PT98803B - Processo de preparacao de uma proteina de ligacao purificada - Google Patents

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Description

MEMÓRIA DESCRITIVA
INTRODUÇÃO
Campo do invento
Esta invenção refere-se a proteínas purificadas de ocorrência natural e à proteína correspondente produzida por técnicas de recombinaçâo, e mais especificamente a tais proteínas e elementos genéticos derivados de uma proteína de ligação a factores de crescimento semelhantes à insulina e aos métodos e composições que utilizam as proteínas e os elementos genéticos.
Antecedentes do invento
Os factores de crescimento semelhantes à insulina (iGFs) são hormonas polipeptídicas de baixo peso molecular que possuem uma homologia estrutural com a proinsulina. São conhecidos dois IGFs diferentes, nomeadamente o IGF-I e o IGF-II, que são mitogénicos in vitro para uma larga diversidade de células em cultura de tecidos. Ambos os IGFs estimulam in vitro o crescimento de diversos tecidos, e, em particular, eles induzem a síntese do colagénio. 0 IGF-1 participa no efeito promotor do crescimento da hormona do crescimento ao nível da condrogénese e na formação óssea, e é, portanto, essencial para o crescimento normal de um indivíduo. Isto é demonstrado pelo facto de que os pigmeus e os poodles anões são deficientes em IGF-1, mas possuem concentrações normais de hormona de crescimento no seu soro. Pensa-se que o IGF-II possua um papel fundamental no desenvolvimento fetal e no crescimento dos nervos.
Para além do seu efeito primário sobre o tecido esquelético, estes factores exibem igualmente funções estimuladoras do crescimento sobre outros tecidos. Sabe-se que os fibroblastos em feridas produzem IGFs que possuem a capacidade de estimular os fibroblastos ao nível do crescimento e da síntese de colagénio, uma proteína estrutural normalmente necessária à cicatrizaçâo de feridas. A vascularização do tecido lesado é igualmente induzida. Adicionalmente, foi também descoberto que os IGFs possuem uma actividade de tipo eritropoietínico, uma vez que induzem a hematopoiese.
Estudos recentes demonstraram que os IGFs produzidos por determinadas células cancerosas, e.g., células do cancro do rim e mama, auto-estimulam a proliferação das células cancerosas e dos tecidos vasculares e fibrosos necessários para apoiar o crescimento dos tecidos cancerosos.
Para além disto, ambos os IGFs evidenciam um espectro de actividades metabólicas semelhantes às da insulina, uma vez que estimulam, em particular, o transporte e o metabolismo da glucose. Os efeitos biológicos dos IGFs e da insulina são mediados através da sua ligaçao a receptores específicos. Em particular, ambos os IGFs possuem a capacidade de se ligar ao receptor da insulina, com uma afinidade de ligação cerca de 100 vezes menor do que a da insulina.
Ambos os IGFs se encontram no sangue a uma concentração aproximadamente 100 vezes superior à da insulina. A hipoglicémia é evitada através de um mecanismo regulador que envolve as proteínas transportadoras presentes no sangue e com a capacidade de formar complexos com os IGFs. Assim, os IGFs circulam no sangue sob a forma de um complexo que não possui actividade semelhante à insulina. Através da sua associação com as proteínas transportadoras (de aqui em diante designadas como proteínas de ligação aos IGFs, ou IGFBPs), a ligação dos IGFs aos receptores celulares de superfície é inibida. Foi igualmente demonstrado que outra função das proteínas de ligação aos IGFs é a de aumentar a curta semi-vida dos IGFs, que são sujeitos a uma rápida degradação proteolítica quando presentes no sangue sob a forma livre.
De acordo com o precedente, os IGFs poderão ser úteis in vitro para estimular a) o crescimento de animais e humanos com deficiência na hormona de crescimento, b) a regeneração de tecidos, tal como a eritropoiese e a condrogénese, c) a cicatrização de feridas e d) as funções de vários orgãos, fígado ou rim. Como resultado da sua acção estimuladora da condrogénese, os IGFs são de uso particularmente adequado para a formação óssea, e.g., no tratamento da osteoporose. Os IGFs para uso nos tratamentos acima referidos são vantajosamente administrados a um indivíduo em associação a pelo menos uma proteína de ligação aos IGFs. A administração desta combinação, em lugar do IGF isolado, tem efeitos benéficos que incluem a prevenção da hipoglicémia e de possíveis efeitos mitogénicos ao nível dos locais de injecção, e o prolongamento da semi-vida do IGF. Adicionalmente, foi descoberto que as proteínas de ligação são igualmente úteis para potenciar o efeito de tipo eritropoietínico do IGF-1. As proteínas de ligação podem igualmente ser úteis para direccionar os IGFs para tecidos específicos.
Quando administradas isoladamente, i.e., sem qualquer IGF, as proteínas de ligação podem igualmente ser de utilidade terapêutica para bloquear os efeitos adversos dos IGFs, como as que ocorrem quando os IGFs são produzidos em excesso, e.g., IGFs livres segregados por certas células cancerosas, e.g·, células cancerosas produtoras de hormonas, tais como as células do cancro da mama ou rim. A terapêutica com proteína de ligação aos IGFs pode igualmente evitar a cegueira como efeito secundário da retinopatia proliferativa diabética. De facto, foi demonstrado que os IGFs podem constituir um dos factores estimuladores da proliferação endotelial e fibroblástica na retinopatia diabética.
Outra utilização terapêutica das IGFBPs consiste no controlo do crescimento excessivo em indivíduos deficientes em proteínas de ligação aos IGFs, uma vez que é bastante provável que altas concentrações de IGF, combinadas com concentrações anormalmente baixas de proteína de ligação, sejam responsáveis pelo crescimento excessivo.
Nos últimos anos, três espécies principais de proteínas de ligaçao aos IGFs, diferentes em dimensões e outras propriedades, foram detectadas no soro de roedores e humanos.
A primeira proteína de ligação a ser descoberta, agora designada por IGFBP-3, é uma glicoproteína de aproximadamente 150 kd, e é composta por diversas subunidades. A sua formação, em contraste com a da segunda, e menor, proteína de ligação aos IGFs, é dependente da acção da hormona de crescimento.
A segunda proteína de ligação a ser descoberta, agora designada por IGFBP-1, possui um peso molecular de aproximadamente 30 - 40 kd no homem e no rato. A IGFBP-1 humana foi já purificada a partir de diversas fontes, incluindo o fluido amniótico (Povoa, G. et al., Eur. J. Biochem. (1984) 144;199, (sendo, portanto, igualmente denominada como proteína de ligação do fluido amniótico), placenta (Koistenen, R. et al., Endocrinology (1986) 118;1375) , e meio condicionado de células G2 de hepatoma, (Powell, D.R. et al., J. Chromatogr. (1987) 420il63). As primeiras duas proteínas de ligação foram caracterizadas segundo o seu conteúdo em aminoácidos e as suas sequências N-terminais de aminoácidos, e verificou-se que eram idênticas, ou pelo menos bastante similares. A comparação das sequências de aminoácidos da proteína de ligaçao aos IGFs, isolada a partir das células G2 de hepatoma (Lee, Y.L. et al., Mol. Endocrinol. (1988) 2 (5):404) e a proteína de ligação aos IGFs, clonada a partir de uma biblioteca de cDNA de placenta (Brinkman, A. et al., The EMBO Journal (1988) Ί_ (8):2417), revela uma homologia de 99% . Adicionalmente, estas duas sequências de aminoácidos demonstraram possuir, em relação a uma proteína de ligação aos IGFs codificada por uma biblioteca de cDNA, uma homologia de 94% (Brewer, M.T. et al., Bioch. Biophys. Res. Com. (1988) 152 (3):1289).
Para além das duas formas principais de proteínas de ligação aos IGFs presentes no soro, foram já identificadas diversas outras proteínas de ligação aos IGFs em diferentes extractos de tecidos humanos e meios de cultura de células, através de técnicas de Western Blot e de marcação por afinidade 125 com [I ]-IGF. Os seus pesos moleculares encontram-se na gama de 15 a 150 kd, e algumas destas proteínas parecem ter sido geradas por degradação proteolítica das maiores proteínas de ligação aos IGFs. Em particular, uma proteína de ligação aos IGFs de 53 kd, que foi purificada a partir de soro humano, representa uma subunidade da IGFBP-1, de 150 kd (Baxter, R.C. Biochem. Biophys. Res. Com. (1966) 139 (3):1256).
Foi igualmente descoberta uma outra forma de proteína de ligação aos IGFs no meio condicionado de células BRL-3A de rato, a qual possui um peso molecular de aproximadamente 33-36 kd. Foi determinada uma sequência parcial amino-terminal da proteína de ligaçao BRL-3A de rato (Motolla, C. et al., Biol.
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Endocrinol, ( 1986) 45:263) . O grau de homologia de 33%, demonstrado entre as sequências terminais do rato e do homem, nâo é suficientemente alto para que as proteínas de ligação respectivas sejam consideradas como equivalentes.
Foi igualmente descoberta uma IGFBP, agora designada por IGFBP-2, que é semelhante à proteína de ligação BRL-3A, tendo
I sido a sua sequência de aminoácidos já completamente estabelecida. A sequência de aminoácidos da IGFBP-2 é diferente das sequências das proteínas de ligação anteriormente conhecidas.
A existência de diferentes proteínas de ligação aos IGFs indica que estas proteínas possuem diferentes funções. Uma vez que é possível diagnosticar estados de doença, e modificar por diversas formas a actividade biológica dos IGFs, usando as proteínas de ligação presentemente conhecidas, existe um interesse significativo na descoberta de proteínas de ligação aos IGFs adicionais possuindo diferentes propriedades biológicas.
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Sumário do Invento
Neste sentido, constitui um objectivo deste invento o fornecimento de uma proteína de ligação aos IGFs possuindo propriedades biológicas diferentes das da IGFBP-1, IGFBP-2 e IGFBP-3.
É ainda um objectivo do presente invento o fornecimento de uma nova proteína de ligação ao IGF usando moléculas de DNA recombinante capazes de expressar a nova proteína de ligação aos IGFs, de forma a que a proteína de ligação se encontre mais prontamente disponível.
Estes e outros objectivos do invento foram atingidos através do fornecimento de uma nova proteína de ligação purificada seleccionada a partir de um grupo que consiste numa proteína de ligação a um factor de crescimento semelhante à insulina possuindo uma sequência de aminoácidos que tem uma homologia de pelo menos 85% com a sequência de aminoácidos da Figura 1, e em fragmentos desta sequência possuindo pelo menos dez (10) aminoácidos consecutivos da dita sequência, sendo que a dita proteína de ligação purificada é capaz de se ligar a um anticorpo específico para a dita proteína ou a um factor de crescimento semelhante à insulina. Fazem também parte do presente invento moléculas de proteínas de ligação produzidas recombinantemente e anticorpos que reconhecem a nova proteína de ligação.
Breve Descrição das Figuras
A Figura 1 é um diagrama esquemático mostrando as sequências de aminoácidos e de nucleótidos de um clone codificando para a IGFBP-4 humana. É evidenciado através de uma seta o hipotético local de clivagem da serina peptidase.
A Figura 2 é um diagrama esquemático comparando a sequência de aminoácidos de uma proteína de ligação humana do presente invento, a IGFBP-4 humana, com as sequências conhecidas das três proteínas de ligação humanas acima apresentadas e com a IGFBP-5, outra nova proteína de ligação humana. Podem ser detectadas nestas sequências áreas de homologia. Estas áreas de homologia revestem-se de particular interesse, uma vez que elas indicam áreas para as quais podem ser obtidas sondas de DNA que possuirão uma elevada probabilidade de sucesso na detecção de moléculas relacionadas. Duas destas áreas homólogas são indicadas por parêntesis, se bem que se encontrem igualmente presentes outras áreas de homologia.
Descrição de Formas Especificas de Realização do Invento
São fornecidas novas composições compreendendo proteínas recombinantes produzidas pela utilização de sequências genéticas que codificam para a IGFBP-4 e para fragmentos dela derivados, juntamente com proteínas isoladas a partir de fontes naturais e métodos para utilização destas composições. 0 cDNA da IGFBP-4 usado para produzir a proteína recombinante foi inicialmente isolado a partir de uma biblioteca de cDNA de osteosarcoma/lambdaZAP humano, usando um processo em duas fases. Numa primeira fase, pequenos fragmentos dos cDNAs codificando para os aminoácidos 7 a 22 da BP4 foram amplificados a partir do cDNA de osteosarcoma pela reacção em cadeia por polimerase, purificados em gel, e sequenciados. Na segunda fase, foram sintetizados oligonucleótidos de complementaridade perfeita, baseados na sequência de nucleótidos da BP4 entre os primers da PCR, sendo estes oligonucleótidos usados como sondas para isolar clones de cDNA. Os clones de cDNA BP4 evidenciando, por electroforese em gel de agarose, o maior segmento de DNA inserido, foram sequenciados. As sequências nucleotídicas e de aminoácidos codificados da BP4 são mostradas na Figura 1.
São usadas nestas figuras, e em outros passos desta especificação, as abreviaturas Standard para nucleótidos e aminoácidos.
São aqui empregues diversos termos habitualmente utilizados nos campos da engenharia genética e da química de proteínas, cujo significado é a seguir definido.
| Dois fragmentos de ácidos nucleicos são homólogos se são capazes de se hibridizar entre si sob as condiçOes de hibridização descritas em Maniatis et al., op. cit., págs. 320323. No entanto, ao usarem-se as seguintes condiçOes de lavagem 2 x SCC, 0,1% SDS, duas vezes à temperatura ambiente, 30 minutos de cada vez; de seguida 2 x SCC, 0,1% SDS, 50°C uma vez, 30 minutos; então 2 x SCC, duas vezes à temperatura ambiente, 10 minutos de cada vez - podem ser identificadas sequências
1» não homólogas que contêm no máximo cerca de 25-30% de complementaridade de pares de bases. Mais preferencialmente, as cadeias homólogas de ácido nucleico contêm 15-25% de nao complementaridade de pares de bases, ainda mais preferencialmente 5-15% de nao complementaridade de pares de bases. Estes graus de homologia podem ser seleccionados usando condições de lavagem mais rigorosas para a identificação de clones a partir de bibliotecas de genes (ou outras fontes de material genético), tal como é bem conhecido da técnica.
