PT99031A - Processo para a introducao de adn estranho em celulas - Google Patents

Description

Descrição referente à patente de invenção de HOECHST JAPAN LIMITED, japonesa, industrial e comer ciai, estabelecida em 10-16, 8--ehome, Akasaka, Minatoku, Tokyo, Japão (inventores; Masahiro Satoh e Nobuhiro Tada, residentes no Japão) para "PROCESSO PARA A INTRODUÇÃO DE ADN ESTRANHO EM CÊLU LAS".

DESCRIÇÃO Âmbito da Invenção A presente invenção refere-se a um processo para a introdução de ADN estranho numa célula utilizando um composto susceptível de se ligar a um ADN de dupla hélice. Especi-ficamente,a invenção refere-se a um processo para a obtenção de um transformante, de uma célula transformada com um ADN estranho por ligação do ADN estranho ao composto para formar um complexo de ADN; composto e em seguida expôr-se uma célula de mamífero a uma suspensão ou solução contendo o complexo de ADN ; composto. Técnica Anterior Têm sido feitas numerosas tentativas para expr imir um ADN estranho numa célula hospedeira por introdução do A DN na célula de organismos superiores, especialmente células de animais. De facto, têm sido propostos vários processos para se obter um transformante, uma célula contendo um ADN estranho. Por exemplo, estes processos incluem um processo do fosfato de cálcio (Graham, F.L. e Van Der Eb., A.J. 1973, Virology 52:456-467) | um processo de DEAE dextrano (Farber, F., e col., 1975, Biochem. • Biophys. Acta.,390;298-311; Pagano, J.S., 1970, Prog. Med. Viro! 1

L2:l-48), um processo da poliornitina (Farber, F., e col., 1975, Biochem. Biophys. Acta.,390:298-311), um processo de microinjec ção de ADN (Cappechi, M.R., 1980, Cell./22:479-488), um processo de polietileno glicol (PEG)/ sulfóxido de dimetilo (SODM) (Jonak, Z.L., e col., 1984, Hybridoma 3:107-118), um processo de tripsina /EDTA/ glicerol (Chu, G.J. e Sharp, P.A., 1981, Gene 13:197-202), um processo de choque osmõtico (Okada, G.Y., e Rechsteiner M., 1982 Cell 29_: 33-41, um processo de fusão de li-possomas (Poste, G., e col., 1976, Methods. Cell. Biol., 14:33--71? Fraley, R. e col., 1980, J.Biol.Chem. 255? 10431-10435; Wong, T.K., e col.,1980, Gene 10;87-94), um processo mediado pe los glóbulos vermelhos de uma cobaia (Furusawa, M., e col.,1976, Methods. Cell. Biol., 14: 73-80; Strauss, S. e Raskas, H., 1980, J.Gen. Virol. 48_: 241-245; Godfrey, W., e col., 1983, Proc.Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80,-2267-2271), um processo de fusão de proto-plasto bacteriano (Chu, G.J. e Sharp, P.A., 1981, Gene 13:197--202; Sandri-Goldin, R.M., e col., 1981, Mol. Cell. Biol. 1:743--752; Oi, V.T., e Morrison, S.L., 1986, Biotechniques 4:214-221) um processo de envelope de virus Sendai reconstituído (Loyter, A., e col., 1984, Ciba. Found, Symp., 103:163-180), beamporaçao de laser (Tsuka Kosh|)M., e col., 1984, Apll. Phys. B.,35:2284--2289; Tao, W.f e col., 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 84: :4180-4181), um processo de electroporação (Neumann, E., e col. 1982; EMBO. J., 1:841-845? Potter, H., e col., 1984, Proc.,Natl, Acad. Aci. U.S.A. 81_: 7161-1765), um processo de microprojectil de tungsténio (Klein, T.M., e col., 1987, Nature 327:70-73) , um processo de vector de retrovírus (Jaenisch, R., 1976, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 73_:1260-1264: Jahner, D. e Jaenish, R., 1980, Nature 287:456-458).Cada um destes procedimentos i distin guido pelo seu próprio espectro de vantagens e desvantagens em relação â eficiência, toxicidade e especificidade; um processo utilizado para um certo tipo de células pode não poder ser utilizado para outro. O processo de fosfato de cálcio e o processo de DEAE dextrano são adequados para células fagõeitas, por exem pio fibroblastos e células L, embora estes métodos não sejam os mais adequados para as células fracamente fagõeitas, por exemplo, linfócitos (Lewis, W.L. e col., 1980, Somat. Cell. Genet. 6:333-348). 2

