PT97349A - Processo para a preparacao de uma composicao para regular o crescimento do cabelo que cpmpreende polipeptidos purificados - Google Patents

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Campo Técnico A presente invenção refere-se a composições novas as quais regulam o crescimento do cabelo. História da Invenção A sociedade em geral continua a ligar um estigma à perda do cabelo. 0 desejo de uma cabeça saudavelmente repleta de cabelo resultou numa diversidade de aprocimações para a "cura" da calvície. Entre o grande número de estudos do crescimento do cabelo que foram descritos na literatura, vários investigadores dirigiram o seu estudo às raízes do cabelo. A raiz do cabelo é uma estrutura longa, compacta, localizada na derme, composta por três grupos celulares principais. 0 primeiro compreende um grupo compacto de fibroblas-tos conhecidas como a papila dérmica a qual inclui um sistema capilar. 0 segundo grupos compreende as células epiteli-ais germinativas da raiz do cabelo as quais se multiplicam e diferenciam para dar origem ao fio de cabelo maduro. 0 terceiro grupo de fibroblastos existe à volta da parte exterior da raiz na camada de tecido conjuntivo. A papila dérmica está presente como uma agregação de células mejenquimatosas durante todo o desenvolvimento dos folículos do cabelo no embrião. A importância da papji la dérmica no crescimento do cabelo e na indução dos folículos no adulto foi demonstrada uma série de estudos sobre os folículos das vibrissas dos ratos (ver Oliver, R.F. "Whisker Growth After Removal of the Dermal Papila and Lengthts of the Follicle in the Hooded Rat" 15 Journal of Embryology and Experimental Morphology 331 (1966à); Oliver, R.F. "Histologi- cal StucLès of Whisker Regeneration in the Hooded Rat" 16 35 1 5 10 15

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 J 25 30 63.372 Case 4139# 12. itóít ^ i Journal of Embryology and Experimental Morphology 231 (l966b^ Demonstrou-se que a remoção cirúrgica da papila dérmica do polículo vibrissa conduz a uma cessação do crèqcimento do ca_ belo (ver Oliver 1966a; Oliver 1966b; Oliver , R.F. "The Experimental Induction of Wisker Growth in the Hooded Rat by Implantation of Dermal Papillae" 18 Journal of Embryolo-gy and Experimental Morphology 43 (1967)). A ressunçãe do crescimento do cabelo nesses polículos ocorre quando uma nova papila dérmica é regenerada ou uma nova papila dérmica é implantada no folículo ablacionado. 0 papel da· papila dérmi ca na indução "de novo" do polículo foi estabelecido numa série de experiências de recombinação nas quais as papilas dérmicas de vibrissa do rato foram combinadas tanto com a epiderme glabrada orelha como com a epiderme afolicular do saco escrotal resultando na formação de folículos tipo vibris sa nas respectivas camadas epidérmicas (ver Oliver, R.F. "The Induction of Follicle Formation in the Adult Hooded Rat by Vibrissa Dermal Papilla" 23 Journal of Embryology and Experimental Morphology 219 (1970)). As papilas dérmicas dos folículos do cabelo de uma diversidade de espécies podem ser cultivadas in vitro e darem origem a conjuntos distintos de células com propriedades morfológicas e de comportamentos ca racterísticos (ver Jahoda, C.A.B. e R.F. Oliver "The Growth of Vibrissa Dermal PapUJa Cells in Vitro" 105 British Journal of Dermatology 623 (1981); Jahoda, C.A.B. e R.F. Oliver "Vibrissa Dermal Papilla Cell Agregative Behaviour In Vitro and In Vitro" 83 Journal of Embryology and Experimental Morphology 81 (1984); "The Culture of Dermal Papilla Cells From Human Hair Follicles" 110 British Journal of Dermatology 685 (1984); Withers, A.P., C.A.B. Jahoda, M.L. Ryder e R.F. Oliver "Culture of Wool Follicle Dermal Papilla Cells From Two Breeds of Sheep" 279 Arch. Dermatol. Res 140 (1984)). Uma propiedade notável das células em cultura das papilas dérmicas dos folículos de vibrissa derreto adulto é a retenção da capacidade para induzir o crescimento do cabelo quando introduzidas dentro das cavidades dos folículos forma _ o _ 35 1 1

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 das pela amputação das metades inferiores do folículo. (ver Jahoda, C.A.B., K.A. Horne e R.F. Oliver "Induction of Hair Growth by Implantation of Cultured Dermal Papilla Cells" 311 Nature London 560 (1984); Horne, K.A, C.A.B. Jahoda e R.F. 0.1iver "Wisker Growth Induced by Implantation of Cultured Vibrissa Dermal Papilla., Cells in the Adult Rat" 97 Journal of Embryology and Experimental Morphology 111 (1986)). Também se demonstrou que as células de papila cultivadas são capazes de tornar a estimular o crescimento do cabelo quando introduzidas dentro dos folículos tornados inactivos assim como a morfogénese indutora de folículos de cabelo completamente novos e a produção subsequente de fibras de cabelo. (Horne, K.A., C.A.B. Jahoda, R.F, Oliver e A.J. Reynolds, "Hair-Growth-Promoting Properties of Dermal Papilla Cells in •3heRat" 380 Journal of Physiology (London) 48P (1986)). A Patente Norte-Americana nQ. 4 832 946, Greei. publicada em 23 de Maio de 1989, registada por Unilever, des^ creve uma composição para aplicação local à pele ou cabelo dos mamíferos, compreendendo uma quantidade de sobrenadante de célula livre de uma cultura de fibroblastos da papila dér mica a qual incrementa o crescimento do cabelo no rato pelo . menos em 10% mais do que aquele de uma composição de controle . J 25 30 A Patente alemã DE 3 431 266, Birzer , publicada em 6 de Março de 1986, descreve que a administração externa ou interna de células de raízes do cabelo com a papila de animais abatidos estimula o crescimento e génese do cabelo e neutraliza a queda do cabelo e o ficar grisalho do cabelo. As células são obtidas da pele de animais e podem ser aplica das internamente por infecção ou como comprimidos ou gotas, e externamente como champôs, cremes e sabões. A Aplicação da Patente PCT No. ¥0 85/04577,' Bazzano, publicada em 24 de Outubro de 1985 descreve uma còm posição contendo um carbameto pirimidina a qual aumenta a ta xa de crescimento do cabelo sobre a pele dos mamíferos, prolonga a fase de crescimento do ciclo de crescimento do cabe- - 3 - 35 63.372 Case: 4139# 12 ABí?. 199 J.