Um fragmento de DNA é derivado de uma sequência de
DNA codificando para a IGFBP-4 se ele contém a mesma, ou
substancialmente a mesma, sequência de pares de bases, que uma
região da sequência codificante para a molécula completa de
IGFBP-4.
Substancialmente as mesmas significa, quando em referência a actívidades biológicas, que as actívidades são do mesmo tipo, se bem que possam diferir em intensidade. Quando em referência a sequências de aminoácidos, o termo substancialmente as mesmas quer significar que as moléculas em questão possuem propriedades biológicas semelhantes e possuem, de preferência, uma homologia de pelo menos 85% nas sequências de aminoácidos. Mais preferencialmente, as sequências de aminoácidos são idênticas em pelo menos 90%. Noutras utilizações, substancialmente as mesmas possui o seu sentido linguístico comum.
Uma proteína é derivada de uma molécula de IGFBP-4 se
possui a mesma, ou substancialmente a mesma sequência de aminoácidos que uma região da molécula de IGFBP-4.
A IGFBP-4, tanto glicosilada como não glicosilada, ou seus derivados polipeptídicos, pode ser usada para produzir anticorpos, tanto monoclonais como policlonais, específicos para a IGFBP-4. Por derivados polipeptídicos destas IGFBPs querem-se significar polipéptidos que diferem em comprimento da IGFBP-4 natural, e contendo cinco ou mais aminoácidos da IGFBP-4 na mesma ordem primária encontrada na IGFBP-4 que é obtida a partir de uma fonte natural. Encontram-se dentro da definição de IGFBP-4 as moléculas de polipéptidos que possuem substancialmente a mesma sequência de aminoácidos que a IGFBP-4, mas que possuem pequenas substituições de aminoácidos que não afectam substancialmente a capacidade de interacção destes derivados polipeptídicos da IGFBP-4 com moléculas específicas para a IGFBP-4, tais como anticorpos e moléculas de IGF, particularmente a IGF-I e, especialmente, a IGF-II. Estes derivados incluem formas glicosiladas, conjugados agregativos com outras moléculas de IGFBPs,v e conjugados covalentes com grupos químicos não relacionados. Os derivados covalentes são preparados por ligação de grupos funcionais com grupos que se encontram na cadeia de aminoácidos das IGFBPs ou no resíduo N- ou C-terminal, através de meios conhecidos da técnica.
Experiências efectuadas com a N-glicanase sugerem que a IGFBP-4 não é glicosilada; isto é, a mobilidade da proteína de ligação em geles não é alterada após digestão com N-glicanase. No entanto, a proteína codificada contém um local de N glicosilação, e a proteína pode, pois, ser glicosilada sob condições apropriadas. Assim, a molécula nativa poderá conter um açúcar que está encoberto na molécula e que é, consequentemente, inacessível às glicanases. Pensa-se ocorrer igualmente este fenómeno com uma cadeia de açúcar da molécula de IGFBP-3. Uma possível indicação de glicosilação da molécula de BP-4 é obtida pelo seu peso molecular. 0 peso molecular previsto para a IGFBP-4 (a partir do cDNA) é menor do que o obtido através da mobilidade em gel. No entanto, ainda não foi possível a detecção experimental de moléculas de açúcar.
As moléculas específicas para a IGFBP-4 incluem polipéptidos, tais como anticorpos, específicos para o polipéptido IGFBP-4 que contém a sequência de aminoácidos da IGFBP-4 de ocorrência natural. Por polipéptidos de ligação específica são englobados os polipéptidos que se ligam à IGFBP-4 e aos seus derivados, e que possuem uma afinidade de ligação mensuravelmente maior para o polipéptido alvo, i.e., a IGFBP-4 e os derivados polipeptídicos da IGFBP-4, do que para outros polipéptidos testados quanto à ligação. É preferida uma afinidade de ligação superior por um factor de 10, mais preferencialmente ainda por um factor de 100. A afinidade de ligação, relativamente a anticorpos, refere-se a um só acontecimento de ligação (i.e., ligação monovalente de uma molécula de anticorpo). Uma ligação específica de anticorpos significa igualmente que a ligação tem lugar ao nível do local normal de ligação do anticorpo da molécula (na extremidade dos ramos da região variável).
Tal como acima exposto, pretende-se que o termo IGFBP-4 englobe pequenas variações de aminoácidos em relação à sequência natural de aminoácidos da IGFBP-4; em particular, são contempladas substituições conservativas de aminoácidos. As substituições conservativas são aquelas que ocorrem dentro de uma família de aminoácidos cujas cadeias laterais são semelhantes. Os aminoácidos codificados geneticamente são geralmente divididos em quatro famílias: (1) acídicos = aspartato, glutamato; (2) básicos = lisina, arginina, histidina; (3) não polares = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; e (4) polares não carregados = glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina, tirosina. A fenilalanina, o triptofano e a tirosina são por vezes classificados conjuntamente como aminoácidos aromáticos. Por exemplo, é razoável esperar que uma substituição isolada de uma leucina com uma isoleucina ou uma valina, um aspartato com um glutamato, uma treonina com uma serina, ou uma substituição semelhante de um aminoácido por um aminoácido estruturalmente relacionado, não exerça um efeito determinante sobre as propriedades de ligação da molécula resultante, especialmente se esta substituição não envolve um aminoácido que se encontre num local de ligação envolvido na interacção da IGFBP-4, ou seus derivados, com uma molécula de IGF. Pode facilmente determinar-se se uma alteração num aminoácido resulta na obtenção de um péptido funcional, ensaiando-se as propriedades de ligação específica do derivado
polipeptídico da IGFBP-4. É abaixo descrito em pormenor um ensaio de ligação.
São produzidos anticorpos específicos para a IGFBP-4 através da imunização de um hospedeiro vertebrado apropriado, e.g., o coelho, com IGFBP-4 purificada ou com derivados polipeptídicos da IGFBP-4, por si sós ou em conjunção com um adjuvante convencional. Geralmente, estarão envolvidas no processo duas ou mais imunizações, e será extraído sangue ou o baço alguns dias após a última injecção. Para anti-soros policlonais, as imunoglobulinas podem ser precipitadas, isoladas e purificadas através de uma variedade de técnicas padronizadas, incluindo a purificação por afinidade usando a IGFBP-4 ligada a uma superfície sólida, tal como um gel ou esferas numa coluna de afinidade. Para anticorpos monoclonais, os esplenócitos serão normalmente fundidos com um linfócito imortalizado, e.g., uma linha celular mielóide, sob condições selectivas que permitam a formação de um hibridoma. Os hibridomas podem então ser clonados, sob condições limitativas de diluição, e os seus sobrenadantes poderão ser ensaiados quanto à presença de anticorpos possuindo a desejada especificidade. As técnicas de produção de anticorpos são bem conhecidas da literatura e são exemplificadas pela publicação Antibodies? A Laboratory Manual (1988), eds. Harlow e Lane, Cold Spring Harbor Laboratories Press, e pelas patentes norte-americanas nos. 4.381.292, 4.451.570, e 4.618.577.
A IGFBP-4 pode ser facilmente purificada por cromatografia de afinidade, usando um anticorpo monoclonal
específico para a IGFBP-4, a partir do sangue e seus componentes, tais como o soro ou plasma, e de células geneticamente modificadas para produzir a IGFBP-4 ou seus derivados polipeptídicos. Para além do uso da cromatografia de afinidade por anticorpos, a IGFBP-4 e seus derivados polipeptídicos podem ser purificados por intermédio de diversas outras técnicas bem conhecidas de purificação de proteínas (tanto isoladas como em combinação), incluindo a imunoprecipitação, filtração em gel, cromatografia de troca iónica, cromatofocalizaçâo, focalizaçâo isoeléctrica, precipitação selectiva, electroforese, e semelhantes. As fracçdes isoladas, durante os processos de purificação, poderão ser analisados quanto à presença de IGFBP-4, ou de derivados polipeptídicos da IGFBP-4, através de imunoensaios usando anticorpos específicos para a IGFBP-4, ou bioensaios específicos para a IGFBP-4. São abaixo fornecidos exemplos detalhados.
isolamento de sequências nucleótídicas, codificando para a IGFBP-4, envolve a criação de uma biblioteca genómica preparada a partir de células que codifiquem para a IGFBP-4, ou a preparação de uma biblioteca de cDNA baseado em RNA isolado a partir de células que expressem a IGFBP-4. Será geralmente de preferir a criação de uma biblioteca de cDNA para isolamento de sequências nucleótídicas que codifiquem para a IGFBP-4, de forma a se evitarem quaisquer possíveis problemas que pudessem sobrevir de tentativas de determinação de fronteiras intron/exon. As bibliotecas genéticas podem ser construídas tanto com células hospedeiras procarióticas como eucarióticas. Podem ser usados os vectores de clonagem vulgarmente disponíveis, como os plasmídeos, cosmídeos, fagos, YACs e semelhantes, para gerar bibliotecas genéticas adequadas ao isolamento de sequências nucleotídicas que codifiquem para a IGFBP-4, ou porções desta.
Métodos úteis para a pesquisa da presença de sequências nucleotídicas da IGFBP-4 em bibliotecas genéticas incluem a preparação de sondas oligonucleotídicas baseadas na informação da sequência N-terminal de aminoácidos da IGFBP-4 purificada ou de fragmentos internos purificados da IGFBP-4 purificada. Usando o código genético Standard de tripletos, podem ser preparadas sequências oligonucleotídicas de cerca de 17 pares de bases, ou maiores, utilizando técnicas convencionais de síntese in vitro, de forma a que estas sequências correspondam a porções da IGFBP-4 para as quais tenha sido determinada a sequência de aminoácidos por análise da extremidade N. As sequências de ácidos nucleicos resultantes poderão ser subsequentemente marcadas com radioisótopos, enzimas, biotina, fluorescentes, ou semelhantes, e usadas como sondas para a análise de bibliotecas genéticas.
Métodos adicionais de interesse no isolamento de sequências de ácidos nucleicos codificando para a IGFBP-4 incluem a análise de bibliotecas genéticas quanto à expressão da IGFBP-4, ou fragmentos desta, usando anticorpos específicos para a IGFBP4, tanto policlonais como monoclonais. Uma técnica particularmente preferida envolve o uso de primers degenerados, baseados em sequências parciais de aminoácidos da IGFBP-4 purificada ou em sequências de moléculas relacionadas conhecidas, e da reacção em cadeia por polimerase (PCR) para a amplificação dos segmentos de gene entre os primers. 0 gene pode então ser isolado usando uma sonda de hibridizaçao específica baseada no segmento de gene amplificado, que é então analisado quanto à expressão apropriada da proteína. É apresentada, nos exemplos que se seguem, uma descrição detalhada desta última técnica.
Podem obter-se sequências nucleotídicas codificando para a IGFBP-4 a partir de moléculas de DNA recombinante recuperadas de isolados de uma biblioteca genética de IGFBP-4. A sequência nucleotídica codificando para a IGFBP-4 pode ser obtida através da sequenciação das sequências nucleotídicas não correspondentes ao vector destas moléculas recombinantes. A informação da sequência nucleotídica pode ser obtida através dos protocolos de sequenciação de DNA vulgarmente usados, tais como a sequenciação de Maxim e Gilbert, a sequenciação didesoxi de nucleótidos, e semelhantes. Podem ser encontrados exemplos de protocolos adequados de sequenciação de nucleótidos em Berger e Kimmel, Methods in Enzymology Vol. 52, Guide to Molecular Cloning Techniques, (1987) Academic Press. A informação contida na sequência de nucleótidos de diversos isolados de DNA recombinante, incluindo tanto isolados de cDNA como de bibliotecas genómicas, pode ser combinada de forma a fornecer a sequência completa que codifica para os aminoâcidos da IGFBP-4, assim como as sequências nucleotídicas dos introns contidos no gene da IGFBP-4, as sequências nucleotídicas a montante, e as sequências nucleotídicas a jusante.
As sequências nucleotídicas obtidas por sequenciação de isolados de bibliotecas genéticas, específicos para a IGFBP-4, são submetidas a análise para identificação de regiOes de interesse no gene da IGFBP-4. Estas regiões de interesse incluem moldes abertos de leitura, introns, sequências promotoras, sequências de terminação, e semelhantes. A análise da informação contida na sequência nucleótidica é, de preferência, executada por computador. Encontra-se disponível no mercado o software adequado à análise de sequências nucleotídicas para detecção de TM regiões de interesse, do qual é exemplo o DNASIS (LKB) . Ao analisar-se a informação da sequência nucleótidica da IGFBP-4, terá igualmente interesse o uso da informação da sequência de aminoácidos obtida através da sequenciação da extremidade N da IGFBP-4 purificada, de forma a melhorar a precisão da análise da sequência nucleótidica.
As sequências nucleotídicas isoladas, codificando para a IGFBP-4, podem ser usadas para produzir a IGFBP-4 purificada, ou fragmentos desta, tanto por metodologia de DNA recombinante como por técnicas de síntese polipeptídica in vitro. Por purificado e isolado pretende-se significar, quando em referência a um polipéptido ou a uma sequência de nucleótidos, que a molécula indicada se encontra presente na substancial ausência de outras macromoléculas biológicas do mesmo tipo. 0 termo purificado, tal como aqui é usado, significa que de preferência estão presentes pelo menos 95% por peso, mais preferencialmente pelo menos 99% por peso, e ainda mais preferencialmente pelo menos 99,8% por peso de macromoléculas biológicas do mesmo tipo (mas a água, tampões, e outras moléculas pequenas, especialmente moléculas possuindo um peso molecular inferior a 1000, poderão estar presentes).
