PT99126B

PT99126B - Metodo para a avaliacao do grau de afinidade ou diversidade genetica de arvores e um programa de reproducao comercial, aplicando a tecnologia do polimorfismo de comprimento do fragmento de restricao (pcfr)

Info

Publication number: PT99126B
Application number: PT99126A
Authority: PT
Inventors: Graham Albert Read; Martin Richard Ward
Original assignee: Cambridge Advanced Tech
Priority date: 1990-10-01
Filing date: 1991-09-30
Publication date: 1999-03-31
Also published as: FI914602A; EP0483514A1; BR9104290A; JPH0591824A; AU8479991A; IL99615A0; NZ239998A; PT99126A; DE69132458D1; AU643071B2; OA09395A; CA2052564A1; ZA917626B; ES2152212T3; MX9101393A; GB9021342D0; EP0483514B1; FI914602A0

Description

MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DE ÁRVORES MEDIANTE UTILIZAÇÃO

DE MARCADORES MOLECULARES

A utilização potencial de marcadores moleculares em sil. vicultura tem sido intensamente discutida (Burr et al., 1983) ; Tanksley, 1983; Beckmann e Soller, (1986) e no que diz respeito a diversas culturas anuais, tais como as de milho (Helentjaris et al., 1986), tomateiros (Bernatzky e Tanksley, 1986; Helentjaris et al., 1986), alface (Landry et al., 1987) e arroz (McCouch et al., 1988), foram construídos cartogramas cromossómicos recorrendo ãs técnicas de Polimorfismo do Comprimento do Fragmento de Restrição (PCFR) e isoenzimas locais. Esses cartogramas e/ou as sondas moleculares associadas (Patente de invenção WO 84/04758; Patente de invenção WO 89/07647; patente de invenção europeia n° 242062) têm sido utilizados para identificar e consequentemente proteger linhas ou variedades inatas; pa ra criar caracteres quantitativos ou poligênicos; para selecção de caracteres específicos no isolamento de populações de sementeira; e para determinar relações filogenêticas entre gêneros e espécies.

A melhoria das espécies de árvores lenhosas apresenta problemas especiais (Zobel et Talbert, 1984) , entre os quais se salienta os germoplasmas fracamente caracterizados, uma restrição à análise da meia região sib de experiências progénicas a partir de cruzamentos aleatórios em pomares de frutos de sementes e uma qualidade variável das sementes de ano para ano.

Uma técnica que tem sido utilizada como tentativa para

-2superar alguns desses problemas consiste na análise de isozi mas. Esta técnica que tem sido utilizada para a determinação de afinidades genéticas das árvores como meio para avaliar o grau de citogâmia e consequentemente a qualidade po tencial dos lotes de semente (Adams, 1983). Contudo, este mé todo enferma do inconveniente que assenta no facto de embora as diferenças entre diagramas isozimáticos indiquem a existência de uma diferença real, a semelhança entre diagramas não im plica necessariamente uma semelhança genética global, uma vez que os marcadores isozimáticos únicos podem nem sempre estar presentes.

Uma área em que a tecnologia do PCFR tem sido aplicada a probelmas de silvicultura consiste na utilização da análise do fragmento de restrição de ADN de cloroplastos para determinar o grau de introgressão em lotes de sementes naturais de po pulações de duas espécies de abetos geograficamente sobrepostas (Szmidt, 1988). Todavia, esta abordagem está limitada pelo facto de avaliar apenas uma pequena parte do genoma que pode não reflectir adequadamente a diversidade ao nível das espé cies.

Estudou-se também a utilização do ADN genómico total para a descrição genética de populações naturais de duas ou três espécies e dos seus híbridos interespecíficos recorrendo à tecnologia do PCFR (Keim et al., 1989) .

Constitui um objectivo da presente invenção proporcionar um método que permita seleccionar árvores tomando como base não só as características fenotípicas mas também a diversidade genética. Isto permite ao silvicultor elaborar programas de cruzamentos mais eficientes e garantir um máximo de diversi

dade genética nas suas populações cultivadas. Este facto pro porciona um ganho económico tomando como base uma maior proporção de árvores vigorosas de elevado rendimento produzidas a partir das sementes colhidas.

Em plantações silvícolas clonais a presente invenção pode ser utilizada para a selecção de clones tomando como base a sua diversidade genética e não apenas o seu comportamento.