lo, e trata vários tipos de alopécias. A Patente Norte-Americana nQ. 4 139 619, Chidsey, publicada em 13 de Fevereiro de 1979, assinada por Upjohn Company, descreve uma composição local compreendendo Minoxidil e iminopirimidinas realcionadas a qual estimula ; a conversão de cabelo aveludado para o cabelo final e aumenta a taxa de crescimento do cabelo terminal.

Objectivos da Presente Invenção É um objectivo da invenção presente fornecer um polipéptido purificado regulador do crescimento do cabelo. Émais um objectivo da presente invenção proporcionar uma composição para regular o crescimento do cabelo. É também um objectivo da invenção presente fornecer uma composição para regular o crescimento do cabelo, a qual é adequada para aplicação local à pele ou cabelo dos mamíferos. É também um objectivo da presente -invenção fornecer uma composição para regular o crescimento do cabelo, a qual é apropriada para aplicação na injecção cutânea.

Também é um objectivo da invenção presente proporcionar um método de regular o crescimento do cabelo, o qual compreende a aplicação ao cabelo ou pele dos mamíferos de uma composição tópica.

Também é um objectivo da invenção presente proporcionar um método de regular o crescimento do cabelo, o qual compreende injecção cutânea de uma composição.

Sumário da Invenção A presente invenção refere-se a uma composição para regular o crescimento do cabelo compreendendo uma quantidade eficaz e segura de um polipéptido possuindo a estrutu ra daqueles derivados das células de papila dérmicas com ca-racterísticas de pH isoeléctrico aparente/peso molecular se-leccionado de entre o grupo que consiste em pi 5,1/45 KD, pi 5,2/43 KD, pi 5,2/40 KD, pi 7,3/25 KD, pi 7,4/25 KD, ou fragmentos activos destes polipéptidos, e respectivas misturas; - 4 - 5 10 15

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e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Descrição Detalhada da Invenção

Como é utilizada aqui, a expressão de "pH eso-eléctrico aparente" significa o pH isoeléctrico que é determinado pelosprocessos de electroforese bidimensional de gel poliacrilimida divuldados em 0’Farrel, P.H; "High Resolution Two-dimensional Electrophoresis of Proteins", 250 Journal of Biological Chemistry 4007 (10975) e 0'Farrell, P.H. "High Resolution Two-dimensional Electrophoresis of Basic as Well as Acidic Proteins", 12 Cell 1133 (1977). 0 processo específico é descrito no Exemplo a seguir. A expressão "aplicação tópica é aqui utilizada com o significado de directamente espalhar ou deitar sobre o cabelo ou pele externas. A expressão "injecção cutânea" é aqui utilizada para significar a introdução de uma substância debaixo ou dentro da pele por uma agulha hipodérmica. A expressão "quantidade eficaz e segura" é utilizada aqui para significar uma quantidade suficiente de uma composição para proporcionar um efeito regulador de crescimento do cabelo desejado numa proporção beneficio/risco razoável . A expressão "farmaceuticamente aceitável" é aqui utilizada com o significado de que drogas, emdicamentos. ou componentes inertes os quais o termo descreve são aproprli das para serem utilizadas em contacto com os tecidos dos seres humanos e de animais inferiores sem toxicidade, irrita çã, reacção alérgica, e reacções semelhantes, indevidas, con seutâneos com uma proporção razoável benefício/risco . A expressão "polipéptido purificado" é utilizado aqui com o significado de uma amostra de polipéptido possuindo uma composição mais uniforme e mais livre de adul-teradores, impurezas, ou contaminantes do que um extracto in tracelular ou um sobrenadante extracelular que compreendam o - 5 - 35 1 63.372 Case: 4139# 5 mesmo polipéptido. Uma diversidade de métodos mecânicos, químicos e biológicos para purificarem as amostras estão à disposição no estado da técnica. Esses exemplos incluem, mas não estão limitados a, electroforese em gel, filtração, cen trífugação gradiente, cristalização, precipitação, cromato-grafia de permuta de iões, liofilização e diálise. 0 tremo "regular o crescimento do cabelo" é aqui utilizado com o significado de induzir a formação de un maior número de fios de cabelo, e/ou aumentar o diâmetro dos fios de cabelo e/ou aumentar o comprimento dos fios de cabelo, e/ou prevenir, retardar, ou suspender o processo da queda do cabelo.

Todas as percentagens, aqui utilizadas, são por peso a não ser que especificadas de outro modo. 15

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Polipéptidos Reguladores do Crescimento do Cabelo A invenção presente anvolve um polipéptido reguladora do crescimento do cabelo purificado (daqui para a frente HGRP) possuindo a estrutura daqueles derivados das células de papila dérmica com características de pH isoeléc-trico aparente/peso molecular seleccionado de entre o grupo que consiste em pi 5,1/45 KD, pi 5,2/43 KD, pi 5,2/40 KD, pi 7,3/25 KD, pi 7,4/25 KD, ou fragmentos activos destes polipéptidos, e respectivas misturas. A presente invenção envolve adicionalmente as composições seguintes: Uma composição para regular o crescimento do cabelo compreendendo uma quantidade eficaz e segura de um polipéptido possuindo a estrutura daquele derivado de células de papila dérmica com um pH isoeléctrico de pi 5,1 e um pes molecular de 45 KD e um veículo farmaceuticamente aceitável. Uma composição para regular o crescimento do cabelo contendo uma quantidade eficaz e segura de um polipéptido possuindo a estrutura daquele derivado de âélulas de papila dérmica com um pH isoeléctrico de pi 5,2 e um peso molecular de 43 KD e um veículo farmaceuticamente aceitável. _ a - 35 1 5