Uma vantagem significativa da produção de IGFBP-4 por técnicas de DNA recombinante, em vez do isolamento da IGFBP-4 a partir de fontes naturais, reside no facto de que podem ser produzidas quantidades equivalentes de IGFBP-4 usando menos material de base do que o que seria necessário para isolar a proteína de ligação a partir de uma fonte natural. A produção da IGFBP-4 através de técnicas recombinantes permite igualmente que a IGFBP-4 possa ser isolada na ausência de algumas moléculas normalmente presentes em células naturalmente produtoras de IGFBP-4. De facto, podem ser facilmente produzidas composições de IGFBP-4 inteiramente livres de qualquer vestígio de proteínas humanas contaminantes, já que a única proteína humana produzida pelo hospedeiro recombinante não-humano é a IGFBP recombinante. São, assim, igualmente evitados potenciais agentes virais provenientes de fontes naturais. Parece também evidente que as técnicas de DNA recombinante podem ser usadas para produzir derivados polipeptídicos da IGFBP-4 que não são encontrados na natureza, tais como as variações acima descritas.
A IGFBP-4 e seus derivados polipeptídicos podem ser expressos por técnicas de DNA recombinante quando uma sequência de DNA codificando para a molécula relevante é funcionalmente inserida num vector. Por funcionalmente inserida pretende-se que esteja em orientação e estrutura adequadas para leitura, tal como é entendido pelos especialistas na técnica. Na produção de uma construção genética, contendo um molde de leitura completo de IGFBP-4, o material de base preferido é um isolado de uma biblioteca de cDNA que codifique para a IGFBP-4, no lugar de um isolado de uma biblioteca genómica. Tipicamente, o gene da IGFBP4 será inserido a jusante de um promotor e será seguido por um codâo de terminação, se bem que possa ser usada, se desejado, a produção sob a forma de uma proteína híbrida seguida por clivagem. De forma geral, serão usadas as sequências específicas para a célula hospedeira que melhorem o rendimento de produção da IGFBP-4 e seus derivados polipeptídicos, e serão adicionadas ao vector de expressão sequências de controlo apropriadas, tais como sequências enhancer, sequências de poliadenilaçâo, e locais de ligação ao ribossoma.
Uma vez isolada a sequência codificante apropriada, esta poderá ser expressa por uma variedade de diferentes sistemas de expressão.
Sistemas de Expressão de Mamífero
Um promotor de mamífero é qualquer sequência de DNA capaz de receber a ligação da RNA polimerase de mamífero e de iniciar a transcrição a jusante (3') de uma sequência codificante (e.g., um gene estrutural) para mRNA. Um promotor possuirá uma região iniciadora da transcrição, que se encontra geralmente colocada em posição proximal em relação à extremidade 5' da sequência codificante, e uma TATA box, geralmente localizada 2530 pares de bases (pb) a montante do local de iniciação da transcrição. Pensa-se que a TATA box direccione a RNA polimerase II para o local correcto de iniciação da síntese do RNA. Um promotor de mamífero conterá igualmente um elemento promotor a montante, tipicamente localizado de entre 100 a 200 pb a montante da TATA box. Um elemento promotor a montante determina a taxa à
I qual a transcrição é iniciada, e pode actuar em ambas as orientações possíveis (Sambrook et al. (1989), Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição.
Os genes virais de mamífero são frequentemente expressos em elevado grau e possuem uma larga gama de possíveis hospedeiros; por estas razões, as sequências codificando para genes virais de mamífero proporcionam sequências promotoras particularmente úteis. Exemplos destes promotores incluem o | promotor precoce do SV40, o promotor LTR do vírus do tumor mamário do rato, o promotor tardio principal do adenovírus (Ad MLP), e o promotor do vírus herpes simplex. Adicionalmente, as sequências derivadas de genes não virais, tais como o gene da metalotioneina murina, proporcionam igualmente sequências promotoras úteis. A expressão poderá ser constitutiva ou regulada (indutível), dependendo de o promotor poder ou não ser induzido com glucocorticóides em células que respondam a estímulos hormonais.
A presença de um elemento enhancer, combinado com os elementos promotores acima descritos, aumentará tipicamente os níveis de expressão. Um enhancer é uma sequência de DNA reguladora que tem a capacidade de exercer uma estimulação da transcrição de até 1000 vezes quando ligada a promotores homólogos ou heterólogos, iniciando-se a síntese ao nível do local normal de iniciação do RNA. Os enhancers são igualmente activos quando colocados a montante ou a jusante do local de iniciação da transcrição, em orientação normal ou invertida, ou a uma distância de mais de 1000 nucleótidos do promotor (Maniatis et al. (1987), Science 236:1237; Alberts et al. (1989), Molecular Biology of the Cell, 2^ Edição). Os elementos enhancer derivados de vírus podem revelar-se particularmente úteis, já que eles apresentam tipicamente uma larga gama de possibilidades a nível de hospedeiro. Exemplos destes enhancers incluem o enhancer precoce do gene do SV40 (Dijkema et al (1985), EMBO J. 4:761) e o enhancer/promotores derivados da longa sequência repetitiva terminal (LTR) do vírus do sarcoma de Rous (Gorman et al. (1982b), Proc. Natl. Acad. Sei. 79;6777) e do citomegalovírus humano (Boshart et al. (1985), Cell £1:521). Adicionalmente, alguns enhancers são reguláveis e tornam-se activos apenas na presença de um indutor, tal como uma hormona ou um ião metálico (Sassone-Corsi e Borelli (1986), Trends Genet. £:215; Maniatis et al. (1987) Science 236:1237).
Uma molécula de DNA pode ser expressa intracelularmente em células de mamífero. Uma sequência promotora pode ser directamente ligada à molécula de DNA, caso no qual o primeiro aminoácido na extremidade N da proteína recombinante será sempre uma metionina, que é codificada pelo codão de iniciação ATG. Se desejado, a extremidade N poderá ser clivada da proteína por incubação in vitro com brometo de cianogénio.
Alternativamente, poderão também ser secretadas proteínas estranhas pela célula, para o meio de cultura, através da criação de moléculas de DNA quimérico que codificam para uma proteína de fusão composta por um fragmento de sequência leader que possibilita a secreção da proteína estranha em células de mamífero. De preferência, existirão locais de processamento, codificados entre o fragmento leader e o gene estranho, que podem ser clivados tanto in vitro como in vivo. 0 fragmento da sequência leader codifica tipicamente para um péptido de sinal, constituído por aminoácidos hidrofóbicos, que dirige a secreção da proteína pela célula. 0 leader tripartido do adenovirus é um exemplo de uma sequência leader que possibilita a secreção de uma proteína estranha em células de mamífero.
Tipicamente, as sequências de terminação da transcrição e de poliadenilação reconhecidas pelas células de mamífero são regiões reguladoras localizadas no sentido 3' em relação ao codão de terminação da tradução, pelo que, juntamente com os elementos promotores, flanqueiam a sequência codificante. A extremidade 3' do mRNA maduro é formada através de clivagem pós-transcripcional, específica de local, e de poliadenilação (Birnstiel et al.
(1985), Cell 41:349; Proudfoot e Whitelaw (1988) «Termination and
3' end processing of eucaryotic RNA.» , em Transcription and Splicing (eds. B.D. Hames e D.M. Glover); Proudfoot (1989), Trends Biochem. Sei. 14:105). Estas sequências dirigem a transcrição de um mRNA que pode ser traduzido para o polipéptido codificado pelo DNA. Exemplos de sinais de terminação da transcrição/poliadenilação incluem os derivados do SV40 (Sambrook et al. (1989), Expression of cloned genes in cultured mammalian cells., em Molecular Cloning: A Laboratory Manual).
Alguns genes podem ser mais eficientemente expressos se estiverem presentes introns (também designados por sequências intervenientes). No entanto, têm sido expressos de forma eficiente vários cDNAs a partir de vectores que não possuem sinais de splicing (também designados por local dador de splice e local aceitador de splice), (ver, e.g., Gothing e Sambrook (1981), Nature 293:620). Os introns são sequências intervenientes não codificantes no interior de uma sequência codificante que contêm locais aceitadores e dadores de splice. Os introns são removidos por um processo designado por splicing, após a poliadenilação do produto primário da transcrição (Nevins (1983), Annu. Rev. Biochem. 52:441; Green (1986), Annu. Rev. Genet. 20:671; Padgett et al. (1986), Annu. Rev. Biochem. 55:1119; Krainer e Maniatis (1988), RNA splicing., em Transcription and splicing (eds. B.D. Hames e D.M. Glover).
Tipicamente, os componentes acima descritos, compreendendo um promotor, um sinal de poliadenilação, e uma sequência de terminação da transcrição são reunidos em construções de expressão. Se desejado, poderão igualmente ser incluídos numa construção de expressão enhancers, introns com locais aceitadores e dadores de splice funcionais, e sequências leader. As construções de expressão são frequentemente mantidas num replicon, tal como um elemento extracromossómico (e.g., plasmídeos) capaz de se manter de forma estável num hospedeiro, tal como células de mamífero ou bactérias. Os sistemas de replicaçâo de mamífero incluem os derivados de vírus de animais, que requerem a presença de factores trans-actuantes para a sua replicaçâo. Por exemplo, os plasmídeos contendo os sistemas de replicaçâo dos papovavírus, como o SV40 (Gluzman (1981), Cell 23:175) ou poliomavírus, replicam-se com um elevado número de cópias na presença do antigénio T virai adequado. Exemplos adicionais de replicons de mamífero incluem os derivados do papilomavírus bovino e do vírus de Epstein-Barr. Adicionalmente, o replicon pode possuir dois sistemas de replicaçâo, o que permite que este se mantenha, por exemplo, em células de mamífero para a sua expressão e num hospedeiro procariótico para a clonagem e amplificação. Exemplo de tais vectores de vai-vem mamífero-bactéria incluem o pMT2 (Kaufman et al. (1989), Moll. Cell. Biol. SH946 e o pHEBO (Shimizu et al. (1986), Mol♦ Cell. Biol. 6:1074).
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Sistemas de Expressão dos Baculovírus
Um promotor de baculovírus é qualquer sequência de DNA capaz de receber a ligação de uma RNA polimerase de baculovírus e de iniciar a transcrição a jusante (3') de uma sequência codificante (e.g., um gene estrutural) para se obter o mRNA. Um promotor possuirá uma região de iniciação da transcrição, que se encontra geralmente em posição proximal relativamente à extremidade 5' da sequência codificante. Esta região de iniciação da transcrição inclui tipicamente um local de ligação da RNA polimerase e um local de iniciação da transcrição. Um promotor de baculovírus poderá igualmente possuir um segundo domínio designado por enhancer, que, quando presente, se encontra geralmente em posição distai relativamente ao gene estrutural. A expressão poderá ser regulada ou constitutiva.
As sequências codificando para genes, que são abundantemente transcritos em estádios tardios no ciclo de infecção, proporcionam sequências promotoras particularmente úteis. Exemplos destas sequências incluem sequências derivadas dos genes da poliedrina (Friesen et al. (1986), The Regulation of Baculovírus Gene Expression, em: The Molecular Biology of Baculoviruses (ed. Walter Doerfler); as publicações E.P.O. nos. 127.839 e 155.476) e do plO (Vlak et al. (1988), J. Gen. Virol. 69:765).
Uma molécula de DNA pode ser expressa intracelularmente. Uma sequência promotora pode estar directamente ligada à molécula de D.NA, caso em que o primeiro aminoácido na extremidade N-terminal da proteína recombinante será sempre uma metionina, que é codificada pelo codão de iniciação ATG. Se desejado, a metionina na extremidade N pode ser clivada da proteína por incubação in vitro com brometo de cianogénio.
As proteínas de fusão proporcionam uma alternativa à expressão directa. Tipicamente, uma sequência de DNA codificando para a porção N-terminal de uma proteína endógena de levedura, ou outra proteína estável, é fundida às extremidades 5' de sequências codificantes heterólogas. Ao se dar a expressão, esta construção fornecerá uma fusão das duas sequências de aminoácidos. Por exemplo, a extremidade N do gene da poliedrina poderá estar ligada à extremidade 5' de um gene estranho e ser expressa em leveduras. A sequência de DNA localizada na junção das duas sequências de aminoácidos pode codificar ou não para um local clivável. Ver, e.g., Luckow et al. (1988), Bio/technology 6:47.
Alternativamente, as proteínas estranhas poderão igualmente ser secretadas a partir da célula através da criação de moléculas de DNA quimérico codificando para uma proteína de fusão, composta por um fragmento de sequência leader que proporciona a secreção da proteína estranha em insectos. 0 fragmento de sequência leader codifica tipicamente para um péptido de sinal, composto por aminoácidos hidrofóbicos que dirigem a secreção da proteína para fora da célula.
DNA codificando para sequências de sinal adequadas poderá ser derivado de genes de proteínas secretadas por insectos ou baculovírus, tal como o gene da poliedrina do baculovírus (Carbonell et al. (1988), Gene 73:409). Alternativamente, sequências leader não provenientes de baculovírus, como as derivadas de genes codificando para o α-interferon humano (Maeda et al. (1985), Nature 315:592), péptido de libertação da gastrina humana (Lebacq-Verheyden et al. (1988), Molec. Cell. Biol. 873129), a IL-2 humana (Smith et al. (1985), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:8404), a IL-3 de rato (Miyajima et al. (1987), Gene 58:273), e a glucocerebrosidase humana (Martin et al. (1988), DNA 2:99), possibilitam igualmente a secreção em insectos.