A falta de diversidade em plantações clonais podem originar per das catastróficas provocadas por condições adversas que afectam todos os clones similares simultaneamente e com a mesma intensi. dade, ao passo que em plantações seleccionadas com base na diversidade genética esses riscos são reduzidos, uma vez que os clones realmente diferentes podem reagir de formas diferentes às condições adversas. Por exemplo, alguns clones podem ser re sistentes a pragas ou doenças e outros clones podem não ter resistência nenhuma. Em alguns países do mundo existem níveis definidos de diversidade, em termos de números de clones por unida de de superfície, que são obrigatórios para as plantações clonais. A presente invenção irá permitir a medição da diversidade sobre diferenças reais em vez da medição sobre números que podem eventualmente não ter qualquer significado no caso de todos os clones seleccionados terem antecedentes genéticos simila res.

A presente invenção tem também como objectivo proporcio nar o método para analisar a progénie produzida a partir de um programa de cruzamento. Num programa de cruzamento aleatório, por exemplo, conforme sucede no caso dos pomares de frutos de semente, as sementes colhidas a partir de árvores individuais serão provenientes de árvores maternas conhecidas mas de diver-4’ sas árvores paternas desconhecidas. É possível estimar a capa cidade geral de combinação a partir de experiências progénicas com essas famílias de meia região sib mas não é possível obter qualquer medição da capacidade de combinação específica.

A presente invenção proporciona a identificação dos progenitores paternos mais prováveis das árvores individuais das famílias de meia região sib facilitando, consequentemente, uma análise mais completa das famílias de região sib total, o que pode permitir avaliar as capacidades de combinação específicas das árvores num pomar de frutos de semente. Numa situação mais prá tica é possível proceder à identificação dos dois progenitores de indivíduos superiores no âmbito de experiências progénicas conseguindo-se, deste modo, informação útil para a selecção das árvores progenitoras para outros cruzamentos.

A fraca qualidade das sementes em termos de uma elevada proporção de sementes provenientes de poucas árvores (citogâmia) ou provenientes de muitas árvores com uma capacidade de combina ção geralmente fraca, pode reduzir bastante a viabilidade económica de uma exploração florestal. Além disso, as sementes co lhidas em pomares de frutos de semente podem ser de qualidade variável durante o período de vida produtivo de um pomar de fru tos de semente. Em pomares jovens de frutos de semente apenas alguns indivíduos precoces podem ser representados como progenitores polinizadores e mesmo em pomares maduros de frutos de semente a qualidade das sementes pode variar de ano para ano con soante as condições de floração. Um outro objectivo da presente invenção consiste em proporcionar um meio para avaliar a qua lidade das sementes em termos de número e identidade provável dos progenitores polinizadores representados num lote de semen-5tes colhidas num pomar de frutos de sementes.

A presente invenção constitui também uma vantagem em termos de cultivo de tipos de árvores comerciais, por exemplo, arvores de exploração florestal (por exemplo, Eucaliptos, Pinus, Picea e Populus), árvores perenes de plantações para colheitas de frutos (por exemplo, Elaeis, Cacao, Hevea e Musa) e árvores de fruto e árvores com semente do tipo da noz (por exemplo, Malus e Juglans).

De acordo com um seu primeiro aspecto, a presente invenção proporciona um método para cultivar árvores em que se aplica a tecnologia do Polimorfismo do Comprimento do Fragmento de Restrição (PCFR) a amostras de material vegetal provenien te de uma diversidade de árvores; a informação obtida com a tec noiogia do PCFR é apresentada segundo uma hierarquia de afinida de genética, sendo um determinado nível da referida hierarquia, por exemplo, o nível inferior, constituído por grupos, cada um dos quais associa duas das árvores pelo facto de haver maior afinidade genética entre elas do que entre qualquer uma delas e outra qualquer árvore em qualquer outro dos referidos grupos; selecciona-se assim duas das referidas árvores com diversidade genética relativa adequada; e depois ê possível obter mais uma ou várias árvores a partir das duas árvores seleccionadas.

É possível obter várias árvores com o cruzamento com o par de árvores seleccionadas. Em alternativa é possível obter outras árvores por clonagem de cada uma das duas árvores selecciodas.

Numa aplicação prática do primeiro aspecto da presente invenção com o objectivo de se obter descendência por cruzamento, executa-se a tecnologia do PCFR de modo a seleccionar-se

uma multiplicidade de pares de árvores progenitoras a partir das quais se obtém a descendência.