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Uma composição para regular o crescimento do cabelo compreendendo uma quantidade eficaz e segura de um polipêptido possuindo a estrutura daquele derivado das células de papila dérmicas com um pH isoeléctrico de pi 5,2 e um peso molecular de 40 KD e um veiculo farmacêuticamente aceitável. Uma composição para regular o crescimento do cabelo compreendendo uma quantidade eficaz e segura de um polipêptido possuindo a estrutura daquele derivado das células de papila dérmica com um pH isoeléctrico de pi 7,3 e um pelo molecular de 25 KD e um veiculo farmacêuticamente aceitável. Uma composição para regular o crescimento do cabelo contendo uma quantidade eficaz e segura de um polipêptido possuindo a estrutura daquele derivado das células dà papila dérmica com um pH isoeléctrico de pi 7,4 e um peso molecular de 25 KD e um veículo farmacêuticamente aceitável. Os HGRPs purificados da presente invenção possuem uma pureza de preferência a 80%, mais frequentemente superior a 95%, mais preferentemente ainda superior a 99%, e com máxima preferência maior do que 99,9%. Os HGRPs purificados da presente invenção podem ser detidos cultivando as células de papila dérmicas um meio nutriente seguido de lise das células. As técnicas de elec-troforese por grediente de pH não equilibrado (NEPHGE) e da electroforese de gel poliacrilamida de sulfato de sódio do-decilo (SDS-PAGE) são então executados sobre os lisados das células para isolar os polipéptidos desejados. Os polipépti-dos isolados são então eluldos do gel para se obter os HGRPs purificados. EXEMPLO 0 exemplo seguinte é projectado para ilustrar o processo para purificação quando aplicado a uma amostra especial. Não se deve entender como limitativo da invenção. 7 35

Mod. 71 - 20.000 βχ. - 90/08 20 J 25 30 63.372 Case: 4139# 1 Cultura da Célula

As células da papila dérmica dos mamíferos são removidas da zonas do bolbo (da raiz) de folículos vibrissa e cultivadas dentro de pratos de cultura como descrito em "The Growth of Vibrisse Jahoda, C.A.B. e R.F. Oliver, Dermal Papilla Cells in Vitro", 105 British Journal of Dermatology 623 (1981); e Jahoda, C.A.B. e R.F. Oliver, "Vibrisse Dermal Papila Cell Aggregative Behavioun in Vivo and in Vitro", 83 Journal of Embryology and Experimental Morphology 81 (1984). As células são mantidas num meio essencial mínimo de Eagle (EMEM; GIBCO Ltd; Paisley, Escócia) suplementado com 4 mM de glutamina, 50 unidades/ml de penicilina, 50 ug/ml de estrs-ptomicina e 20% de soro fetal de bovino (GIBCO Ltd, Paisley Escócia).

Identificação por Peso Molecular e Gradiente de pH

As células de papila dérmicas dos mamíferos são colocadas a 2-4 x 10^ de células por 35 mm de placa de petri de plástico (Nunc ou Sterilin) um meio de crescimento como acima e mantidas a uma temperatura de 37°C uma atmosfera saturada de água de 5% de C02/ar. A cultura é desenvolvida até à confluência. A cultura é mantida em confluência sem uma mudança do meio de crescimento durante 48 horas e então marcados durante 18 a 20 horas com 150 uCi/ml de h-[^^Sl-me tionine (Amersham International, A Public Limited Company Amersham, England) em EMEM contendo 1/10 da concentração normal de metionina e suplementada com 1% de soro fetal de bovino dialisado e glutamina e penicilina/ estreptomicina.

Os processos de electroforese bidimensional de gel poliacrilamida são baseados naqueles descritos em 01Far-rell (1975) e 01Farrell (1977) . Os lisados marcados das células são obtidos pela adição de 150 ul de tampão da lise (9,5M de ureia, 2% de surfactante não iónico Nonidet P40 e 2% de anfolinas, pH 3^5 a 10 para cada placa de cultura de 35 mm. A radioactividade incorporada dentro de cada amostra - 8 - 35 1 5 10 ) 15

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é determinada pela pres^pitação de ácido tricloroacético (TCA) de 5 ul aliquotas seguida pela contagem de cintilação líquida. As amostras contendo 10 de desintegração por minuto são centrifugadas num microcentrifugador durante 2 min., espalhadas nos geles de poliacrilamida cilíndricos (3x95 mm) contendo Anfolinas pH 3,5 a 10 (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Milton Keynes, England). A electroforese por gradiente de pH não equilibrado (NEPHGE) é conduzida a 1650 volt hora à temperatura ambiente. Após a electroforese , os geles cilíndricos são equilibrados num tampão de amostra SDS-antes da análise na segunda dimensão sobre 10% ou 12% de geles viscosos (140 x 145 x0,8 mm) por electroforese em gel de poliacrilamida de sulfato de sódio dodecilo (SDS-PAGE). Na reali-sação da electroforese na segunda dimensão, os geles viscosos são fixados, tratados com um intensificados fluorográfico (Amersham International, A Public Limited Company, Amersham, England), secos sob vácuo e expostos durante 5 dias ao filme Kodak XAR a uma temperatura de -70°C. 0 gradiente pH gerado no gel cilíndrico de primeira dimensão é determinado pela divisão de um gel contro le em segmentos ^de 10 mm, extraindo cada segmento em 2 ml de água desionizada durante 16 horas à temperatura ambiente e determinando o pH de cada extracto. Os pesos moleculares apa rentes de polipéptidos resolvidos na segunda dimensão são obtidos de uma curva de calibração gerada pela utilização de proteínas de indicador molecular baixo ( Bio-Rad Ltd, Watford, England).