Tipicamente, as sequências de terminação da transcrição, reconhecidas por insectos, são regiões reguladoras localizadas a 3' do codão de terminação da tradução, e que desta forma flanqueiam, juntamente com o promotor, a sequência codificante. Estas sequências dirigem a transcrição de um mRNA que pode ser traduzido para o polipéptido codificado pelo DNA. Exemplos de sequências de terminação da transcrição incluem as derivadas do gene da poliedrina (Miller et al. (1988), Ann. Rev. Microbiol. 42:177).
Previamente à inserção do gene estranho no genoma do baculovírus, os componentes acima descritos, compreendendo um promotor, um leader (se desejado), a sequência codificante de interesse, e a sequência de terminação da transcrição, são tipicamente reunidos numa construção intermédia de transinserçâo. As construções intermédias de trans-inserçâo são manutenção, procariótico frequentemente mantidas num replicon, tal como um elemento extracromossómico (e.g., plasmideos), capaz de se manter de forma estável num hospedeiro, tal como uma bactéria. 0 replicon possuirá um sistema de replicaçâo, permitindo assim a sua para clonagem e amplificação, num hospedeiro 0 promotor e a sequência de terminação da transcrição, presentes na construção, compreenderão tipicamente uma secção, com 2,5 kb, do genoma do baculovírus, para que seja possível a integração do gene estranho no genoma do baculovírus através de fenómenos de recombinação duplamente cruzada, produzindo-se um vector de expressão de baculovírus (Miller et al. (1989), Bioessays 4:91). 0 vector de expressão de baculovírus é tipicamente armazenado num baculovírus recombinante infeccioso.
Ao usarem-se vectores de expressão de baculovírus, não são geralmente usados marcadores seleccionáveis, tais como os genes de resistência a antibióticos. A selecçâo é tipicamente efectuada por inspecção visual para pesquisa de corpos de oclusão. Exemplos do uso de marcadores seleccionáveis são dados em outros passos desta Especificação.
Têm sido desenvolvidos vectores de expressão de baculovírus recombinantes para infecção de diversas células de insectos. Por exemplo, têm sido desenvolvidos baculovírus recombinantes para, entre outros: Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Heliothis zea, Spodoptera fruqiperda, e Trichoplusia ni (P.C.T. WO 89/046699; Carbonell et al. (1985), J. Virol. 56:153; Smith et al. (1983),
Mol. Cell. Biol. 3:2156; Wright (1986), Nature 321:718; ver, genericamente, Fraser et al. (1989), In Vitro Cell. Dev. Biol. 25:225).
São bem conhecidos da técnica os métodos de introdução de DNA exógeno em insectos hospedeiros, métodos esses que tipicamente incluem ou a transfecção das células do insecto hospedeiro com DNA ou a infecção de células de insecto ou de insectos vivos, geralmente larvas, com vírus. As técnicas de transfecção são baseadas na técnica do fosfato de cálcio que foi originalmente desenvolvida para as células de mamífero (Graham et al. (1973), Virology 52:456). As técnicas de transfecção com DNA e de infecção virai variam geralmente com o género do insecto a ser transformado. Ver, e.g., Autograph (Carstens et al. (1980), Virology 101:311), Heliothis (virescens) (P.C.T. Pub. Na W088/02030), Spodoptera (Kang (1988), Baculovirus Vectors for Expression of Foreign Genes, em: Advances in Virus Research, vol. 35).
Sistemas Bacterianos de Expressão
Um promotor bacteriano é qualquer sequência de DNA capaz de receber a ligação de uma RNA polimerase bacteriana e de iniciar a transcrição a jusante (3'f) de uma sequência codificante (e.g., gene estrutural) para se obter mRNA. Um promotor possuirá uma região de iniciação da transcrição que se encontra geralmente em posição proximal relativamente à extremidade 5' da sequência codificante. Esta região de iniciação
da transcrição inclui tipicamente um local de ligação da RNA polimerase e um local de iniciação da transcrição. Um promotor bacteriano poderá igualmente possuir um segundo domínio designado como operador, que poderá coincidir em parte com um local adjacente de ligação à RNA polimerase no qual é iniciada a síntese de RNA. 0 operador permite uma transcrição por regulação negativa (indutível), uma vez que uma proteína repressora de gene se pode ligar ao operador, inibindo, deste modo, a transcrição de um gene específico. Pode ocorrer uma expressão constitutiva na ausência de elementos de regulação negativa, tais como o operador. Adicionalmente, pode conseguir-se uma regulação positiva através de uma sequência proteica de ligação, activadora de gene, que, quando presente, se encontra geralmente em posição proximal (5') em relação à sequência de ligação à RNA polimerase. Um exemplo de uma proteína activadora de gene é a proteína activadora de catabolitos (CAP), que tem um papel adjuvante na iniciação da transcrição do operâo lac na Escherichia coli (E. coli) (Raibaud et al. (1984), Annu. Rev. Genet. 18:173). A expressão regulada pode, então, ser positiva ou negativa, sendo desta forma ampliada ou reduzida a transcrição.
As sequências codificando para enzimas das vias metabólicas proporcionam sequências promotoras particuiarmente úteis. Exemplos incluem sequências promotoras derivadas de enzimas metabolizadoras de açúcares, tais como a galactose, lactose (lac) (Chang et al. (1977), Nature 198:1056), e maltose. Exemplos adicionais incluem sequências promotoras derivadas de enzimas biossintéticos, como os do triptofano (trp) (Goeddel et al. (1980), Nuc. Acids Res. 8;4057; Yelverton et al. (1981), Nucl. Acids Res. 2J731; a Patente Norte-americana Ns 4.738.921; as E.P.O. Publ. nos. 36.776 e 121.775). O sistema promotor da τlactamase (bla) (Weissman (1981), The cloning of interferon and other mistakes, em Interferon 3 (ed. I. Gressner)), o sistema promotor do bacteriófago lambda PL(Shimatake et al. (1981), Nature 292:128) e o sistema promotor do T5 (Patente Norteamericana Ns 4.689.406) proporcionam igualmente sequências promotoras úteis.
Adicionalmente, promotores sintéticos que não ocorrem na natureza funcionam igualmente como promotores bacteríanos. Por exemplo, sequências de activação da transcrição de um promotor bacteriano ou de bacteriófago podem ser reunidas com as sequências operâo de um outro promotor bacteriano ou de bacteriófago, criando um promotor híbrido sintético (Patente Norte-americana N9 4.551.433). Por exemplo, o promotor tac é um promotor híbrido trp-lac composto por sequências de promotor trp e de operão lac, que é regulado pelo repressor lac (Amann et al. (1983), Gene 25:167; de Boer et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sei. 80:21). Adicionalmente, um promotor bacteriano pode incluir promotores de ocorrência natural de origem não bacteriana que possuem a capacidade de receber a ligação da RNA polimerase bacteriana e iniciar a transcrição. Um promotor de ocorrência natural de origem não bacteriana pode igualmente ser acoplado a uma RNA polimerase compatível para obtenção de elevados níveis de expressão de alguns genes em procariotas. 0 sistema RNA polimerase/promotor do bacteriófago T7 é um exemplo de um sistema promotor acoplado (Studier et al. (1986), J. Mol. Biol. 189:113; Tabor et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. 82:1074). Ainda, um promotor híbrido pode igualmente ser composto por um promotor de bacteriófago e por uma região operadora de E. coli (Publicação E.P.O. N2 267.851).
Para além de uma sequência promotora funcional, é também útil a existência de um local eficiente de ligação ao ribossoma para a expressão de genes estranhos em procariotas. Na E. coli, o local de ligação ao ribossoma é designado por sequência de Shine-Dalgarno (SD) e inclui um codão de iniciação (ATG) e uma sequência de 3-9 nucleótidos de comprimento, localizada 3-11 nucleótidos a montante do codão de iniciação (Shine et al. (1975), Nature 254:34). Pensa-se que a sequência SD promova a ligação do mRNA ao ribossoma através do emparelhamento de bases entre a sequência SD e a extremidade 3' do rRNA 16S da E. coli (Steitz et al. (1979), Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA., em Biological Regulation and Development: Gene Expression (ed. R.F. Goldberger), para a expressão de genes eucarióticos e procarióticos com um local fraco de ligação ao ribossoma (Sambrook et al. (1989), Expression of cloned genes in Escherichia coli., em Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
Uma molécula de DNA pode ser expressa intracelularmente. É possível ligar directamente uma sequência promotora à molécula de DNA, caso em que o primeiro aminoácido na extremidade N será sempre uma metionina, que é codificada pelo codao de iniciação ATG. Se desejado, a metionina na extremidade N pode ser clivada da proteína por incubação in vitro com brometo de cianogénio, ou por incubação in vivo ou in vitro com uma metionina N-terminal peptidase bacteriana (Publicação E.P.O. N2 219.237).
As proteínas de fusão proporcionam uma alternativa à expressão directa. Tipicamente, uma sequência de DNA codificando para a porção N-terminal de uma proteína bacteriana endógena, ou outra proteína estável, é fundida às extremidades 5' de sequências codificantes heterólogas. Ao se dar a expressão, esta construção proporcionará uma fusão das duas sequências de aminoácidos. Por exemplo, o gene celular do bacteriófago lambda pode ser ligado à extremidade 5' de um gene estranho e ser expresso em bactérias. A proteína de fusão resultante possui de preferência um local para uma enzima de processamento (factor Xa), para a clivagem da proteína do bacteriófago a partir do gene estranho (Nagai et al. (1984), Nature 309:810) . As proteínas de fusão podem igualmente ser formadas por sequências dos genes lacZ (Jia et al. (1987), Gene £0:197), trpE (Allen et al. (1987), J. Biotechnol. 5:93; Makoff et al. (1989), J. Gen. Microbiol. 135:11) e Chey (E.P.O. Publ. N2 324.647). A sequência de DNA localizada ao nível da junção das duas sequências de aminoácidos pode codificar ou não para um local clivável. Outro exemplo é uma proteína de fusão da ubiquitina. Uma tal proteína de fusão é ί» construída com a região da ubiquitina que retém, de preferência, um local para uma enzima de processamento (e.g. uma protease de processamento específico da ubiquitina), para a clivagem da ubiquitina a partir da proteína estranha. Através deste método, poderá ser isolada a proteína estranha nativa (Miller et al. (1989), Bio/Technology 7:698).
Alternativamente, pode igualmente obter-se a secreção de proteínas estranhas pela célula, através da criação de moléculas de DNA quimérico codificando para uma proteína de fusão composta por um fragmento com a sequência de um péptido de sinal, que possibilita a secreção da proteína estranha em bactérias (Patente Norte-americana N2 4.336.336). 0 fragmento da sequência de sinal codifica tipicamente para um péptido de sinal composto por aminoácidos hidrofóbicos que dirigem a secreção da proteína pela célula. A proteína poderá ser secretada para o meio de crescimento (bactérias gram-positivas) ou para o espaço periplásmico, localizado entre as membranas interior e exterior da célula (bactérias gram-negativas). Existem, de preferência, locais de processamento, que podem ser clivados in vivo ou in vitro, codificados entre o fragmento do péptido de sinal e o gene estranho.
DNA codificando para sequências de sinal adequadas poderá ser derivado de genes para proteínas bacterianas secretadas, tais como o gene da proteína da membrana exterior da E. coli (ompA) (Masui et al. (1983), em: Experimental Manipulation of Gene Expression; Ghrayeb et al. (1984), EMBO J.
J
3:2437) e a sequência de sinal da fosfatase alcalina da E. coli (phoA) (Oka et al. (1985), Proc. Natl. Acad. Sei. 82:7212). Como um exemplo adicional, pode ser usada a sequência de sinal do gene da alfa-amilase de diversas estirpes de Bacillus para a secreção de proteínas heterólogas pelo B. subtilis (Paiva et al. (1982), Proc. Natl, Acad. Sei. USA 79:5582; Publicação E.P.O. N2 244.042).
Tipicamente, as sequências de terminação da transcrição, reconhecidas por bactérias são regiões reguladoras localizadas na posição 3' relativamente ao codâo de terminação da tradução, que assim, juntamente com o promotor, flanqueiam a sequência codificante. Estas sequências dirigem a transcrição de um mRNA que pode ser traduzido para o polipéptido codificado pelo DNA. As sequências de terminação da transcrição incluem frequentemente sequências de DNA de cerca de 50 nucleótidos, capazes de formar estruturas em stem loop que funcionam como adjuvantes na terminação da transcrição. Exemplos incluem sequências de terminação da transcrição derivadas de genes com promotores fortes, tal como o gene trp da E. coli, assim como outros genes biossintéticos.
Tipicamente, os componentes acima descritos, compostos por um promotor, sequência de sinal (se desejado), sequência codificante de interesse, e sequência de terminação da são reunidos em construções de expressão. As de expressão são frequentemente mantidas num transcrição, construções replicon, tal como um elemento extracromossómico (e.g., plasmídeos), capaz de se manter de forma estável num hospedeiro, como uma bactéria. 0 replicon possuirá um sistema de replicação, o qual permitirá a sua manutenção num hospedeiro procariótico para fins de expressão ou de clonagem e amplificação. Adicionalmente, um replicon poderá ser um plasmídeo de um elevado ou de um baixo número de cópias. Um plasmídeo de um elevado número de cópias originará geralmente um número de cópias no intervalo de cerca de 5 a cerca de 200, e tipicamente de cerca de 10 a cerca de 150. Um hospedeiro contendo um plasmídeo de elevado número de cópias conterá de preferência pelo menos cerca de 10, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 20 plasmídeos. Poderá ser seleccionado um vector de elevado ou de baixo número de cópias, dependendo do efeito que o vector e a proteína estranha exercem sobre o hospedeiro.