De acordo com um segundo aspecto, a presente invenção proporciona um método para utilização em silvicultura segundo o qual se aplica a tecnologia do PCFR ao material proveniente de uma árvore da descendência, ao material da árvore materna da referida árvore e descendente e ao material de uma diversidade de árvores que possam eventualmente ser árvores paternas em relação ã referida árvore descendente e os dados assim obtidos são submetidos a análise com o objectivo de determinar qual a árvore de entre as possíveis árvores paternas que mais provavelmente é a árvore paterna da referida árvore descendente. Este método pode ser utilizado em relação a uma multiplicidade de árvores maternas num grupo de árvores com o objectivo de obter informação e conhecimento sobre a capacidade de combinação especifica.

material vegetal ao qual se aplica a tecnologia PCFR é constituído adequadamente por material proveniente de folhas ou rebentos, de preferência material proveniente de rebentos ou folhas jovens. De preferência o ADN extraído para se lhe apli car a tecnologia do PCFR deve ser ADN genómico total.

De acordo com um terceiro aspecto, a presente invenção proporciona um método para utilização em silvicultura segundo o qual se aplica a tecnologia do PCFR às sementes de um lote de sementes utilizando-se depois os dados obtidos para se conseguir um critério de avaliação desse lote de sementes. 0 cri. tério de avaliação pode ser, por exemplo, o grau de citogâmia das árvores individuais ou a proporção de progenitores polinizadores potenciais representados nesse lote de sementes. 0 cri

tério de avaliação para esse lote de sementes pode ser compa rado com o mesmo critério aplicado a outro lote de sementes.

Descrição das Figuras

A Figura 1 mostra uma representação diagramática de um autorradiograma de ADN proveniente de 25 amostras de árvores que foram digeridas com endonuclease de restrição EcoR I e cuja son dagem foi efectuada com o vector de inserção proveniente do cio ne GLPP063. Esta sonda revelou um total de 30 fragmentos discretos nessas árvores particulares, mas revelou 32 fragmentos discretos em todas as árvores testadas.

[ O Quadro 1 mostra o alinhamento dos resultados do diagrama obtidos a partir do autorradigrama da Figura 1, lendo-se no sentido descendente do autorradigrama os diversos fragmentos desde os de maiores dimensões até aos de menor dimensões. Os dados especificados para cada amostra são constituídos por uma série de 32 dígitos binários].

A Figura 2 representa um dendrograma produzido por análises de agrupamento dos dados indicados no Quadro 1. É possível observar pequenos sub-grupos por serem agrupados conjuntamente como resultado de um maior grau de semelhança entre eles do que com outros membros da população que constitui a amostra no seu todo.

A Figura 3 representa o dendrograma produzido por análi se de agrupamentos dos resultados produzidos por vãrias sondas, (seis). As sequências binárias são concatenadas e lidas sob a forma de um grande conjunto de dados (118 dígitos). O agrupamento de sub-grupos é mais definido do que quando se utiliza uma

-8sonda única.

A Figura 4 representa o dendrograma produzido por anã lise de agrupamentos dos dados de impressões digitais (fingerprint) obtidas por seis sondas com fusão dos últimos seis agrupamentos para produzir 6 grupos genéticos.

Descrição pormenorizada do método preferencial

Preparação do ADN genómico.

Produtos de digestão genómica e electroforese em gel.

Manchas de Southern.

Bibliotecas de sondas.

Preparação de sondas.

Marcação de sondas.

Hibridação e autorradiografia.

Selecção de clones.

Classificação e análise das sequências (bandas)» Análise da diversidade.