Eluição dos Polipéptidos Os polipéptidos os quais são para ser purifi cados e mais tarde incorporados dentro de uma composição da presente invenção são isolados de um lisado não radioactivo. )uas separações de lisados correm ao mesmo tempo. As amostras ie um lisado de célula "radio-marcados" colocam-se sobre um *el , e as amostras de um lisado de células não "radiamarca-lo" colocam-se sobre um segundo gel. Todas as outras condições mantêm-se iguais, i.e, a medida de amostra, a medida do 1 1

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 gel, a percentagem de gel, a solução de temporamente,a volta gem horas, a temperatura, etc. A seguir à separação dos polipéptidos de um lisado de célula não radioactivo por electroforese bidimen-sional em gel poliacrilamida os segmentos no segundo gel cor_ respondendo a pH isoeléctrico aparente/pesos moleculares de pi 5,1/45 KD, pi 5,2/43 KD, pi 5,2/40 KD, pi 7,3/25 KD, e pi 7,4/25 KD são identificados pelas bandas "radiomarcados" no primeiro gel . Estas áreas são extirpadas do gel utilizan do uma navalha de barbear . Cada banda extirpaddo é colocado uma peça tubular de diálise a qual contém também uma solução de tamponament© apropriada (1,5 g tris, 7,2 g de Glicina, 0,5 g de Sulfato de laurilo em 500 ml de água). 0 tubo-de diálise contendo o polipéptido e o tampão é colocado numa câmara de electroforese contendo a mesma solução de tampona-mento como a encontrada no tubo de diálise. 0 polipéptido é electro-eluído dentro da solução de tamponamento do tubo de diálise. 0 gel extirpado que já não contém o polipéptido é removido do tubo. 0 polipéptido eluído dentro da solução tampão do tubo pode ser concentrado e/ou submetido a liofo-lização para ser utilizado com o veículo apropriado.

Fragmentos de Polipéptido J 25

Um fragmento do)s) polipéptido(s) isolado(s) pode ser gerado pela clivagem do polipéptido natural com pro teases. Uma diversidade de enzimas podem ser empregues em tal processo, incluindo mas não limitadas a, brometo de c±a_ nogénio, tripsina, quinotripsina, e pepsina. 30

Um fragmento do(s) polipéptido(s) isolado(s) pode também ser gerado pela síntese in vitro de áreas especificas do polipéptido nativo por técnicas padrão.

Composições Reguladoras do Crescimento do Cabelo

Outro aspecto da invenção presente envolve com posições para regular o crescimento do cabelo compreendendo uma quantidade eficaz e segura de um polipéptido possuindo a - 10 -

63.372 Case: 4139# 1 estrutura daqueles derivados das células de papila dérmicas ÇQmcaracterísticas de pH isoeléctrico aparente/peso molecular seleccionado de entre o grupo que consiste em pi 5,1/45 KD, pi 5,2/43 KD, pi 5,2/40 KD, pi 7,3/25 KD, pi 7,4/25 KD, ou 5 fragmentos activos destes polipéptidos, e misturas correspon dentes; e um veículo farmaceuticamente aceitável. A quantida de dos HGRPs a serem incorporados com um veículo adequado nar composições para utilização reguladora do crescimento do cabelo pode variar grandemente. As quantidades preferidas de 10 um polipéptido purificado nessas composições variam entre cerca de 0,01% e cerca de 20%, as mais preferidas variam entre cerca de 0,1% e cerca de 5% por peso. 0 Veiculo 15

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As composições da presente invenção compreen dem um condutor sólido, .*semi-sólido ou líquido cosmeticamen-te e/ou fisiologicamente aceitável para permitir que os HGRPs sejam libertados no alvo recipiente desejado numa con centração apropriada. 0 veículo pode ele mesmo ser inerte ou pode possuir benefícios fisiológicos ou farmacêuticos por si mesmo. A natureza do veículo será ditada pelo método esco lhido para a administração da composição. 0 método de administração da composição do HGRPs pode variar desde os métodos internos tal como injecção aos métodos externos locais. Um método preferido de administração dos HGRPs é por injecção cutânea. 0 veículo para facilitar esta administração compreenderá de preferência água ou uma solução salina. Um método mais preferido de administração do:i HGRPs é por aplicação tópica. A aplicação tópica é alcançada preferentemente com composições na forma de atornizadores, tónicos, cremes, loções, champôs, e os semelhantes. As composições tópicas da invenção presente podem ser formuladas como líquidos, por exemplo como uma lo ção, creme, champô, condicionador ou leite. Essas composições líquidas podem ser elaboradas para serem utilizadas em _11_ 35 i 1 5

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conjunção com um aplicador tal como um aplicador de bola rolante (rollon ), ou com um dispositivo atanizador tal como um aerosol contendo propulsor, ou um recipiente adaptado com uma bomba para administrar o produto líquido. Alternativamente, as composições da invenção podem ser sólidas ou semi-sólidas, por exemplo barras (sticks1 cremes ou geles. Essas composições sólidas ou semi-sólidas podem ser elaboradas para serem usadas conjuntamente com um aplicador adequado ou simplesmente com um tubo, ou garrafa, ou como um tecido impregnado de líquido, tal como um pano. A selecção de um condutor com esta finalidade exibe uma grande variedade de hipóteses dependendo da for ma do produto requerida da composição . Os veículos apropriados podem ser classificados como se descreve daqui para a frente. 0 termo "veículo tópico" refere-se a substâncias as quais podem actuar como diluente, dispersante, ou so] ventes nos HGRPs os quais garantem por isso que ele pode ser aplicado e distribuído uniformemente sobre o alvo escolhido numa concentração apropriada. 0 veiculo é preferentemente um que possa auxiliar a penetração dos HGRPs na pele para alcan çar o meio envolvente do folículo do cabelo. Os veículos tópicos úteis em composições da invenção exposta podem incluir água como um veículo, e/ou pelo menos um outro veículo cosmeticainen-te aceitável que vão a água. Os veículos úteis nas composi-ões tópicas de acordo com a invenção podem incluir "liposso-mas", latexas, "microfagos", e várias formas de micro-enca-psulação dos HGRPs. Geralmente, o cundutor é tanto de natureza orgânica como uma emulsão aquosa e capaz de possuir os HGRPs disparsos ou dissolvidos lá dentro. 0 veículo pode incluir emolientes, intensificadores de penetração de pele, agentes corantes, fragâncias, emulsificadores, agentes espe£ santes, e solventes farmaceuticamente aceitáveis. Segue-se uma descrição mais detalhada das composições locais preferidas: -17- 35 1 i 5 10 > 15 s i