Alternativamente, as construções de expressão poderão ser integradas no genoma bacteriano por meio de um vector integrativo. Os vectores integrativos incluem tipicamente pelo menos uma sequência homóloga ao cromossoma bacteriano, que permite a integração do vector. As integrações parecem resultar de recombinações entre DNA homólogo do vector e do cromossoma bacteriano. Por exemplo, os vectores integrativos construídos com DNA de diversas estirpes de Bacillus integram-se no cromossoma de Bacillus (Publicação E.P.O. N2 127.328). Os vectores integrativos podem igualmente ser compostos por sequências de bacteriófago ou de transposão.
Tipicamente, as construções de expressão extracromossómicas ou integrativas podem conter marcadores seleccionáveis que permitam a selecçâo das estirpes bacterianas que foram transformadas. Os marcadores seleccionáveis podem ser expressos no hospedeiro bacteriano, e podem incluir genes que tornam a bactéria resistente a fármacos tais como a ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, kanamicina (neomicina), e tetraciclina (Davies et al. (1978), Annu. Rev. Microbiol. 3,2:469). Os marcadores seleccionáveis poderão igualmente incluir genes biossintéticos, tais como os correspondentes às vias biossintéticas da histidina, triptofano e leucina.
Alternativamente, alguns dos componentes acima descritos podem ser reunidos para formar vectores de transformação. Os vectores de transformação são tipicamente compostos por um marcador seleccionável, que poderá ser mantido num replicon ou inserido num vector integrativo, como acima descrito.
Têm sido desenvolvidos vectores de expressão e transformação, tanto replicons extracromossómicos como vectores integrativos, para a transformação de uma larga variedade de bactérias. Por exemplo, foram desenvolvidos vectores de expressão para, entre outras, as bactérias seguintes: Bacillus subtilis (Paiva et al. (1982), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:5582; Publicação E.P.O. NSs 36.259 e 63.953; P.C.T. WO 84/04541), Escherichia coli (Shimatake et al. (1981), Nature 292:128; Amann et al. (1985), Gene 40:183; Studier et al. (1986), J. Mol. Biol. 189:113; Publicações E.P.O. N2s 36.776, 136.829 e
136.907? Pedido de Patente do Reino Unido com o número de série
8418273), Streptococcus cremoris (Powell et al. (1988), Appl.
Environ. Microbiol. 54:655)? Streptococcus lividans (Powell et al. (1988), Appl. Environ. Microbiol. 54:655), Streptomyces lividans (Patente Norte-americana Ns 4.745.056).
Sao bem conhecidos da técnica os métodos de introdução de DNA exógeno em hospedeiros bacterianos, métodos esses que incluem, tipicamente, a transformação de bactérias tratadas com CaCl2 ou outros agentes, tais como catiões divalentes ou DMSO. O DNA pode igualmente ser introduzido nas células bacterianas por electroporaçâo. As técnicas de transformação variam usualmente segundo a espécie bacteriana a ser transformada. Ver, e.g., (Masson et al. (1989), FEMS Microbiol. Lett. 60:273; Paiva et al. (1982), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79;5582; Publicação E.P.O. N2s
36.259 e 63.953; P.C.T. WO 84/04541, Bacillus), (Miller et_al.
(1988), Proc. Natl. Acad. Sei. 85:856; Wang et al. (1990), J. Bacteriol. 172:949, Campylobacter), (Cohen et al. (1973) Proc. Natl. Acad. Sei. 69:2110; Dower et al. (1988), Nucleic Acids Res♦ 16:6127; Kushner (1978), An improved method for transformation of Escherichia coli with ColEl-derived plasmids., em Genetic Engineering: Proceedinqs of the International Symposium on
Genetic Engineering (eds. H.W. Boyer e S. Nicosia); Mandei et al. (1970), J. Mol. Biol. 53:159; Taketo (1988), Biochim. Biophys. Acta 949:318; Escherichia), (Chassy et al. (1987), FEMS Microbiol. Lett. 44:173, Lactobacillus); (Fiedler et al. (1988), Anal. Biochem. 170:38, Pseudomonas); (Augustin et al. (1990),
FEMS Microbiol. Lett. 66:203, Staphylococcus); (Barany et al. (1980), J. Bacteriol. 144:698; Harlander (1987) Transformation of lactis by electroporation, em: Streptococcal Genetics (ed. J. Ferreti e R. Curtiss III); (Perry et al. (1981), Infec. Immun. 22:1295; Powell et al. (1988), Appl. Environ. Microbiol. 54:655; Somkuti et al. (1987), Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology 1:412, Streptococcus).
Descrição: Sistema de Expressão de Leveduras Um promotor de levedura é qualquer sequência de DNA capaz de receber a ligação de uma RNA polimerase de levedura e de iniciar a transcrição a jusante (3') de uma sequência codificante (e.g., gene estrutural) para se obter mRNA. Um promotor possuirá uma região de iniciação da transcrição que se encontra geralmente em posição proximal relativamente à extremidade 5' da sequência codificante. Esta região de iniciação da transcrição inclui tipicamente um local de ligação da RNA polimerase (a TATA box) e um local de iniciação da transcrição. Um promotor de levedura poderá igualmente possuir um segundo domínio designado como sequência activadora a montante (UAS), que, se presente, se encontra geralmente em posição distai relativamente ao gene estrutural. A UAS permite uma expressão regulada (indutível). A expressão constitutiva ocorre na ausência de uma UAS. A expressão regulada poderá ser positiva ou negativa, ampliando ou reduzindo a transcrição desta forma.
Uma levedura é um organismo fermentativo com uma via metabólica activa; assim, as sequências codificando para enzimas da via metabólica proporcionam sequências promotoras particularmente úteis. Exemplos incluem a álcool desidrogenase (ADH) (Publicação E.P.O. N2 284044), enolase, glucoquinase, glucose-6-fosfato isomerase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAP ou GAPDH), hexoquinase, fosfofrutoquinase, 3fosfoglicerato mutase, e piruvato quinase (PyK) (Publicação E.P.O. N2 329203). O gene PHO5 de levedura, codificando para a fosfatase ácida, proporciona igualmente sequências promotoras úteis (Myanohara et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80;1).
Adicionalmente, os promotores sintéticos que não ocorrem na natureza funcionam igualmente como promotores de leveduras. Por exemplo, as sequências UAS de um promotor de levedura podem ser reunidas à região de activação da transcrição de outro promotor de levedura, criando um promotor híbrido sintético. Exemplos de tais promotores híbridos incluem a sequência reguladora da ADH ligada à região de activação da transcrição da GAP (Patentes Norte-Americanas N2s. 4.876.197 e 4.880.734). Outros exemplos de promotores híbridos incluem promotores consistindo nas sequências reguladoras dos genes ADH2, GAL4, GAL10 or PHO5, combinadas com a região de activação transcricional de um gene de enzima glicolítica, tal como a GAP ou a PyK (Publicação E.P.O. N2 164556). Adicionalmente, um promotor de levedura pode incluir promotores de ocorrência natural não provenientes de leveduras, possuindo a capacidade de receber a ligação da RNA polimerase de levedura e de iniciar a transcrição. Exemplos de tais promotores incluem, entre outros, (Cohen et al. (1980), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77;1078; Henikoff et al. (1981), Nature 283;835; Hollenberg et al. (1981), Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96:119; Hollenberg et al. (1979), The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae, em: Plasmids of Medicai, Environmental and Commercial Importance (eds. K.N. Timmis e A. Puhler); Mercerau-Puigalon et al. (1980), Gene 11:163; Panthier et al. (1980), Curr. Genet. 2:109).
Uma molécula de DNA pode ser expressa intracelularmente em leveduras. É possível ligar directamente uma sequência promotora à molécula de DNA, caso em que o primeiro aminoácido na extremidade N da proteína recombinante será sempre uma metionina, que é codificada pelo codão de iniciação ATG. Se desejado, a metionina na extremidade N pode ser clivada da proteína por incubação in vitro com brometo de cianogénio.
As proteínas de fusão proporcionam uma alternativa à expressão directa. Tipicamente, uma sequência de DNA codificando para a porção N-terminal de uma proteína endógena de levedura, ou outra proteína estável, é fundida às extremidades 5' de sequências codificantes heterólogas. Ao se dar a expressão, esta construção proporcionará uma fusão das duas sequências de aminoácidos. Por exemplo, o gene da superóxido dismutase (SOD) de levedura ou humana pode ser ligado à extremidade 5' de um gene estranho e ser expresso em leveduras. A sequência de DNA localizada na junção das duas sequências de aminoácidos pode codificar, ou não, para um local clivável. Ver, e.g., a Publicação E.P.O. N2 196056. Outro exemplo é uma proteína de fusão da ubiquitina. Uma tal proteína de fusão é construída com a região da ubiquitina que retém, de preferência, um local para uma enzima de processamento (e.g. uma protease de processamento específico da ubiquitina), para a clivagem da ubiquitina a partir da proteína estranha. Através deste método, poderá ser isolada a proteína estranha nativa (P.C.T. WO 88/024066; Pedido de Patente Norte-americana com o N2 de série 359.599, de 7 de Agosto de 1989, a apresentação da qual é aqui incorporada para referência). Este sistema é o actualmente preferido para a produção da IGFBP-4.
Alternativamente, pode igualmente obter-se a secreção de proteínas estranhas pela célula, para o meio de crescimento, através da criação de moléculas de DNA quimérico codificando para uma proteína de fusão composta por um fragmento de sequência leader, que possibilita a secreção da proteína estranha em leveduras. Existem, de preferência, locais de processamento, codificados entre o fragmento leader e o gene estranho, que podem ser clivados in vivo ou in vitro. 0 fragmento da sequência leader codifica tipicamente para um péptido de sinal composto por aminoácidos hidrofóbicos que dirigem a secreção da proteína pela célula.
DNA codificando para sequências de sinal adequadas poderá derivar de genes correspondentes a proteínas secretadas por leveduras, tais como o gene da invertase de levedura (Publicação E.P.O. . Na 12873; J.P.O. Publ. Na 62.096.086) e o gene do factor A (Patente Norte-americana Na. 4.588.684).
Alternativamente, existem leaders não provenientes de leveduras, tal como um leader do interferon, que possibilitam igualmente a secreção em leveduras (Publicação E.P.O. . Ne 60057).
Uma classe preferida de leaders de secreção é a dos que utilizam um fragmento do gene do factor alfa da levedura, que contém tanto uma sequência de sinal «pré» como uma região «pró». Os tipos de fragmentos de factor alfa que podem ser utilizados incluem o leader pré-pró do factor alfa completo (cerca de 83 resíduos de aminoácidos), assim como leaders do factor alfa truncado (tipicamente cerca de 25 a cerca de 50 resíduos de aminoácidos) (Patentes Norte-americanas N2s. 4.546.083 e 4.870.008; Publicação E.P.O. N2 324274). Leaders adicionais utilizando um fragmento leader do factor alfa que possibilita a secreção incluem leaders híbridos de factor alfa construídos com uma pré-sequência de uma primeira levedura, mas uma pró-região do factor alfa de uma segunda levedura (ver, e.g., P.C.T. WO 89/02463) .
Tipicamente, as sequências de terminação da transcrição reconhecidas por leveduras são regiões reguladoras localizadas em posição 3' relativamente ao codão de terminação da tradução, que assim, juntamente com o promotor, flanqueiam a sequência codificante. Estas sequências dirigem a transcrição de um mRNA que pode ser traduzido para o polipéptido codificado pelo DNA. Exemplos de sequências de terminação da transcrição, e de outras sequências de terminação reconhecidas por leveduras, incluem as codificando para enzimas glicolíticas.
Tipicamente, os componentes acima descritos, compostos por um promotor, leader (se desejado), sequência codificante de interesse, e sequência de terminação da transcrição, são reunidos em construções de expressão. As construções de expressão são frequentemente mantidas num replicon, tal como um elemento extracromossómico (e.g., plasmídeos), capaz de se manter de forma estável num hospedeiro, tal como uma levedura ou uma bactéria. 0 replicon poderá possuir dois sistemas de replicação, permitindo a sua manutenção, por exemplo, numa levedura para fins de expressão e num hospedeiro procariótico para fins de clonagem e amplificação. Exemplos de tais vectores de vai-vem levedurabactéria incluem o YEp24 (Botstein et al. (1979), Gene 8:17-24), pCl/1 (Brake et al. (1984), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:46424646), e YRpl7 (Stinchcomb et al. (1982), J. Mol. Biol. 158:157). Adicionalmente, um replicon poderá ser um plasmideo de um elevado ou de um baixo número de cópias. Um plasmideo de um elevado número de cópias originará geralmente um número de cópias no intervalo de cerca de 5 a cerca de 200, e tipicamente de cerca de 10 a cerca de 150. Um hospedeiro contendo um plasmideo de elevado número de cópias conterá de preferência pelo menos cerca de 10, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 20 plasmídeos. Poderá ser seleccionado um vector de elevado ou de baixo número de cópias, dependendo do efeito que o vector e a proteína estranha exercem sobre o hospedeiro. Ver, e.g., Brake et al., supra.
Alternativamente, as construções de expressão poderão ser integradas no genoma da levedura através de um vector integrativo. Os vectores integrativos contêm tipicamente pelo menos uma sequência, homóloga a um cromossoma de levedura, que permite a integração do vector, e contêm, de preferência, duas sequências homólogas que flanqueiam a construção de expressão. As integrações parecem resultar de recombinações entre DNA homólogo do vector e do cromossoma da levedura (Orr-Weaver et al. (1983), Methods in Enzymol. 101:228-245). Um vector integrativo pode ser dirigido para um locus específico na levedura, através da selecçâo da sequência homóloga apropriada para inclusão no vector. Ver Orr-Weaver et al, supra. Podem ser integradas uma ou mais construções de expressão, possivelmente afectando os níveis de proteína recombinante produzida (Rine et al (1983), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:6750). As sequências cromossómicas incluídas no vector podem ocorrer sob a forma de um segmento único no vector, o que resulta na integração do vector completo, ou sob a forma de dois segmentos homólogos a segmentos adjacentes no cromossoma e flanqueando a construção de expressão no vector, o que pode resultar na integração estável de apenas a construção de expressão.