Estes processo utilizara uma alteração da membrana celular como por exemplo a destruição temporária de uma parte da membrana das células e uma maior permeabilidade da célula através de uma modificação celular ou uma endocitose da cê lula, com a excepção dos processos de microinjecção e do vector de vírus. Os processos são baseados nos seguintes mecanismos: logo que ê introduzido um ADN estranho numa célula, parte do ADN entra na região nuclear da célula por mero acaso. Em seguida, o ADN torna-se incorporado num cromossoma hospedeiro. Contu do, a eficiência da transformação destes processos ê bastante baixa, (por exemplo, aproximadamente 1/105). Pelo contrário, o processo da microinjecção, em que um ADN estranho ê directamen-te introduzido no núcleo da célula hospedeiro através de uma mi cropipeta, tem uma eficiência de transformação bastante elevada (por exemplo, aproximadamente 1/103 por célula) como descrito por Cappechi, M.R., 1980, Cell 22^479-488. Embora o processo da microinjecção proporcione uma elevada eficiência de transformação, o processo necessita de elevada capacidade e equipamento especial e não ê facilmente efectuado.

Problemas a serem resolvidos pela Invenção A presente invenção proporciona um processo fácil e eficaz para introduzir o ADN estranho em certas células que têm sido consideradas difíceis de serem transformadas por processos convencionais.

Meios para resolver os Problemas

Os presentes inventores verificaram que um cer to composto se liga especialmente a ADN e utilizaram com sucesso o composto como veículo para introduzir o ADN numa célula al vo: foi introduzido ADN estranho numa célula hospedeiro por exposição da célula hospedeiro a uma suspénsão ou solução contendo um complexo de ADN : composto em que o composto ê susceptível de se ligar a um ADN de dupla hélice. Especificamente o ADN estranho. ê ligado ao composto e é adicionada uma suspensão ou solução contendo o complexo de ADN: composto a uma cultura de células confluentes (por exemplo, linha de células CHO). A cultu- 3

ra de células ê em seguida incubada por várias horas numa condi ção selectiva. Apôs a incubação, foi verificado que se podia ob ter uma célula contendo o ADN estranho (transformante). A presente invenção proporciona um processo para a introdução de ADN estranho numa célula hospedeiro por ex posição de célula hospedeiro a uma suspensão ou solução contendo um complexo de ADN:composto.

Existem dois tipos de ligação de um composto a um ADN estranho. Um destes tipos ê designado como a incorpora ção intercalar em que toda a molécula ou parte da molécula do composto ê inserida entre as bases empilhadas de ADN. Esses com postos incluem a actinomicina D, compostos de antraciclina, e compostos de acridina. 0 outro tipo ê designado por incorporação não intercalar em que o composto não ê inserido entre os pares de bases.

Qualquer composto dos tipos acima mencionados pode ser utilizado como veículo para um ADN estranho. Qs composs tos de tipo não intercalar são preferíveis devido a terem uma menor probabilidade para introduzir a mutação numa célula hospe deiro. Zimmer, C., e col., (Prog.Biophy.Molec.Bio.,47:31-112, 1986) descrevem compostos que se ligam de forma não intercalar a ADN. Os compostos de tipo não intercalar são classificados em três grupos: Compostos classificados como antibióticos incluem a netropsina (Finlay,A.C., e col.,1951,J.Am.Chem.Soc.73:341-343) distamicina A (Arcamone,F., e col.,1958,German Pat. 1,027,667, Chem.Abstr.,1961,55:2112),mitramicina,cromomicina A3,olivomici-na(Gause,G.F.,1967, Em Antiobiotics,ed.D.Gottlieb e P.D.Shaw, p246-258),antramicina(Horwitz,S.B.,19 71,Prog.Molec.Subcell.Biol. 2:40-47),sibiromicina (Gause,G.H.,1975,Em Antibiotics III ed.J. M.Corcoran e F.H.Hahn, p269-273),tomaimicina (Hurley,L.H.,1977, J.Antibiot.,30:349-370),naftlridinomicina (Kluepfel,D.,e col., 1975,J.Antibiot.,28:497-502),saframicina A e C (Arai,T. e col., 1977, J.Antihiot.310:1015-1018) , e NSC-298223 (Hanka,L.J., e col., 1978, J.Antibiot. 31: 1211-1217).

