Leu	Leu
			20
His	Asp	Arg	Lys	Glu	Phe	Ala	Lys
		35					40
Lys	Trp	Asp	Thr	Ala	Asn	Asn	Pro
	50					55
Phe	Thr	Asn	Ile	Thr	Tyr	Arg	Gly
65					70

SEQ ID NO:5:
Leu	Ser	Vai Met	Gly	Ala	Ile	Leu
	10				15
Ile	Trp	Lys Leu	Leu	Ile	Thr	Ile
25				30
Phe	Glu	Glu Glu	Arg	Ala	Arg	Ala
			45
Leu	Tyr	Lys Glu	Ala	Thr	Ser	Thr
		60

Thr (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:6:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 26 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Não (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (ix) CARACTERÍSTICAS:

(A) NOME/CHAVE: Região (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= Xaa representa um segmento espaçador que pode estar ou não presente e cuja sequência pode diferir de cada vez que é usado.

(ix) CARACTERÍSTICAS:

(A) NOME/CHAVE: Região (B) LOCALIZAÇÃO: 26 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= Xaa representa um segmento espaçador que pode estar ou não presente e cuja sequência pode diferir de cada vez que é

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POR

-50usado.

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6:

Xaa Tyr His Asp Arg Lys Glu Phe Ala Lys Phe Glu Glu Glu Arg Ala 15 10 15

Arg Ala Lys Trp Asp Thr Ala Asn Asn Xaa

25 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:7:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 23 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Não (v) TIPO DE FRAGMENTO: terminal C (ÍX) CARACTERÍSTICAS:

(A) NOME/CHAVE: Região (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= Xaa representa um segmento espaçador que pode estar ou não presente e cuja sequência pode diferir de cada vez que é usado.

(ix) CARACTERISTICAS:

(A) NOME/CHAVE: Região (B) LOCALIZAÇÃO: 23 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= Xaa representa um segmento espaçador que pode estar ou não presente e cuja sequência pode diferir de cada vez que é usado.

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7:

Xaa Ala Asn Asn Pro Leu Tyr Lys Glu Ala Thr Ser Thr Phe Thr Asn 15 10

Ile Thr Tyr Arg Gly Thr Xaa 20

433

SCR 0600P/SCRF 228.1

POR -51(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:8:

(í) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 44 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: Não (ÍV) ANTI-SENTIDO: Não (V) TIPO DE FRAGMENTO: terminal C

(ix) CARACTERÍSTICAS:

(A) NOME/CHAVE: Região (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= Xaa representa um segmento espaçador que pode estar ou não presente e cuja sequência pode diferir de cada vez que é usado”.

(IX) CARACTERÍSTICAS:

(A) NOME/CHAVE: Região (B) LOCALIZAÇÃO: 44 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= Xaa representa um segmento espaçador que pode estar ou não presente e cuja sequência pode diferir de cada vez que é usado.

Xaa

Arg

Ser

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA:	SEQ ID NO:8:
Tyr His Asp Arg Lys Glu Phe	Ala Lys Phe Glu
5	10
Ala Lys Trp Asp Thr Ala Asn	Asn Pro Leu Tyr
20	25
Thr Phe Thr Asn Ile Thr Tyr	Arg Gly Thr Xaa
35 40

Glu Arg Ala 15

Glu Ala Thr 30 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:9:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 75 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido

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POR

-52(D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Não (v) TIPO DE FRAGMENTO: terminal C (ix) CARACTERÍSTICAS:

(A) NOME/CHAVE: Região (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= Xaa representa um segmento espaçador que pode estar ou não presente e cuja sequência pode diferir de cada vez que é usado.

(ix) CARACTERÍSTICAS:

(A) NOME/CHAVE: Região (B) LOCALIZAÇÃO: 75 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= Xaa representa um segmento espaçador que pode estar ou não presente e cuja sequência pode diferir de cada vez gue é usado.