Tipicamente, as construções de expressão extracromossómicas e integrativas poderão conter marcadores seleccionáveis que permitam a selecçâo das estirpes de leveduras que foram transformadas. Os marcadores seleccionáveis podem incluir genes biossintéticos que podem ser expressos na levedura resistência à
Adicionalmente, hospedeira, tais como o ADE2, HIS4, LEU2, TRP1, e ALG7, e o gene de resistência G418, que conferem às células de leveduras a tunicamicina e ao G418, respectivamente.
um marcador seleccionável adequado poderá igualmente proporcionar à levedura a capacidade de crescer na presença de compostos tóxicos, como o metal. Por exemplo, a presença do CUPl permite que a levedura cresça na presença de iOes cobre (Butt et al. (1987), Microbiol. Rev. 51:351).
Alternativamente, alguns dos componentes acima descritos podem ser reunidos para formar vectores de transformação. Os vectores de transformação são tipicamente compostos por um marcador seleccionável, que poderá ser mantido num replicon ou desenvolvido num vector integrativo, como acima descrito.
Têm sido desenvolvidos vectores de expressão e transformação, tanto replicons extracromossómicos como vectores integrativos, para a transformação de uma larga variedade de leveduras. Por exemplo, foram desenvolvidos vectores de expressão para, entre outras, as leveduras seguintes: Candida albicans (Kurtz et al. (1986), Mol. Cell. Biol. £:142), Candida maltosa (Kunze et al. (1985), J. Basic Microbiol. 25:141), Hansenula polymorpha (Gleeson et al. (1986), J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp et al. (1986), Mol. Gen. Genet. 202:302), Kluyveromyces fragilis (Das et al. (1984), J. Bacteriol. 158:1165), Kluyveromyces lactis (De Louvencourt et al. (1983), J, Bacteriol. 154:737; Van den Berg et al. (1990), Bio/Technology
8:135), Pichia guillerimondii (Kunze et al. (1985), J. Basic Microbiol. 25:141), Pichia pastoris (Cregg et al. (1985), Mol. Cell. Biol. 5:3376; patentes norte-americanas nos. 4.837.148 e 4.929.555), Saccharomyces cerevis iae (Hinnen et al. (1978), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:1929; Ito et al. (1983), J. Bacteriol. 153:163), Schizosaccharomyces pombe (Beach e Nurse (1981), Nature 300:706), e Yarrowia lipolytica (Davidow et al. (1985), Curr. Genet. 10:380471; Gaillardin et al. (1985), Curr. Genet. 10 :49).
Os métodos de introdução de DNA exógeno em leveduras hospedeiras são bem conhecidos da técnica, e incluem tipicamente a transformação de esferoplastos ou de células intactas de leveduras tratadas com catiões alcalinos. As técnicas de transformação variam geralmente com a espécie de levedura a ser transformada. Ver, e.g., (Kurtz et al. (1986), Mol. Cell. Biol. Ç>:142; Kunze et al. (1985), J. Basic Microbiol. 25:141; Candida); (Gleeson et al. (1986), J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp et al. (1986), Mol. Gen. Genet. 202:302; Hansenula); (Das et al. (1984), J. Bacteriol. 158:1165; De Louvencourt et al. (1983), J. Bacteriol. 154:1165; Van den Berg et al. (1990), Bio/Technology (3:135; Kluyveromyces); (Cregg et al. (1985), Mol. Cell. Biol. 5:3376; Kunze et al. (1985), J. Basic Microbiol. 25:141; patentes norte-americanas nos. 4.837.148 e 4.929.555; Pichia); (Hinnen et al. (1978), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:1929; Ito et al. (1983), J. Bacteriol. 153:163; Saccharomyces); (Beach e Nurse (1981), Nature 300:706; Schizosaccharomyces); (Davidow et al. (1985), Curr. Genet. 10:39; Gaillardin et al. (1985), Curr.
Genet. 10:49; Yarrowia).
Métodos de Diagnóstico Utilizando Antigénios
As composições compreendendo antigénios do invento, assim como o material genético, podem ser usadas em ensaios de diagnóstico. Entre a informação biologicamente útil que pode ser obtida encontra-se a de concentrações de proteína de ligação excessivamente altas devido à presença de tumores, que resultam numa produção aumentada de IGF ou de uma das proteínas de ligação IGFBP (uma vez que as proteínas de ligação são produzidas na presença de IGF em excesso). Adicionalmente, diversos estados patológicos conhecidos podem estar relacionados com as concentrações de IGF. Por exemplo, certos tipos de osteoporose estão relacionados com as concentrações de IGF. Adicionalmente, as proteínas de ligação podem ser usadas na identificação, produção e purificação de IGFs produzidos por via recombinante. Os métodos de detecção da presença da IGFBP-4 compreendem a análise de uma amostra biológica como uma amostra de sangue, fluido cefaloraquidiano, ou tecido tumoral ou ósseo.
Tipicamente, os métodos para detecção de produtos para análise, tais como as proteínas de ligação do invento, são baseados em imunoensaios. Tais técnicas são bem conhecidas e não necessitarão de uma descrição detalhada. Exemplos incluem as técnicas de imunoensaio heterogéneo e homogéneo. Ambas as técnicas são baseadas na formação de um complexo imunológico entre a proteína de ligação e um anticorpo específico
correspondente. Os ensaios heterogéneos para a IGFBP-4 utilizam tipicamente um anticorpo monoclonal ou policlonal específico ligado a uma superfície sólida. Os ensaios em sandwich são cada vez mais utilizados. Os ensaios homogéneos, que são efectuados em solução na ausência de uma fase sólida, poderão também ser usados, por exemplo na determinação da diferença na actividade enzimática causada pela ligação do anticorpo livre a um conjugado enzima-antigénio. São apresentados diversos ensaios adequados nas Patentes Norte-americanas N^s. 3.817.837, 4.006.360, 3.996.345.
O reagente de superfície da fase sólida no ensaio acima referido é preparado por técnicas conhecidas de ligação de material proteico a material de suporte sólido, tal como esferas poliméricas, varetas, ou material de filtro. Estes métodos de ligação incluem geralmente a adsorçâo não específica da proteína ao suporte ou a ligação covalente da proteína, tipicamente através de um grupo amina livre, a um grupo quimicamente reactivo do suporte sólido, tal como um grupo activado carboxilo, hidroxilo ou aldeído.
Numa segunda configuração de diagnóstico, conhecida como ensaio homogéneo, a ligação do anticorpo a um produto a analisar produz alguma alteração no meio de reacção que pode ser detectada directamente neste meio. Os tipos gerais de ensaios homogéneos conhecidos e daqui em diante propostos incluem (a) detectores de marcação por spin, em que a ligação do anticorpo ao antigénio é detectada por uma alteração na mobilidade registada (alargamento dos picos de divisão de spin), (b) detectores δ
fluorescentes, em que a ligação é detectada por uma alteração na eficiência de fluorescência, (c) detectores enzimáticos, em que a ligação do anticorpo efectua as interacções enzima/substrato, e (d) detectores de ligação a lipossomas, em que a ligação conduz à lise dos lipossomas e à libertação do detector encapsulado. A adaptação destes métodos ao antigénio proteico do presente invento segue os métodos convencionais de preparação de reagentes de ensaios homogéneos.
Aplicações de Diagnóstico Utilizando Sondas Genéticas material genético do invento pode, ele próprio, ser usado em diversos ensaios como sonda para material genético presente em materiais de ocorrência natural. O produto a analisar poderá ser uma sequência nucleotídica que se hibridiza com uma sonda composta por uma sequência de (geralmente) desde pelo menos cerca de 16 nucleótidos consecutivos, geralmente cerca de 30 a 200 nucleótidos, até substancialmente a sequência completa das sequências acima apresentadas (sequências de cDNA). 0 produto a analisar poderá ser RNA ou cDNA. A amostra é tipicamente uma das descritas na secção anterior. Um resultado positivo é geralmente caracterizado como a identificação de um material genético composto por uma sequência que possui uma homologia de pelo menos 70% com uma sequência de pelo menos 12 nucleótidos consecutivos das sequências aqui descritas, geralmente com uma homologia de pelo menos 80% com pelo menos cerca de 60 nucleótidos consecutivos destas sequências, podendo o material genético ser composto por uma sequência substancialmente homóloga a toda a extensão das sequências. Para a detecção do produto a analisar, quando o produto a analisar se hibridiza com uma sonda, a sonda poderá conter um marcador detectável. As sondas mais particularmente úteis para a detecção de proteínas de ligação são baseadas em regióes conservadas destas proteínas, particularmente dos aminoácidos 181-191 (PNCD) e dos aminoácidos 212-215 (CWCV) da BP4. Estes aminoácidos possuem um elevado grau de conservação em todas as proteínas de ligação aos IGFs relacionadas. Apenas a IGFBP-1 apresenta uma diferença, um N em lugar de um D na posição
191.
Um método para amplificação de ácidos nucleicos alvo, para análise posterior por ensaios de hibridizaçâo, é conhecido como reacção em cadeia por polimerase, ou técnica de PCR. A técnica de PCR pode ser aplicada à detecção da IGFBP-4 do invento em amostras suspeitas, usando primers oligonucleotídicos espaçados uns dos outros e baseados na sequência genética aqui apresentada. Os primers são complementares relativamente a cadeias opostas de uma molécula de DNA de dupla cadeia, e estão tipicamente separados entre si por cerca de 50 a 450 nucleótidos (nt) ou mais (geralmente não mais do que 2000 nt). Este método contempla a preparação de primers oligonucleotídicos específicos, seguida de ciclos repetidos de desnaturação do DNA alvo, ligação ao primer, e extensão com uma DNA polimerase para obtenção de fragmentos de DNA da dimensão esperada, baseada no espaçamento dos primers. Os produtos de extensão gerados a partir de um
Λ primer funcionam como sequências-alvo adicionais para o outro primer. 0 grau de amplificação de uma sequência alvo é controlado pelo número de ciclos que são realizados, e é teoricamente calculado pela simples fórmula 2n, em que n é o número de ciclos. Uma vez que a eficiência média por ciclo se encontra no intervalo de cerca de 65% a 85%, 25 ciclos produzem de 0,3 a 4,8 milhões de cópias da sequência alvo. O método de PCR encontra-se descrito em diversas publicações, incluindo Saiki et al., Science (1985), 230:1350-1354; Saiki et al., Nature (1986), 324:163-166; e Scharf et al., Science (1986), 233:1076-1078. Ver também as Patentes Norte-americanas N2s. 4.683.194; 4.683.195; e 4.683.202.
invento inclui um método de diagnóstico específico para a determinação da IGFBP-4, baseado na amplificação selectiva de fragmentos de DNA codificando para a IGFBP-4. Este método utiliza um par de primers de cadeia simples, derivados de regiOes não homólogas de cadeias opostas de um fragmento duplex de DNA seleccionado a partir das sequências apresentadas na Figura 1. Estes fragmentos primer, que formam um dos aspectos deste invento, são preparados a partir de fragmentos de IGFBP-4, como acima descrito. 0 método segue o processo de amplificação de sequências seleccionadas de ácidos nucleicos, tal como descrito na Patente Norte-americana N2 4.683.202, como acima exposto.
Anticorpos Monoclonais
Tanto em utilização in vivo de anticorpos para a IGFBP4 e anticorpos anti-idiotipo como para uso em diagnóstico, poderá ser preferível a utilização de anticorpos monoclonais. Poderão ser produzidos anticorpos monoclonais anti-partículas de vírus, ou anticorpos anti-idiotipo, tal como se segue. 0 baço ou linfócitos de um animal imunizado são removidos e imortalizados, ou usados para preparar hibridomas através de métodos conhecidos pelos peritos na técnica. Para a produção de um hibridoma humanohumano, é seleccionado um dador de linfócitos humanos. Poderá ser usado o vírus de Epstein-Barr (EBV) para a imortalizaçâo de linfócitos humanos, ou um parceiro de fusão humano para produção de hibridomas humano-humano. Poderá também ser utilizada, na geração de anticorpos monoclonais humanos, a imunização primária in vitro com péptidos. Os anticorpos secretados pelas células imortalizadas são analisados para a determinação de clones secretores de anticorpos com a especificidade desejada.
Ensaio das Propriedades Biológicas da IGFBP-4 A propriedade de estabelecer uma ligação com um factor de crescimento semelhante à insulina é uma das actívidades biológicas exibidas pelas proteínas do invento. Estas proteínas podem ser convenientemente testadas num ensaio de ligação usando o IGF-I (Rinderknecht, E. e Humbel, R.E., J. Biol. Chem. (1978), 253:2769) ou o IGF-II (Rinderknecht, E. e Humbel, R.E., FEBS (1978), 89:283), de preferência o IGF-II, numa forma marcada, e.g., iodada. Por exemplo, um tal ensaio poderá incluir de forma conveniente a realização de uma electroforese em gel (SDS-PAGE) das proteínas do invento, seguida por uma imunotransferência de
Western (Western Blot) do gel, incubando-se o «blot» na presença
125 da [ I]IGF-I ou II, lavando-se o «blot» para remoção do IGF-I ou -II livre, e detectando-se a radioactividade do «blot».
Fontes de IGFBP-4
Se bem que as IGF-BPs do invento correspondam originalmente a IGF-BPs humanas, as IGF-BPs de mamíferos, e.g., murinas, porcinas, equinas ou bovinas, estão incluídas na definição de IGF-BPs, desde que possuam o grau de homologia requerido.
As IGF-BPs do invento incluem as purificadas a partir de um extracto de tecido ou de um meio de cultura condicionado, assim como as obtidas por via recombinante.