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1-Loções As loções podem compreender uma quantidade eficaz (de preferência entre cerca de 0,01% e 10%, mais preferentemente entre cerca de 0,1% e 1%) dos HGRPs; entre 1% é 50%, de preferência entre 3% e 15%, de um emoliente; sendo o excipiente agua, um álcool C2 ou C^, ou uma mistura de água e de álcool. Vários emolientes são conhecidos. Exemplos desses emolientes são os que se seguem: a. ceras e óleos de hidrocarbonetos. Os exemplos são o óleo mineral, o petrolato (vaselina), a parafina, ceresina, azo-querite, cera microcristalina, polietileno, e peridroesqua-leno. b. Óleos de silicone, tais como dimetilpolisiloxanos, metil-fenilpolisiloxanos, copolímeros de silicone glicol solúveis em água e em álcool e fluídos de silicone volitivo tais como ciclometicane. c. Óleos e gorduras de trigliciridos tais como os derivados dí fontes vegetais, animais ou marinhos. Os exemplos incluem óleo de castor, óleo de cârtamo, óleo de semente de algodão, óleo de milho, óleo de oliva (azeite), óleo de fígado de baca lhau, óleo de avocado, óleo de amêndoa, óleo de palma, óleo de sésamo e óleo de soja. d. Os ésteres acetoglicêridos, tais como os monoglicéridos acetilados. e. Os glicêridos etoxilados, tais como o monoestearato de glicerida etoxido. f. Os ésteres de alquil de ácidos gordos possuindo 10 a 20 átomos de carbono. Os ésteres de metilo, isopropilo e butilo de ácidos gordos são utilizáveis aqui. Os exemplos incluem laurato de hexilo, laurato de .isohexilo, palmitato de isohe-xilo, palmitato de isopropilo, miristato de isopropilo, olea-to de decilo, oleato de isodecilo, estearato de hexadecilo, estearato de decilo, isoestearato de isopropilo, adipato de diisopropilo, adipato de diisohexilo, adipato de dihecil- decilo, sebacato de diisopro- 13 35 1 5

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pilo, lactato de Paurilo, lactato de ministilo, e lactato de cetilo. g. Ésteres de alquenilo de ácidos gordos possuindo 10 a 20 átomos de carbono, Os respectivos exemplos incluem miuistato de oleilo, estearato de oleilo, e oleato-de oleilo. h. Os ácidos gordos possuindo 8 a 22 átomos de carbono. Os exemplos adequados incluem os ácidos pelargonico, laúrico, mirístico, palmítico, esteárico, isoesteárico, hidroxiesteá-rico, oleico, linoleico, ricinoleico, araquidónico, boénico, e erúcico. i. Os álcoois gordos contendo 8 a 22 átomos de carbono. Os álcoois de laurilo, miristilo, cetilo, hexadecilo, estearilo, isoestearilo, hidroxiestearilo, oleilo, ricinoleilo, beenilo, erucilo, e 2-octilo dodecilo são exemplos de álcoois gordos satisfatórios. j. Éster de álcoois gordos . Os álcoois gordos etoxilados com 8 a 20 átomos de carbono incluem os álcoois de laurilo, cetilo, estearilo, isoestearilo, oleilo, e colesterol possuir do ligados a eles entre 1 a 50 grupos de óxido de etileno ou 1 a 50 grupos de óxido de propileno, ou uma mistura dos mesmos . k. Éter-esteres tais como os ésteres de ácido gordo de álcoois gordos etoxilados. l. Lanolina e derivados . Lanolina, óleo de lanolina, cera de lanolina, álcoois de lanolina, ácidos gordos de lanolina, lanolato de isopropilo, lanolina etoxilada, álcoois de lanolina etocxilados, colesterol etocilado, álcoois de lanolina propoxilados, lanolina acetilada, álcoois de lanolina aceti-lada; linoleato de álcoois de lanolina, ricinoleato de álcoois de lanolina, acetato de ricinoleato de álcoois de lanolina, acetato de álcoois-ésteres etocilados,hidrogenólise de lanolina, lanolina hidrogenada etoxilada, lanolina de sorbi-tol etocilada, e bases de absorção de lanolina semi-sólida e líquida são exemplificativas de emolientes derivados de lanolina. m. Álcoois polihídricos e derivados de polié^teres. Os res- 14 35 5