Os compostos classificados como compostos sin têticos incluem os compostos de bis-benzimidazolilo tais como 4

2-/ 2- (4-hidroxifenil)benzimidazolil-5/-5- (4-metilpiperazinil--1)-benzimidazole/ (a seguir referido como Ho 33258), Loewe,H. e Urbanietz,J.,1974,Arzneim.Forsch.24,19727/2/"”2-(4-etoxifenil) benzimidazolil-5/-5-(4-metilpiperazinil)benzimidazole/ a seguir referido como Ho 33342), Arndt-Jovin,D.J., e Jovin,T.M.,1977,J. Histochem.Cytochem.25:585-5 89/,berenil(Newton,B.A.,19 6 7,Biochem J.105:50-51),DDUG (4,4'-diacetil-difenilureia-bisquanihidrazona (Baguley,B.C.,1982,Molec.Cell.Biochem.43:167-181),ionenoX (Day R.A.,e col.,l978,Biochem.Biophis. Res.Commun.84:969-977),mesote tra-(2-N-metilpiridil)-porfina (Carvlin,M.J. e Fiel,R.J.,1983, Nucl.Acids.Res.11:6121-6138),DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindole) (Mildner,B.,e col.,1979,Cell.Molec.Biol.25:399-407).

Os compostos classificados como compostos es-teróides de diamina incluem irediamina A e malouetina.(Silver, 3., e col.,1975,Em antibiotics III ed.J.W.Corcoran e F.E.Hahn, p614-622) . A estrutura química de Ho 33258 e Ho 33342 ê a seguir apresentada .

Ho 333258

OH

Ho 33342

OC2H5 5

Os Ho 33258 e Ho 33342 ligam-se de preferência a um ADN de dupla hélice e o ADN ligado ao composto é visua lisado por iluminação de UV devido â redução de fluorescência. Estas propriedades dos compostos têm sido utilizadas para revelar os núcleos das células viáveis (Zimmer, C. e Wahnert, U, 1986, Prog. Biophys. Molec. Biol. £7 31112). 0 composto ê fraca mente tõxico para as células e dâ uma imagem clara da região mi croscopicamente nuclear, propriedade que tem uma grande vantagem para a utilização laboratorial. Pensa-se que o Ho 3342 pene tra mais facilmente nas membranas das células do que o Ho 33258

Embora o reagente acima referido tenha sido utilizado para revelar células e cromossomas, o reagente nunca foi utilizado para introduzir um ADN estranho numa célula. A presente invenção tem-se focado nas propriedades de Ho 33342 e Ho 33258 susceptíveis de penetrar na membrana de célula, locali zandD-se na região nuclear e ligando-se especificamente a ADN e utilizando as propriedades para introduzir o ADN estranho numa célula por exposição sua a uma solução contendo o complexo do composto:ADN na célula.

As células alvo a serem transformadas incluem células de mamíferos disponíveis de uma colecção de cultura de células como pôr exemplo CHO,NIH/3T3,L,LtK,FM3A (tumor da mama do rato), bhk (rim de Hamster jovem), CV-1, COS-1 (célula de rins dos Macacos Verdes Africanos), HeLa (células do tumor utey rocervical humano), e HL-60 (leucemia promielocítica humana), e 293 derivado de rim humano, células de esperma e células de ôvu los (numa fase de preinstalação), células dos tecidos dos fetos, e protoplastos de células de plantas.