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:9:

Xaa

Gly

Pro

Asp

Ile

Leu

Vai

Vai

Leu

Leu

Ser

Vai

Met

Gly

Ala

Ile

1

5

10

15

Leu

Leu

Thr

Gly

Leu

Ala

Ala

Leu

Leu

Ile

Trp

Lys

Leu

Leu

Ile

Thr

20

25

30

Ile

His

Asp

Arg

Lys

Glu

Phe

Ala

Lys

Phe

Glu

Glu

Glu

Arg

Ala

Arg

35

40

45

Ala

Lys

Trp

Asp

Thr

Ala

Asn

Asn

Pro

Leu

Tyr

Lys

Glu

Ala

Thr

Ser

50

55

60

Thr

Phe

Thr

Asn

Ile

Thr

Tyr

Arg

Gly

Thr

Xaa

65

70

75

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:10:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: ll aminoãcidos (B) TIPO: aminoácido

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POR

-53— '(h(D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Não (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:10: Arg Pro Asp Asp Ser Lys Asn Phe Ser Ile Gin 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:11:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Não (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:11; Met Asp Leu Ser Tyr Ser Met Lys Asp Asp Leu 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:12:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Não (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:12: Gly Ala Phe Vai Asp Lys Pro Vai Ser Pro Tyr Met 1 5

433

SCR 0600P/SCRF 228.1

POR -54(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:13:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Não (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:13:

Glu Ala Lys Vai Arg Gly Cys Pro Gin Glu Lys Glu Lys Ser Phe Thr 15 10 15

Ile Lys (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:14:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Não (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:14:

Thr Thr Arg Thr Asp Thr Cys Met Ser Ser Asn Gly Leu 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:15:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 19 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Não (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno

433

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POR

-55(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:15:

Arg Asp Glu Ile Glu Ser Vai Lys Glu Leu Lys Asp Thr Gly Lys Asp 15 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:16:

(í) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: NãO (ÍV) ANTI-SENTIDO: Não (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:16:

Tyr Tyr Glu Asp Ser Ser Gly Lys Ser Ile Leu Tyr 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:17:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: Não (ÍV) ANTI-SENTIDO: Não (V) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:17: Ala Arg Ala Lys Trp Asp Thr Vai Arg Asp Gly Ala

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Claims (6)

1. REIVINDICAÇÕES

   1 - Processo de preparação de um polipéptido possuindo uma sequência de resíduos de aminoácido com menos de cerca de 120 resíduos e incluindo uma sequência de resíduos de aminoácido correspondendo a uma fórmula seleccionada de entre o grupo consistindo em

   Tyr-His-Asp-Arg-Lys-Glu-Phe-Ala-Lys-Phe-GluGlu-Glu-Arg-Ala-Arg-Ala-Lys-Trp-Asp-Thr-AlaAsn-Asn (SEQ ID NO 1) ;

   Ala-Asn-Asn-Pro-Leu-Tyr-Lys-Glu-Ala-Thr-SerThr-Phe-Thr-Asn-Ile-Thr-Tyr-Arg-Gly-Thr (SEQ ID NO 2);

   Ile-His-Asp-Arg-Lys-Glu-Phe-Ala-Lys-Phe-GluGlu-Glu-Arg-Ala-Arg-Ala-Lys-Trp-Asp-Thr-AlaAsn-Asn-Pro-Leu-Tyr-Lys-Glu-Ala-Thr-Ser-ThrPhe-Thr-Asn-Ile-Thr-Tyr-Arg-Gly-Thr (SEQ ID NO 4); e

   Gly-Pro-Asp-Ile-Leu-Val-Val-Leu-Leu-Ser-ValMet-Gly-Ala-Ile-Leu-Leu-Thr-Gly-Leu-Ala-AlaLeu-Leu-Ile-Trp-Lys-Leu-Leu-Ile-Thr-Ile-HisAsp-Arg-Lys-Glu-Phe-Ala-Lys-Phe-Glu-Glu-GluArg-Ala-Arg-Ala-Lys-Trp-Asp-Thr-Ala-Asn-AsnPro-Leu-Tyr-Lys-Glu-Ala-Thr-Ser-Thr-Phe-ThrAsn-Ile-Thr-Tyr-Arg-Gly-Thr (SEQ ID NO 5).

   caracterizado por se proceder a uma síntese por técnicas de ácidos nucleicos recombinantes ou a uma síntese química em fase sólida por adição sequencial de um ou mais resíduos de aminoácido ou resíduos de aminoácido adequadamente protegidos a uma cadeia polipeptídica em crescimento, sobre uma matriz.
2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polipéptido estar fixado numa matriz sólida.