Preparação do ADN Genómico

A preparação do ADN baseia-se numa modificação do método de Dellaporta et al., (1983). Utilizou-se amostras de ±0 g de cada uma das árvores candidatas de Eucalyptus globulus, de preferência constituídas por tecido de folhas jovens, as quais foram trituradas com pilão e almofariz em azoto líquido durante 3 minutos. Adicionou-se 5 g de polivinilpirrolidona e depois acrescentou-se 95 ml de tampão de extracção frio (EGTA 50 mM, acetato de magnésio, 60 mM, NaCl 500 mM, Tris-Cl 100 mM, DTT

mM e Pronase E a 50 jxg/ταΐ; pH 8,0) e depois adicionou-se 5 5 ml de SDS a 20%, misturando-se tudo muito bem após cada ad_i ção. Efectuou-se a extracção do ADN por incubação à tempera tura de 65°C durante 10 minutos. Adicionou-se 35 ml de aceta to de potássio 5 M e manteve-se o lisado em repouso em gelo durante 30 minutos. Após centrifugação a 11000 g durante 10 minutos filtrou-se o sobrenadante através de uma camada de Miracloth e adicionou-se 70 ml de propan-2-ol. Manteve-se a mistura ã temperatura de -20°C durante pelo menos 2 horas e de pois centrifugou-se a 12000 g durante 20 minutos. Drenou-se muito bem o granulado de ADN, preparou-se com ele nova suspensão em 700 yjl de Tris-Cl 50 mM/EDTA 10 mM, pH 8,0; e depois transferiu-se para um tubo de microcentrifugação. Os resíduos insolúveis foram removidospor centrifugação durante 2 minutos. Adicionou-se 500 jíl de propan-2-ol e 70 jil de acetato de amónio 10 M ao sobrenadante que depois foi mantido em repouso sobre neve carbónica durante 30 minutos. Preparou-se o granulado de ADN por centrifugação durante 10 minutos, drenou-se e preparou-se nova suspensão em 200 j\.l de TE (Tris-Cl lOmM, EDTA 1 mM; pH 8,0).

Produto de digestão genómica e electroforese em gel

Efectuou-se a digestão de restrição do ADN genómico com uma variedade de endonucleases de restrição sob condições e em tampões recomendados pelos fabricantes (Life Technologies).

Carregou-se 5yig de cada amostra de ADN digerido em gel de agarose a 0,8% em tampão TBE (Tris, 90 mM, ácido bórico, 90 mM, EDTA 2 mM). Carregou-se 400 ng de um vector de digestão Hind III

de ADN lambda no mesmo gel para desempenhar a função de padrão comparativo. Os produtos de digestão foram submetidos a electroforese durante a noite a cerca de 1,3v/cm.

Manchas de Southern

Todas as manchas foram preparadas por transferência ca pilar recorrendo a um procedimento similar ao de Southern (1975) conforme descrito por Sambrook et al., (1989a), com as modifica ções seguintes: i) a membrana de marcação utilizada foi uma membrana Biodyne B (0,45yim, nylon); ii) esta membrana não exige a neutralização do gel após o passo de desnaturação em meio alcalino; e iii) após a transferência a membrana foi cozida à temperatura de 80°C durante 30 minutos e depois foi lavada em solução 2xSSC (lxSSC significa NaCl 150 mM, acetato de sódio 15 mM; pH 7,2) , envolvida em mortalha de Saran e armazenada à tempera tura de -20°C durante o tempo necessário.

Biblioteca de Sondas

Todos os clones foram obtidos a partir de duas bibliotecas genómicas de E. globulus. 0 ADN genómico total de E. globulus foi preparado conforme descrito antes, restringido por Pst I e clonado no vector plasmídico pUC9. Os clones foram man tidos como culturas bacterianas em glicerol à temperatura de -80°C e quando foi necessário desenvolveram-se sobre agar L con tendo 100 Ug/ml de ampicilina.

Preparação da Sonda

Preparou-se a sonda de ADN por amplificação da Reacção da Cadeia da Polimerase (RCP) do vector de ADN genómico em cada clone plasmídico. Isto foi conseguido por suspensão de uma colónia bacteriana, que continha o clone seleccionado, directamente no tampão da RCP.

A amplificação do produto de inserção do clone foi efec tuada com Polimerase Taq em tampão fornecido pelo fabricante (Promega) e enriquecido com quatro desoxinucleótidos trifosfatos (dATP, dGTP, dCTP, dTTP; 200Jumole de cada um deles) e com dois iniciadores oligonucleotídicos (0/25yig por reacção) num volume de reacção de 50 jil contendo 0,25 unidade de Polimerase Taq. A incubação foi efectuada de acordo com o programa seguin te:

94°C

X

90

s,

40°C

X

10

s,

70°C

X

3

min;

1

ciclo

94°C

X

10

s,

40°C

X

10

s,

72°C

X

3

min;

9

ciclos

94°C

X

10

S,

40°C

X

10

S,

72°C

X

4

min;

10

ciclos

94°C

X

10

S,

40°C

X

10

S,

72°C

X

5

min;

10

ciclos

72°C

X

5 ]

min;

1 ciclo

Durante a RCP foram utilizados os iniciadores seguintes:

RFLP1 ATTACGCCAAGCTTGGCTGCA

RFLP2 TTCCCGGGGATCCGTCGA

Também se podia ter utilizado os iniciadores de Sequen ciação M13 e de Sequenciação Inversa para a RCP com todos os clones.