Usos da IGFBP-4
As aplicações terapêuticas das proteínas de ligação do invento incluem o seu uso como agentes terapêuticos únicos e o seu uso em combinação com um IGF, sendo esta última utilização a preferida.
Quando usada em combinação com um IGF, uma proteína de ligação do presente invento é adequada para uso nas indicações acima mencionadas, primariamente como um agente indutor de crescimento, regenerador de tecidos ou cicatrizador de feridas.
Assim, o invento proporcionai
i) o uso de uma proteína de ligação do invento juntamente com o IGF, sob a forma de uma combinação livre ou
fixada, para a estimulação do crescimento de um indivíduo, regeneração de um orgão ou tecido ou cicatrizaçâo de feridas, ou ii) um método para estimulação do crescimento, regeneração de um orgão ou tecido ou cicatrizaçâo de feridas num indivíduo, compreendendo este método a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação do invento, juntamente com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um IGF a um paciente que necessite de tal tratamento, ou iii) uma composição farmacêutica para a estimulação do crescimento, regeneração de um orgão ou tecido ou cicatrizaçâo de feridas num indivíduo, composta por uma proteína de ligação do invento juntamente com um IGF e com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável, ou iv) uma embalagem contendo formas separadas, até à administração, de uma proteína de ligação do invento e de um IGF, juntamente com instruções para mistura ou administração concomitante.
Uma proteína de ligação, em associação a um IGF, possui particular interesse na mediação da condrogénese ou da hematopoiese. Isto pode ser evidenciado pelos testes A a C que se seguem.
A) Um IGF aumenta a formação óssea, como indicado por, e.g., uma incorporação aumentada de [3H]-prolina nas proteínas colagénicas e não colagénicas de ossos do crâneo de um feto de rato. Ocorre um efeito sinérgico quando é usado um IGF na presença de uma proteína de ligação do invento. As culturas de ossos do crâneo de rato são preparadas por dissecação dos ossos parietais e frontais de fetos de ratos com 21 dias de gestação, fazendo a divisão ao longo da sutura sagital e efectuando a cultura segundo o método de Kream et al. (Endocrinology (1985), 116:296). É adicionada uma proteína de ligação, ou um IGF, em doses de 10 a 200 ng/ml de cultura. Quando a proteína de ligação é adicionada em combinação com o IGF, a sua razão molar é de 1:1. A cultura é efectuada durante 24 a 48 horas. Para a quantificação da incorporação de [3H]prolina em proteínas digeríveis por colagenase e em proteínas não colagénicas, procede-se à digestão de homogenizados ósseos com colagenase bacteriana, de acordo com o método de Diegelman R. e Peterkofsky (Dev. Biol. (1972), 28:443), modificado por Kream et al. (Endocrinology (1985), 116:296).
B) Um IGF diminui a reabsorção óssea, tal como indicado por uma diminuição na libertação de [45]Ca pelo osso. Ocorre um efeito sinérgico quando é usado um IGF na presença de uma proteína de ligação do invento. 0 teste é efectuado segundo os princípios de Raisz (J. Clin. Invest. (1965), 44:103). Ratas grávidas são injectadas s.c. com [45]Ca no décimo-oitavo dia de gestação. É injectado um IGF, isoladamente ou em presença de uma proteína de ligação do invento, numa dose de 10 a 200 ng por animal. A proteína de ligação é adicionada de forma a que a razão molar em relação ao IGF seja de 1:1. No décimo-nono dia, os animais são sacrificados e os fetos removidos. As hastes mineralizadas dos rádios e dos úmeros são dissecadas e colocadas em cultura. A reabsorção é quantificada com base na libertação de [45]Ca pelos explantes ósseos.
C) As proteínas de ligação aos IGFs do invento, assim como outras proteínas de ligação aos IGFs, potenciam o efeito de tipo eritropoietínico do IGF-I. Este facto pode ser, em particular, demonstrado testando o IGF-I, e.g., 10 ng/ml de IGFI, isoladamente ou em combinação com a proteína de ligação aos IGFs madura representada na Figura 1, e.g., uma alíquota de 50 μΐ de um sobrenadante derivado de uma cultura de uma linha celular
CHO gue expressa a proteína de ligação aos IGFs madura representada na Figura 1, através de um ensaio CFU-E como descrito em Fagg, B. e Roitsch, C.A., Cell. Physiol. (1986), 126:1. Enquanto que o resultado obtido com a proteína de ligação aos IGFs isolada não se revela significativamente diferente do obtido com o controlo, é observado um efeito sinérgico da combinação quando em comparação com o do IGF-I isolado.
Adicionalmente, a actividade mitogénica de um IGF combinado com uma proteína de ligação do invento pode ser testada como se segue: a incorporação da [ H]metil-timidina em células CCL 39 (fibroblastos do pulmão de hamster chinês) em cultura é medida tal como descrito por Plouet et al., Cell. Miol. (1984), 30:105. Neste ensaio, a linha celular CCL 39 é semeada numa placa, a 40.000 células por cúpula, em 0,5 ml de meio de cultura MEM (Gibco) contendo 10% de soro de vitelo fetal, 0,1% de penicilina, 0,4% de estreptomicina e 0,5% de fungizone. Após uma incubação de 72 horas a 37°C, em atmosfera de 5% de CO2, as células são lavadas com meio MEM na ausência de soro de vitelo fetal, e são então cultivadas neste meio durante 20 horas. Nesta fase, a cultura celular é confluente, e um IGF, ou uma proteína de ligação, ou ambos reunidos, são inoculados cada um numa dose de 10 ng para 200 ng de meio de cultura. Quando reunidos, a proteína de ligação e o IGF devem encontrar-se numa razão molar de 1:1. A amostra de teste é incubada a 37°C durante 24 horas, e é-lhe então adicionado lgCi de [ H]metil-timidina em 10 jil de PBS. Após uma incubação de 4 horas, a incorporação de metiltimidina é interrompida por lavagem das células com PBS. As células são fixadas com 0,5 ml de ácido tricloroacético (5%) durante 30 min., lavadas com água e, finalmente, lisadas com 0,5 ml de NaOH 0,1 M durante 2 horas, a 37°C. São transferidos 0,5 ml do lisado para um balão de cintilação, misturando-se com 3 ml de líquido de cintilação para medição de radioactividade β. A proteína de ligação potência a actividade mitogénica do IGF, se bem que o nível de radioactividade que é medido quando uma proteína de ligação é usada isoladamente não seja substancialmente diferente do obtido com a amostra de controlo.
Mais particularmente, uma proteína de ligação do invento, em combinação com um IGF, é útil a) para o tratamento do hipopituitarismo, do nanismo de tipo Laron, da osteoporose, de anemias, especialmente como complicações de uma insuficiência renal crónica e deficiência hepática ou renal, e b) para promover a cicatrização de feridas, tais como úlceras e queimaduras, ou feridas ocorrendo em resultado de acidentes ou resultando de actos cirúrgicos .
Para uso em associação a uma proteína de ligação do invento, o IGF é preferencialmente seleccionado a partir do grupo consistindo em: IGF-I, tal como descrito por Rinderknecht, E. e Humbel, R.E., J. Biol. Chem. (1978), 253:2769, o IGF-II, tal como descrito por Rinderknecht, E. e Humbel, R.E., FEBS (1978), 89:283, e qualquer derivado ou fragmento do IGF-I e IGF-II que possua uma actividade como factor de crescimento semelhante à insulina. Mais preferencialmente, o IGF seleccionado será o IGFII.
Para uso em associação a um IGF, uma proteína de ligação do invento será, de preferência, uma proteína que possua um grau de homologia de 85% a 100% com a pré-IGF-BP ou a IGF-BP apresentadas na Figura 1.
Quando não associadas a IGFs, as proteínas de ligação do invento possuem aplicações terapêuticas adicionais em quaisquer distúrbios fisiológicos que resultem de uma produção excessiva de IGFs livres, e.g., cancros produtores de IGFs como o cancro da mama ou do rim, a retinopatia proliferativa diabética ou o crescimento anormal de crianças altas possuindo elevadas concentrações séricas de IGF livre.
Assim, o invento proporciona igualmente:
(i) o uso de uma proteína de ligação do invento no tratamento de distúrbios fisiológicos resultando de uma produção excessiva de IGF livre por um mamífero, por exemplo o corpo humano, e.g., cancros produtores de IGF, retinopatia diabética ou crescimento anormal de indivíduos altos, ou
(ii) um método para o tratamento de distúrbios
fisiológicos resultando de uma produção excessiva de IGF livre,
e.g., cancros produtores de IGF, retinopatia diabética ou
crescimento anormal de um indivíduo, que compreende a
administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação do invento a um indivíduo que necessite de tal tratamento, ou (iii) uma composição farmacêutica para o tratamento de distúrbios fisiológicos resultantes de uma produção excessiva de IGF livre, e.g., cancros produtores de IGF, retinopatia diabética ou crescimento anormal de indivíduos, que compreende uma proteína de ligação do invento em associação a um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável, ou (iv) um método de libertação de IGFs para orgâos ou tecidos específicos, baseado nas propriedades de ligação diferencial da IGFBP-4, como indicado pelos testes biológicos.
Os fragmentos das formas transformadas da pré-IGF-BP ou IGF-BP mostrados na Figura 1 revestem-se de particular interesse no tratamento de distúrbios fisiológicos resultantes de uma produção excessiva de IGF livre no corpo humano.
Pode administrar-se uma proteína de ligação do invento, isoladamente ou em combinação com um IGF, por qualquer via convencional adequada a péptidos, em particular entericamente, e.g., sob a forma de comprimidos ou cápsulas, ou, de preferência, parentericamente, e.g., subcutaneamente ou intravenosamente, sob li
a forma de injecções ou infusões. Adicionalmente, a administração poderá igualmente ser tópica, e.g., sob a forma de pomadas ou suspensões, quando para uso, e.g., como um agente cicatrizante de feridas.
Para todas as indicações acima descritas a dosagem apropriada variará, evidentemente, dependendo, por exemplo, da natureza e gravidade da alteração a ser tratada e do modo de administração. Por exemplo, podem ser obtidos resultados satisfatórios no tratamento da osteoporose ou da anemia com dosagens diárias de cerca de 0,1 gg/kg a 40 gg/kg de peso corporal, de preferência de cerca de 0,5 gg/kg a cerca de 20 gg/kg de peso corporal, de uma proteína de ligação do invento. Em mamíferos maiores, por exemplo humanos, uma dosagem diária indicada é a de cerca de 5 gg convenientemente administrada por via parentérica, por exemplo uma vez por dia. Para a cicatrização de feridas, uma dosagem diária de 0,1 a 10 gg de uma proteína do 2 invento por cm de área da ferida será indicada em mamíferos maiores, por exemplo humanos. Esta dose será convenientemente administrada uma vez por dia. Quando usada em combinação com um IGF, a razão molar da proteína de ligação relativamente ao IGF será de preferência de 0,1:1 até 5:1, mais preferencialmente de 0,5:1 até 2:1, e ainda mais preferencialmente de 1:1.
As composições farmacêuticas do invento poderão ser fabricadas de forma convencional.
Outros usos para as proteínas de ligação do invento incluem diversas utilizações na produção de moléculas de IGF por técnicas recombinantes. As proteínas de ligação do invento podem ser usadas para a detecção de IGF produzido por leveduras na sua conformação nativa (activa), em oposição às formas inactivadas. Adicionalmente, as proteínas do invento poderão ser usadas como veículo (possivelmente sob a forma de proteínas co-expressas) na produção de IGF. Uma vez que se verificou que a proteína de ligação estabiliza o IGF in vivo, é esperado que o mesmo comportamento se verifique in vitro. As proteínas de ligação podem igualmente ser usadas para purificar os IGFs produzidos por leveduras, ao promoverem a ligação destes a uma superfície sólida (tal como na cromatografia por afinidade).
Apesar de o invento ter sido descrito em referência a formas de realização, métodos, construções, e usos particulares, tornar-se-á evidente aos peritos na técnica que se poderão efectuar diversas alterações e modificações sem que seja abandonado o espírito do invento.
Exemplo 1
Coluna de afinidade Sefarose-IGF-I
Foram dissolvidos 60 mg de IGF-I recombinante (CibaGeigy AG, Basel, Suíça) em 20 ml de NaHCO3 0,1 M, pH 8,3, contendo NaCl 0,5 M, e a solução foi adicionada a Sefarose 48 activada por CNBr (4 g de gel seco), de acordo com o protocolo do fornecedor (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suécia). 0 gel foi equilibrado com 500 ml de tampão de fosfato de sódio 0,05 M/NaCl 0,5 M, pH 6,5, numa coluna de vidro de 1,5 x 15 cm (volume da camada de gel, 15 ml).
Purificação das IGFBPs séricas
Esta técnica foi executada de acordo com uma modificação do método de Martin e Baxter (18, 19). De notar que as referências mostradas entre parêntesis nos Exemplos se referem às referências listadas por números na secção de Literatura Relevante desta Especificação. Um litro de plasma humano citratado, fora do prazo de validade, foi agitado durante duas horas à temperatura ambiente com 50 U (1 ml) de trombina cálcica, filtrado através de um tecido de algodão e acidificado. O IGF dissociado foi removido com SP-Sephadex C-25. O pH foi, em seguida, ajustado até 6,5, e o precipitado foi removido por centrifugação a 20.000 r.p.m. durante 30 min. O sobrenadante foi bombeado através da coluna de afinidade Sefarose-IGF-I acima descrita, a 34 ml/min, e a coluna foi lavada com 500 ml de tampão de fosfato de sódio 0,05 M/NaCl 0,5 M, pH 6,5. A proteína de ligação (i.e., a IGFBP) foi eluida com 40 ml de ácido acético 0,5 M, dialisada por 3 vezes contra dois litros de acetato de amónio 0,1 M, e liofilizada. 0 material liofilizado (40 mg) foi dissolvido em 4 ml de ácido heptafluorobutírico 0,1 M contendo 20% (v/v) de acetonitrilo, e o material insolúvel foi removido por centrifugação a 10.000 durante 10 min. 0 sobrenadante límpido foi submetido a HPLC (2 corridas com 2 ml cada) numa coluna Nucleosil CiQ (Macherey-Nagel, D ren, FRG) (19). As fracçOes efluentes foram secas num Speed-Vac (Savant Instruments,
Hicksville, NY), recolhidas em 1 ml de ácido acético 0,01 M, e secas de novo. 0 material resultante foi dissolvido em 250 μΐ de
H2O para análise de ligandos por blot (ver abaixo) e marcação com prata (20).