   73 433

   SCR 0600P/SCRF 228.1

   POR -57-
3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polipéptido preparado consistir essencialmente numa sequência de resíduos de aminoácido correspondendo a uma fórmula seleccionada de entre o grupo consistindo em

   Tyr-His-Asp-Arg-Lys-Glu-Phe-Ala-Lys-Phe-GluGlu-Glu-Arg-Ala-Arg-Ala-Lys-Trp-Asp-Thr-AlaAsn-Asn (SEQ ID NO 1);

   Ala-Asn-Asn-Pro-Leu-Tyr-Lys-Glu-Ala-Thr-SerThr-Phe-Thr-Asn-Ile-Thr-Tyr-Arg-Gly-Thr (SEQ ID NO 2);

   Tyr-His-Asp-Arg-Lys-Glu-Phe-Ala-Lys-Phe-GluGlu-Glu-Arg-Ala-Arg-Ala-Lys-Trp-Asp-Thr-AlaAsn-Asn-Ala-Asn-Asn-Pro-Leu-Tyr-Lys-Glu-AlaThr-Ser-Thr-Phe-Thr-Asn-Ile-Thr-Tyr-Arg-GlyThr (SEQ ID NO 3);

   Ile-His-Asp-Arg-Lys-Glu-Phe-Ala-Lys-Phe-GluGlu-Glu-Arg-Ala-Arg-Ala-Lys-Trp-Asp-Thr-AlaAsn-Asn-Pro-Leu-Tyr-Lys-Glu-Ala-Thr-Ser-ThrPhe-Thr-Asn-Ile-Thr-Tyr-Arg-Gly-Thr (SEQ ID NO 4); e

   Gly-Pro-Asp-Ile-Leu-Val-Val-Leu-Leu-Ser-ValMet-Gly-Ala-Ile-Leu-Leu-Thr-Gly-Leu-Ala-AlaLeu-Leu-Ile-Trp-Lys-Leu-Leu-Ile-Thr-Ile-HisAsp-Arg-Lys-Glu-Phe-Ala-Lys-Phe-Glu-Glu-GluArg-Ala-Arg-Ala-Lys-Trp-Asp-Thr-Ala-Asn-AsnPro-Leu-Tyr-Lys-Glu-Ala-Thr-Ser-Thr-Phe-ThrAsn-Ile-Thr-Tyr-Arg-Gly-Thr (SEQ ID NO 5).
4. 4 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o polipéptido estar fixado numa matriz sólida.
5. 5 - Processo de determinação da presença de auto-anticorpos anti-GPIIIa numa amostra de fluido vascular, sendo os referidos auto-anticorpos indicadores de uma púrpura trombocitopénica imunológica crónica num paciente, caracterizado por compreender:

   (a) misturar uma amostra de fluido vascular de um paciente com um polipéptido preparado de acordo com a reivindicação 1,

   73 433

   SCR 0600P/SCRF 228.1

   POR

   -58para formar uma mistura de imunorreacção;

   (b) manter a referida mistura sob condições de ensaio biológico, durante um período de tempo suficiente para formar um produto de imunorreacção contendo o referido polipéptido;

   (c) determinar a presença do referido produto de imunorreacção e, deste modo, a presença dos referidos auto-anticorpos anti-GPIIIa.
6. 6 - Processo de produção de um conjunto de diagnóstico para a determinação da presença de auto-anticorpos anti-GPIIIa numa amostra de fluido vascular, caracterizado por se embalar, em separado, como um reagente, uma quantidade de um polipéptido, preparado de acordo com a reivindicação 1, suficiente para pelo menos um ensaio, e opcionalmente um suporte sólido e/ou um segundo anticorpo e/ou um anticorpo anti-polipéptido, embalados também separadamente.