-12Após a RCP e a análise do gel os clones foram purificados por extracção com fenol/clorofórmio seguindo-se a preci pitação com etanol. Foi possível omitir o passo da extracção com fenol/clorofórmio sem quaisquer efeitos prejudiciais.

Após avaliação do ADN por fluorometria (fluorómetro Hoeffer) misturou-se 1 ng de ADN lambda com 50 ng de cada pro duto de inserção para realçar os padrões comparativos sobre as manchas genómicas.

Marcação da Sonda

As sondas de ADN foram radioidentificadas pelo método hexamérico aleatório de Feinberg e Vogelstein (1983, 1984) uti.

lizando um estojo de marcação Pharmacia Oligonucleotíde LabeJL . 32 ling Kit. Utilizou-se 50yiCi de P-dATP para marcar 50 ng do ADN sonda. Após incubação durante 2 horas interrompeu-se a reacção e desnaturou-se a sonda por adição de 200jul de ãgua e manteve-se em ebulição durante 3 minutos. A sonda foi depois colocada imediatamente sobre gelo e adicionou-se à solução de hibridação decorridos 10 minutos.

Hibridação e Autorradiografia

A mancha genómica que se pretendia hibridar foi pré-lavada com 2xSSC e depois foi lavada com Triton X-100 a 1% e finalmente lavou-se com uma solução prê-hibridação (adiante descrita em pormenor). Tosas as soluções foram pré-aquecidas à temperatura de 55°C. Colocou-se depois a membrana em frascos de hibridação contendo 50 a 100 ml de solução de pré-hi-

bridação (5xSSC, Tris-Cl 50 mM, EDTA 5 mM, 0,2% de BSA, 0,2% de Ficoll 400000, 0,2% de polivinilpirrolidona, 0,1% de SDS, 0,1% de pirofosfato de sódio, 0,05% de Blotto; pH 7,5) e procedeu-se a sua mcubaçao a temperatura de 55 C em estufa gi ratória (Hybaid) durante pelo menos 5 horas (normalmente duran te a noite).

Eliminou-se a solução de pré-hibridação e adicionou-se 20 ml de solução recente (pré-aquecida à temperatura de 55°C). Depois adicionou-se a sonda desnaturada, substituiu-se o frasco na estufa de hibridação e procedeu-se ã incubação à temperatura de 55°C durante um intervalo de tempo determinado pelas dimensões das sondas e calculado para o intervalo 1-3 x x cot 1/2.

Apõs a hibridação a membrana foi lavada à temperatura de 55°C, em banho-maria, com agitação, sequencialmente com as 3 soluções seguintes: i) 1 litro de 2xSSC/0,2% de SDS durante 1 hora, ii) 1 litro de 0,5xSSC/0,2% de SDS durante 1 hora, iii) 1 litro de 0,2xSSC/0,2% de SDS durante 30 minutos. Depois cobriu-se a membrana com mortalha de Saran e efectuou-se a au torradiografia conforme descrito por Sambrook et al.(1989b).

Após a autorradiografia removeu-se a membrana para no va sondagem por incubação, com agitação, nas soluções seguintes: i) NaOH 0,4M , à temperatura de 45°C durante um interva lo de tempo compreendido entre 30 e 45 minutos, ii) 0,lxSSC/0,l% de SDS ã temperatura ambiente durante 15 minutos, iii) Tris-HCl 0,2 M; pH 7,4, à temperatura ambiente durante 15 minutos. Depois cobriu-se a membrana com mortalha Saran e armazenou-se à tempera tura de -20°C para voltar a utilizar.

-14Selecção dos Clones

Procedeu-se à hibridação de clones provenientes de bi^ bliotecas de E. globulus, contra manchas de Southern de ADN ge nómico restringido, proveniente de um pequeno número de origens, designadamente das espécies Eucalyptus, híbridos inter específicos e E. globulos. Os clones que exibiram o mais ele vado grau de discriminação entre essas amostras, quer individual quer conjungadamente, foram seleccionados para utilização na análise subsequente de um conjunto mais amplo de proveniências E. globulus.