As células de esperma e células de óvulos tra nsformadas de acordo còm a invenção resultarão num animal trans gênico e o processo da invenção abre assim uma nova forma de produzir um animal transgénico facilmente e com eficiência, células de esperma transformadas com ADN.estranho são inseminadas em células de oviilos, ou células de óvulos transformadas com um ADN estranho que se deixam desenvolver para um feto. Alguns dos recém-nascidos assim obtidos podem ser possivelmente um animal transgénico. 6

Algumas células absorvem rapidamente o complexo do composto:ADN, mas se uma célula não absorver o complexo, ê desejâvem facilitar a absorção utilizando os processos a seguir descritos. Os processos incluem um processo de DEAE-dextra-no, um processo de fosfato de cálcio, um processo de poliorniti-na, um processo de PEG/SODM, e um processo de tripsina/EDTA/gli-cerol. Alternativamente, o processo físico para ajudar a absorção do complexo inclui a electroporação e a abertura de poros com feixe de laser. Além disso, pode ser minimizado o efeito toxico do composto nas células por utilização conjunta de um reagente por exemplo DiO-Cs-3 (3,3-dipentiloxicarbocianina). Pode ser utilizado qualquer ADN de dupla helice como ADN estranho. Ê preferível utiliz'ar um vector de expressão de ADN. Esse ADN estranho inclui uma unidade de expressão mínima consistindo num promotor, um gene de interesse (um gene que codifica uma proteína pretendida, por exemplo, cADN) e um sinal de poliadenilação, ou um ADN genõmico contendo uma região 5'- não transladada, exão intrão, e uma região 3'- não transladada se desejado. As células são transformadas em ADN, com uma mistura do ADN e um marcador seleccionãvel / por exemplo, um gene(neo) resistente â neomicina] um gene (Hmr) resistente â higromicina B_7 ou o ADN fundido com o matfàdor seleccionãvel acima referido.

As condições adequadas para introduzir um ADN estranho numa célula podem ser apenas determinadas por eficiência de transformação. Estas condições que podem influenciar a e-ficiência da transformação incluem uma célula de tipo hospedeiro, uma espécie de compostos, uma sua concentração, um tempo de incubação, uma forma de ADN (por exemplo, circular ou linear) e uma sua concentração.

Uma célula CHO (do ovário de hamster chinesa), por exemplo, ê transformada na altura em que ela ê subconfluente. D complexo de Ho 33342:ADN ê adicionado â cultura de células CHO 5 incubado durante algumas horas. Uma grande quantidade de ADN e ie Ho 33342 aumenta geralmente a eficiência de transformação. Con tudo, quando é adicionado 12 /im ou mais de Ho 33342 â cultura- de células e a cultura é incubada durante 20 horas, ê inibido o cres cimento da célula CHO. Se for utilizada uma concentração razoavel .inente elevada de Ho 33342, o tempo de incubação deve ser limitado 7

a 2-20 horas. Tipicamente, pode ser preferível uma concentração de 0,2 a 6 juM de Ho 33342 e 20 horas de tempo de incubação para a transformação. A eficiência da transformação ê ainda aumentada por adição de uma concentração razoavelmente elevada de Ho 33342 por exemplo (12 juM) â célula num meio isento de soro e incubando a cultura durante um pequeno período de tempo (por exemplo, 2 ho ras). A quantiade adequada de ADN para a transformação é de 0,1--10 ;ug para uma placa de culturas de 60 mm. A forma do ADN pode ser qualquer (por exemplo circular, linear) e o tamanho do ADN pode estar na gama de um peso molecular de 2-3 kb atê 30 kb. Um dos melhores candidatos será o pSV2neo em que pode ser inserido ADN adicional. Apôs a trahsformação da célula com o complexo Ho 33342: ADN, o transformante ê escrutinado para o marcador selec-tivo (por exemplo gene de resistência a um antibiótico do tipo neo). Na presente invenção, o marcador seleccionável já presente no ADN estranho ê o utilizado.

Resumo da Invenção A presente invenção proporciona um processo fácil e viável para introduzir ADN estranho numa célula.

Descrição das Figuras A fig, 1 mostra uma hibridização de revelação de Souther apôs electroforese de ADN cromossômico amplificado por PCR (Reacção de cadeia de polimerase). 1015-1018), e NSC-298223 (Hanka,L.J., e col.,1978, J.Antibiot. 31: 1211-1217).