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pectivos exemplos são o glicol de propileno, o glicol aipro-pileno, o glicol polipropileno (M.W. 2000 a 4000), glicóois polioxietileno polioxipropileno, glicoóis polioxipropileno polioxietileno, glicerol, glicerol etoxilado, glicerol pro-poxilado, sorbitol, sorbitol etoxilado, sorbitol hidroxipro-pilo, glicol polietileno (M.W. 200 a 6000), glicoóis de meto-xi polietileno 350, 550, 750, 2000, 5000, de homopolímeros poli/oxido de etileno J (M.W. 100 000-5 000,000), glicoóis pc lialquileno e derivados , hexileno glicol (2-metilo-2,4-pent£ nediol), 1,3-butileno glicol, 1.2,6-hexanetriol, etohexadiol USP (2-etilo-l,3-hexanediol) C-^-C^g de glicol vicinal , e derivados de polioxipropileno de trimetilol-propano. n. Ésteres de álcool polihídrico. Os ésteres de ácidos mono-e di- gordos de etileno-glicol, ésteres de ácido mono- e di-gordos glicol de dietileno. ésteres de ácidos mono- e di-gordos glicol de polietileno (M.W. 200 a 6000), ésteres de ácidos mono- e di- gordos glicol de propileno, monooleato 2000 de glicol polipropileno, monoestearato 2000 de glicol polipropileno, monoestearato de propileno glicol etoxilado, ésteres de ácidos mono- e di- gordos de glicerila, ésteres de ácidos poli-gordos de poliglicerol, monoestearato de glicf: rila etoxilado, monoestearato de 1,3-butileno glicol , dies-tearato de 1,3-butilenoglicol, éster de ácido gordo poliol polioxietileno, ésteres de ácidos gordos de sorbitan, e ésteres de ácidos gordos de polioxietileno de sorbitan são ésteres de álcoois polihídricos satisfatórios. o. Esteres de cera tais como cera de abelha, espermacete (ou cetina), miristato de miristilo, estearato de estearilo. p. ©erivados de cera virgem (ou de abelha), e.g. cera de ab£ lha de polioxietileno sorbitol. Estes são produtos de reac-ção da cera de abelha com sorbitol etoxilado de conteúdo de óxido de etileno variável, formando uma mistura de éter-ésteres . q. Ceras vegetais incluindo as ceras de carnaúba e de cande-lila. r. Fosfolípidos tais como lecitina e derivados. s. Esteróis. Colesterol, ésteres de ácido gordo de coleste- 15 35 1 5 10 > 15

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rol são exemplos deles. t. Amidas tais como amidas de ácidos gordos, amidas de ácidos gordos etoxilados, alcanolamidas de ácidos gordos sólidos^ As loções compreendem ainda preferentemente en tre 1% a 10¾, mais preferentemente entre 2% e 5%, de um emul· sificante. Os emulsificantes podem ser não-iónicos, aniónicos ou catiónicos. Exemplos de emulsificantes não-iónicos satisfatórios incluem álcoois gordos possuindo 10 a 20 átomos de carbono , álcoois gordos possuindo 10 a 20 átomos de carbono condensados com 2 a 20 moles de óxido de etileno ou óxido de propileno, fenóis de alquilo com 6 a 12 átomos de carbono na cadeia de alquilo condensados com 2 a 20 moles de óxido de etileno, ésteres de ácido mono- e di- gordo de óxido de etileno, gordos , ésteres de ácidos mono- e di- gordo de glicol de etileno em que o meio ácido gordo contém entre 10 a 20 átomos de carbono, de dietileno glicol, glicoóis de polietile no de peso molecular compreendido entre 200 a 6000, glicóis de propileno com epso molecular entre 200 e 3000, glicerol, sorbitol, sorbitan, sorbitol polioxietileno, sorbitan polioxi etileno e ésteres de cera hidrofílica. Os emulsificantes aniç nicos adequados incluem os sabões de ácidos gordos, por exem pio os sabões de sódio, potássio e trietanolamina, em que 0 meio ácido gordo contém entre 10 e 20 átomos de carbono.' Oç tros emulsificantes aniónicos adequados incluem os sulfatos de metal alcalino, de amónio ou de sulfatos alquilo de amónic substituídos aril sulfonatos de alquilo, um sulfonato de éter de etoxialquilo possuindo 10 a 30 átomos de carbono no meio alquilo. Os sulfonatos de éter de etoxialquilo contêm entre 1 a 50 unidades de óxido de etileno. Os emulsificantes catiónicos satisfatórios são os compostos quaternários de amónio, de morfolínio e piridínio. Alguns dos emolientes descritos nos parágrafos precedentes têm também propriedades de emulsi-ficação. Quando uma solução é elaborada contendo um emoliente tal, não é necessário um emulsificante adicional, embora ele possa ser incluído na composição. 0 excipiente da loção é água ou um álcool - 16 - 35 63.372 Case: 4139#

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1 C2 ou Cg, ou uma mistura de água e do álcool . As loções são elaboradas misturando simplesmente todos os componentes uns com os outros. De preferência o composto da presente invenção é dissolvido na mistura. Os componentes convencionais opcio-5 nais podem ser incluídos. Um aditivo tal é um agente de espes sarnento num nível compreendido entre 1% e 10% da composição. Os exemplos de agentes de espessante adequados incluem: poli meros de carboxipolimetileno encadeados em cruz, celulose de etilo, glicóis de polietileno, goma de tragacante, goma de •jq "Kharaya", gomas de xanteína e bentonita, celulose hidroxie-tilo, e celulose de hidroxipropilo. 2. Cremes 15

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Os cremes compreendem uma quantidade eficaz (de preferência entre cerca de 0,01% e 10%, mais preferentemente entre cerca de 1% e 5%) dos HGRPs; entre 5% e 50%, de preferência entre 10% e 25%, de um emoliente, sendo o excipiente água. Os emolientes atrás descritos podem ser utilizados tam bém nas composições de creme. Opcionalmente, a fórmula do cre me contém um emulsificante adequado, como previamente se descrevem. Quando um emulsificante é incluído, é-o na composiçãc numa percentagem entre 3% e 50%, de preferência entre 5% a 20%. 3. Soluções A fórmula da solução compreende uma quantidade ef: caz (de preferência entre cerca de 0,01% e 10% , mais prefe-rentemente entre cerca de 0,1% e 1%), dos HGRPs; sendo o excipiente água e/cxi.umsàLvente orgânico apropriado. As substâncias orgânicas adequadas utilizáveis como solventes ou como uma parte de um sistema dissolvente são as seguintes: propi-leno glicol, glicol de polietileno (M.W. 200 a 600), glicol de polipropileno (M.W. 425 a 2025), glicerina, ésteres de soi; bitol, 1,2,6-hexanetriol, etanol, isopropanol, tartrato de dietilo, butanediol, e respectivas misturas. Esses sistemas, dissolventes podem conter também água. 17 - 35 1 5