Classificação e análise das sequências (bandas)

Ao fazer-se a revelação dos autorradiogramas, os fragmentos hibridantes (bandas) presentes e provenientes de cada ADN genómico foram classificados conforme se indica a seguir.

As posições de todas a s bandas de cada autorradiograma (ou de cada conjunto de autorradiograma, no caso de terem sido hi bridadas várias membranas com a mesma sonda) foram localizadas tomando como referência os padrões de comparação do ADN lambda. Cada ADN genómico foi depois classificado em função da presença ou da ausência de cada uma dessas bandas sendo os resultados registados como 1 (presença) ou 0 (ausência). 0 diagrama de bandas para cada ADN genómico (e consequentemente pa ra cada árvore) foi descrito por uma série de dígitos binários, por exemplo, a sequência digital 10010111001 pode eventualmen te descrever um ADN genómico que exiba 6 fragmentos hibridantes para uma sonda que revelou um total de 11 fragmentos distintos em cada conjunto de ADNs (árvores) cuja pesquisa foi efectua da por este processo.

É possivel combinar os dados obtidos com diversas son das encadeando as sequências binárias de cada sonda/autorradiograma subsequente para proporcionar uma série mais longa de dígitos. Não se fez nenhuma tentativa de ponderação dos resul tados obtidos de modo a reflectir as diferentes intensidades das bandas ou de modo a reflectir o facto de as diversas sondas revelarem a presença de diferentes números de bandas. Ao fazer-se a comparação de grupos de árvores, os resultados provenientes de todos os fragmentos possíveis foram classificados incluindo as bandas comuns (presentes em todos os casos) e as bandas ausentes nos autorradiogramas individuais mas que foram encontradas no grupo (de árvores) noutros autorradiogramas. Is to permitiu garantir que o diagrama relativo aos fragmentos de uma árvore individual foi sempre o mesmo independentemente do facto de quaisquer outras árvores estarem incluídas no autorra diograma. Este facto permitiu garantir que o grau de semelhan ça entre quaisquer duas árvores assumiu o mesmo valor independentemente de quaisquer outras árvores que estivessem também em análise.

Deste modo, é possível construir uma impressão digital genética (genetic fingerprint) para cada árvore utilizando os diagramas de fragmentos obtidos com diversas sondas.

Análise da Diversidade

Com o auxílio de um computador estabeleceu-se uma matriz de semelhanças utilizando coeficientes de semelhança,

-16tais como o Coeficiente de Jaccard (Sokal e Sneath, 1963), o qual utiliza o número de bandas de cruzamento entre quaisquer duas amostras divididas pelo número total de cruzamentos e de bandas únicas presentes nas duas amostras. Esses coeficientes podem ser utilizados depois num algoritmo, por exemplo, Unweighted Pair Group.-Arithmetic Average Clustering Method (UPGMA) ou Ward’s Method (Wishart, 1987) para agrupar conjuntamente as amostras de maior semelhança em dendrogramas ou noutras repre sentações gráficas.

A título de xemplo refere-se agora a utilização dessas impressões digitais genéticas para medir a diversidade genética numa população florestal com fins comerciais.

EXEMPLO

Extraíu-se ADN de 92 árvores seleccionadas aleatoriamente numa experiência efectuada com E. globulus em que era co nhecida a origem das sementes, num programa de exploração comer ciai. Utilizou-se material proveniente de sementes recolhidas em 32 locais nos estados australianos de Victória e Tasmãnia e suas ilhas adjacentes. As impressões digitais genéticas foram produzidas com 14 sondas seleccionadas para cada árvore conforme descrito antes. As matrizes de semelhança, utilizando o Coeficiente de Semelhança de Jaccard, foram calculadas e foram preparados dendrogramas utilizando o método de Ward para son das individuais (na Figura 1 e no Quadro 1 mostra-se, respectivamente, um exemplo do autorradiograma de 25 árvores sondadas com uma única sonda, GLPP063 e a impressão genética sob a forma de presença ou ausência de bandas). As impressões digitais genéticas obtidas com as sondas mais descriminatórias foram de pois combinadas sequencialmente e procedeu-se ao cálculo de novas matrizes de semelhança. Logo que foram conseguidos agrupamentos estáveis (Figura 3) , o que no caso vertente sucedeu com 6 sondas, procedeu-se ao agrupamento dos grupos principais (Figura 4). As seis sondas foram GLPP011; GLPP029; GLPP063;