125
Análise de ligandos por blot do -I-IGF
Foi usado o método de Hossenlopp et al. (21) com ligeiras modificações (6, 19). Alíquotas de 5 μΐ das fracções efluentes da HPLC foram sujeitas a electroforese em tiras de gel de poliacrilamida-15% SDS, sob condições não redutoras. O 14 marcador de peso molecular marcado com C (Rainbow Marker,
Amersham, UK) foi reduzido. Os geles foram transferidos para membranas de nitrocelulose e processados como descrito (21). As membranas foram incubadas durante 6 h à temperatura ambiente num saco de plástico selado com 3 x 106 cpm de IGF-II marcado com 125
I (22). Após diversas lavagens, as membranas secas pelo ar foram expostas durante 12-48 h, a -70°C, a uma película de raios
X (Kodak, X-OMÂT, AR) numa cassette Kodak X-OMATIC (Eastman,
Rochester, NY).
125
O I-IGF II foi escolhido como traçador para a
125 pesquisa porque nem todas as bandas são detectadas com o I-IGF I (ver abaixo).
Electrotransferência para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (Immobilion)
Foram submetidos a electroforese 10 a 30 μg de IGFBP
purificada por HPLC, tal como acima descrito (tiras de gel de poliacrilamida de 15 x 15 x 0,15 cm), sob condições redutoras, seguindo-se uma electrotransferência (2 h a 0,8 A) para uma membrana Immobilion (Millipore Corp., Bedford, MA), como descrito por Matsudaira (23). A membrana foi corada durante 5 segundos com Azul de Coomassie R-250 a 0,1% em metanol a 50%, descorada em metanol a 50% / ácido acético a 10% durante 5 min à temperatura ambiente, e de seguida cuidadosamente enxaguadas com H2O. A membrana foi seca ao ar, e as bandas de proteínas foram cortadas e armazenadas a -20°C.
A análise de aminoácidos foi efectuada por degradação automatizada de Edman, utilizando um sequenciador de proteínas da Applied Biosystems, modelo 470A (Foster City, CA) (25).
Isolamento de tecidos e de RNA
Foi obtido tecido de osteosarcoma humano através do Dr. Marshall Urist, UCLA. O RNA total foi isolado pelo método do tiocianato de guanidínio (27). Foi usado um Osterizer para homogeneizar o tecido. O RNA Poli(A)+ foi purificado através de um único fraccionamento em oligo (dT) celulose (29).
Síntese de oligonucleótidos
Foram sintetizados adaptadores oligonucleotídicos, sondas, e primers de sequenciação e de PCR através do método do fosforamidito, usando um sintetizador da Applied Biosystems, modelo 380A (Foster City, CA), sendo estes elementos purificados *
por electroforese em gel de poliacrilamida, e dessalinizados em
SEP-PAK Ci8 (Waters; Milford, MA).
Foram sintetizados um o1igonucleótido 14-mero (5' CCTGTAGATCTCCG 3') e um oligonucleótido 18-mero (5' AATTCGGAGATCTACAGG 3'), para utilização como adaptadores da EcoRI para a biblioteca de cDNA do osteocarcinoma humano contruída em lambdaZAP. 0 14-mero foi fosforilado (30) e imediatamente aquecido a 95°C durante 15 min, para inactivação da polinucleótido quinase. Os adaptadores contêm igualmente um local de restrição interno da Bgl II, e são descritos em maior detalhe na secção seguinte, que descreve a construção da biblioteca de cDNA.
Os dois primers de PCR para a BP4 foram: (1) um primer «de sentido» consistindo numa mistura de 64 27-meros [5' AGATCTGAATTCGCA(A/G)GGXGTXCA(A/G)GC 3'] e (2) um primer «antisentido» consistindo numa mistura de 64 28-meros [5'AGATCTGAATTCG(A/G)TC(C/T)TC(C/T)TC(C/T)TCXAC 3'], em que X pode representar qualquer dos quatro desoxinucleótidos. Foram incluídos nos primers locais de restrição para a Eco RI, de modo a permitir a subclonagem em vectores de sequenciação M13. A sonda BP4 consistiu num 23-mero (5' GCGGGTTGTCCAGGGGGCTGCGT 3').
Amplificação por PCR das sequências BP4
As reacções de PCR foram realizadas de acordo com o fornecedor do kit de PCR (Perkin/Elmer/Cetus), usando os primers de PCR descritos (ver a secção de Síntese de 01igonucleótidos), numa concentração final de 8 μια. 0 molde de cDNA foi sintetizado a partir de 2,5 gg de RNA de osteosarcoma humano (Ost 2) poli(A)+. As condições de síntese do cDNA foram idênticas às abaixo descritas para a síntese da primeira cadeia de cDNA (ver Construção da Biblioteca de cDNA). 0 cDNA foi fraccionado em Biogel A-15m, recuperado por precipitação em etanol, e ressuspenso em 100 μΐ de água estéril. Foram usados para cada reacção de PCR 2,5 a 5 μΐ do molde de cDNA. Foram realizados 35 ciclos de PCR, num termociclador de DNA Perkin/Elmer/Cetus. Os primeiros 10 ciclos consistiram em um passo de desnaturação de 1 min a 94°C; um passo de emparelhamento de 1 min, a 45°C; e um passo de extensão de 1 min, a 45°C. Os 25 ciclos seguintes consistiram em um passo de desnaturação de 1 min a 94°C; um passo de emparelhamento de 1 min, a 55°C; e um passo de extensão de 1 min, a 72°C. 0 passo final de extensão no último ciclo foi de 7 min. As amostras foram extraídas uma vez com fenol/clorofórmio/lAA (1:1:0,04), e outra com clorofórmio/lAA (24:1), sendo depois recuperadas por precipitação em etanol, digeridas com EcoRI, e fraccionadas por electroforese em gel de acrilamida a 7% e 1 x TBE (30). Foi retirado do gel o DNA com uma migração entre os 40-70 pb, sendo este purificado por passagem numa coluna Elutip-d, ligado ao corte ml3 mol8 da EcoRI, e introduzido em DH5aF' para sequenciação de DNA.
Construção da biblioteca de cDNA
A primeira cadeia de cDNA foi sintetizada a partir de
RNA de osteosarcoma (0st3) poli(A)+, tal como descrito (33), mas RNA
com as seguintes modificações: foram aquecidos 10 μυ de
poli(A)+ a 65°C, durante 3 min, em 20 μΐ de Tris-HCl 5 mM (PH
7,5), colocando-se a mistura imediatamente em gelo durante 1 min, ajustando-se então (à temperatura ambiente) até conter Tris-HCl 50 mM (pH 8,3 a 42°C), MgCl2 8 mM, KC1 30 mM, ditiotreitol 10 mM, dATP, dGTP, dTTP e [a-32] dCTP (300 cpm/pmol), 2 mM cada, 60 U de RNasina, e 2,5 ug de oligo(dT)12-18· Foram adicionadas 60 μϋ de transcriptase reversa do vírus da leucemia murina, obtida por ) clonagem, para iniciar a síntese do cDNA (volume total de reacção 40 μΐ), e a reacção prosseguiu durante 60 min, a 42°C. A segunda cadeia de cDNA foi sintetizada e ligada aos adaptadores da EcoRl (ver a secção de Síntese de Oligonucleótidos), tal como descrito (34) . 0 cDNA de dupla cadeia (dscDNA) foi fosforilado (30), ajustado a NaCl 0,5M/EDTA 25 mM, e aquecido a 75°C durante 15 min para inactivação da polinucleótido quinase. 0 dscDNA foi separado dos adaptadores não ligados por cromatografia em Biogel A-15m, e recuperado por precipitação em etanol. 0 dscDNA foi ligado ao lambdaZAP cortado pela EcoRl (Stratagene), segundo descrito pelo fornecedor, mas incluindo polietilenoglicol (PEG) 8000 (Sigma) a 15% no meio de reacção, uma modificação já previamente descrita (35) . 0 DNA ligado foi recuperado por centrifugação (12.000 x g), lavado com clorofórmio, seco, ressuspenso em 4 μΐ de H2O, e incubado com um extracto para empacotamento in vitro (Stratagene), de acordo com as instruções do fornecedor. Foi 7 obtida uma biblioteca de 2,3 x 10 clones recombinantes independentes. Foram propagados fagos recombinantes na BB4 (Stratagene).
E. coli
Análise da biblioteca de cDNA
Foram plaqueados aproximadamente 300.000 fagos recombinantes, provenientes da biblioteca de cDNA Ost3 (50.000 fagos/137 mm de diâmetro da placa), sobre a E. coli BB4, e cultivados durante 5-6 horas a 37°C. Os fagos foram transferidos para filtros de nitrocelulose (Millipore, HATF 137), processados (36), e analisados com as sondas de BP4. A sonda de BP4 foi marcada com polinucleótido quinase T4 e com [τ-3^^] ATP (28), até
Q uma actividade especifica de 1-2 x 10 cpm/gg. Os filtros foram pré-hibridizados durante 1-2 h a 37°C, em 5 x SSC (1 SSC = cloreto de sódio 0,15 M/citrato de sódio 0,015 M, pH 7), formamida a 40%, 5 x solução de Denhartdt (1 x solução de
Denhardt = polivinilpirrolidona a 0,02% / Ficoll a 0,02% / albumina sérica bovina a 0,02%), sulfato de dextrano a 10%, fosfato de sódio a 50 mM, pH 6,8, pirofosfato de sódio 1 mM, NaDodS04 a 01%f e ^NA desnaturado de esperma de salmão a 50 gg/ml. Foi adicionada a sonda marcada, numa concentração de 10 cpm/ml, e a hibridização prosseguiu durante 12 h, a 37°C, com agitação suave. Os filtros foram lavados em 2 x SCC/NaDodSO4 a 0,1%, a 60°C, e expostos a películas Kodak XAR-2 com um filtro intensificador DuPont Lightning Plus, durante 12 h, a -80°C. As áreas de placas fornecendo sinais duplicados foram recolhidas, re-plaqueadas, e re-analisadas até à obtenção de placas puras.
Isolamento, Subclonagem e Sequenciação de Plasmídeos
Foram removidos do lambdaZAP os segmentos de cDNA da BP4 contendo o Bluescript SK(-), através do protocolo de resgateexcisão descrito pelo fornecedor (Stratagene). 0 DNA plasmídico foi isolado pelo método de lise alcalina (30). Os segmentos foram separados do vector Bluescript SK(-) por uma digestão com Bgl II, e fraccionados por electroforese em gel de agarose. Os segmentos foram retirados do gel e eluídos passivamente durante 12 h, com agitaçao suave, com Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) e EDTA 1 mM (TE); foram, de seguida, purificados por Elutip-D, como descrito pelo fornecedor (Schleicher e Schuell), e subclonados num vector de sequenciação M13 (37). A sequenciação do DNA foi efectuada através do método de terminação da cadeia por didesoxi (38), usando tanto primers de M13 como primers internos específicos. As regiOes ambíguas foram resolvidas usando 7-deaza-2desoxiguanidina-trifosfato (39) e sequenase (US Biochemicals).
Depósito da Informação Genética
As sequências genéticas apresentadas na Figura 1 encontram-se depositadas na American Type Culture Collection, encontrando-se aí identificadas tal como se segue:
Proteína Ident i f ic ador Na estirpe Número
Clonada Interno de E. coli ATCC
IGFBP-4 pBsPB4.1 RR1 Δ M15 68388

Claims (6)

1- Um processo de preparaçao de uma proteína de ligaçao purificada escolhida do grupo consistindo numa proteína de ligaçao ao factor de crescimento semelhante à insulina, possuindo uma sequência de aminoácidos que é, pelo menos, 85% homóloga à sequência de aminoácidos da Figura 1, e aos fragmentos da mesma, compreendendo, pelo menos, 10 aminoácidos consecutivos da referida sequência que são capazes de se ligar a um anticorpo específico para a referida proteína ou a um factor de crescimento semelhante à insulina, caracterizado pelo facto de compreender a síntese da referida proteína ou fragmento, a purificação da referida proteína ou fragmento a partir de uma fonte natural, ou a produção da referida proteína ou fragmento pelo desenvolvimento de um organismo recombinante compreendendo um gene codificando para a referida proteína ou fragmento.
2- Um processo de preparação de uma proteína de ligação purificada,z conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a referida proteína compreender a sequência de aminoácidos da Figura 1.
3- Um processo de preparação de uma proteína de ligação purificada, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto da referida proteína compreender um dos referidos fragmentos.
4- Um processo de preparação de uma proteína de ligação purificada, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender a purificação da referida proteína ou fragmento a partir de uma fonte natural.
5- Um processo de preparação de uma proteína de ligação purificada, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender o desenvolvimento de um organismo recombinante compreendendo um gene codificando para a referida proteína ou fragmento.
6- Um processo de preparação de um anticorpo, de um fragmento de um anticorpo, ou de um derivado do mesmo que reconhece a IGFBP-4, caracterizado pelo facto de compreender a estimulação de uma célula imune para produzir o referido anticorpo, e o isolamento do referido anticorpo a partir da referida célula imune ou de uma linha celular derivada da referida célula imune.
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