Processos e Exemplos A invenção será descrita com pormenor nos seguintes Processos e Exemplos. Os exemplos pretendem apenas ilustrar a invençãoe não limitam o âmbito da invenção. O ADN cromossômico ê isolado e purificado da cultura de células resistentes a G-418. 8

Isolamento e Purificação do ADN Cromossómico de uma Cultura Transformante Resistente a G-418

Foi aspirada uma colónia resistente a G-418 utilizando um tubo microcapilar e transferiu-se para uma placa de 24 furos (Falcon;No. 3047) contendo 1 ml de um meio de cultura 2-/_ 2- (4-hidroxifenil)benzimidazolil-5/-5- (4-metilpiperazinil -1)-benzimidazole / (a seguir referido como Ho 33258), Loewe, H. e Urbanietz, J.,1974, Arzneim.Forsch. 24,192ij, 2-/~2-(4-etoxife nil) benzimidazolil-5/-5-(4-metilpiperazinil) benzimidazole / a seguir referido como Ho 33342),Arndt-Jovin,D.J., e Jovin,T.M.,1977 J.Histochem.Cytochem.25: 585-589^7/berenil(Newton,B.A. ,1967,Bio-chem.J. 105:50-51),DDUG (4,4'-diacetil-difenilureia-bisquanihi-drazona)(Baguley,B.C.,1982,Molec.Cell.Biochem. £3:167-181),ione-noX (Day,R.A., e col., 1978,Biochem.Biophys.Res.Commun.84:969-977 ), mesotetra-(2-N-metilpiridil)-porfina (Carvlin,M.J.e Fiel,R.J. 1983,Nucl.Acids.Res.il:6121-6138),DAPI(4,6-diamidino-2-fenilindo le) (Mildner,B.,e col.,1979,Cell .Molec.Biol 25: 399-407). A placa foi incubada à temperatura de 37°C numa atmosfera de 5% de CC>2/ /95% de ar durante 10 dias. Foram adicionados 0,5 ml de solução de tripsina (0,025% de tripsina, 0,02% de EDTA (p/v) em tampão de fosfato) a cada furo e a placa foi incubada a 37°C durante 5 minutos. A célula foi recolhida por centrifugação (1300 r.p.m. durante 3 minutos, â temperatura ambiente). Foram dissolvidos 500 ,ul de tampão de lise (6 mg/ml de proteínase K e 20 mg/ml de proteinase E numa solução contendo 50mM de Tris-HCl/pH8.0,0.lM de NaCl, 20mM de EDTA e 1% de SDS) e foram adicionados â célula. O lisado foi incubado com agitação a 37°C durante 24 horas. Foram adicionados 500 jul de fenol equilibrado com TE lOmM de tris--HCl, 1 mM de EDTA pH 8,0 e o lisado e a mistura foram incubados com agitação â temperatura ambiente durante 30 minutos. A mistura foi em seguida eentrifugada a 15.000 rpm durante 10 minutos a 4°C e o sobrenadante foi guardado. Foi repetida a extracção por mais duas vezes. Foram adicionados ao sobrenadante 10 /il de RNase A £~(4 mg/ml) ? (Sigma)_/, que foram dissolvidos em NaCl 0,15M. A mistura foi agitada e incubada a 37°C por mais de 3 horas. Após a digestão do AEN, foram adicionados 800 jul de álcool 9

isopropílico à mistura e a mistura foi deixada â temperatura ambiente durante 5 minutos. A mistura foi em seguida centrifugada a 15.000 rpm durante 15 minutos a 4°C e a pastilha foi lavada com 70% de etanol, seca e ressusoensa em 50 jul de TE. 0 ADN cromossõmico assim recuperado foi utilizado na fase seguinte.

Escrutínio de ADN Cromossõmico Utilizando um Oligõmero Possuindo Parte da Sequência do Gene Neo

O ADN estranho incorporado no cromossoma foi especificamente ampliado por um processo de reacção em cadeia de polimerase (PCR: Saiki, R.K., e col., 1986, Nature 324:163-166). O ADN estranho ampliado foi submetido a electroforese em gel de agarose e a banda de ADN do gel foi transferida para um filtro de "nylon". A presença do ADN estranho foi detectada utilizando parte de um gene neo como sonda. Especificamente, foram sintetizadas dois primários por um sintetizador de ADN (Applied Biosys-tem; 380A); foram sintetizados 10 primários complementares 4.9 ul de ADN cromossõmico (2ng), lul de neo-1 (10pM) , lul de neo-2