GLPP093; P002 e P022. De cada uma destas seis sondas, acolhidas em E. coli , depositou-se uma amostra ao abrigo do Tratado de Budapeste, no Depósito de Reconhecimento Internacional de Microrganismos para efeitos de procedimento de registo de pa tente de invenção, na National Coleection of Industrial and Marine Bactéria, Aberden, Escócia, a 17 de ]setembro de 1991, sob os respectivos números de registo NCIMB 40444, NCIMB 40443; NCIMB 40442; NCIMB 40441; NCIMB 40446 e NCIMB 40445.

Neste xemplo, as árvores dos Grupos 2 e 3 na sua globalidade mostraram-se mais dissemelhantes, isto é, geneticamente diferentes quando comparadas com árvores dos Grupos 1, 6, 4 e 5 e no âmbito deste último agrupamento as árvores dos Grupos 1 e 6 apresentaram-se geneticamente mais diferentes do que as ãr vores dos Grupos 4 e 5.

Pode verificar-se a partir do Quadro 2 que os Grupos 2 e 3 eram constituídos apenas por material proveniente do estado de Victória e que nenhuma dessas origens ficou dividida entre os dois grupos, de tal modo que o Grupo 2 englobou 20 árvores de 4 origens distintas e o grupo 3 englobou 24 árvores de 8 origens. A classificação para os Grupos 1, 6, 4 e 5 não foi tão clara mas globalmente esses 4 grupos englobaram material proveniente da Ta_s mania e os Grupos 1 e 6 formaram um conjunto com 25 árvores pro venientes de 12 origens da Tasmânia e os Grupos 4 e 5 formaram

-18outro conjunto com 16 árvores provenientes de 4 origens da Ta_s mânia. Apenas uma origem da Tasmânia (T 08) proporcionou árvo res para esses dois conjuntos. Todavia houve 4 origens de Victória nesses dois conjuntos, uma das quais (V 03) foi repre sentada por 4 árvores que sugeriu fortemente uma origem não usual para esta proveniência particular.

A discriminação entre as proveniências Tasmaniana e Vic toriana não foi surpreendente mas o grau de discriminação de proveniências contidas nessas duas regiões geográficas foi real, mente surpreendente. 0 que é mais extradordinãrio ê que este tipo de informação sobre a diversidade genética pode ser utilã. zado pelos silvicultores para organizaremm os seus germoplasmas e para lhes permitir uma decisão sobre quais os cruzamentos a efectuar ou quais os clones a seleccionar. O cruzamento entre árvores dos Grupos 1, 6, 4 e 5 e árvores dos Grupos 2 e 3 poderia criar uma base genética alargada e os cruzamentos no interior dos mesmos grupos poderiam reduzir significativamente a di. versidade genética. De modo idêntico, os clones seleccionados em todos os grupos diferentes poderiam seleccionar uma diversidade genética mais ampla de material florestal do que os clones seleccionados no interior de um grupo.

Estes conceitos também podem ser utilizados para a medi_ ção da diversidade genética em populações naturais como meio pa ra decidir quais as áreas que contêm as populações mais diversas ou para decidir quais os genótipos particulares que devem ser con servados.

REFERBNCIAS

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-21-ί

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-2.

QUADRO 1 ’ t

Impressões digitais genéticas sob a forma de presença (1) ou ausência (0) de bandas obtidas com uma sonda GLPP063 para 25 árvores provenientes da Tasmãnia e de Victória.

V14 00000100010010000000000000000000

V14 0000000000001 0101 010001 010000000

V07	10000000000010001000001000000000
V07	00000000010010101000011000000000
V07	0001 00101 1 101 0001 00001 1000000í00
_V07	00000001000011011100011000110100
V07	00000000011010001000011000000000
V07	00000011000010101000001011000000
V11	00000000000010101000011000000000
V11	00000100010110001000011100001000
V06	01000011000110001111001000000000
V06	0000000000001 01 01 000001000000000
V16	00000110111010001000011000000000
V16	00000101010010001001111000000000
V03	00001010111011001000111000000000
V03	00000000011010001000000000000000
V03	00000100010011001001001000000000
V03	00000011010010101000001000001110
T06	00000010010010001001011000001000
T06	00000000010010101000001000000000
T06	0000010001 001 0001 00001 1000001 000
T09	0000001001 001 01 01 10101 1 01 0001 000
T09	00000011001010001100001000000000

-2/QUADRO 2

Distribuição de árvores em 6 grupos de E. globulus provenientes da Tasmânia (T 01 - T 15) e provenientes de Victória (V 01 - V 17).