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Estas composições em forma de solução podem ser aplicadas à pele tal como é, ou então podem ser formuladas dentro de um aerosol e aplicadas à pele como um "spray-on" (pulverização directa sobre a pele). As composições de aerosol compreendem ainda entre 25% e 80%, de preferência entre 30% e 50%, de um propulsor adequado. Exemplos desses propulsc_ res são os hidrocarbonetos com peso molecular baixo clorado, fluorado e clorofluorados . 0 óxido nitroso, o dióxido de cai bono, butano, e o propano são também utilizados como gases propulsores. Estes propulsores são utilizados a um nível suficiente para expelir o conteúdo do recipiente. 4. Geles As composições de gel podem ser formuladas mistu . rando simplesmente um agente de espessamento adequado às com posições da solução previamente descritas. Exemplos de agentes de espessamento apropriados foram previamente descritos em relação às loções. As.composições de gel compreendem uma quantidade eficaz (preferentemente entre cerca de 0,01% e 10%, mais preferentemente entre cerca de 1% e 5%) dos HGRPs; entre 5% e 75%, de preferência entre 10% e 50%, de um dissolvente orgânico como previamente descrito; entre 0,5% e 20%, de preferência entre 1% e 10% do agente de espessamento; sendo o ex-cepiente água. 5. Substâncias Sólidas As composições de formas sólidas têm utilização como composições do tipo barra (stick), planeadas para apljl cação do couro cabeludo ou outras partes do corpo. Essas com posições compreendem uma quantidade eficaz (preferentemente entre 0,01% e 10%, mais preferentemente entre cerca de 1% e 5%) dos HGRPs, e entre 50% e 98%, de preferência entre 60% e 90%, dos emolientes previamente descritos. Esta composição pode compreender ainda entre 1% e 20%, preferentemente entre 5% e 15%, de um agente de espessamento apropriado, e opcionaJ: mente emulsificantes e água. 0s agentes de espessamento pre- 18 35 63.372 Case: 4139#

j viamente descritos em relação às loções são apropriados aqui. 5

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Intensificadores de Penetração A presença de um aumentador de penetração pode potenciar o benefício dos HGRPs melhorando a sua distribuição através da camada córnea para o seu local de acção no ambiente do folículo do cabelo próximo da papila dérmica 0 intensificador de penetração pode conformemen-te funcionar de várias maneiras. Ele pode, por exemplo, melhc_ rar a distribuição do impulsionador do crescimento do cabelo sobre a superfície da pele. Alternativamente , ele pode aumentar a distribuição da composição dentro da pele quando aplicado localmente, ajudando assim a sua passagem para o seu local de acção. Outros mecanismos aumentando o benefício dos HGRPs podem também estar envolvidos. Os exemplos de aumentadores de penetração incluem, mas não estão limitados a: um aumentados de 1-dodecilaza-cicloheptano-2 em combinação com certos diois C^-C^ ou um aumentador 1- de azacicloalquilo substituído-2 (ver a Patente Norte-Americana 4 557 934, Cooper, publicada em 10 de Dezembro de 1985); uma combinação binária de um diol C^-C^ e um "composto desordenador do envoltório da célula" (ver a Paten te Norte-Americana 4 552 872, Cooper, Loomans e Fawzi, publicada em 12 de Novembro de 1985); uma combinação binária de y pirolidona N-(2-hidroxietilo) e um "composto desordenador do envoltório da célula" (ver Patente Norte-Americana 4 537 776, Cooper , publicada em 27 de Agosto de 1985); um composto com preendendo álcool de laurilo, sebacato de diisopropilo, seba-cato de dibutilo, adipato de dioctilo, dipelargonato de pro-pileno glicol, laurato de butilo, miristato de etilo, miris-tato de butilo, palmitato de isopropilo, álcool de oleílo, · sebacato de dietilo, sebacato de dioctilo, azelato de dioct^L lo, laurato de hexilo, caprãto de etilo, estearato de butilo, isoestearato de isopropilo, 2-etilhexilo pelargonato , benzoó to de butilo, benzoato de benzila, salicilato de benzila, ftalato de dibutilo e/ou laurato de etilo (ver Patente Norte- - 19 - 35 5

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-Americana 4 299 826; Luedders registada em 10 de Novembro de 1981); um éster de açúcar em combinação com um sulfóxido ou um óxido de fosfina (ver Patente Norte-Americana 4 150 114 Smith , registada em 17 de Abril de 1979; a Patente Norte-Americana 4 148 917, Smith, registada em 10 de Abril de 1979; a Patente Norte-Americana 4 148 887, Smith, registada em 10 de Abril de 1979; a Patente Norte-Americana 4 148 874, Smith registada em 10 de Abril de 1979; a Patente Norte-Americana 4 148 893, Smith registada em 10 de Abril de 1979; a Patente Norte-Americana 4 130 667, Smith, 19 de Dezembro de 1978; a Patente Norte-Americana 4 130 643, Smith , registada em 19 dí Dezembro de 1978; a Patente Norte-Americana 4 046 886, Smith registada em 6 de Setembro de 1977; a Patente Norte-Americam 3 952 099, Smith , registada em 20 de Abril de 1976; a Patente Norte-Americana 3 896 238, Smith, registada em 22 de Julhc de 1975); um veículo compreendendo sulfóxidos alifáticos (ver a Patente Norte-Americana 3 953 599, MacMillan e Lyness, registada em 27 de Abril de 1976; a Patente Norte-Americana 3 903 256, MacMillan e Lyness, registada em 2 de Setembro de 1975; a Patente Norte-Americana 3 839 566, MacMillan e Lyness registada em 1 de Outubro de 1974; a Patente Norte-Americana 3 678 156, MacMillan e Lyness, registada em 18 de Julho de 1972); um veículo compreendendo uma combinação binária de um diol Cg-C^ ou um triol Cg-Cg e um composto específico de lí-pido polar de álcool ^ ou C^g (ver a Aplicação de Patente Europeia 249397, Kasting, Smith, Massaro e Snyder, publicada em 16 de Dezembro de 1987); um veículo compreendendo um diol C3-C4 , um éster diol ou um éter diol e um composto desòrde-nador do envoltório da célula (ver a Aplicação da Patente Europeia 095813, Cooper, publicada em 7 de Dezembro de 1983; Aplicação da Patente Europeia 043738, Wickett, Cooper e Loomans, publicada em 13 de Janeiro de 1982); um veículo com preendendo um alcanol primário Cg-C^ e um propano ou butano diol (ver a Aplicação da Patente Europeia 013459, Wickett, Cooper e Loomans, publicada em 23 de Julho de 1980); 20 35