TM

(ΙΟρΜ), 2 ul de dNTPs (200uM),0.1 ul de Ampli Taq polimerase (0.5U; TAKARA No.2531), e 1 ul de tampão PCR (10X) correspondentes â sequência próxima do codão de ATG nucleõtido número 1558 a 1577) num gene neo) e outro primário complementar 5'-CTTGACAA AAAGAACCGGC-3' (neo-2) correspondente a uma sequência com cerca de 130 pb a juzante do codão de ATG do gene neo (nucleõtidos número 1681 a 1700). 0 ADN estranho continha o gene neo (derivado de Tn descrito em Beck, E, e col. ,1982,Gene. ,9^:327-336) , que con fere resistência âs células contra G-418, que ê um análogo da neomicina. Foram combinados 4.9ul de ADN cromossomãtico (2ng), lul de neo-1 (ΙΟρΜ) , lul de neo-2 (ΙΟρΜ), 2 ul de dNTPs (200uM),

TM 0.1 ul de Ampli Taq polimerase (0.5U; TAKARA No. 2531), e 1 ul de tampão PCR (10X) num tubo de microcentrifugação (Sarsted;No. 72.699). Foram colocados 20 ul de éleo de parafinao(Sigma; No. 400-5) por cima da mistura e foi efectuada a reacção de PCR utilizando um ciclador térmico de ADN (Abe Science; Tomcom 2). O ADN cromossõmico de molde foi desnaturado a 95°C, e foram efec-tuados 40 ciclos com uma temperatura de 95°C durante um minuto, 56°C durante 2 minutos, e 72°C durante 2 minutos. Apõs a reacção de PCR, a mistura foi removida e foram submetidos a electroforese - 10 -

10 ul da mistura num gel de agarose a 2%. 0 gel em seguida foi mergulhado numa solução contendo NaCl 1,5M e NaOH 0,5N durante 30 minutos. O ADN no gel foi recolhido num filtro de "nylon" utilizando 20X SSC (3M de NaCl, 0,3M de citrato de sódio). 0 filtro foi em seguida recozido a 80°C durante 2 horas. Foi efectuada a hibridização de Souther utilizando uma sonda de ADN, com cerca de 1 Kb de segmento Bglll (no nucleõtido 1515) - Smal (no nucleõ tido 2516) do gene neo. O ADN cromossómico foi escrutinado para a determinação da presença do ADN estranho incorporado. Se o se£ mento de 142 pb entre os primários neo-1 e neo-2 estava presente no ADN cromossómico, podia ser detectado um sinal de hibridização. No caso de estar ausente o segmento, não podia ter detectado o sinal de hibridização

Exemplo 1

Foram colocadas-numa placa de 60 mm (Falcon; No. 3002) contendo 4 ml de MEM-t/+ (Gibco) + 10% de soro de vitelo fetal no dia anterior ã adição de um complexo de um composto :ADN, 2 - 7,5X105 células de CHO (linha de células deficiente re ductase de dihidrofolato; Urlaub, G., e Chasin, L.A., 1980, Proc Natl. Acad. Sei. U.S.A., 77;4216-4422). A placa foi incubada a 37°C em atmosfera de 5% de 00^/95% de ar. No dia seguinte o meio de cultura foi substituído com um meio contendo o complexo Ho 33342: ADN. O meio de cultura contendo o complexo de Ho 33342: ADN foi preparado imediatamente antes de se adicionar o meio ãs células: foi dissolvida uma quantidade adequada do ADN (um ADN estranho) em TE e foi combinada uma concentração adequada de uma solução de armazém de Ho 33342 (500 ng de Ho 33342 foram dissolvidos em 1 /il de água destilada e a solução foi armazenada no es curo a 4°C). Foi adicionada água destilada ã mistura para levar o volume a 100 jul. A mistura foi agitada cuidadosamente e em seguida colçcada no escuro â temperatura ambiente durante mais de 10 minutos. O ADN estranho era o pSV2neo (Gorman, C., e col., 1983, Science.,221;551-553). Foram em seguida adicionados 100 jul do complexo de Ho 33342 : ADN a 4 ml de MEM-0*- + 10% de soro de . vitela fetal e cultivou-se durante 20 horas. * 0 meio contendo o complexo foi desprezado e as - células foram lavadas 3 vezes com MEM-°^ isento de soro. Foram 11