T

V

01	T	01	T	05	T	05	V	07	V	01
03	T	02	T	06	T	05	V	07	V	02
03	T	04	T	06	T	05	V	07	V	04
04	T	08	T	06	T	05	V	07	V	04
04	T	11	T	06	T	05	V	07	V	04
09	T	12	T	06	T	05	V	07	V	04
09	T	12	T	07	T	08	V	07	V	04
09	T	12	T	07			V	11	V	04
10	T	12	T	07			V	11	V	04
11	T	13	V	03			V	1 1	V	06
1 4	T	15	V	03			V	11	V	06
1 5	T	15	V	03			V	11	V	06
15			V	03			V	11	V	06
12			V	05			V	11	V	08
1 4							V	11	V	08
							V	11	V	08
							V	11	V	09
							V	1 4	V	09
							V	14	V	16
							V	15	V	16

V 16

QUADRO 2 (Continuação)

V 16

V 17

-u-

Claims

REIVINDICAÇÕES

1.- Método para a reprodução de árvores, caracteriza do pelo facto de se aplicar a tecnologia do Polimorfismo do Com primento do Fragmento de Restrição (PCFR) a amostras de material vegetal proveniente de diversas árvores, pelo facto de a informação obtida com essa tecnologia do PCFR ser apresentada segundo uma hierarquia de afinidade genética, havendo um nível nessa hierarquia constituído por grupos, estando cada grupo rela cionado com duas dessas árvores por serem mais geneticamente afins uma da outra do que qualquer das duas árvores é geneticamente afim com outra árvore em qualquer dos outros grupos referidos; pelo facto de serem seleccionadas duas dessas árvores de diversidade genética relativa apropriada; e ainda pelo facto de se obter(em) outra(s) árvore(s) a partir das duas árvores selec cionadas.
2. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se obter outra árvore por cruzamento das duas árvores seleccionadas.
3. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se obterem outras- árvores por clonagem de cada uma das duas árvores.
4. - Método de acordo com qualquer das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo facto de as árvores serem uma espécie comercial.
5. - Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de a referida espécie ser o eucalipto.
6. - Método de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de as amostras serem folhas
7. - Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de as amostras serem rebentos.
8. - Método para utilização na reprodução de árvores, caracterizado pelo facto de se aplicar a tecnologia do PCFR ao material de uma árvore da descendência, ao material de uma árvore mãe da referida árvore descendente., e ao material de várias árvores que eventualmente sejam as árvores paternais da re ferida árvore e pelo facto de os dados daí obtidos serem submetidos a análise com o objectivo de se determinar a árvore do grupo possível de árvores paternais que é a árvore paternal mais provável da árvore descendente.
9. - Método de acordo com a reivindicação 8, caracteri zado pelo facto de se aplicar a uma multiplicidade de árvores mãe num grupo determinado de árvores.
10. - Método para utilização na reprodução de árvores, caracterizado pelo facto de se aplicar a tecnologia do PCFR para plantar um rebento e pelo facto de os dados daí obtidos serem utilizados para proporcionar· um critério de avaliação do referido rebento.
11.- Método de acordo com a reivindicação 10, caracte rizado pelo facto de o critério de avaliação ser o grau de uniformidade das árvores individuais.
12. - Método de acordo com a reivindicação 10, caracte rizado pelo facto de o critério de avaliação ser a proporção de origens de pólen representadas no referido rebento.
13. - Método de acordo com a reivindicação 10, caracte rizado pelo facto de o critério de avaliação do referido rebento ser comparado com o mesmo critério estabelecido em relação a um segundo rebento.
14.- Método de acordo com uma qualquer das reivindica ções anteriores, caracterizado pelo facto de as sondas utilizadas na tecnologia do PCFR serem seleccionadas entre GLPP011; GLPP029;

GLPP063;