63.372 Case: 4139# 1 Outros Estimulantes de Crescimento do Cabelo A composição de acordo com a invenção pode tam bém compreender opcionalmente outros estimulantes do cresci-5 mento do cabelo capazes de funcionarem de várias maneiras para aumentar o benefício dos HGRPs. Exemplos de outras substâncias as quais por si mesmas possuem a capacidade para re-giíar o crescimento do cabelo incluem, mas não estão limitadas a, minoxidilo, ácido retinoico, diazóxido, iamina e os 10 seus derivados de cobre, anti-inflamatórios, bloqueadores do canal de cálcio, anti-bacterianos surfactantes não iónicos, mucopolissacaridos, e anti-androgénios. 15

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Outros Componentes A composição de acordo com a invenção pode cor ter outros componentes que não aqueles já mencionados, dependendo da forma do produto desejado. É, por exemplo, possível incluir antissépticos, conservantes, antioxidantes, emulsifi-cantes, agentes corantes, sabões e detergentes. A composição de acordo com a invenção pode tam bém ser utilizada como um veículo para uma grande variedade de componentes cosméticamente ou farmaceuticamente activos, em especial componentes os quais possuem alguns efeitos benéficos quando aplicado à pele que não o estimulo do crescimento do cabelo. A composição de acordo com a invenção pode também compreender opcionalmente um perfume uma quantidade suficiente para tornar a composição aceitável ao consumidor e agradável de utilizar. Geralmente, o perfume constituirá entre 0,01% e 0,1% por peso da composição. A Utilização de Composições para Induzir, Manter ou Intensi-ficar o Crescimento do Cabelo A invenção proporciona também a utilização dos HGRPs isolados das células de papila dérmicas em cultura no tratamento da calvice. Os seguintes métodos de utilização - 21 - 1 i » 5

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 J 25 30 63.372 Case: 4139# podejn ser utilizados para inverter , suspender, ou prevenir o início da queda do cabelo. As composições de acordo com a invenção são de preferência projectadas para aplicação por injecção cutânea. A quantidade da composição e a frequência de injecção cutânes podem variar grandemente, dependendo das necessidades pessoais. Como um exemplo de aplicação por injecção cutânea , aconselha-se que uma composição adequada para injecção cutânea com preendendo os HGRPs seja injectada"cutaneamente" de preferência entre uma vez por dia a uma vez cada seis meses, mais preferentemente entre três vezes por semana a uma vez por mê£ e sobretudo entre uma vez por semana a duas vezes por mês.> A composição para injecção cutânea conterá preferentemente entre cerca de 0,001% e 10% dos HGRPs , mais preferentemente entre cerca de 0,1% e cerca de 10%, e mais preferentemente ainda entre cerca de 0,1% e 1%. 0 período de duração das in-jecções deverá ser preferentemente durante um período de tem po entre cerca de um mês a dez anos, mais preferentemente entre cerca de três meses e cerca de dois anos, ainda mais preferentemente entre cerca de seis meses e cerca de um ano, r£ sultando assim na regulação do crescimento do cabelo. Um método mais preferido para aplicar as composições de acordo com a presente invenção envolve a aplicação local ao couro cabeludo de um ser humano para regular o crescimento do cabelo, em especial onde a cabeça já está careca ou está a ficar sem cabelo. A quantidade da composição e & frequência da aplicação ao cabelo e/ou ao couro cabeludo podem variar grandemente, dependendo das necessidades pessoaií mas aconselha-se como exemplo que a aplicação local varie de preferência entre 8 a 10 vezes por dia, mais preferente-merte entre 4 e 6 vezes diárias, mais preferentemente entre 2 e 3 vezes ao dia, e sobretudo uma vez por dia. A composição para aplicação local conterá preferentemente entre cerca de 0,001% e 10% dos HGRPs, mais preferentemente entre cerca de 0,01% e 10%, e sobretudo entre cerca de 0,1% e 1% . 0 períodc - 22 - 35

Claims (1)

1. 63.372 Case: 4139# da tempo da aplicação local deverá ser preferentemente durante um período de duração entre cerca de um mês e dez anos, mais preferentemente entre cerca de três meses e dois anos, ainda mais preferentemente entre cerca de seis meses e um ano, resultado assim na regulação do crescimento do cabelo. Enquanto as formas de realização particulares da invenção exposta foram descritas, será óbvio para os especialistas no ramo que várias alterações e modificações da invenção exposta podem ser feitas sem se afastarem do espirito e escopo da invenção. Pretende-se englobar, nas reivindicações em apêndice, todas, essas modificações que estão dentro do escopo da invenção. -REIVINDICAÇÕES- l3. - Processo para a preparação de uma composição para regular o crescimento do cabelo apropriada para aplica·?-ção tópica à pèle ou cabelo de um mamífero ou poir injecção^ cutãnèar-caracterizado .pelo facto de 'compreender: a) entre· 0,01% —10% de um polipéptido possuindo a es^ trutura dos derivados das células dérraicas da pap:L la com caracterfsticas de pH- isoeléctrico aparen— te/peso molecular, seleccionado do grupo que con sista enrpl 5,1/45 KD, pi 5,2/43 KD, pi 5,2/40 KD pl 7,3/25 KD, pi 7,4/25 KD; ou respectivos fragmei^ tos; a respectivas- misturas; a b) um veículo farmaceuticamente aceitável. Lisboa, 12. AIR 1991

   ITY OF DUNDEE

   ENG.· MANUJ Adjunto do AOPt íoq? Vasco leite Arco de Conceição, 3-1.' * 1100 LISBOA =23 =