f+ adicionados 4 ml de um meio de cultura contendo MEM-v· fresco e 10% de soro de vitela fetal às células e a cultura foi incubada durante 42 horas. As células foram submetidas a tripsiniza-ção e foi contado o numero de células. Foram colocadas 5 X 104 células numa placa de 100 mm (Falcon; No.3003) contendo 7 ml de um meio de cultura /~400 jug/ml de G-418) Gibco; No.860-1811), ΜΕΜ-°^+, 10% de soro de vitela fetal/. A cultura foi incubada durante 12 dias com a mudança do meio em cada três dias. A tabela 1 mostra o numero de colónias resistentes a G-418 por placa no dia 14.

Tabela 1 ADN de plasmídeo (jug) Ho 33342 (jaM) Numero de colónias no dia 14 1 0 0 1 2 0 1 6 2 1 12,5 3 É evidente da Tabela 1 que as colónias resistentes a G-418 foram encontradas nas placas tratadas com o complexo de Ho 33342: ADN estranho. As placas tratadas com apenas ADN não produziam uma co lõnia resistente a G-418, mesmo partindo de uma densidade superior de células, (por exemplo, 5X105 ou 5X106).

Foram transformadas células não resistentes a G-418 em células resistentes a G-418, sugerindo que o ADN estranho tinha si do incorporado no ADN cromossómico das células não resistentes a G-418 e gene resistente a G-418 tinha sido expresso nas células. A incorporação do ADN estranho nas células transformadas foi confirmado da forma seguinte: a célula foi removida da placa por aspiração num microcõpio e cultivadas ainda para se obter o ADN. O ADN cromossómico foi isolado da célula, amplificado por PCR, e submetido a electroforese em gel, Foi encontrada na linha da célula transformada uma banda de 142 pb, que ê a dimensão do - 12 -

Claims (1)

1. ADN estranho, mas não na linha de controlo (células não trans-fectadas) (Fig.l) Exemplo 2 Foi cultivada a célula CHO-dhfr como descrito no Exemplo 1 com a excepção de o meio de cultura utilizado ser isento de soro de vitela fetal. A Tabela 2 mostra os números de colónias resis tentes a G-418 no dia 14 após tratamento com o complexo de Ho 33342: ADN Tabela 2 ADN de plasmldeo (>ig) Ho 33342 (joM) Número de colónias no dia 14 1 0 0 1 2 1 1 6 1 1 12,5 18 12,5 juM de Ho 33342, que ê uma concentração relativamente elevada do composto, em combinação com o meio de cultura isento de so ro aumentaram notavelmente a eficiência da transformação. REIVINDICAÇÕES a - 1 Processo para a introdução de um ADN estranho numa célula por exposição da célula a uma suspensão ou solução contendo um complexo de composto: ADN estranho caracterizado por se utilizar um composto que ê susceptível de se ligar a um ADN de dupla hélice. - 13 - - 2a - Processo de acordo com a reivindicação 1 ca-racterizado por o composto do complexo composto: ADN estranho ser 2-/ 2-(4-hidroxifenil)benzimidazolil-5/-(4-metilpiperazinil-l) benzimidazole ou 2-/—2-(4~etoxifenil)benzimidazolil-57-5-(4-metilpiperazinil”l)-benz imidazole - 3a - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2 caracterizado por o processo ser combinado com um processo de transformação convencional. - 4a - Processo de acordo com qualquer das reivindica ções 1, 2 ou 3 caracterizado por o ADN estranho ser inserido em PSV2 neo. - 5a - Processo de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, ou 4 caracterizado por se obterem células eucariõticas. - 6a - Processo de acordo com a reivindicação 5 carac terizado por as células eucariõticas serem células de mamíferos ou de roedores. - 7a - Processo de acordo com a reivindicação 5 carac terizado por as células eucariõticas serem células de esperma ou células de óvulos. A requerente reivindica a prioridade do pedido japonês apresentado em 25 de Setembro de 1990 sob o No HEI-2-251 ,843. Lisboa, 24 de Setembro de 1991

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